TFG COMPLETO JAVIER LÁZARO

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Exposición a volátiles de planta como 
elicitores de defensas en cítricos. 
Javier Lázaro Mora 
Tutora UCV: Ángela Moreno Gálvez 
Tutores externos: Prof. Alberto Urbaneja y Dra. Meritxell Pérez-Hedo 
4º curso de Biotecnología 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos 
En primer lugar, me gustaría agradecer a mis tutores externos Meritxell y Alberto por 
darme esta oportunidad en la que he aprendido mucho, por dedicarme su tiempo y por 
prestarme su ayuda siempre que la he necesitado. Muchas gracias por vuestro esfuerzo 
y dedicación. 
Agradecer también a la Universidad Católica de Valencia y sus docentes, por 
enseñarme todo lo que sé sobre Biotecnología, y en concreto a Ángela, mi tutora interna, 
por haberme tutorizado, ayudado y guiado de la mejor manera posible durante este 
tiempo. 
Por último, agradecer a mi familia por su dedicación y esfuerzo para que yo pudiera 
estudiar lo que me gustaba y por confiar en mí en todo momento. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Índice de contenido 
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1 
1.1. MECANISMOS DE DEFENSA DE PLANTAS ................................................1 
1.2. VOLÁTILES DE PLANTA COMO ELICITORES DE DEFENSAS ....................2 
1.3. MARCADORES DE LAS PRINCIPALES RUTAS DE DEFENSA ....................3 
1.3.1. RUTA DEL ÁCIDO JASMÓNICO 
1.3.2. RUTA DEL ÁCIDO SALICÍLICO 
1.3.3. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS ESTABLES (SAMPs) 
1.4. CITRICULTURA EN ESPAÑA Y LA COMUNIDAD VALENCIANA ..................7 
1.5. PATRONES CÍTRICOS ...............................................................................8 
1.5.1. CITRANGE CARRIZO 
1.5.2. NARANJO AMARGO 
1.6. PLAGAS DE IMPORTANCIA Y CONTROL BIOLÓGICO EN CULTIVOS DE 
CÍTRICOS ...................................................................................................9 
2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................... 13 
3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 15 
3.1. OBJETIVO PRINCIPAL .............................................................................15 
3.2. OBJETIVOS SECUNDARIOS ....................................................................15 
4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 17 
4.1. MATERIAL VEGETAL ...............................................................................17 
4.2. BIOENSAYOS ...........................................................................................21 
4.3. EXTRACCIÓN DE RNA .............................................................................21 
4.4. TRATAMIENTO CON DNAsa .....................................................................22 
4.5. OBTENCIÓN DE cDNA .............................................................................23 
4.6. qPCR ........................................................................................................23 
4.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ........................................................................24 
5. RESULTADOS .................................................................................................. 25 
 
5.1. RESPUESTA TRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES DEFENSIVOS 
MARCADORES DE LA VÍA SA AGUAS ARRIBA ........................................25 
5.2. RESPUESTA TRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES DEFENSIVOS 
MARCADORES DE LA VÍA SA AGUAS ABAJO ...........................................27 
5.3. RESPUESTA TRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES DEFENSIVOS 
MARCADORES DE LA VÍA JA ...................................................................28 
5.4. RESPUESTA TRANSCRIPCIONAL DE DOS PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS 
ESTABLES ...............................................................................................29 
6. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 31 
 
7. CONCLUSIONES ............................................................................................... 35 
8. LÍNEAS FUTURAS ............................................................................................ 37 
9. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 39 
Índice de figuras 
FIGURA 1. Modelo de interacciones entre plantas e insectos herbívoros y mecanismos 
de defensa química asociados ......................................................................................... 1 
FIGURA 2. El papel del ácido jasmónico (JA) en la respuesta de las plantas al estrés 
abiótico.............................................................................................................................. 4 
FIGURA 3. Dos vías biosintéticas del ácido salicílico en las plantas: la vía de la 
fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) y la vía del isocorismato (IC) .................................... 5 
FIGURA 4. Estructura SAMP .......................................................................................... 7 
FIGURA 5. Piojo rojo de California ............................................................................... 10 
FIGURA 6. Pulgón verde ............................................................................................... 10 
FIGURA 7. Pulgón del algodón ...................................................................................... 10 
FIGURA 8. Plantas citrange Carrizo .............................................................................. 17 
FIGURA 9. Citrange Carrizo........................................................................................... 18 
FIGURA 10. Plantas naranjo amargo ............................................................................ 18 
FIGURA 11. Naranjo amargo ......................................................................................... 19 
FIGURA 12. Cámara de cultivo de patrones ................................................................. 20 
FIGURA 13. Cámara climática con citrange Carrizo (Izquierda) y naranjo amargo 
(Derecha) expuestos a un volátil colocado en la parte superior ................................... 20 
FIGURA 14. Respuesta transcripcional del gen defensivo ICS (gen marcador de la vía 
SA aguas arriba) ............................................................................................................ 26 
FIGURA 15. Respuesta transcripcional del gen defensivo CM1 (gen marcador de la vía 
SA aguas arriba) ............................................................................................................ 26 
FIGURA 16. Respuesta transcripcional del gen defensivo PAL (gen marcador de la vía 
SA aguas arriba) ............................................................................................................ 27 
FIGURA 17. Respuesta transcripcional del gen defensivo NPR1 (gen marcador de la 
vía SA aguas abajo) ...................................................................................................... 28 
FIGURA 18. Respuesta transcripcional del gen defensivo PR5 (gen marcador de la vía 
SA aguas abajo) ............................................................................................................ 28 
FIGURA 19. Respuesta transcripcional del gen defensivo LOX2 (gen marcador de la 
vía JA) ............................................................................................................................ 29 
FIGURA 20. Respuesta transcripcional del péptido estable ant imicrobiano SAMP ..... 30 
FIGURA 21. Respuesta transcripcional del péptido estable antimicrobiano LAMP ..... 30 
 
Índice de tablas 
TABLA 1. Lista decebadores delanteros y reverso de cada gen empleado ............... 24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resumen 
 La liberación de volátiles vegetales inducidos por herbívoros (HIPVs) forma parte 
de una serie de mecanismos de defensa tanto directos e indirectos de las plantas que 
se activan cuando estas son atacadas por artrópodos herbívoros. Los HIPVs son 
capaces de activar mecanismos de defensa en plantas vecinas intactas. En este trabajo 
centrado en los cultivos de cítricos, se investigó si cinco de estos volátiles eran capaces 
de inducir defensas en dos patrones de cítricos como son el naranjo amargo y el citrange 
Carrizo. Para ello, plántulas de 5 meses de edad de ambos patrones se expusieron 
durante 48 horas a [(Z)-3-hexenil propanoato, 1-hexanol, (Z)-3-hexenil butanoato, (Z)-3-
hexenil acetato y metil salicilato]. La activación de defensas se midió estudiando la 
respuesta transcripcional de los genes defensivos ICS, CM1 y PAL (marcadores de la 
vía SA aguas arriba), NPR1 y PR5 (marcadores de la vía SA aguas abajo), LOX2 
(marcador de la vía JA), más dos péptidos estables antimicrobianos (SAMP y LAMP). 
La mayoría de los genes se expresaron con una gran parte de los volátiles ensayados 
en el caso del naranjo amargo activando la vía SA aguas arriba y aguas abajo y la vía 
JA, a excepción de SAMP y LAMP, los cuales presentaron una mayor expresión en 
citrange Carrizo con el volátil (Z)-3-hexenil butanoato [(Z)-3-HB]. Por tanto, naranjo 
amargo mostró una mejor respuesta a la exposición de los volátiles en comparación con 
citrange Carrizo y asimismo experimentó una mayor activación de mecanismos de 
defensa. Estos resultados son el punto de partida para avanzar en el uso de compuestos 
volátiles como elicitores de defensa en los cultivos de cítricos, cuyo interés por su 
potencial para inducir las defensas de las plantas y su aplicación en el campo ha 
aumentado mucho en los últimos años. 
 
