Guia de Trabalhos Práticos

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GUIA DE TRABAJOS 
PRÁCTICOS 
 
 
 
 
 
 
 
Planta de Bioprocesos Industriales- INTI 
2014
Materia de Especialización 
CEBI_E18 
Planta Piloto 
 
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El presente documento pretende orientar al estudiante en las distintas etapas de un 
proceso biotecnológico. Las distintas etapas son desarrolladas como diferentes trabajos 
prácticos en el orden en el cual deberían acontecer en un proceso real. 
 
Por otro lado, se incluyen al final en forma de anexos, las diferentes técnicas empleadas 
para los seguimientos de las diferentes etapas. 
 
Información adicional y específica estará disponible y será entregada a lo largo de la 
cursada. 
 
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GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS DE PLANTA PILOTO 
 
Índice: 
 
T.P. Nro 1. Preparación de medios de cultivo ..............................................................4 
T.P. Nro 2. Producción de una proteína verde fluorescente (GFP) ...............................6 
T.P. Nro 3. Disrupción de las células y concentración................................................. 11 
T.P. Nro 4. Purificación de proteína GFP .................................................................... 13 
ANEXO I: Preparación de inóculo. .............................................................................. 24 
ANEXO II: Determinación de la concentración de glucosa por método enzimático ..... 26 
ANEXO III: Determinación de la densidad óptica a 600 nm ........................................ 29 
ANEXO IV: Recuento de células viables en placa ...................................................... 30 
ANEXO V: Determinación de Masa seca .................................................................... 33 
ANEXO VI: Electroforesis desnaturalizante en gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE) .... 37 
ANEXO VII: Determinación relativa pureza por Densitometría.................................... 45 
Referencias Bibliográficas .......................................................................................... 51 
 
 
 
 
 
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T.P. Nro 1. Preparación de medios de cultivo 
 
Introducción y Objetivo. 
Cualquier medio de cultivo de bacterias o levaduras debe incluir: 
1. Una fuente de carbono 
2. Agua 
3. Una fuente de nitrógeno 
4. Una fuente de fósforo 
5. Una fuente de azufre 
6. Otros nutrientes minerales y vitaminas. 
Un medio de cultivo es definido o sintético, cuando se conoce exactamente su composición 
química. Sin embargo es habitual en el trabajo de laboratorio, el empleo de medios 
complejos. Por ejemplo, el extracto de levadura y las peptonas (proteína hidrolizada) son 
los ingredientes básicos del medio Luria-Bertani (LB), utilizado muy frecuentemente para 
crecimiento de E.coli. Estos materiales proporcionan una gran variedad de fuentes de 
carbono, nitrógeno, fósforo y azufre en forma de péptidos y aminoácidos así como una 
mezcla de cofactores. 
Tanto los medios de cultivo como equipos y materiales deben ser esterilizado antes de ser 
utilizados con las cepas puras. Los procesos de esterilización disminuyen la carga 
bacteriana (la probabilidad de que un microorganismo esté presente en forma activa o 
latente es igual o menor de 1 en 1.000.000 definido como coeficiente de seguridad de 
esterilidad). Existen varios métodos de esterilización de líquidos, recipientes e 
instrumentos utilizados en la manipulación de cultivos puros. En el trabajo práctico, 
utilizaremos la esterilización por calor húmedo, empleando temperaturas de 121ºC 
(utilizando vapor a 1,2 atm) durante un período de 20 minutos. 
 
El objetivo de este TP es aprender a preparar y a esterilizar un medio de cultivo complejo y 
acondicionar el biorreactor para su esterilización en autoclave. 
 
Materiales 
Caldo de Cultivo LB: 
Peptona 10g/litro 
Extracto de Levadura 5g/litro 
NaCl 10 g/litro 
 
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Ajustar el pH hasta 7,0 con NaOH. 
Autoclave Marca SCT 
Biorreactor BIOSTAT® Bplus 5. Sartorius Stedim Biotech. 
 
Métodos 
Preparar 3 litros de caldo de cultivo LB. 
Acondicionar el reactor, cubriendo con papel de autoclave todos los puertos de conexión al 
exterior antes de ingresarlo al esterilizador. 
Verificar el nivel de agua del autoclave, colocar la carga a esterilizar dentro del autoclave y 
autoclavar durante un tiempo mínimo de 30 min a 1,2 atm y 121°C. Colocarse los guantes 
de protección. Proceder a abrir la tapa del autoclave cuidando alejar el rostro de la boca 
del autoclave y retirar el biorreactor. 
 
Debido a los extensos tiempos de preparación, acondicionamiento y autoclavado del 
biorreactor, este TP será solo mostrativo. 
 
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T.P. Nro 2. Producción de una proteína verde fluore scente (GFP) 
 
Introducción y Objetivos 
En biotecnología, el conocimiento de las características de crecimiento de un 
microorganismo es esencial para lograr una eficiencia de transformación reproducible, y 
para obtener rendimientos repetibles de plásmidos y proteínas recombinantes. Las células 
que están creciendo en un cultivo discontinuo (Batch), normalmente experimentan cuatro 
diferentes estadios de crecimiento: una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento 
exponencial (log), una fase de crecimiento estacionario, y una fase de muerte. En la fase 
de latencia “Lag”, las células comienzan su adaptación al medio fresco de cultivo y 
comienzan a duplicarse lentamente. Terminada la fase Lag, las células comienzan su fase 
de crecimiento exponencial, donde la tasa de crecimiento en la población microbiana es 
exponencial y se mantiene constante. El comienzo y la duración de la fase exponencial es 
variable, y debe establecerse para cada medio y cada cepa microbiana empleados. 
Conforme se consumen los nutrientes en un sistema discontinuo, la velocidad de 
crecimiento va disminuyendo hasta llegar a detenerse alcanzándose así la fase 
estacionaria. En esta fase, las células no están todas en el mismo estado fisiológico; 
algunas se están dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morir. Pero la 
población se mantiene constante. Conforme se agota la mayor parte de los nutrientes, el 
número de células que mueren sobrepasa al número de células que se reproducen, y el 
cultivo entra en la fase de muerte. 
La construcción de una curva de crecimiento que incluya las fases de latencia, 
exponencial, estacionaria y de muerte, nos permitirá establecer los parámetros cinéticos de 
crecimiento. 
El objetivo del trabajo práctico es que el alumno realice una experiencia en un bioreactor a 
escala de laboratorio, con el fin de producir la proteína GFP (Green fluorescent protein) a 
partir de una cepa recombinante de E. coli. Inicialmente el sistema será operado de forma 
Batch hasta consumo total de la fuente de carbono (Glucosa), para luego cambiar la 
operación a un sistema Fed-batch o de cultivo en batch alimentado, con el fin de evitar 
llegar a la fase estacionaria, prolongando la fase exponencial mediante el control y 
agregado de nutrientes. Posteriormente, se inducirá la cepa para producir la proteína 
recombinante de interés. 
 
 
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Se busca además que el alumno se familiarice con el análisis cinético de los parámetros 
fermentativos; la operación, determinación y seguimiento del crecimiento celular y el 
proceso de inducción de proteínas recombinantes en un cultivo microbiano, 
 
Con el fin de realizar el seguimiento del proceso fermentativo se realizará el Control del 
Proceso midiendo los parámetros de crecimiento: DO600 y Glucosa cualitativa (Ver método 
de determinación en Anexo). Adicionalmente, se tomaran muestras para Control de 
Calidad en los que se determinarán la concentración de glucosa, recuento de células 
viables (Unidades formadoras de colonia por ml), masa seca y geles de poliacrilamida (Ver 
procedimiento de determinación en Anexos I a V). 
 
A partir de los resultados obtenidos durante la fermentación se buscará en caso de ser 
posible,determinar la velocidad específica de crecimiento de un cultivo (µ) durante la 
etapa Batch, así como también el tiempo medio de duplicación o tiempo de generación (t) y 
el rendimiento del proceso en la fase de crecimiento (Yx/s). 
 
 
 
 
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Procedimiento: 
 
Actividades de acondicionamiento: 
A llevar a cabo por el personal de Centro de Biotecnología Industrial-INTI 
1) Acondicionar el bioreactor Biostat B5 Plus para su esterilización. Ver figura 1. 
2) Preparar el medio de cultivo LB, volumen de trabajo 3 litros (De acuerdo a T.P. No.1). 
3) Esterilizar el medio de cultivo y el bioreactor por vapor húmedo a 121 °C y 1,2 atm en 
autoclave. 
4) Preparar el inoculo de la fermentación creciendo la cepa de E. coli recombinante 
durante 16-18 horas en tres erlenmeyers conteniendo cada uno 100ml de caldo LB con 
antibiótico de selcción (Ver Anexo I). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Esquema de un biorreactor de escala de laboratorio. 
 
 
 
 
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Actividades del T.P.: 
1) Inocular el bioreactor con 10% del volumen final de fermentación (recordar adicionar al 
medio los antibióticos de selección). 
2) Durante todo el proceso de fermentación se deben seguir los parámetros de 
fermentación suministrados de forma on-line por el controlador del equipo (Temperatura, 
O2 disuelto, pH, agitación, aireación, dosificación de antiespumante y volumen de 
dosificación de soluciones de regulación de pH). Registrar los valores en la “Planilla de 
Fermentación”. 
3) Tomar una muestra cada hora para Control de Proceso (Volumen=5ml) y otra para 
Control de calidad (Volumen=10ml). 
4) Realizar la medición de DO600 y glucosa cualitativa para todas las muestras tomadas 
durante la fermentación (y muestras intermedias que se consideren necesarias). 
5) De acuerdo a la medición cualitativa de glucosa, determinar el tiempo de consumo total 
de la fuente de carbono en el proceso Batch. 
6) Una vez consumida completamente la fuente de carbono adicionar glucosa al 40% a 
flujo constante por medio de una bomba peristáltica. El porcentaje de dosificación de la 
bomba debe ser calculado para mantener una concentración de glucosa de 2g/L por hora, 
durante todo el procedo de Fed-Batch. 
7) Alcanzar una DO600 entre 6,00 y 8,00 para realizar la inducción de la proteína 
recombinante. 
8) Una vez alcanzada la DO600 adicionar extracto de levadura a una concentración final de 
2 g/L. 
9) Setear la temperatura a 28°C para dirigir la induc ción de proteína soluble en el 
citoplasma celular. 
10) Inducir con una concentración final de IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido) de 
1mM en el fermentador. 
11) Permitir el proceso de inducción durante dos horas. 
12) Continuar con el registro de los parámetros de proceso y tomar las muestras para 
control de proceso y control de calidad. 
13) Una vez cumplidas las dos horas de inducción, cosechar el cultivo por medio de bomba 
peristáltica. 
14) Centrifugar el cultivo cosechado a 7000 rpm por 15 min. 
15) Resuspender el pellet en Buffer de Ruptura suplementado con un inhibidor de 
proteasas (Para el práctico se utilizará: PMSF-Fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y almacenar 
en cámara fría. 
 
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16) Confeccionar una tabla para registro de todos los parámetros medidos: 
Hora Tiempo (h) DO 
(Abs 600nm) 
Peso Seco 
(g/L) 
Concentración de 
glucosa (g/L) UFC/ml Operador 
 T1 
 T2 
 tn 
 
 
 
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T.P. Nro 3. Disrupción de las células y concentraci ón 
 
Introducción y objetivos. 
Los métodos de disrupción se pueden clasificar en dos categorías: métodos físicos y 
métodos químicos. 
Métodos físicos. 
• Disrupción en molino de bolas 
• Disrupción utilizando un molino de rotor 
• Disrupción utilizando prensa francesa 
• Disrupción utilizando homogenizador de alta presión 
• Disrupción utilizando vibración ultrasónica. 
Métodos químicos y físicoquímicos 
• Disrupción utilizando detergentes 
• Disrupción utilizando enzimas 
• Disrupción utilizando solventes 
• Disrupción utilizando shock osmótico 
Los métodos físicos están más focalizados a la ruptura de la pared celular mientras que los 
métodos químicos y fisicoquímicos se utilizan principalmente para desestabilizar la 
membrana celular. 
El objetivo del TP será el procesado del producto obtenido del biorreactor, de manera que 
el alumno pueda observar y aprender los factores que requieren especial atención en esta 
operación unitaria. 
 
Materiales y métodos. 
Se utilizará un homogeinizador de alta presión Marca APV Lab. Modelo 2000. 
La cosecha del biorreactor deberá ser enfriada a 4ºC antes de proceder al primer paso por 
el homogenizador. Registrar la presión de trabajo utilizada (aproximadamente será de 800 
Bar) y el número de ciclos de ruptura (de 3 a 4). Controlar la temperatura al final de cada 
ciclo para decidir, de ser necesario, una etapa de enfriamiento adicional antes de iniciar el 
siguiente paso. Retirar muestras de 5 ml pre-ruptura y después de cada ciclo para: 
• Controlar la ruptura por microscopía óptica y Densidad óptica (DO600) 
• Guardar alícuotas para analizar pellet y sobrenadante de ruptura por electroforesis en 
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y determinación de concentración de proteínas 
cuantitativa. 
 
 
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Centrifugar el producto de la ruptura a 8000 rpm durante 20 minutos. Recuperar el 
sobrenadante a 4ºC, ya que la proteína de interés se encuentra soluble. Entregar el 
producto al área de purificación. 
 
 
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T.P. Nro 4. Purificación de proteína GFP 
 
Durante este TP se realizará un esquema de purificación como se presenta a 
continuación: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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A continuación se desarrollarán los conceptos principales de cada etapa interviniente. 
Los alumnos podrán regresar a este esquema para poder ubicarse. 
 
Cromatografía de Intercambio Iónico (CII) 
La Cromatografía de Intercambio Iónico (CII) separa moléculas en función de las diferentes 
cargas netas superficiales. 
En las moléculas que tienen grupos ionizables, la carga neta superficial es altamente 
dependiente del pH. Como las proteínas son anfotéricas, por estar formadas por muchos 
aminoácidos que contienen grupos ácidos y básicos débiles, su carga neta superficial 
cambiará con los cambios del pH del ambiente en el que están. Cada proteína tiene, 
entonces, su propia relación carga neta/pH (la cual puede ser visualizada como una curva 
de titulación) y este hecho se aprovecha en la CII para facilitar la separación. 
En una separación por CII se van controlando las interacciones reversibles que ocurren 
entre las moléculas cargadas y el medio cromatográfico (cargado con signo opuesto), a fin 
de favorecer el pegado o la elución de moléculas específicas y conseguir la separación. 
Una proteína que no posee carga neta, a un pH equivalente a su punto isoeléctrico (PI), no 
interactuará con un medio cargado. En cambio, a un pH por arriba de su PI, la proteína se 
pegará a un medio cargado positivamente (intercambiador de aniones) y, a un pH por 
debajo de su PI, se pegará a un medio cargado negativamente (intercambiador de 
cationes). La elección de utilizar un medio u otro, generalmente se define por el rango de 
pH en el cual la proteína en cuestión es más estable. 
 
Figura 2: Gráfica de comportamiento de una proteína frente a la variación del pH. 
 
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En CII, una buena selectividad (el grado de separación entre dos picos) se logra realizando 
la separación a valores de pH elegidos cuidadosamente para maximizar las diferencias en 
las cargas netas de los componentes de interés. La selectividad óptima se puede esperar a 
valores de pH en los que la separación entre las curvas de titulación de la proteína de 
interés y de las otras proteínas de la muestra (contaminantes) sea máxima. 
En este Trabajo Práctico se usarán intercambiadores aniónicos. Como se conoceque el 
Punto Isoeléctrico de la proteína GFP es de 6.2, se trabajará con buffers de pH=8.2, para 
asegurar que la proteína esté cargada negativamente. 
Este punto se discutirá más ampliamente durante el desarrollo del TP, analizando curvas 
de titulación obtenidas por Isoelectroenfoque. 
 
Etapas en una Cromatografía de Intercambio Iónico 
En una CII se suele seguir una serie de pasos, los cuales se pueden ver en la Figura 3: 
1) Equilibración: Un medio cromatográfico de CII comprende una matriz de partículas 
esféricas, generalmente porosas para ofrecer una superficie interna de interacción 
mayor. El medio es colocado dentro de una columna, para formar un lecho 
empacado. El lecho se equilibra con buffer, el cual llena los poros de la matriz y los 
espacios internos y externos de las partículas. El buffer de equilibrio debe tener un 
pH y una fuerza iónica que aseguren que, cuando se carga la muestra, las proteínas 
de interés se peguen al medio y que la mayor cantidad posible de impurezas no lo 
hagan. 
2) Inyección de la muestra: Las proteínas que tienen la carga correcta se van pegando 
al lecho y quedan concentradas adentro de la columna, mientras que las proteínas 
que no tienen la carga superficial correcta irán pasando a través de la columna a la 
misma velocidad que el flujo del buffer. 
3) Lavado: Cuando toda la muestra ha sido cargada, la columna es lavada con algunos 
ml de buffer inicial (Buffer de Equilibrio), de manera tal que todas las proteínas que 
no se pegaron al lecho salgan de la columna. 
4) Elución: se cambian las condiciones para comenzar a eluir a las proteínas que 
quedaron pegadas. Frecuentemente, las proteínas se eluyen incrementando la 
fuerza iónica (concentración de sal) del buffer. A medida que la fuerza iónica 
aumenta, los iones salinos (típicamente, Na+ o Cl-) compiten con las moléculas 
 
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pegadas por las cargas de la superficie del medio, y las proteínas comienzan a eluir 
y salen de la columna. Las proteínas con la menor carga neta al pH seleccionado, 
serán las que primero eluyan de la columna. En cambio, las proteínas con la mayor 
carga neta a ese pH serán retenidas más fuertemente y serán las últimas en salir. 
Cuanto mayor sea la carga neta de una proteína, mayor fuerza iónica se necesitará 
para despegarla del medio. Controlando los cambios en la fuerza iónica y usando 
diferentes formas de gradiente, las proteínas se eluyen diferencialmente, en forma 
purificada y concentrada. 
En el Trabajo Práctico se usara un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCl. 
 
5) Lavado final: Por último, se realiza una etapa de lavado con un buffer de mayor 
fuerza iónica, el cual removerá las proteínas fuertemente pegadas, aún retenidas, al 
final de la elución. 
En el Trabajo Practico se usara NaCl 1 M. 
 
La columna debe reequilibrarse nuevamente con buffer de equilibrio antes de aplicar más 
muestra, en la corrida siguiente. 
 