Palabras clave: cítricos; patrón; naranjo amargo; citrange Carrizo; elicitores; volátiles; 
HIPVs; genes defensivos; SA, JA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abstract 
The release of herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) is part of a series of 
direct and indirect plant defence mechanisms that are activated when plants are attacked 
by arthropod herbivores. HIPVs are capable of activating defence mechanisms in intact 
neighbouring plants. In this work focused on citrus crops, we investigated which of these 
aforementioned volatiles are able to induce defences in two citrus rootstocks such as 
sour orange and citrange Carrizo, exposing them to five volatiles [(Z)-3-hexenyl 
propanoate, 1-hexanol, (Z)-3-hexenyl butanoate, (Z)-3-hexenyl acetate and methyl 
salicylate] for 48 hours. For this, the transcriptional response of the defensive genes ICS, 
CM1 and PAL (upstream SA pathway markers), NPR1 and PR5 (downstream SA 
pathway markers), LOX2 (JA pathway marker), plus two stable antimicrobial peptides 
(SAMP and LAMP) were studied. Most genes were expressed with a large proportion of 
the volatiles tested in sour orange activating the upstream and downstream SA pathway 
and the JA pathway, with the exception of SAMP and LAMP, which showed higher 
expression in citrange Carrizo with the volatile (Z)-3-hexenyl butanoate [(Z)-3-HB]. 
Therefore, bitter orange showed a better response to volatile exposure compared to C. 
carrizo and also experienced a higher activation of defence mechanisms. These results 
are the starting point to advance the use of volatile compounds as defence elicitors in 
citrus crops, whose interest for their potential to induce plant defences and their 
application in the field has greatly increased in recent years. 
 
Keywords: citrus; rootstock; sour orange; citrange Carrizo; elicitors; volatiles; HIPVs; 
defensive genes; SA, JA. 
Javier Lázaro Mora 
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1. Introducción 
 
1.1. Mecanismos de defensa de plantas 
 
Las plantas se encuentran en una constante interacción con el ecosistema y evitan las 
condiciones adversas mediante sus mecanismos de defensa. Tanto el estrés abiótico 
(sequía, temperaturas extremas, inundaciones, luz intensa o salinidad) como los daños 
mecánicos producen el desarrollo de mecanismos de defensa a modo de protección 
frente a las alteraciones, los cuales conllevan la activación de diversas vías bioquímicas 
que conducen a la liberación de compuestos defensivos o cambios morfológicos 
(Bouagga, 2018). 
Junto con las situaciones de estrés mencionadas anteriormente, las plantas también 
sufren los ataques de patógenos de plantas y artrópodos de herbívoros, siendo los 
insectos los principales invasores (Pérez-Hedo et al. 2021a). Para hacer frente a estas 
amenazas, las plantas han desarrollado una serie de defensas químicas, proteicas y 
estructurales consistentes en la detección de los organismos invasores y su detención 
para evitar que provoquen daños considerables (Kessler, 2017). Las tácticas de defensa 
de las plantas pueden dividirse en dos categorías: las defensas constitutivas, que 
engloban barreras físicas y químicas existentes previo ataque de los insectos, y las 
defensas inducibles, cuya activación se produce tras la detección del ataque de los 
insectos. Se han observado dos tipos de defensas inducibles en las plantas: defensas 
directas y defensas indirectas, mostradas en la Figura 1 (Bouagga, 2018). 
 
Figura 1. Modelo de interacciones entre plantas e insectos herbívoros y mecanismos de defensa química 
asociados. Los insectos que se alimentan por encima y por debajo del suelo se enfrentan a respuestas de 
defensa químicas directas. Las defensas indirectas están representadas por el néctar extra floral que puede 
atraer a los enemigos naturales para defender la planta mediante la emisión de compuestos orgánicos 
volátiles (Bouagga, 2018). 
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Las defensas directas estructurales incluyen todos los rasgos que pueden reforzar la 
capacidad endógena de las plantas para contrarrestar los ataques de los insectos 
afectando a la fisiología y/o el comportamiento de los depredadores, como el desarrollo 
de espinas y/o la formación de una cutícula cerosa. En cuanto a las defensas directas 
químicas, son utilizadas por la planta para contrarrestar a los atacantes mediante la 
producción de toxinas, junto con compuestos antidigestivos y antinutritivos. Las 
defensas indirectas incluyen todos los rasgos que por sí mismos no tienen un impacto 
directo significativo sobre los herbívoros atacantes, pero que pueden atraer a los 
enemigos naturales de dichos herbívoros mediante la producción y emisión de una 
mezcla única de compuestos volátiles (Aljbory y Chen, 2018). 
 
1.2. Volátiles de planta como elicitores de defensas 
 
Los elicitores son sustancias químicas que pueden tener diferentes orígenes y provocar 
una serie de efectos fisiológicos y respuestas morfológicas en las plantas. Estas 
sustancias activan genes y rutas de señales de transducción produciendo especies 
reactivas de oxígeno (ROS), ácido salicílico o ácido jasmónico, lo que desencadena 
respuestas de defensa en las plantas mediante la producción de hormonas defensivas. 
Las plantas que se exponen a diversos elicitores producen una mayor eficacia de 
respuestas frente a factores de estrés (Martínez y Ortega, 2020). En los últimos años, 
el uso de estos elicitores o moléculas inductoras se ha postulado como una gran 
alternativa por la diversidad de compuestos que las plantas generan durante su 
desarrollo y como respuestas frente a situaciones de estrés (García et al. 2018). 
El ataque de artrópodos herbívoros activa diferentes vías metabólicas vinculadas con 
las respuestas defensivas directas e indirectas de las plantas, como las vías del ácido 
salicílico (SA) y jasmónico (JA) que producen la liberación de volátiles vegetales 
inducidos por herbívoros (HIPVs) (Pérez-Hedo et al. 2018a). Algunos deestos volátiles, 
la mayoría de los cuales son terpenoides, derivados de ácidos grasos, fenilpropanoides 
y bencenoides, pueden tanto atraer a los enemigos naturales de dichos artrópodos 
(parasitoides o depredadores), como repeler a los herbívoros y alertar a las plantas 
vecinas (priming) (Pérez Hedo et al. 2018b). Estos HIPVs pueden conseguir además un 
aumento de la productividad de las plantas mediante las interacciones tróficas en la 
defensa de estas (plantas, herbívoros y enemigos naturales), las cuales son de gran 
importancia para acrecentar el control biológico (Pérez-Hedo et al. 2015). 
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Las plantas previamente expuestas a artrópodos herbívoros pueden comunicarse a 
través de estos volátiles con otras plantas intactas para inducir defensas en estas sin 
necesidad de una exposición previa. Las plantas que reciben estas señales de 
advertencia volátiles pueden desencadenar una amplia gama de respuestas defensivas, 
como la producción de inhibidores de la proteinasa (IP), la emisión de compuestos 
volátiles, la producción de alcaloides, la formación de tricomas y la secreción de néctar 
floral adicional (Pérez-Hedo et al. 2021a). 
El interés por las posibles aplicaciones del uso de estos volátiles para inducir las 
defensas de las plantas ha aumentado mucho en los últimos años (Pérez-Hedo et al. 
2021b). 
En este trabajo, investigamos cuáles de los volátiles posteriormente mencionados son 
responsables de inducir las defensas en plantas cítricas, en concreto dos patrones, el 
naranjo amargo y el citrange Carrizo. Al activar las defensas mediante volátiles 
mediremos marcadores de expresión de genes relacionados con la defensa. 
 
1.3. Marcadores de las principales rutas de defensa 
 
La supervivencia de las plantas depende en gran medida de su capacidad de adaptación 
a un entorno variable mediante redes de señalización. Estas redes establecen 
conexiones entre las señales ambientales y las respuestas celulares. Las hormonas 
vegetales ejercen un papel primordial en el establecimiento de redes de señalización 
para regular el crecimiento de las plantas y las respuestas relacionadas con el estrés 
(Ruan et al. 2019). 
 
1.3.1. Ruta del ácido jasmónico 
 
El ácido jasmónico (JA) es una sustancia endógena reguladora del crecimiento que se 
halla en las plantas superiores y se biosintetiza a través de la acción consecutiva de 
enzimas presentes en el cloroplasto, el peroxisoma y el citosol (Ali y Baek, 2020). Junto 
a sus precursores y derivados, denominados jasmonatos (JAs), son moléculas 
importantes en la regulación de muchos procesos fisiológicos que intervienen en el 
crecimiento y desarrollo de las plantas, y, como molécula de señalización, también en 
la mediación de las respuestas defensivas de las plantas al estrés biótico y abiótico al 
que están sometidas (temperatura, sequía, sal, luz, metales pesados y otros factores de 
estrés) mediante la expresión de una serie de genes asociados como el LOX2, junto con 
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otra serie de respuestas moleculares y fisiológicas observadas en la Figura 2 (Wang et 
al. 2020). 
 
Figura 2. El papel del ácido jasmónico (JA) en la respuesta de las plantas al estrés abiótico (Wang et al. 
2020). 
 
Con los estudios en el área de los mecanismos de las redes de señalización hormonal, 
se ha descubierto que el ácido salicílico, el etileno, la auxina y otras hormonas vegetales 
interactúan con JA para regular la adaptación de las plantas al medio ambiente y sus 
respuestas a los diferentes factores de estrés (Ruan et al. 2019). 
 
1.3.2. Ruta del ácido salicílico 
 
El ácido salicílico (SA) es una importante hormona vegetal encargada de regular el 
crecimiento y desarrollo de las plantas, así como la activación de defensas frente a 
estrés biótico y abiótico y la mediación de las respuestas del huésped ante la infección 
de patógenos (Klessig et al. 2018). Su papel en la activación de la defensa de las plantas 
está bien establecido, pero su biosíntesis en las plantas no se conoce del todo (Lefevere 
et al. 2020). 
Se considera que el SA proviene de dos posibles vías, vistas en la Figura 3: la vía ICS 
y la vía PAL, ambas a partir del corismato, precursor de la fenilalanina, la tirosina y el 
triptófano. No obstante, no se han identificado todas las enzimas que catalizan estas 
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vías en las plantas. La corismato mutasa (CM), por ejemplo, es una enzima clave en la 
biosíntesis de SA. Entender la biosíntesis de SA es importante para comprender cómo 
funcionan las respuestas de los patógenos de las plantas y cómo los patógenos pueden 
interferir en ellas (Lefevere et al. 2020). 
 
Figura 3. Dos vías biosintéticas del ácido salicílico en las plantas: la vía de la fenilalanina amoníaco -liasa 
(PAL) y la vía del isocorismato (IC). AAO = aldehído oxidasa; BA2H = ácido benzoico 2 -hidroxilasa; CM = 
corismato mutasa; ICS = isocorismato sintasa; IPL = isocorismato piruvato liasa. Los signos de interrogación 
indican enzimas que se supone que median en la conversión indicada pero que aún no han sido 
identificadas definitivamente (Klessig et al. 2018). 
 
La importancia de ambas vías para la biosíntesis de SA difiere entre las especies 
vegetales, por lo que es difícil hacer generalizaciones sobre la producción de SA que 
abarquen todo el reino vegetal. En Arabidopsis thaliana, por ejemplo, la vía ICS es la 
más importante, mientras que la vía PAL parece ser más importante para la acumulación 
de SA en el arroz. También es posible que ambas vías contribuyan por igual, como 
ocurre en la soja (Lefevere et al. 2020). 
Mientras que la idea de la vía ICS como ruta de producción de SA en las plantas es 
relativamente nueva, la importancia de la vía PAL se conoce desde hace mucho más 
tiempo. Hay que tener en cuenta que PAL es una enzima previa que da lugar a muchos 
otros compuestos posiblemente relacionados con la defensa (Lefevere et al. 2020). 
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Junto con lo mencionado anteriormente, el no expresor de genes PR1 (NPR1) y el gen 
marcador de la resistencia sistémica adquirida (SAR) PR5, ejercen su papel regulador 
en la expresión de los genes aguas abajo a través de la interacción con los factores de 
transcripción. Actualmente, el conocimiento de las complejas redes de regulación y los 
procesos metabólicos después de que las plantas perciban las señales ambientales es 
todavía muy limitado (Ruan et al. 2019). 
 
1.3.3. Péptidos antimicrobianos estables (SAMPs) 
El Huanglongbing de los cítricos (HLB), causado la bacteria Candidatus Liberibacter 
asiaticus (CLas), es la enfermedad más devastadora de los cítricos en todo el mundo. 
Desde el primer informe de HLB en Florida en 2005, la superficie y la producción de 
cítricos en Florida disminuyeron en un 38% y 74%, respectivamente. Aunque todas las 
variedades de cítricos de importancia comercial son susceptibles al HLB, se ha 
observado tolerancia al HLB en algunos híbridos y parientes cercanos de los cítricos 
como por ejemplo en Microcitrus australiasica, Eremocitrus glauca y Poncirus trifoliata) 
(Huang et al. 2020). 
En la actualidad, no existen estrategias eficaces para prevenir la infección ni para curar 
los árboles positivos al HLB, pero mediante el análisis comparativo de la expresión de 
pequeños RNAs y RNAs mensajeros (mRNAs) entre los cultivos sensibles al HLB y los 
híbridos y parientes cercanos de cítricos tolerantes al HLB, se ha conseguido identificar 
una nueva clase de péptidos antimicrobianos estables (SAMPs) (Figura 4) que 
recientemente se ha comprobado que pueden inhibir bacterias en cítricos e inducir la 
inmunidad innata de la planta. SAMP y LAMP no sólo tienen actividad antimicrobiana 
sino que también tienen actividad de cebadores y pueden inducir respuestas de defensa 
sistémica de los cítricos. Esta doble función de los SAMPs puede reducir la presencia 
de CLas y suprimirlos síntomas de la enfermedad en los árboles positivos al HLB, 
además activar las respuestas de defensa sistémica de la planta contra nuevas 
infecciones (Huang et al. 2020). 
Según Huang et al. 2020, en ensayos controlados en invernaderos, SAMP y LAMP no 
sólo redujeron eficazmente CLas y los síntomas de la enfermedad en los árboles 
positivos al HLB, sino que también indujeron la inmunidad innata para prevenir e inhibir 
las infecciones. A diferencia de los antibióticos, los SAMPs son estables al calor, por lo 
que resultan más adecuados para aplicaciones de campo. 
 
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Figura 4. Estructura SAMP, que contiene dos fragmentos α-hélice cortos conectados por una región bisagra 
de prolina con una terminación N y C sueltas. 
 