 
Figura 3: Etapas de una Cromatografía de Intercambio Iónico 
 
 
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Cromatografía por IMAC 
Las proteínas con una “cola” (tag) de histidinas tienen una alta afinidad selectiva por el Ni2+ 
y otros metales divalentes, los cuales son inmovilizados en un medio cromatográfico 
usando ligandos quelantes. Por ese motivo, esta técnica cromatográfica suele 
denominarse IMAC, por “Immobilized Metal Ion Chromatography” (Cromatografía por Iones 
Metálicos Inmovilizados). 
 
En la Figura 4 se muestra un esquema de las etapas de una típica purificación por IMAC: 
 
Figura 4: esquema de las etapas de una purificación por IMAC 
 
1. Carga del medio con el ion elegido 
2. Equilibración de la columna con el Buffer de Equilibrio 
3. Aplicación de la muestra 
4. Lavado con Buffer de Equilibrio: se retira todo el material de la muestra que no se 
pegó a la columna (“Pass Trough”) 
5. Elución: remoción del material pegado a la columna con el Buffer de Elución 
(generalmente, aplicado en forma de gradiente) 
6. Lavado con el Buffer final, para remover todo lo que pudo haber quedado pegado a 
la columna y terminar de limpiarla 
7. Reequilibración: nuevamente con el Buffer de Equilibrio, para dejar preparada a la 
columna para una nueva corrida 
 
En la Figura 5 se muestra un resultado teórico de una cromatografía de este tipo, tal como 
se realizará en el Trabajo Práctico, en el cual se visualiza la lectura de la Absorbancia a 
280 nm y la concentración del Buffer de Elución (Buffer B). 
 
 
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Figura 5: Resultado de una cromatografía por IMAC típica 
 
Luego de la siembra, se espera que la mayor parte de las proteínas que no son de interés, 
no se peguen a la columna y salgan durante el lavado inicial. La proteína pegada en forma 
específica a la columna debería salir en algún momento del gradiente de elución, en forma 
de pico. 
Si hubiese quedado alguna proteína muy fuertemente pegada a la resina, debería salir con 
el lavado final. 
Para la elución se utilizará en el Buffer de Elución Imidazol, una sustancia que compite con 
las histidinas por los átomos de níquel disponibles. A medida que va aumentando la 
concentración de Imidazol, ésta va desplazando a las moléculas que están pegadas a la 
columna, de acuerdo a la fuerza de su unión (primero saldrán las moléculas más 
débilmente pegadas y luego las que están fuertemente pegadas). 
 
Desarrollo del Trabajo Práctico 
 
Selección del medio cromatográfico 
Se realizarán varios ensayos con columnas de volumen de lecho pequeño para determinar 
qué medio cromatográfico resulta más conveniente para purificar la proteína de interés. Se 
probarán diferentes medios, tanto de Intercambio Aniónico como de IMAC, haciendo 
corridas en las mismas condiciones. 
A lo largo de todo el Trabajo Práctico se ensayarán los siguientes medios: 
 
 
 
 
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 Medio (Nombre comercial) Tipo Fabricante 
1 Q Sepharose Fast Flow Intercambiador de aniones fuerte GE 
2 Q Sepharose XL Intercambiador de aniones fuerte GE 
3 Q Ceramic HyperD F Intercambiador de aniones fuerte PALL 
4 ANX Sepharose 4 Fast Flow Intercambiador de aniones débil GE 
5 DEAE Sepharose Fast Flow Intercambiador de aniones débil GE 
6 DEAE Ceramic HyperD F Intercambiador de aniones débil PALL 
7 Capto Q ImpRes Intercambiador de aniones fuerte GE 
8 Source 15 Q Intercambiador de aniones fuerte GE 
9 Ni Sepharose 6 Fast Flow IMAC GE 
10 IMAC HyperCel IMAC PALL 
 
Cada grupo realizará, por lo menos, dos cromatografías, una de intercambio iónico y una 
de IMAC. Se analizarán y compararán los resultados obtenidos con todos los medios 
ensayados en el TP. 
 
Condiciones de las corridas: 
Siembra: 500 µl de Sobrenadante de Ruptura 
Intercambio Aniónico: 
Buffer de Equilibración: Tris-HCl 50 mM, pH=8,2. 
Buffer de Elución: Tris-HCl 50 mM + NaCl 1 M, pH=8,2. 
Gradiente: lineal de 0-50% B (Buffer de Elución), en 10 Volúmenes de Columna (VC) + 5 
VC a 100% B. 
IMAC: 
Buffer de Equilibración: Tris-HCl 50 mM + NaCl 300 mM, pH=7,5. 
Buffer de Elución: Tris-HCl 30 mM + NaCl 300 mM + Imidazol 500 mM, pH=7,5. 
Gradiente: lineal de 0-100% B, en 10 VC + 5 VC a 100% B. 
En cada corrida se colectarán las fracciones correspondientes a los lavados iniciales (lo 
que pasa de largo, sin pegarse a la columna: “Pass trough”) y a los diferentes picos 
obtenidos con la elución. 
 
Parámetros para evaluar el Scouting 
Registrar los valores y, paralelamente, ir volcándo los a la PLANILLA 1. 
 
 
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a) PUREZA 
La pureza se calcula mediante densitometría como: % de la banda de interés sobre el % de 
proteína total. 
 
Datos necesarios sobre la MUESTRA: 
 
Pureza inicial (por SDS-PAGE) = _______ % (2) calculada mediante densitometría 
Proteínas Totales (por Bradford) = _______ mg/ml (1) 
Volumen sembrado = ________ ml (3) 
 
b) EFICIENCIA 
La eficiencia se calcula mediante la siguiente ecuación: 
 
Eficiencia= (Pureza obtenida (4) / Pureza inicial (2)) x 100= (____(4)/____(2)) x100 =____ % (5)Datos necesarios: 
Pureza obtenida (por SDS-PAGE) de la fracción colectada del pico = ______ % (4) calculada 
mediante densitometría 
 
c) RECUPERACION 
La recuperación se calcula mediante la siguiente ecuación: 
 
Recuperación = (Masa de GFP recuperada (8)/ Masa de GFP sembrada (9)) x 100 
 
 
Siendo: 
Masa de GFP recuperada= Proteínas Totales del pico (6)x Volumen del pico(7)x Pureza del pico(4) (8) 
Masa de GFP recuperada= ________ mg/ml x ________ ml x ______ __% 
Masa de GFP recuperada= _________ mg 
 
Y 
 
Masa de GFP sembrada = (Proteínas Totales de la muestra (1) x Volumen sembrado(3) x Pureza 
inicial(2) (9) 
Masa de GFP sembrada = ________ mg/ml x ________ ml x _______ %) 
Masa de GFP sembrada = ________ mg (9) 
 
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Datos necesarios: 
 
Proteínas Totales del pico (por Bradford) de la fracción colectada = ______ mg/ml (6) 
Volumen del pico (por Volumetría o Cromatograma) = ______ ml (7) 
Pureza del pico (por SDS-PAGE) de la fracción colectada del pico = ______ % (4) 
Pureza inicial (por SDS-PAGE) = _______ % (2) 
Proteínas Totales (por Bradford) = _______ mg/ml (1) 
Volumen sembrado = ________ ml (3) 
 
Finalmente: 
 
Recuperación = [(8) / (9)] x 100 = ( ______ mg / ______ mg) x 100 = ______ % (10) 
 
Volcar los datos en la PLANILLA 1 y completar la TABLA 1. 
 
Capacidad de pegado (“binding”) 
La cantidad real de proteína que puede unirse a un medio cromatográfico, bajo 
determinadas condiciones experimentales, se denomina Capacidad Estática de Pegado 
(capacidad del medio). Si esas condiciones incluyen el flujo utilizado, la cantidad pegada 
se refiere como Capacidad Dinámica de Pegado (DBC). 
La Capacidad Dinámica de Pegado depende de las propiedades de la proteína, de las 
propiedades del medio y de las condiciones experimentales utilizadas. Por ese motivo, 
debe ser calculada en cada caso en particular. 
Objetivo: en esta etapa del Trabajo Práctico se estimará la DBC de la resina que resultó 
elegida luego del Scouting. Conocer la DBC de una resina puede ser útil, en dos 
situaciones diferentes: 
I. Teniendo una columna ya empacada, para calcular cuál es la cantidad máxima de 
muestra que conviene sembrar. 
II. Teniendo una cantidad de muestra definida para procesar, para calcular el 
volumen de resina que conviene empacar en una columna. 
 
Determinación de la DBC: 
a. Medir la absorbancia máxima de la muestra con el cromatógrafo, haciendo pasar 
muestra por la tubuladura (en lugar de la columna). 
 
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b. Utilizando la columna elegida, comenzar a sembrar la muestra y detener la siembra 
cuando se alcance el 50% de la absorbancia máxima. 
c. Lavar con buffer de equilibrio hasta llegar al 0% de absorbancia. 
d. Realizar una elución rápida, con buffer de alta fuerza iónica (1 M). Colectar todo el 
pico eluido y medir su volumen. 
e. Calcular la cantidad máxima de proteína que puede unirse a la columna (A), al flujo 
elegido, como: 
A = C (12) x V (13) (11) 
Donde: 
C: Concentración de Proteína en el pico eluido = _____ mg/ml (12) a estimarse por 
Bradford (o por integración de la curva) 
V: Volumen del pico eluido = ______ ml (13) 
 
f. La Capacidad Dinámica (DBC) se calcula como A/volumen del lecho empacado: 
 Volumen del lecho empacado = _____ ml (14) 
 DBC = ______ mg(A) / _____ ml (14) 
 
 
DBC = ______ mg de Proteína / ml de medio (15) 
 
 
Optimización por gradiente escalonado 
Objetivo: intentar mejorar la Resolución de los picos y/o acortar la cromatografía. 
Una vez seleccionado el medio cromatográfico, se buscará optimizar la cromatografía en 
cuanto a resolución alcanzada (grado de separación de los picos) y/o duración de la 
corrida. 
Para esto se diseñará un gradiente escalonado, acorde a la finalidad buscada, y se 
compararán los resultados con los obtenidos con el gradiente lineal. 
Los detalles se explicarán durante el desarrollo del Trabajo Práctico. 
 