1.4. Citricultura en España y la Comunidad Valenciana 
 
En España una gran mayoría de la producción de cítricos se exporta para su consumo 
fresco, lo que le convierte en el mayor exportador de cítricos frescos en el mundo con 
más de cuatro millones de toneladas de cítricos exportados y el sexto productor con una 
producción de casi siete millones de toneladas en la campaña 2016/2017 (FAO 2016) 
por lo que se debe ofrecer un producto sin deterioros ni daños y libre de plagas. 
Prácticamente la totalidad de esta producción se concentra en tres comunidades 
autónomas: Andalucía, Comunidad Valenciana y Murcia. En concreto, la Comunidad 
Valenciana ocupa alrededor del 55 % de la superficie total destinada a la producción 
citrícola de toda España (Urbaneja, 2017). 
Es por esto por lo que la sanidad del cultivo es uno de los pilares fundamentales en la 
gestión de plagas. Asimismo, dicha gestión debe suministrar un producto con un mínimo 
de residuos de pesticidas conforme a los requerimientos del mercado internacional. Por 
todo lo mencionado anteriormente, la citricultura española se encuentra en una situación 
óptima para poner en práctica programas de Gestión Integrada de Plagas (GIP) en todo 
el territorio (Bouvet, 2018), lo que ha conducido a que la aplicación de dichos programas 
se multiplicara por cinco en las superficies productoras de cítricos entre 2005 y 2012 en 
la Comunidad Valenciana (Martín y Llorens, 2014). La GIP, cuyo principal objetivo es 
mantener las densidades de plaga de fitófagos por debajo de sus umbrales económicos 
de daños (UED), se basa en la aplicación de una mezcla de métodos biotecnológicos, 
biológicos, químicos y culturales con el objetivo de reducir al mínimo el empleo de 
productos fitosanitarios (Urbaneja et al. 2018). 
 
Javier Lázaro Mora 
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1.5. Patrones cítricos 
 
El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) provoca una de las peores enfermedades 
para este tipo de cultivos, lo que obliga a utilizar patrones resistentes o tolerantes a la 
misma. 
Existen características influidas por el patrón como el desarrollo y la profundidad de las 
raíces, el tamaño del árbol, la calidad y época de maduración del fruto, la cosecha, entre 
otras. Es por esto por lo que no existe un patrón ideal y se deben tomar en consideración 
varios factores a la hora de ser seleccionados para su empleo, escogiendo el patrón que 
mejor se adapte a las condiciones ambientales de una zona concreta, ya que cada uno 
posee sus ventajas y desventajas. Por ello, la citricultura mundial no puede trabajar 
únicamente con un patrón, porque no existe aquel que acumule todas las características 
requeridas por un comportamiento propicio ante las diferentes situaciones de estrés 
bióticas o abióticas (González, 2017). 
Así, en caso de que se produjeran afecciones graves en alguno de los patrones 
seleccionados, no se vería afectado todo el sistema de cultivo. 
 
1.5.1. Citrange Carrizo 
Obtenido en Texas por hibridación de Poncirus trifoliata y el naranjo dulce (González, 
2017), es el principal patrón utilizado en la citricultura española, y actualmente es el más 
empleado para naranjos, mandarinos y pomelos. 
Es resistente al virus de la tristeza de los cítricos y a la cachexia, pero sensible a la 
enfermedad exocortis, que se caracteriza por la aparición de escamas y grietas en la 
corteza, manchas amarillas en los brotes tiernos y enanismo, producida por el viroide 
de la exocortis de los cítricos, y al nematodo de los cítricos Tylenchulus semipenetrans. 
En cambio, es resistente al nematodo Radopholus similis y presenta tolerancia a 
Phytophthora spp. También presenta tolerancia al frío y es el más tolerante al 
encharcamiento, pero es sensible a la clorosis férrica inducida en terrenos calizos y 
presenta gran sensibilidad a la salinidad (Aleza et al 2020). 
Este patrón es compatible con variedades de mandarino, naranjo dulce y pomelo e 
incompatible con el limonero. Se obtienen plantas uniformes y de buen vigor en vivero, 
además de frutas de gran tamaño y alta calidad de las mismas, presentando una gran 
productividad (Aleza et al. 2020). 
 
Javier Lázaro Mora 
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1.5.2. Naranjo amargo 
De origen asiático, el naranjo amargo es un híbrido entre Citrus máxima y Citrus 
reticulata. Empleado como patrón para todas las especies, desde 1968 y como 
consecuencia de la aparición del virus de la tristeza, se utiliza principalmente como 
patrón de limoneros. Esta enfermedad le provoca la muerte cuando es injertado en 
naranjo dulce, mandarina, limero y pomelo, pero no en limonero (González, 2017). 
Este patrón es muy utilizado esencialmente por dos características importantes que 
posee: los escasos problemas que genera al injertarlo y el gran desarrollo que presenta 
en sus primeros instantes tanto en semillero como en invernadero. Estas extraordinarias 
cualidades fueron las responsables de la gran expansión que llegó a adquirir el naranjo 
amargo, alcanzando el 95% de la superficie de la cuenca mediterránea (González, 
2017). 
 
1.6. Plagas de importancia y control biológico en cultivos de cítricos 
 
En la citricultura española se han citado más de 90 fitófagos potencialmente plaga, pero 
únicamente unos 15 de estos alcanzan la categoría de especie plaga. Según el grado 
de control que ejercen sus enemigos naturales (excelente, satisfactorio o insuficiente), 
estos se agrupan en: fitófagos secundarios, plagas ocasionales y plagas clave 
(Urbaneja, 2017). Las plagas claves en estos cultivos son algunas especies de 
artrópodos sobre las que se centran la mayoría de los estudios como la mosca 
mediterránea de la fruta Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae), el piojo 
rojo de California Aonidiella aurantii (Maskell) (Hemiptera: Diaspididae) (Figura 5), la 
araña roja Tetranychus urticae (Koch) (Prostigmata: Tetranychidae) en clementinos y 
los pulgones Aphis spiraecola (Patch) (Hemiptera: Aphididae) (Figura 6) y Aphis gossypii 
(Glover) (Hemiptera: Aphididae) (Figura 7) en clementinos y plantas jóvenes (Tena et 
al. 2016). 
 
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10 
 
 
Figura 5. Piojo rojo de California Aonidiella aurantii Maskell (Hemiptera: Diaspididae) (Bouvet, 2018). 
 
 
Figura 6. Pulgón verde Aphis spiraecola Patch (Hemiptera: Aphididae) (Bouvet, 2018). 
 
 
Figura 7. Pulgón del algodón Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae) (Bouvet, 2018). 
 