 
 
 
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Escalado 
Cuando se deben procesar grandes volúmenes de muestra, luego de optimizar la 
separación a pequeña escala se transfiere el mismo proceso a una escala mayor, 
utilizando una columna de mayor tamaño. 
Las reglas generales para un cambio de escala en una cromatografía se muestran en la 
siguiente Tabla: 
 
MANTENER AUMENTAR 
Altura del lecho de la columna Volumen de la columna (diámetro) 
Flujo lineal (cm/h) Flujo volumétrico (ml/min) 
Concentración de la muestra Volumen sembrado (*) 
Volumen del gradiente de elución (**) 
 
(*) Mantener la relación Volumen de Siembra/Volumen del lecho. 
(**) Mantener la relación Volumen del Gradiente/Volumen de la columna. 
 
Conversión entre flujo lineal y flujo volumétrico. 
Para comparar resultados obtenidos a partir de columnas de diferentes tamaños, es 
conveniente expresar el flujo en forma lineal (cm/hora). Sin embargo, el flujo usualmente 
se expresa en forma volumétrica (ml/min). 
Para hacer la conversión entre uno y otro, se utilizan las siguientes fórmulas: 
a) De flujo lineal (cm/h) a flujo volumétrico (ml/min): 
 Flujo Volumétrico (ml/min) = (Flujo Lineal (cm/h) / 60) x (π x d2 / 4) 
 Donde d = diámetro interno de la columna, en cm. 
b) De flujo volumétrico (ml/min) a flujo lineal (cm/h): 
 Flujo Lineal (cm/h) = Flujo Volumétrico (ml/min) x 60 x 4 / (π x d2) 
 Donde d = diámetro interno de la columna, en cm. 
 
Durante el desarrollo de Trabajo Práctico se planteará un ejemplo teórico para que los 
alumnos realicen los cálculos correspondientes. 
 
 
 
 
 
 - 24 - 
ANEXO I: Preparación de inóculo. 
 
Conservación de Microorganismos. 
Existen varios métodos para conservar cepas: 
• Liofilización 
• Conservación a -70ºC o en nitrógeno líquido. Para evitar que las células se destruyan 
durante la congelación, el medio de cultivo debe contener un agente crioprotector como 
el dimetilsulfóxido (DMSO) al 7% (v/v), o el glicerol al 15%. 
• A temperatura ambiente, en forma de cultivo en siembra profunda en tubos 
herméticamente cerrados que contienen un medio sólido rico. 
• Con refrigeración, en forma de cultivos en tubo inclinado (slant). 
 
Inoculación y subcultivo 
Como una gran cantidad de las células de un inóculo obtenido de un cultivo en un tubo 
inclinado están muertas, la mayoría de los experimentos comienzan con el inóculo de un 
pequeño volumen de un medio de crecimiento y después el crecimiento de estas células 
durante la noche, a la mañana, el crecimiento se habrá detenido. Para obtener células en 
crecimiento activo para un experimento en particular, se diluye el cultivo de la noche unas 
10-100 veces y se vuelve a incubar durante varias horas, hasta que las células vuelven a 
encontrarse en crecimiento exponencial. Además, si un cultivo en crecimiento exponencial 
se enfría rápidamente por debajo de los 8º (introduciendo el matráz con el cultivo en un 
baño de agua fría), se conserva a 4ºC, y después se atempera rápidamente a la 
temperatura original a la que el cultivo había estado creciendo, el crecimiento se reanuda 
sin fase de latencia. 
 
Técnica aséptica y transferencia de cultivos 
Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y para 
mantener la esterilidad de los medios y soluciones, como así también, proteger al operador 
de la contaminación con el cultivo. La técnica aséptica significa evitar cualquier contacto 
entre el cultivo puro, el medio estéril, y las superficies estériles del recipiente de cultivo, 
con microorganismos contaminantes. Para conseguir este objetivo: 
1. Se desinfecta el área de trabajo para reducir el número de contaminantes 
potenciales. 
2. los instrumentoscon los que se realiza la transferencia están esterilizados. 
3. El trabajo se realiza rápido y eficientemente para minimizar el tiempo de exposición. 
 
 - 25 - 
4. El trabajo también puede ser realizado en Flujo Laminar o Cabina de Seguridad 
Biológica, minimizando los riesgos de contaminación de los inóculos y precultivos 
preparados. 
 
Los pasos típicos en la transferencia de un cultivo de un recipiente a otro son los 
siguientes: 
1. Flamear el ansa de siembra. 
2. Abrir y flamear las bocas de los tubos de cultivo 
3. Recoger un poco de cultivo crecido y transferirlo al medio fresco. 
4. Flamear las bocas de los recipientes de cultivo antes de cerrarlos 
5. Volver a flamear el ansa de siembra. 
 
 
 - 26 - 
 
ANEXO II: Determinación de la concentración de gluc osa por método 
enzimático 
 
Objetivo y fundamento del método. 
 
Se busca determinar la concentración de glucosa en el medio para conocer la 
cantidad de fuente de carbono de la que dispone el microorganismo, y luego, determinar la 
tasa de consumo de fuente de carbono. Se determina la concentración de glucosa al 
sobrenadante de las muestras del cultivo, tomadas a diferentes tiempos (por ejemplo cada 
1 hora). 
Para ello se utiliza el kit comercial “Glicemia enzimática AA” de Wiener Lab®. Este 
método ha sido adaptado para lectura a 490nm en lectora de microplacas. 
La técnica se basa en las siguientes reacciones enzimáticas que producen un 
compuesto coloreado. 
GOD 
 Glucosa + O2 + H2O Ácido glucónico + H2O2 
POD 
 H2O2 + 4-AF + 4-hidroxibenzoato quiminona roja 
Las enzimas provistas en el kit son la glucosa oxidasa (GOD) y la peroxidasa 
(POD). Además el reactivo contiene el 4-aminofenazona (4-AF) y el 4-hidroxibenzoato. 
 
 Procedimiento. 
Curva de calibración. 
 
1. Preparar todas las soluciones estándar a partir de una solución 1 g/l de glucosa de 
acuerdo a lo indicado en la tabla I. 
 
 
Nombre Concentración de 
glucosa 
Volumen sl de 
glucosa 
Volumen de 
agua 
Blanco 0 g/L - 20 µl 
S1 0,125 g/L 50 µl S4 50 µl 
S2 0,25 g/L 50 µl S3 50 µl 
S3 0, 50 g/L 50 µl sc estándar 50 µl 
S4 0,75 g/L 75 µl sc estándar 25 µl 
S5 1g/L 20 µl sc estándar - 
Tabla I: diluciones de la solución estándar para la construcción de la curva de calibración 
 
 
 - 27 - 
NOTA: se sugiere preparar estas diluciones directamente en la microplaca, en los wells A12 a H12; ya 
que el volumen lo permite, no se requieren tubos extras, y además es más fácil pipetear el volumen 
requerido para la reacción. 
 
Muestra. 
 
1. Alicuotar 0,5- 1 ml del sobrenadante de cada una de las muestra de cultivo obtenida 
a distintos tiempos en un eppendorf. 
2. Centrifugar 2 min a velocidad máxima, en la centrífuga de mesada. 
3. Separar nuevamente en el sobrenadante obtenido en un eppendorf correctamente 
rotulado. 
4. Preparar varias diluciones del sobrenadante de modo de obtener alguna cuya 
concentración de glucosa quede dentro del rango de la curva de calibración. 
A continuación se muestran las proporciones para las diluciones sugeridas. 
 
Dilución Vol. de 
muestra (µl) 
Vol. de 
H2O (µl) 
Volumen final 
(µl) 
1/2 50 50 100 
1/5 20 80 100 
1/25 20 480 500 
1/30 10 290 300 
1/40 10 390 400 
1/50 10 490 500 
Tabla II: posibles diluciones de la muestra 
 
Reacción. 
 
Antes de comenzar, se recomienda alicuotar en un tubo una cantidad de reactivo de 
Glicemia Enzimática AA (Wiener®) suficiente para todo el ensayo. Para la reacción, 
procurar que el reactivo esté a temperatura ambiente. 
1. Agregar 190 µl del reactivo en cada well. 
2. Agregar 10 µl de muestra, muestra diluida, solución estándar o blanco, según 
corresponda. Depositar la muestra con la punta de pipeta apoyada sobre una pared 
del well. 
NOTA: la reacción comienza en el momento que la muestra se mezcla con el reactivo. Procurar que la 
reacción comience en todos los wells al mismo tiempo. 
3. Una vez que se agregaron todas las muestras, homogeneizar el contenido de todos 
los wells utilizando la pipeta multicanal, intentando que no se formen burbujas en la 
superficie. 
4. Incubar la placa 5 min en estufa a 37°C. Si tien e tapa, colocársela. 
5. Retirar la placa de la estufa y esperar 5 min más (para que se estabilice la 
reacción). 
6. Determinar la absorbancia a 490 nm en la lectrora de placas Sunrise de TECAN. 
 
 Cálculos. 
Se realiza una curva de calibración con las diluciones de concentración conocida, 
que se hacen a partir de una solución estándar de glucosa. Con los datos obtenidos se 
grafica la curva Abs 490 vs. concentración de glucosa. A partir de ésta se obtiene la 
ecuación de la recta que mejor ajusta, y luego se interpolan los valores de absorbancia 
 
 - 28 - 
obtenidos para las muestras. Si la muestra fue diluida, es necesario multiplicar el resultado 
por el factor de dilución. 
 
 Criterios de Aceptación. 
- Para la curva de calibración, el R2 debe ser mayor a 0,98 
- El CV% de los duplicados para la curva de calibración y las muestras debe ser 
menor al 15%. No se pueden eliminar datos duplicados. 
- Si alguno de los duplicados para una determinada muestra quedase fuera del 
rango de calibración, descartar los datos, y repetir el ensayo a partir de una dilución más 
adecuada. 
- El resultado final será el promedio de los valores de concentración de glucosa 
obtenidos para todas aquellas diluciones que cumplan. A su vez, el CV% no debe superar 
el 15%. 
 
 - 29 - 
ANEXO III: Determinación de la densidad óptica a 60 0 nm 
 
Procedimiento. 
1. Prender el espectofotómetro y esperar 30 min a que se estabilice. 
2. Setear la longitud de onda del equipo en 600 nm. 
3. Tomar 1 ml de medio de cultivo y colocarlo en la cubeta. 
4. Introducir la cubeta en el espectrofotómetro procurando no tocar el lado por el cual 
pasa el haz de luz. 
5. Establecer esta medición como Blanco. 
6. Tomar la muestra y, de ser necesario, diluirla para que la medición sea acorde al 
criterio de aceptación de resultados. 
7. Introducir la cubeta en el espectrofotómetro y leer la muestra diluida. 
NOTA: de haber diluido la muestra, es necesario multiplicar el valor de DO 600 nm por el factor de 
dilución. 
 
 Criterios de Aceptación. 
Para que una medición sea aceptable debe entrar en el rango de absorbancia entre 
0,200 y 0,800. En caso de encontrarse por encima de dicho rango la muestra debe diluirse 
con agua destilada hasta cumplir con este criterio. En caso de encontrarse por debajo 
debe realizarse una dilución menor o, en caso de no ser posible, informar el dato obtenido. 
 
 - 30 - 
ANEXO IV: Recuento de células viables en placa 
 
Objetivo y fundamento del método. 
El recuento microbiológico se realiza con el objetivo de determinar el número de 
células viables en una muestra del cultivo, de modo de poder seguir el crecimiento 
microbiano durante el proceso. 
Dado que una célula puede multiplicarse sobre un medio de cultivo semi-solido 
hasta formar una única colonia visible llamada Unidad Formadora de Colonia (UFC), el 
número de colonias producidas a partir de un determinado volumen de cultivo indicará el 
número de células viables en dicho volumen. Sin embargo, el número de colonias 
obtenidas dependerá también del medio de cultivo que se utilice para el recuento, de la 
habilidad de la cepa para crecer en el medio elegido y demás condiciones experimentales 
que involucran incluso a la manipulación de la muestra por el operador. 
Para un recuento confiable es necesario disponer de colonias bien diferenciables 
una de otra, se comete menos error haciendo recuento de placas cuyo crecimiento se 
encuentre entre 30 UFC y 300 UFC. Las contaminaciones en la placa podrían alterar el 
correcto conteo e incluso algunos hongos podrían anularlo, por lo que se recomienda 
seguir el procedimiento respetando las condiciones de asepsia que se indicarán en el 
curso. 
 
Procedimiento. 
Se trabajaráen condiciones asépticas bajo flujo laminar. Ingresar al flujo todos los 
materiales a utilizar antes de comenzar con el plaqueo. 
� Muestra de cultivo bacteriano 
� Medio Agar-LB con y sin antibióticos (ampicilina [Amp] y Kanamicina [Kn]) en 
placas plásticas de petri descartables 
� Solución fisiológica estéril 
� Tips y tubos tipo eppendorf estériles 
� Gradillas 
� Vaso de precipitado con alcohol 96% 
� Espátula de Drigasky o rastrillo de vidrio estéril 
� Mechero 
� Recipiente de descarte con lavandina 
 
 
 
 - 31 - 
1. Realizar los cálculos necesarios para obtener en la placa entre 30 y 300 UFC. 
Considerar que 1 unidad de DO 600 nm equivale a 7x108 bacterias/ml. 
 
 
2. Una vez obtenidos los cálculos, realizar las diluciones de forma aséptica con 
solución fisiológica estéril. Preparar para cada muestra dos diluciones. 
 
Tabla de Diluciones: 
Dilución Muestra (µl) Sc. Fisiológica (µl) 
1/2 500 500 
1/3 200 400 
1/5 200 800 
1/8 100 700 
1/10 100 900 
1/100 10 990 
Tabla 1: proporciones utilizadas para diluir la muestra de cultivo a plaquear según dilución. 
 
3. Sembrar en cada placa 100 µl de la dilución preparada. Se sembrarán ambas 
diluciones elegidas por triplicado (4 placas por muestra). 
4. Dispersar el volumen agregado con la espátula de Drigasky o rastrillo de vidrio 
previamente esterilizado por flameo con etanol 96%. 
NOTA: distribuir uniformemente el líquido sobre la superficie del ágar hasta que se haya absorbido 
toda la humedad y el rastrillo ofrezca cierta resistencia. Al finalizar, volver a sumergir el restrillo en el 
etanol 96%. 
5. Rotular apropiadamente la placa con el nombre de la muestra y la dilución a la que 
corresponde. 
 
Ejemplo: 
Se recibe una muestra de OD= 1. Según el factor de conversión, 1 OD= 7X108 
Bacterias/ml. 
Deben realizarse entonces diluciones de modo tal de que 0,1 ml de muestra 
contengan entre 30 y 300 bacterias. Por lo que se realizan las siguientes 
diluciones utilizando la tabla 1: 
 
 
 
 La primera serie representa una dilución 1/800.000 de la muestra, de 
modo que obtendremos un total de 875 bacterias/ml en la última dilución. 
Sembrando 0,1 ml se esperarían 87 bacterias, valor que se encuentra dentro 
del rango deseado de 30-300 UFC/Placa. 
 Mientras que la segunda serie representa una dilución 1/400.000, por lo 
que obtendremos un total de 1750 bacterias/ml en la última dilución, 
sembrando 0,1 ml se esperarían 175 bacterias, un número apropiado, dentro 
del rango de 30-300 UFC/Placa. 
 
Diluciones seriadas: 1/100 1/100 1/10 1/8 siembra de 100 ul por triplicado. 
 1/4 siembra de 100 ul por triplicado. 
 
 - 32 - 
6. Incubar las placas de forma invertida (con la tapa hacia abajo y el ágar hacia arriba) 
a 37°C over night, o a temperatura ambiente por 2 d ías. 
 
Cálculos. 
 
Calcular UFC/ml empleando la siguiente fórmula: 
 UFC/ml = N°Colonias x Factor de dilución 
 Volumen Sembrado en ml 
 Donde N°Colonias es la cantidad de colonias detect adas al final de la incubación. 
 
Criterios de aceptación. 
Son criterios pre-establecidos con el fin de determinar un margen de error 
razonable y así asegurar resultados confiables. La calidad en las determinaciones se logra 
estandarizando los procedimientos de modo reducir la variabilidad de los datos. 
- La cantidad de UFC por placa debe estar entre 20-500, si esto no se cumpliera, no 
reportar el resultado. 
- El CV% entre los triplicados de una misma dilución debe ser menor al 25%. 
- Si esto no se cumpliera, se podrá eliminar 1 sólo resultado de los triplicados. Si 
aún así no se cumple la condición, el dato se considera no válido. 
- El resultado final es el promedio de todas las diluciones que cumplan con el 
criterio. En caso que sólo una dilución cumpla con el criterio, ésta sola representará el 
resultado final. 
 
 
 - 33 - 
ANEXO V: Determinación de Masa seca 
 
Objetivo y fundamento del método. 
 El crecimiento de una población o cultivo celular se encuentra ligado al 
incremento de masa del cultivo y al aumento del número de células en un tiempo 
determinado, ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que se 
encuentren en crecimiento balanceado (en el que todos los componentes aumentan en 
proporción por unidad de tiempo) 
 La determinación de masa seca, es un método directo para describir el 
crecimiento celular que consiste en el secado de los sedimentos de una muestra a 105°C 
hasta peso constante. Las medidas del peso seco del sedimento suelen representar el 10-
15% de los valores esperados para un sedimento húmedo. Este indicador “masa seca” es 
considerado como una mejor aproximación que la determinación de masa húmeda del 
sedimento ya que elimina grandes errores debidos al líquido intercelular retenido. La mayor 
complicación que presenta este método, consiste en la determinación de pequeñas 
cantidades de variación de peso, por lo que cuanto mayor sea la exactitud de la balanza 
que se utilice, más fiable serán los resultados. 
En el laboratorio se suelen utilizar dos técnicas para la determinación de la masa 
seca: El método tradicional, mediante secado en estufa, o utilizando un analizador de 
humedad. 
 