Javier Lázaro Mora 
11 
 
Como en otras zonas citrícolas, en España, el mayor riesgo para los cítricos es la 
introducción de plagas exóticas. Por desgracia, este proceso se ve intensificado con el 
cambio climático y el aumento del comercio internacional. En lo que a nuestra citricultura 
se refiere, en los últimos doce años se ha aclimatado una nueva plaga exótica o 
emergente cada 2-3 años. La gestión de plagas ha evolucionado desde las prácticas 
dominantes de los plaguicidas hasta la gestión integrada asentada en el uso de agentes 
de control biológico. El uso de enemigos naturales exóticos como parte del control 
biológico se está empleando cada vez con más frecuencia en cultivos como los de 
cítricos. Esta introducción intencionada de enemigosnaturales para su establecimiento 
y control de la plaga a largo plazo se conoce como control biológico clásico (Urbaneja 
et al. 2020). 
Este método está en auge en la citricultura española al observar que los enemigos 
naturales autóctonos no resultaron eficaces frente a dos de las últimas plagas exóticas 
que colonizaron los cítricos españoles, el psílido Trioza erytreae (Del Guercio) 
(Hemiptera: Triozidae) y el cotonet Delottococcus aberiae (De Lotto) (Hemiptera: 
Pseudococcidae) (Pérez-Rodríguez et al. 2019). 
Un elevado porcentaje de plagas registradas en los cultivos son especies invasoras, por 
ello, se ha llegado a la conclusión de que los enemigos naturales que se emplean para 
su control deberán provenir del mismo lugar de origen para que sean más efectivos. 
Además, el efecto del control biológico utilizado deberá ser duradero en el tiempo pese 
a no eliminar la plaga al completo (Cock et al. 2016). Junto con el conocimiento del rango 
de presas que tienen los depredadores, también es importante comprender el efecto 
que tienen las presas sobre el rendimiento de estos. La calidad y el tipo de presa son 
factores de gran importancia en la supervivencia, la reproducción y el desarrollo de los 
enemigos naturales (Schuldiner y Coll, 2017). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. Justificación 
 
Los enfoques de regulación de plagas en los cítricos mediterráneos tienden a ser mucho 
más sostenibles en comparación con muchas otras zonas productoras de cítricos del 
mundo (Urbaneja et al. 2020). El uso restringido de ingredientes activos ha estimulado 
el desarrollo de estrategias de control biológico de conservación que tienen como 
objetivo conservar los enemigos naturales dentro del sistema y aprovechar sus servicios 
de regulación de plagas. Estos programas se centran en minimizar el uso de plaguicidas 
y son fundamentales para satisfacer las demandas de los consumidores de cítricos de 
alta calidad sin residuos de plaguicidas. Desafortunadamente, los enfoques de manejo 
sostenible de plagas en el Mediterráneo se ven interrumpidos periódicamente por la 
invasión de plagas exóticas. La necesidad urgente de manejar estas plagas exóticas 
compromete el manejo sostenible de plagas. Por tanto, es fundamental encontrar 
alternativas eficaces pero sostenibles a los insecticidas en los cítricos. 
Como ya se mencionó anteriormente, el uso de defensas de plantas inducidas por 
volátiles para el manejo de plagas de cultivos aún no se ha explotado. Trabajos previos 
en tomate (Pérez-Hedo et al 2021a, b) han abierto las puertas para que esta novedosa 
técnica se aplique en otros cultivos agrícolas, como es el caso de los cítricos, donde 
hasta la fecha no se ha explorado cómo las defensas de las plantas inducidas por HIPVs 
pueden mediar las respuestas en plagas y enemigos naturales de los cítricos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3. Objetivos 
 
3.1. Objetivo principal 
 
Por tanto, el objetivo principal de este trabajo será analizar el efecto de la exposición de 
cinco volátiles, (Z)-3-hexenil propanoato, 1-hexanol, (Z)-3-hexenil butanoato, (Z)-3-
hexenil acetato y metil salicilato en la respuesta defensiva de dos patrones de cítricos, 
el naranjo amargo y el citrange Carrizo. 
 
3.2. Objetivos secundarios 
 
Para ello, se analizarán los siguientes objetivos parciales: 
 
1. La respuesta transcripcional de genes defensivos relacionados con hormonas 
vegetales relacionadas con defensas como son ICS, CM1 y PAL (marcadores 
de la vía SA aguas arriba), NPR1 y PR5 (marcadores de la vía SA aguas abajo) 
y LOX2 (marcador de la vía JA). 
 
2. La respuesta transcripcional de dos péptidos estables antimicrobianos (SAMP y 
LAMP), los cuales se ha visto recientemente que pueden inhibir bacterias en 
cítricos e inducir la inmunidad innata de la planta. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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4. Materiales y métodos 
 
4.1. Material vegetal 
 
Las dos especies vegetales utilizadas en este trabajo pertenecen a la familia Rutácea y 
son utilizadas comúnmente como patrones en la citricultura mediterránea: citrange 
Carrizo (Citrus sinensis x P. trifoliata) (Figuras 8 y 9) y naranjo amargo (Citrus x 
aurantium) (Figuras 10 y 11). De cada especie se seleccionaron 48 plantas, las cuales 
fueron expuestas a cinco volátiles de planta ((Z)-3-hexenil propanoato, 1-hexanol, (Z)-
3-hexenil butanoato, (Z)-3-hexenil acetato y metil salicilato). Todos los tratamientos de 
inducción se compararon con un tratamiento control. 
 
Figura 8. Plantas citrange Carrizo (IVIA). 
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Figura 9. Citrange Carrizo (IVIA). 
 
 
Figura 10. Plantas naranjo amargo (IVIA). 
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Figura 11. Naranjo amargo (IVIA). 
 
Las plantas de los diferentes patrones se encontraban en una cámara de cultivo (Figura 
12) a 25 ± 2ºC, con una humedad relativa de 65 ± 10% y un fotoperiodo de 14:10 h (L:D) 
cuando se seleccionaron para su exposición al volátil correspondiente mediante un 
dispensador polimérico (Pérez-Hedo et al. 2021b). Para cada combinación volátil-
patrón, se colocaron ocho plantas de 5 meses de edad en una cámara climática (Figura 
13) en la que se puso el volátil en la parte superior, resultando en un total de 96 
muestras. Las cámaras que contenían las plantas y el volátil determinado se 
mantuvieron aisladas y sin tocar durante 48 horas para evitar la interferencia de volátiles 
y se mantuvieron a 25 ± 2ºC, con una humedad relativa de 65 ± 10% y un fotoperiodo 
de 14:10 h (L:D). 
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Figura 12. Cámara de cultivo de patrones (IVIA). 
 
 
Figura 13. Cámara climática con citrange Carrizo (Izquierda) y naranjo amargo (Derecha) expuestos a un 
volátil colocado en la parte superior (IVIA). 
 
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21 
 
4.2. Bioensayos 
 
Pasadas las 48h dentro de las cámaras se cortó por la zona apical de las plantas 
tratando de conseguir las hojas más jóvenes. Para el proceso de corte se necesitaron 
unas tijeras, papel de aluminio, guantes, nitrógeno líquido y bolsas de plástico 
correctamente etiquetadas con el nombre del patrón (citrange Carrizo o naranjo 
amargo), el tratamiento correspondiente (control o volátil), la fecha en la que se cortó y 
el tiempo transcurrido desde su entrada en las cámaras hasta el momento del corte 
(48h). 
Una vez cortada la zona apical, se envolvio en un trozo de papel de aluminio y se 
introdujo rápidamente en nitrógeno líquido. Dicho proceso se realiza de esta manera 
porque en el momento del corte se genera un daño en la planta, provocando en ella la 
activación de una serie de defensas y reacciones que se quieren frenar, ya que lo que 
interesa comprobar es el efecto del volátil sobre la misma. Tras este proceso, se 
colocaron las bolsas de plástico que contenían cada una de las partes cortadas y 
envueltas como se ha indicado anteriormente, en un congelador a -80ºC para 
mantenerlas intactas hasta el momento de proceder a la extracción de RNA. 
 