Procedimiento. 
Mediante analizador de húmedad: 
Materiales: 
Analizador de humedad Sartorius 
Micropipetas 
Tubos tipo Corning® de 15 ml 
Centrifuga 
Platillos de aluminio 
 
1. Centrifugar 4 ml de muestra en un tubo Corning® de 15 ml a una velocidad de 
5.000 rpm durante 10 min. (cada muestra se prepara por simplificado). 
2. Descartar el sobrenadante. 
3. Resuspender en aproximadamente 2 ml de agua purificada. 
NOTA: El volumen de agua adicionado sirve únicamente para poder tomar las células, para pasarlas 
al platillo. Debido a que mientras menor sea el volumen de agua utilizado menos tiempo llevará el 
secado, se recomienda resuspender las células con la menor cantidad de agua posible. 
4. Colocar un nuevo platillo de aluminio en la balanza y tarar el equipo. 
5. Agregar la muestra resuspendida al platillo de aluminio con una micropipeta gota a 
gota, buscando abarcar la mayor superficie posible del mismo. 
6. Secar utilizando el programa Masa seca 105/105/105°C 1% 300 s. 
7. Esperar la señal de finalización de secado (Aproximadamente 15 minutos) 
 
 - 34 - 
8. Hacer la conversión de volumen para obtener el resultado de masa seca en g/L. 
 
Mediante secado en estufa: 
Materiales: 
Estufa de secado 
Tubos Eppendorf® 1,5 ml. 
Micropipetas 
Centrifuga 
Balanza analítica 
 
1. Rotular cada tubo Eppendorf® con el nombre de la muestra (cada muestra se 
prepara por triplicado). 
2. Secar a 60°C en estufa la totalidad de tubos a u tilizar con las tapas abiertas durante 
aproximadamente 30 minutos. 
3. Tapar los tubos dentro de la estufa de secado y colocarlos en el disecador (dejarlos 
hasta que alcancen la temperatura ambiente). 
4. Pesar cada tubo en balanza analítica y registrar su peso como “Peso inicial”. 
5. Dispensar 1,5 ml de muestra en cada tubo. Procurar homogeneizar bien las 
muestras antes de tomar la alícuota. 
6. Centrifugar durante 7 min a 12.000 rpm. 
7. Descartar el sobrenadante, en descartes para residuos de medio de cultivo y 
patógenos. 
8. Secar los tubos conteniendo los pellets de células -con las tapas abiertas-, a 105°C 
Overnight, o hasta peso constante. 
9. Tapar los tubos dentro de la estufa de secado, colocarlos en un disecador hasta 
alcanzar la temperatura ambiente. 
10. Pesar cada tubo en balanza analítica y registrar su peso como “Peso Final”. 
11. Calcular la diferencia entre el peso final y el peso inicial para cada tubo. Promediar 
los valores obtenidos para los triplicados, y extrapolar el resultado a 1L (El 
resultado debe expresarse en g/L). 
 
 
 
 - 35 - 
ANEXO VI: Cuantificación de proteínas totales por e l método de Bradford 
 
Objetivo y fundamento del método. 
Se utilizala técnica de Bradford con el objetivo de cuantificar las proteínas totales 
en muestras como las de ruptura celular y las de fracciones cromatográficas, entre otras. 
Esta técnica se ha convertido en el método preferido para la cuantificación de proteínas ya 
que es más simple, rápido y más sensible que el método de Lowry. 
El método de Bradford se basa en la unión del colorante Coomassie Blue G250 a 
las proteínas. Donde la cantidad de proteína es proporcional a la coloración resultante. 
Aunque el colorante libre puede existir en cuatro formas iónicas diferentes (cuyos 
valores de pKa son 1,15, 1,82 y 12,4), las tres formas cargadas que predominan en la 
solución acidificada del ensayo son las formas catiónicas roja y verde tienen una 
absorbancia máxima a 470 nm y 650 nm respectivamente. En contraste, la forma más 
aniónica del colorante, la que se una a las proteínas, tiene una absorbancia máxima a 590 
nm. Así la cantidad de proteína puede ser estimada si se determina la cantidad de 
colorante obtenido en su forma iónica azul. Esto se logra usualmente midiendo la 
absorbancia de la solución a 595 nm. 
 
 Procedimiento. 
Curva de calibración. 
 
1. Preparar la solución de trabajo de BSA (concentración final = 100 µg/mL) haciendo 
una dilución 1:10 de la solución stock de BSA 1mg/mL. Se recomienda preparar por 
lo menos 1,5 mL de esta solución de albumina. 
2. A partir de la solución de trabajo de BSA (100 µg/mL), preparar directamente en la 
microplaca las diluciones para la curva de calibración de acuerdo a lo indicado en la 
Tabla II. Cada punto debe realizarse por triplicado. 
 
 Curva de calibración (vol final = 160 µL) 
µg/ml de BSA 
0 
(Blanco) 
10 15 20 25 30 35 40 
µL de agua Milli Q 160 144 136 128 120 112 104 96 
µL de solución de 
trabajo de BSA 
100 µg/mL 
0 16 24 32 40 48 56 64 
Tabla II: diluciones de la solución de trabajo para construir la curva de calibración 
 
 
 
 
 
 - 36 - 
Muestra. 
 
Preparar varias diluciones de la muestra (con agua) de modo de obtener alguna 
cuya concentración de proteínas totales quede incluida en el rango de la curva de 
calibración. 
Realizar estas diluciones en un tubo eppendorf aparte y de cada una, alicuotar 160 
µL por pocillo; y a su vez, ensayar cada muestra por triplicado. Otra opción es realizar por 
triplicado la dilución final directamente sobre la placa, considerando que el volumen final es 
de 160 µL. 
 
Reacción. 
 
1. Agregar 30 µl del Reactivo de Bradford a cada well (a cada punto de la curva de 
calibración, cada muestra y sus respectivas diluciones) utilizando la micropipeta 
multicanal. 
2. Homogeneizar con la micropipeta multicanal evitando originar burbujas. 
3. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. 
4. Leer en la lectora de microplacas a una longitud de onda de 595 nm. 
 
 Cálculos. 
Se realiza una curva de calibración con los datos obtenidos, graficando Abs 595 vs. 
concentración de BSA. A partir de ésta, se obtiene la ecuación de la recta que mejor 
ajusta, y luego se interpolan los valores de absorbancia obtenidos para las muestras. Si la 
muestra fue diluida, será necesario multiplicar dicho resultado por el factor de dilución. 
 
Criterios de aceptación. 
- El ensayo se considera válido cuando el coeficiente de variación (C.V. %) de la 
regresión de la curva es mayor al 98%. 
- El C.V. % de cada punto de la curva patrón debe ser menor o igual a 15% 
- Si alguna de estas condiciones no se cumpliera, se podrán eliminar hasta 2 
puntos correspondientes a triplicados independientes de la curva. 
- El C.V. % de los triplicados de las muestras, debe ser menor o igual a 15%. Si 
esto último no se cumpliera, se puede eliminar un punto de las tres lecturas independientes 
de las muestras. 
 
 - 37 - 
 
ANEXO VI: Electroforesis desnaturalizante en gel de Poliacrilamida (SDS-
PAGE) 
 
 
Objetivo y fundamento del método. 
 
El SDS-PAGE es el método que se utiliza para analizar mezclas de proteínas 
cuantitativamente y se basa en la separación de proteínas de acuerdo a su tamaño. 
Existen varios métodos de electroforesis en geles de poliacrilamida (o PAGE del inglés 
Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Entre las diferentes variantes de ésta técnica, la 
electroforesis en geles discontinuos de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio o SDS-
PAGE (del inglés de Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) 
descripta originalmente por Laemmli (1), es el sistema más comúnmente usado. Esta 
técnica se utiliza para el análisis de proteínas mediante la separación según su relación 
carga/masa dentro de una matriz de acrilamida. 
Dado que las proteínas nativas tienen distintas formas, pesos moleculares y cargas, 
se utiliza la desnaturalización mediante el tratamiento con agentes reductores (como el β-
mercaptoetanol) y agentes caotrópicos (como el detergente dodecil sulfato de sodio ó 
SDS) de modo que las proteínas conserven solamente su estructura primaria y queden con 
carga negativa proporcional a su tamaño. Estas proteínas sometidas a un campo eléctrico 
se desplazan a una velocidad proporcional a su relación entre carga y masa. 
Cuando las proteínas se solubilizan en presencia del detergente aniónico SDS, éste 
se une a las proteínas, rompiendo interacciones hidrofóbicas y desnaturalizándolas. Las 
proteínas desnaturalizadas de la muestra adoptarán una estructura en forma de bastoncillo 
con una serie de moléculas de SDS cargadas negativamente a lo largo de la cadena 
polipeptídica. 
Debido a que la cantidad de SDS que se une a las proteínas es prácticamente 
proporcional a su tamaño, los complejos SDS-proteínas presentan un valor carga/masa 
constante y por lo tanto se separan de acuerdo a su tamaño cuando migran desde el 
cátodo al ánodo a una velocidad relacionada con su peso molecular. 
 
El sistema aquí utilizado es discontinuo, donde la composición del gel concentrador 
y el gel separador son heterogéneos. Es decir, se varían el tamaño de poro y el pH de 
modo que se producir el apilamiento de la muestra, para lograr una mejor resolución de las 
bandas. 
 