4.3. Extracción de RNA 
 
Al comenzar este proceso se necesitó nitrógeno líquido para mantener las muestras y 
poder triturarlas sin que se activasen las defensas y reacciones mencionadas en el 
apartado anterior. Se trituraron con un mortero (CoorsTek, CO, USA) hasta conseguir 
una textura arenosa y se pasaron a tubos de microcentrífuga de 2 ml (Eppendorf, HAM, 
Alemania), llenándolosaproximadamente hasta los 700 l. A estos tubos se les añadió 
1ml de Trizol (NZYTech, LIS, Portugal) se les aplicó un vórtex (Heidolph, Schwabach, 
Alemania) para homogeneizar las muestras y se incubaron 5 minutos a temperatura 
ambiente. Para quitar el material insoluble del homogeneizado se centrifugó (Hettich, 
Westfalia, Alemania) a 13.000 rpm a 4ºC durante 5 minutos y después se transfirió el 
sobrenadante de cada tubo a uno nuevo debidamente etiquetado para realizar la 
separación de fases. Para esto se añadieron 300 l de cloroformo (Sigma-Aldrich, MO, 
USA) y se aplicó de nuevo un vórtex de unos 10-15 segundos. A continuación se volvio 
a centrifugar una vez más a 13.000 rpm a 4ºC durante 5 minutos y se llevó a cabo la 
precipitación del RNA, para lo cual en primer lugar, lo que se hizo fue transferir el 
sobrenadante a un nuevo tubo de 1’5ml ahora. A estos tubos se les añadieron 350 l de 
Isopropanol (PanReac AppliChem, IL, USA) y 350 l de 1’2 M NaCl y se mezclaron por 
Javier Lázaro Mora 
22 
 
inversión triple antes de ser incubados de nuevo a temperatura ambiente, esta vez 
durante 10 minutos. Se centrifugó de nuevo a 13.000 rpm a 4ºC durante 15 minutos en 
esta ocasión y posteriormente de desechó el sobrenadante para quedarnos con el soluto 
(pellet), que es el RNA extraído de las muestras. Para llevar a cabo el lavado del RNA 
se añadieron 500 l de etanol al 70% (VWR Chemicals, PA, USA) al pellet y se centrifugó 
a 10.000 rpm a 4ºC durante 1 minuto. Este proceso de lavado del RNA se repitió en dos 
ocasiones antes de dejar secar el pellet en una estufa (JP Selecta S.A., Barcelona, 
España) a 37ºC durante 15 minutos. Una vez secado y eliminados todos los restos de 
etanol, se resuspendió el pellet en unos 25 l (dependiendo de la calidad y cantidad del 
pellet) de Nuclease-free water (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) mezclando con la 
micropipeta (Gilson, Val-d’Oise, Francia) hasta conseguir una textura completamente 
líquida. Por último, se realizó la cuantificación de RNA midiendo en un NanoDrop 
(Thermo Fisher Scientific, MA, USA) cogiendo 1’5 l de la muestra con la micropipeta. 
Para las siguientes etapas se necesita partir de una concentración de 1000 ng/l, por 
tanto, en los casos en los que no se obtuvo dicha concentración se realizó una dilución 
hasta conseguir el valor deseado. Una vez terminada la medición de las muestras, se 
volvieron a guardar a -80ºC hasta el siguiente paso. 
 
4.4. Tratamiento con DNAsa 
 
Para poder hacer una limpieza de posibles trazas de DNA genómico se le aplicó a las 
muestras un tratamiento con DNAsa. Lo primero que se hizo fue, en tubos de 
microcentrífuga de 1’5 ml, preparar para cada muestra 5’6 l de RNA + H2O (1 l + 4,6 
l), 0’7 l de DNAsa Turbo (Invitrogen, CA, USA) y 0’7 l de Buffer 10X (Invitrogen, CA, 
USA) e incubarlos en la estufa a 37ºC durante 30 minutos en una gradilla metálica 
(Auxilab, Navarra, España). Pasado este tiempo se añadieron 0’7 l de DNAsa 
Inactivation Reagent (Invitrogen, CA, USA) a los tubos para parar la reacción. Una vez 
añadido el inhibidor, se incubaron los tubos a temperatura ambiente durante dos minutos 
mientras se agitaban con la mano 2-3 veces y posteriormente se centrifugaron a 
temperatura ambiente a 10.000 rpm durante 1 minuto y medio. Al sacarlos de la 
centrífuga se recuperaron con micropipeta 7 l en tubos para PCR (Nest Biotechnology, 
Jiangsu, China) colocados en una gradilla específica Cryo-Safe cooler (Eppendorf, 
HAM, Alemania), con mucho cuidado de no coger el gel formado en la centrifugación 
(pellet), y se guardaron a -80ºC en una gradilla para almacenamiento de tubos de PCR 
(Thermo Fisher Scientific, MA, USA) hasta que fueron utilizados para el siguiente 
proceso. 
Javier Lázaro Mora 
23 
 
 
4.5. Síntesis de cDNA 
 
Para llevar a cabo la síntesis de cDNA, a cada muestra se le añadió 0’5 l de PrimeScript 
RT Enzyme Mix I + 0’5 l de Oligo dT Primer (10 M) + 2 l de 5X PrimeScript Buffer 
(for Real Time) (Takara, Kusatsu, Japan). Esto resultó en un volumen total por muestra 
de 10 l (7 l + 3 l). Lo siguiente fue incubar en un termociclador (Applied Biosystems, 
CA, USA) a 37ºC durante 15 minutos y a 85ºC durante 5 segundos, se transfirieron los 
tubos inmediatamente a hielo y se guardaron a -20ºC en una gradilla. 
 
4.6. qPCR 
 
Como se ha descrito en los apartados anteriores, se partió de un cDNA con una 
concentración de 1000 ng/l. En tubos de microcentrífuga de 1’5 ml se realizaron las 
siguientes diluciones seriadas para la realización de la recta patrón para cada gen 
estudiado: en el primer tubo (1) se introdujo un mix con 1 l de cada muestra, en el 
segundo tubo (1/10) se introdujeron 3 l del primer tubo + 27 l de H2O, en el tercer tubo 
(1/100) se introdujeron 3 l del segundo tubo + 27 l de H2O y en el cuarto tubo (1/1000) 
se introdujeron 3 l del tercer tubo + 27 l de H2O. 
La reacción de qPCR SYBR GREEN cuantitativa se realizó con el detector de secuencia 
LightCycler 480 System (Roche Life Science, Penzberg, Alemania) descrito por Pérez-
Hedo et al. 2015. Utilizando condiciones de qPCR estándar y el uso de cebadores 
específicos. 
En cada pocillo de la placa debía haber una cantidad de 9 l (5 l de NZYSpeedy qPCR 
Green Master Mix (2x) (NZYTech, Lisboa, Portugal) + 0’5 l de Primer Forward y Primer 
Reverse a una concentración de 10mM, cuyas secuencias se pueden observar en la 
Tabla 1) + 1 l de la muestra. Además, en la placa se puso un control negativo con 9 l 
de mix + 1 l de H2O. 
 
 
 
 
 
Javier Lázaro Mora 
24 
 
Tabla 1. Lista de cebadores delanteros y reverso de cada gen empleado. 
Gen Cebador delantero 5′→3′ Cebador reverso 5′→3′ 
GAPDH GGAAGGTCAAGATCGGAATCAA CGTCCCTCTGCAAGATGACTCT 
ICS GGAGGAGGAGAGAGTGAATTTG GGGTTGCTTCCTTCTACTATCC 
CM1 CATGAAACTGGAGGGCATAAGA CGTTGTCCGTCTATGGTGAAA 
PAL CACATTCTTGGTAGCGCTTTG AGCTACTTGGCTGACAGTATTC 
NPR1 GTACCTTGAAAACAGAGTTGGACTGG TGCTCCTCTTGCATTTTGAAAGGTG 
PR5 TACCTCCACCTCTCTCATTCTT GTGCGAGAGAAGGTTAGCTATG 
LOX2 GAACCATATTGCCACTTTCG CGTCATCAATGACTTGACCA 
SAMP AACAGGGGCAAGAATGTGAGCAT ACACGTACTGTTGTCAAGGC 
LAMP ATTGAACCCATGAAGTCTTTCCAATG CGTATTCAACATGTGCCGGAT 
 
El proceso de la reacción de qPCR consistió en una serie de cambios de temperatura 
repetidos en torno a 40 veces, llamados ciclos, cada uno con una serie de etapas: 
1) Pre-incubación a 95ºC durante dos minutos que permitió separar los ácidos 
nucleicos de doble cadena. 
2) Amplificación de la secuencia objetivo con cambios de temperatura (95ºC - 
15segs; 56ºC - 20segs y 72ºC – 15segs) durante 40 ciclos, permitiendo así el 
alineamiento de los cebadores al ADN molde. 
3) Curva fusión con cambios de temperatura (95ºC - 5segs; 65ºC – 1min y 97ºC – 
continuo) durante un ciclo en la que el colorante SYBR Green I se unió a cada 
nueva copia de ADN bicatenario. 
4) Última etapa de enfriamiento a 40 grados durante 30segs y un ciclo. 
 
4.7. Análisis estadístico 
 
Los resultados de las respuestas transcripcionales con marcadores se normalizaron 
usando una transformación logarítmica cuando fue necesario en el caso de no ser 
normales (test de Kolmogorov-Smirnov) y luego se analizaron usando un ANOVA de 
una vía seguido de la comparación de medias. Debido al interés de cada uno de los 
volátiles se aplicó un test de Dunnet entre cada media de cada uno de los tratamientos 
respecto al control. Los valores se muestran como la media ± el error estándar. 
Javier Lázaro Mora 
25 
 
5. Resultados 
 
5.1. Respuesta transcripcional de los genes defensivos marcadores 
de la vía SA aguas arriba 
Se observó una sobreexpresión de los tres genes defensivos marcadores de la vía 
SA aguas arriba estudiados en las plantas expuestas a los volátiles en las figuras 
14, 15 y 16, bien en uno de los patrones solamente como se aprecia en las figuras 
14 y 15 o bien en ambos patrones como se muestra en la figura 16. 
La expresión deICS fue significativamente mayor tras la exposición a todos los 
volátiles en el caso del patrón naranjo amargo (Figura 14, izquierda), en 
comparación con el tratamiento control (p < 0,0001). Sin embargo, en cuanto a la 
expresión de ICS en el patrón citrange Carrizo (Figura 14, derecha) tras ser expuesto 
a todos los volátiles ensayados, no se observó dicha expresión con ninguno de los 
volátiles empleados comparados con el control (p = 0,6289). 
También se puede observar como la expresión del gen CM1 fue notablemente 
superior en el patrón naranjo amargo (Figura 15, izquierda) tras su exposición a 
todos los volátiles (p = 0,0014), con la excepción del volátil (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-
3-HA]. En cambio, como ocurrió con el gen ICS, el gen CM1 en el patrón citrange 
Carrizo (Figura 15, derecha) tampoco se expresó con ninguno de los volátiles 
respecto al control (p = 0, 0033). 
En lo referente a la expresión de PAL, en el patrón naranjo amargo (Figura 16, 
izquierda) sucedió lo mismo que en la expresión de CM1 mencionada en el párrafo 
anterior, siendo superior al exponerlo a todos los volátiles (p < 0.0001), salvo en el 
volátil (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA]. En este caso, la expresión de PAL en el 
patrón citrange Carrizo (Figura 16, derecha) se vio incrementada únicamente con la 
exposición de éste a los volátiles 1-hexanol [(Z)-3-HL] y (Z)-3-hexenil butanoato [(Z)-
3-HB] (p < 0.0001). 
Javier Lázaro Mora 
26 
 
 
Figura 14. Respuesta transcripcional del gen defensivo ICS (gen marcador de la vía SA aguas arriba) en 
naranjo amargo (izquierda) y en citrange Carrizo (derecha) expuestos a 1-hexanol [(Z)-3-HL], (Z)-3-hexenil 
butanoato [(Z)-3-HB], (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP], (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA] y metil salicilato 
[MeSa]. 
 
 
Figura 15. Respuesta transcripcional del gen defensivo CM1 (gen marcador de la vía SA aguas arriba) en 
naranjo amargo (izquierda) y en citrange Carrizo (derecha) expuestos a 1-hexanol [(Z)-3-HL], (Z)-3-hexenil 
butanoato [(Z)-3-HB], (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP], (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA] y metil salicilato 
[MeSa]. 
 
Control (Z)-3-HL (Z)-3-HB (Z)-3-HP (Z)-3-HA MeSA
0
10
20
30
40
ICS_AMARGO
E
x
p
re
s
ió
n
 r
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la
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v
a
 I
C
S
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A
P
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H
*
*
*
*
*
Control (Z)-3-HL (Z)-3-HB (Z)-3-HP (Z)-3-HA MeSA
0
10
20
30
40
ICS_CARRIZO
E
x
p
re
s
ió
n
 r
e
la
ti
v
a
 I
C
S
/G
A
P
D
H
Control (Z)-3-HL (Z)-3-HB (Z)-3-HP (Z)-3-HA MeSA
0
2
4
6
CM1_AMARGO
E
x
p
re
s
ió
n
 r
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v
a
 C
M
1
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A
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D
H
*
*
**
Control (Z)-3-HL (Z)-3-HB (Z)-3-HP (Z)-3-HA MeSA
0
2
4
6
CM1_CARRIZO
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la
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v
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 C
M
1
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A
P
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H
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27 
 
 
Figura 16. Respuesta transcripcional del gen defensivo PAL (gen marcador de la vía SA aguas arriba) en 
naranjo amargo (izquierda) y en citrange Carrizo (derecha) expuestos a 1-hexanol [(Z)-3-HL], (Z)-3-hexenil 
butanoato [(Z)-3-HB], (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP], (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA] y metil salicilato 
[MeSa]. 
 
5.2. Respuesta transcripcional de los genes defensivos marcadores 
de la vía SA aguas abajo 
En este aspecto, se pudo observar una sobreexpresión de los dos genes defensivos 
marcadores de la vía SA aguas abajo estudiados en las plantas expuestas a los volátiles 
en las figuras 17 y 18, tanto en uno de los patrones únicamente conforme está 
representado en la figura 17, como en ambos patrones según se muestra en la figura 
18. 
Por lo que respecta a la expresión de NPR1, se vio claramente aumentada en naranjo 
amargo (Figura 17, izquierda) al ser expuesto a todos los volátiles, sin excepción, 
comparando con el tratamiento control (p = 0,0051). No obstante, el gen NPR1 en 
citrange Carrizo (Figura 17, derecha) no se expresó con ninguno de los volátiles 
ensayados (p = 0,6148). 
En referencia a la expresión del gen PR5, en el patrón naranjo amargo (Figura 18, 
izquierda) se observó una sobreexpresión al exponerlo al volátil (Z)-3-hexenil 
propanoato [(Z)-3-HP], al contrario de lo ocurrido con la exposición al volátil metil 
salicilato [MeSa], la cual fue claramente inferior respecto al tratamiento control (p < 
0.0001). Asimismo, la expresión de PR5 en el patrón citrange Carrizo (Figura 18, 
derecha) también aumentó exclusivamente al ser expuesto al volátil (Z)-3-hexenil 
propanoato [(Z)-3-HP] (p = 0,0210). 
 