 - 38 - 
Mediante esta técnica se puede determinar el peso molecular de las proteínas de 
una muestra, comparando su movilidad relativa en el gel con la de un estándar (una 
mezcla de proteínas de peso molecular conocido) o marcador de peso molecular. 
En este Trabajo Práctico, se analizarán mediante esta técnica, muestras de cultivo 
para verificar la inducción de la expresión de la proteína, muestras de la ruptura celular y 
de la purificación mediante FPLC. 
 
 
Procedimiento. 
Armado del cassette de gel 
 
1. Corroborar la limpieza de las placas de vidrio: la placa de vidrio corto (y fino) y la 
placa de vidrio espaciadora (mas gruesa y con los espaciadores). Repasar los 
vidrios con etanol 96% y papel. 
2. Armar el molde del vidrio ubicando las placas de manera tal que la placa de vidrio 
espaciadora quede detrás de la placa corta, y en la placa espaciadora se pueda 
leer la palabra “UP” del lado superior. 
 
 
 
 
3. Colocar el marco de molde hacia arriba con ambas aletas abiertas, es decir, con 
ambas aletas en posición perpendicular con respecto al marco. Introducir ambas 
placas de vidrio. 
 
 
 
 - 39 - 
 
 
4. Cerrar ambas aletas, llevándolas simultáneamente hacia afuera. Realizar esta 
operación sobre una superficie plana, controlando que parte inferior de las placas 
de vidrio estén niveladas entre sí y con respecto a la base del marco de molde. 
 
 
 
 
5. Colocar el marco de molde con los vidrios ensamblados en el soporte del molde, 
asegurándose de que el espacio entre los vidrios quede sellado por la junta gris de 
la parte inferior del soporte. 
 
 
 
 
6. Llenar los vidrios con agua y controlar de que no se produzca ninguna pérdida por 
la junta. Si esto ocurriese, repetir el ensamblado del casette y volver a realizar esta 
prueba con agua. 
7. Vaciar el molde de los vidrios sólo Si NO se observanpérdidas de agua, y secar el 
espacio entre ambas placas de vidrio con tiras de papel secante (procurar que no 
queden residuos del papel entre los vidrios). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Preparación de los geles 
 
- Gel separador al 16%: 
Las proteínas deben correr primero a través del gel concentrador y luego por el gel 
separador, para ello, en primer lugar se prepara (y se coloca entre los vidrios del molde) el 
gel separador; y por último el gel concentrador. 
 
1. Preparar la mezcla del gel separador colocando los reactivos de a cuerdo a los 
volúmenes y en el orden en que se presentan en la siguiente tabla. 
 
Gel 16% 
 1 gel 2 geles 4 geles 
1) Agua destilada 0,95 mL 1,9 mL 3,8 mL 
2) Tris-HCl 1,5M pH 8,8 1,25 mL 2,5 mL 5 mL 
3) SDS 10% 50 µL 100 µL 200 µL 
4) Acrilamida 30% 2,7 mL 5,4 mL 10,8 mL 
5) APS 10% 50 µL 100 µL 200 µl 
6) TEMED 3,5 µL 7,0 µL 14,0 µL 
Volumen final 5 mL 10 mL 20 mL 
 
NOTA: Los geles se forman por la polimerización del monómero de acrilamida en presencia de pequeñas 
cantidades de bis-acrilamida como cross-linker. Dicha polimerización es un ejemplo de catálisis por radicales 
libres. Es el TEMED el que cataliza la descomposición del ión persulfato (APS) para dar un radical libre. Por lo 
tanto, al agregar el TEMED comenzará la reacción de polimerización (reacción exotérmica). A partir de este 
momento se cuenta con tiempo limitado para el vaciado del gel entre los vidrios. 
 
2. Colocar la mezcla del gel entre los vidrios utilizando una pipeta automática de 5 mL. 
Considerar que deben quedar 3 cm libres hasta el borde del vidrio corto (que es el 
espacio necesario para luego colocar el gel concentrador y el peine). 
3. Agregar cuidadosamente aproximadamente 1 mL de alcohol isobutílico saturado en 
agua. 
4. Dejar reposando hasta que concluya la reacción de polimerización (verificar la 
polimerización observando el resto de mezcla que quedó en el tubo). 
5. Una vez que terminó la reacción, quitar la solución de alcohol de la parte superior 
del gel. Lavar con agua una o dos veces. Secar cuidadosamente la parte superior 
entre los vidrios con papel secante, sin dañar el borde superior del gel. 
 
- Gel concentrador (o stacking): 
 
6. Preparar los peines sobre la parte superior de los geles. 
7. Preparar la mezcla del gel concentrador añadiendo los reactivos de a cuerdo a los 
volúmenes y en el orden en que se presentan en la siguiente tabla. 
 
 
 
 
 
 
 
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Gel concentrador 
 1 gel 2 geles 4 geles 
1) Agua destilada 0,95 mL 1,9 mL 3,8 mL 
2) Tris-HCl 0,5M pH 6,8 375 µL 750 µL 1,5 mL 
3) SDS 10% 15 µL 30 µL 60 µL 
4) Acrilamida 30% 200 µL 400 µL 800 µL 
5) APS 10% 17,5 µL 35 µL 70 µl 
6) TEMED 3,5 µL 7,0 µL 14,0 µL 
Volumen final aproximado 1,6 mL 3,1 mL 6,2 mL 
 
NOTA: En este caso la reacción de polimerización es aún más rápida que la que sucede con el gel separador 
dada la mayor concentración de catalizador, por lo cual se cuenta con menos tiempo para colocar el gel entre 
los vidrios. 
 
8. Llenar el espacio entre los vidrios hasta el borde. Inmediatamente luego colocar los 
peines en la posición correcta. Cuidar que no queden burbujas atrapadas, ya que la 
base de las calles podrían no quedar rectas. 
9. Dejar reposando hasta que concluya la reacción de polimerización (verificar la 
polimerización observando el resto de mezcla que quedó en el tubo). 
 
 
Montaje de los geles en la cuba 
 
1. Retirar los casettes del soporte del molde, moviendo simultáneamente las dos 
aletas hacia el centro. 
 
 
2. Colocar ambos casettes en el montaje de los electrodos, esta vez con el vidrio más 
corto hacia adentro. Registre la posición de cada gel dentro del montaje de 
electrodos. 
 
 
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3. Colocar los geles en el cuadro de abrazaderas. Cerrar las abrazaderas presionando 
con los dedos índices de cada mano el montaje de los electrodos mientras que con 
los pulgares se cierran las aletas hacia el centro, tal como se observa en el lateral 
del cuadro de abrazaderas. 
 
 
4. Colocar los geles y el cuadro de abrazaderas ensamblado en el tanque de corrida. 
 
 
5. Verter el buffer de corrida en el espacio que queda entre ambos casettes hasta que 
desborde, permitiendo que el espacio entre el cuadro de abrazaderas y el tanque 
se llene hasta aproximadamente 3- 4 cm. desde del fondo del tanque. 
6. Dejar reposar el buffer por unos minutos hasta que le nivel del buffer se estabilice 
entre los vidrios. Si el nivel del buffer no se estabiliza y no se mantiene constante 
retirar el recuadro de abrazaderas sacar los geles y repetir todos los pasos desde el 
punto 2. 
 
 - 43 - 
7. Retirar los peines desde parte superior deslizándolos hacia arriba cuidando de no 
deformar los pocillos de siembra (wells). Completar el nivel de buffer hasta el borde 
superior de los vidrios entre los geles. 
 
 
Preparación y siembra de la muestra 
 
1. Acondicionar cada muestra según la cuantificación de proteínas surgida de la 
cuantificación de Bradford. 
Para una correcta visualización con tinción de Coomassie, debe sembrarse una 
masa de entre 4,5-9 µg de proteína; y el volumen de siembra final debería estar 
entre 15-20 µl, que es volumen que soporta el well. 
2. Crackear las muestras, hirviendo la mezcla de proteínas con buffer muestra a 100° 
C durante 5 minutos. Pasar a hielo y centrifugar unos segundos de modo de bajar 
el agua condensada. 
3. Colocar la guía para siembra y sembrar dentro de los pocillos. Registrar el orden de 
siembra para cada calle. 
 
 
Preparación del equipo e inicio de la corrida 
 
1. Coloque la cubierta del tanque, observando la correspondencia entre los colores de 
los bornes y los orificios de la cubierta. 
2. Conectar los cables, considerando la misma correspondencia observada en el 
punto anterior. 
3. Establecer el voltaje en 100 V e iniciar la corrida (botón “start”). 
4. Dejar correr hasta que observar que el frente de corrida salga del gel. 
 
 
Finalización de la corrida 
 
1. Detener la corrida con el botón de “stop”. 
2. Apagar y desconectar la fuente de poder. Retirar la cubierta. 
3. Retirar el cuadro de abrazaderas del tanque. 
4. Abrir el cuadro de abrazaderas y retirar el montaje de electrodos. 
5. Retirar los geles del montaje de electrodos. Mantener identificado cada gel durante 
todo el proceso. 
6. Eliminar el gel concentrador con la espátula. Identificar el lado de cada gel 
(muesca) 
7. Lavar el gel con agua de la piseta. Despegarlo cuidadosamente del vidrio con el 
chorro de agua y volcarlo en el recipiente para tinición. El gel debe quedar 
extendido y sin arrugas. 
 
 
Tinción del gel 
 
1. Llenar el recipiente para tinción con solución de Coomasie coloidal y cerrar el 
recipiente. 
2. Dejar en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas aproximadamente 
(over night). 
3. Enjuagar con abundante agua. Cambiar el agua sucesivas veces hasta que el 
fondo del gel quede claro. 
 
 - 44 - 
 
 
Registro y análisis de los resultados 
El registro del gel obtenido se realiza fotografiándolo o escaneándolo. Al tenerlo en 
formato digital se puede realizar su análisis (por ejemplo: densitometría) por medio de 
algún software adecuado. 
Para analizar el peso molecular de las proteínas de la muestra, debe sembrarse en 
el mismo gel una mezcla de proteínas de peso molecular conocido denominada calibrador 
o “marcador de peso molecular”. 
Para la mayoría de las proteínas un gráfico de log 10 de la masa molecular vs. 
movilidad relativa arroja un grafico lineal, aunque se debe ser conciente para una 
determinada concentración de gel esta relación es solamente lineal en un rango limitado a 
masas moleculares1. 
Para determinar el peso molecular de una proteína desconocida es necesario 
establecer la relación entre la movilidad relativa (Rf) de las proteínas del estándar de 
proteínas. Para ello, se grafica log del peso molecular (PM) vs. Rf donde: 
 
distancia que recorrió la proteína Rf= 
distancia recorrida por el frenteUna vez construido el gráfico y establecida la relación entre movilidad y masa, 
conociendo el Rf de las proteínas desconocidas puede ser determinado el PM de la 
proteína de interés. 
 
Conservación 
Dado que gel es muy frágil, y se hace difícil su manipulación, es muy conveniente 
secar el gel obtenido. Para ello, luego de enjuagar el gel se lo monta sobre papel secante y 
se cubre con papel de celofán. Se seca durante 1 hora a 80°C, en la secadora con vacío. 
 
 
 
 
 
1 Cabe mencionar que ésta relación se mantiene real para proteínas que unen SDS en una proporción constante. Esto es 
así para muchas proteínas pero algunas otras, por ejemplo aquellas altamente básicas, pueden correr diferente a lo 
esperado según lo que indica su peso molecular conocido. En el caso de las histonas, las cuales son altamente básicas, 
migran mas lentamente de lo esperado, presumiblemente por una reducción total de la carga negativa debido a la alta 
proporción de aminoácidos cargados positivamente. Las glicoproteínas también tienden a correr de forma anormal 
presumiblemente porque el SDS solo se une a la parte polipeptídica de la molécula. 
 
 - 45 - 
ANEXO VII: Determinación relativa pureza por Densitometría 
 
Objetivo y fundamento del método. 
Se utilizará la densitometría para determinar aproximadamente qué porcentaje 
representa una banda determinada en un gel de poliacrilamida, respecto del resto de las 
bandas detectadas en una misma calle. Esto permite comparar la abundancia de una 
determinada proteína en las diferentes calles que tengan sembradas la misma masa de 
proteína total por calle. Es útil por ejemplo, para determinar la eficiencia en la recuperación 
de proteína luego de los procesos de purificación. 
El método se basa en la cuantificación relativa de la señal (en este caso, el ancho 
de la banda) mediante un software de análisis de imágenes. 
 
Procedimiento 
En primer lugar es necesario obtener una imagen del gel de la mayor calidad 
posible. Esto se puede realizar con un fotodocumentador para geles, o bien, un scanner o 
cámara digital convencional con la mayor resolución posible. Además se requiere contar 
algún software adecuado para realizar el análisis de imágenes (e.g.: Image J, Doc-ItLS, 
Image Lab, Scion Image, LabScan). 
A continuación se describe particularmente el procedimiento para utilizar el 
programa de análisis de imágenes Doc-ItLS. 
1. Abrir el programa Doc-ItLS y seleccionar la imagen a analizar, arrastrándola hacia 
la pantalla principal. 
NOTA: En la imagen a analizar NO deben verse bordes en blanco, que no pertenezcan al gel. Puede 
que sea necesario editar la imagen original recortando cualquier superficie de la imagen que no 
corresponda al gel, usando con cualquier programa editor de imágenes, como el Microsoft Office 
Picture Manager o similares. El formato aceptado depende del programa a utilizar, generalmente los 
formatos aceptados son (JPEG, TIFF, GIF, PNG, TGA y BMP). En este caso se utiliza formato JPEG. 
2. Hacer click en “Analisys” en la barra de tareas, “1D análisis/ Lane Tools/ Add Lane”. 
3. Hacer click en “OK”, en la ventana emergente seleccionando la opción “Create 
grayscale image using all chanels”. 
4. Seleccionar, haciendo clic, todas las calles de la imagen blanco y negro generada 
en el punto 3. 
5. Click en “1D análisis/ Masters Tool/ find Lanes and bands”. Se abrirá una ventana 
(ver Figura 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 46 - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Imagen que muestra las opciones que aparecen en el programa Doc-ItLS como opción para análisis 
de imágenes de geles 1D. 
 
En un análisis de rutina, es importante que los parámetros de análisis de imágenes 
se mantengan invariables para evitar incluir errores de apreciación del operario en la 
edición de imágenes. 
Los parámetros a utilizar en la rutina, figuran en la Figura 1. Estos son: 
• Search mode: “Bands Only”. 
• Search options: “Constant lanes witdth across all lanes” y “Force all lanes 
straight”. 
• Search parameters: “Image Background White” y “Bands sensitivity 98.000”. 
• Background correction 255. 
6. Hacer click en “Ok”. 
7. Editar las bandas seleccionando “1D análisis/ Master Tools/ edit Object”. Eliminar 
las bandas autodetectadas que no correspondan haciendo click sobre las mismas, 
y luego presionar la tecla “Supr”. Achicar las bandas que el programa extienda 
excesivamente, seleccionando el borde inferior de cada banda y arrastrándolo 
hasta el tamaño correcto (ver Figura 2). 
 
 
 
 
 
 - 47 - 
 
 
Figura 2: Se muestra una banda seleccionada utilizando la herramienta “Edit objects”. 
 
8. Una vez finalizada la edición de bandas, hacer click en “Analisys/ 1D análisis/ 
Masters Tools/ data explore”. 
9. Clickear en “To Excel”. Y guardar el archivo en el disco rígido de la computadora. 
Por default, el programa proporciona todos los datos detectados en el archivo. 
10. Una vez abierto el archivo de Excel para visualizar los datos, realizar click sobre el 
número “4” ubicado cerca del borde superior izquierdo del archivo como lo muestra 
la Figura 3. Una vez realizado esto los datos se desplegarán. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 48 - 
 
 
Figura 3: Muestra el archivo Excel arrojado por el programa. Un círculo rojo muestra la opción 4 para desplegar 
todos los datos del archivo. 
 
11. Sobre los datos I-VOL obtenidos determinar el porcentaje correspondiente a cada 
banda sobre el total de las bandas en la calle. 
Para ello: sumar el I-VOLtotal por calle (equivalente al 100%), dividir el I-VOL de 
cada banda por el I-VOL total y multiplicarlo por 100. 
 
I-VOLbanda (%)= (I-VOLbanda / I-Voltotal) x 100 
 
El resultado se expresa como porcentaje. 
 
 
 
 
 
 
 
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CEBI 2014 Trabajo Práctico Area de Purificación 
 
TABLA 1 
 
Equipo Medio Pureza Eficiencia Recuperacion DBC 
 % % % mg/ml 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 50 - 
PLANILLA 1 
Fecha: Equipo: 
Cromatografia: 
 
Referencia Dato Fuente Resultado Unidad 
(1) Proteinas Totales Muestra CONTROL CALIDAD (Bradford) mg/ml 
(2) Pureza Muestra CONTROL CALIDAD (SDS-PAGE) % 
(3) Volumen Siembra Medido ml 
(4) PUREZA PICO GFP CONTROL CALIDAD (SDS-PAGE) % 
(5) EFICIENCIA ( (4) / (2) ) x 100 % 
(6) Proteinas Totales Pico GFP CONTROL CALIDAD (Bradford) mg/ml 
(7) Volumen Pico GFP Medido ml 
(8) Masa GFP Recuperada (6) x (7) x (4) mg 
(9) Masa GFP Sembrada (1) x (3) x (2) mg 
(10) RECUPERACION ( (8) / (9) ) x 100 % 
(11) Màximo Pegado de Proteinas (12) x (13) mg 
(12) Proteinas Totales Pico Eluido CONTROL CALIDAD (Bradford) mg/ml 
(13) Volumen Pico Eluido Medido ml 
(14) Volumen Lecho Empacado Medido ml 
(15) DBC (CAPACIDAD DINAMICA) (11)/ (14) mg/ml 
 
 
 - 51 - 
Referencias Bibliográficas 
 
- Becker JM, Caldwell GA, Zachgo EA. (1999). Biotecnología. Curso de Practicas de 
Laboratorio. Ed Acribia, Zaragoza, España. 
- Guía de Trabajos Práctico, Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología. (2006). 
Disponible desde: http://www.ffyb.uba.ar/micro_ind/biot1/tps/gtp2007.doc 
- Manual de operación del sistema Millipore. (2009). Pellicon Laboratory. 
- Najafpour, Ghasem D. (2007). Biochemical engineering and biotechnology. 1st. ed. 
Elsevier, Ámsterdam. 
- Raja Ghosh. (2006). Principles of Bioseparations Engineering. World Scientific, New 
Jersey . 
- “Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing. Principles and Methods”. 
Amersham Bio-Sciences. 2004. 
- “Recombinant Protein Purification Handbook. Principles and Methods”. GE Healthcare 
Bio-Sciences. 2009.