Control (Z)-3-HL (Z)-3-HB (Z)-3-HP (Z)-3-HA MeSA
0
1
2
3
4
PAL_AMARGO
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 P
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* *
**
Control (Z)-3-HL (Z)-3-HB (Z)-3-HP (Z)-3-HA MeSA
0
1
2
3
4
PAL_CARRIZO
E
x
p
re
s
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 r
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 P
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L
/G
A
P
D
H
*
*
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28 
 
 
Figura 17. Respuesta transcripcional del gen defensivo NPR1 (gen marcador de la vía SA aguas abajo) en 
naranjo amargo (izquierda) y en citrange Carrizo (derecha) expuestos a 1-hexanol [(Z)-3-HL], (Z)-3-hexenil 
butanoato [(Z)-3-HB], (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP], (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA] y metil salicilato 
[MeSa]. 
 
 
Figura 18. Respuesta transcripcional del gen defensivo PR5 (gen marcador de la vía SA aguas abajo) en 
naranjo amargo (izquierda) y en citrange Carrizo (derecha) expuestos a 1-hexanol [(Z)-3-HL], (Z)-3-hexenil 
butanoato [(Z)-3-HB], (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP], (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA] y metil salicilato 
[MeSa]. 
 
5.3. Respuesta transcripcional del gen defensivo marcador de la vía 
JA 
En este punto, se apreció una sobreexpresión del gen defensivo marcador de la vía JA 
estudiado en las plantas expuestas a los volátiles en la figura 19. En tal caso, 
únicamente se pudo observar dicha sobreexpresión en el patrón naranjo amargo (Figura 
19, izquierda), en el cual, tras su exposición a todos los volátiles, el gen LOX2 se expresó 
considerablemente con la excepción del volátil (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA] (p = 
0,0020). En cambio, el gen LOX2 en citrange Carrizo (Figura 19, derecha) no se expresó 
con ninguno de los volátiles empleados (p = 0,3834). 
Control (Z)-3-HL (Z)-3-HB (Z)-3-HP (Z)-3-HA MeSA
0.0
0.5
1.0
1.5
NPR1_AMARGO
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Figura 19. Respuesta transcripcional del gen defensivo LOX2 (gen marcador de la vía JA) en naranjo 
amargo (izquierda) y en citrange Carrizo (derecha) expuestos a 1-hexanol [(Z)-3-HL], (Z)-3-hexenil 
butanoato [(Z)-3-HB], (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP], (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA] y metil salicilato 
[MeSa]. 
 
5.4. Respuesta transcripcional de dos péptidos antimicrobianos 
estables 
En cuanto a la respuesta transcripcional de los dos péptidos antimicrobianos 
estables, se observó una sobreexpresión de ambos péptidos estudiados en las 
plantas expuestas a los volátiles en las figuras 20 y 21, siendo la misma en los dos 
casos y patrones. 
Se vio como el SAMP en el patrón naranjo amargo (Figura 20, izquierda) no se 
expresó con ninguno de los volátiles ensayados en comparación con el tratamiento 
control (p = 0,0567). Sin embargo, se pudo apreciar una clara sobreexpresión del 
SAMP en citrange Carrizo (Figura 20, derecha) pero únicamente tras exponerlo al 
volátil (Z)-3-hexenil butanoato [(Z)-3-HB] (p < 0.0001). 
En lo referente a la expresión de LAMP, se observó la misma expresión que en 
SAMP, mencionada en el párrafo anterior. Por lo que, en naranjo amargo (p = 
0,2314) (Figura 21, izquierda) no se produjo expresión con ninguno de los volátiles 
utilizados, mientras que en citrange Carrizo(Figura 21, derecha) la expresión de 
LAMP aumentó tras la exposición del patrón a (Z)-3-hexenil butanoato [(Z)-3-HB] (p 
= 0,0004). 
Control (Z)-3-HL (Z)-3-HB (Z)-3-HP (Z)-3-HA MeSA
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Figura 20. Respuesta transcripcional del péptido estable antimicrobiano SAMP en naranjo amargo 
(izquierda) y en citrange Carrizo (derecha) expuestos a 1-hexanol [(Z)-3-HL], (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-
HA], (Z)-3-hexenil butanoato [(Z)-3-HB], (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP] y metil salicilato [MeSa]. 
 
 
Figura 21. Respuesta transcripcional del péptido estable antimicrobiano LAMP en naranjo amargo 
(izquierda) y en citrange Carrizo (derecha) expuestos a 1-hexanol [(Z)-3-HL], (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-
HA], (Z)-3-hexenil butanoato [(Z)-3-HB], (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP] y metil salicilato [MeSa]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Control (Z)-3-HL (Z)-3-HA (Z)-3-HB (Z)-3-HP MeSA
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6. Discusión 
En este trabajo se comprueba la eficacia de cinco volátiles de origen vegetal inducidos 
por herbívoros (HIPVs) (Pérez-Hedo et al. 2018a), 1-hexanol, (Z)-3-hexenil butanoato, 
(Z)-3-hexenil propanoato, (Z)-3-hexenil acetato y metil salicilato en comparación con un 
tratamiento control, en inducir respuestas defensivas en dos patrones de cítricos, 
naranjo amargo y citrange Carrizo. Para ello, se ha medido el estudio de la respuesta 
transcripcional de los genes defensivos ICS, CM1 y PAL (marcadores de la vía SA aguas 
arriba) (Klessig et al. 2018, Lefevere et al. 2020), NPR1 y PR5 (marcadores de la vía SA 
aguas abajo), LOX2 (marcador de la vía JA) (Ruan et al. 2019, Wang et al. 2020), más 
dos péptidos estables antimicrobianos (SAMP y LAMP) (Huang et al. 2020). Así como 
los factores bióticos y abióticos activan rutas metabólicas que producen el desarrollo de 
mecanismos de defensa (Bouagga, 2018), en este ensayo se ha buscado producir el 
mismo efecto mediante el uso de los volátiles, los cuales se seleccionaron al ser 
emitidos por las plantas después de la actividad de alimentación de los depredadores 
zoófagos según se describe en Pérez-Hedo et al. (2018b). 
Curiosamente, según Pérez-Hedo et al. (2018b), después de la exposición a HIPVs, el 
número de volátiles que se desencadenan en esas plantas expuestas es 
significativamente mayor que los detectados en las plantas de tomate picadas por 
míridos zoofitófagos. En Pérez-Hedo et al. (2021 a) por ejemplo, en el caso de las 
plantas expuestas al (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP], veintidós volátiles fueron 
notablemente más abundantes en comparación con las plantas no expuestas y 
diecinueve volátiles en el caso de las plantas expuestas al metil salicilato [MeSa]. 
Los resultados presentados muestran como los genes marcadores de la vía SA aguas 
arriba ICS, CM1 y PAL se sobreexpresan con los volátiles 1-hexanol [(Z)-3-HL], (Z)-3-
hexenil butanoato [(Z)-3-HB], (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP] y metil salicilato 
[MeSa] en naranjo amargo. Además, el gen ICS también se sobreexpresa empleando 
el volátil (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA] en el mismo patrón. En cambio, en citrange 
Carrizo los genes ICS y CM1 no se sobreexpresan con ninguno de los volátiles 
ensayados respecto al control y únicamente el gen PAL muestra una sobreexpresión 
utilizando los volátiles 1-hexanol [(Z)-3-HL] y (Z)-3-hexenil butanoato [(Z)-3-HB]. 
Esto indica que en naranjo amargo la vía del salicílico aguas arriba se ve activada tanto 
por la vía ICS como por la vía PAL con prácticamente todos los volátiles empleados en 
todos los genes, salvo con el volátil (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA] que solamente 
consigue la expresión del gen ICS. La activación de las respuestas defensivas 
generadas por el SA al exponer este naranjo amargo a dichos volátiles podría hacer a 
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32 
 
estos plantones repelentes a artrópodos herbívoros y atrayentes a enemigos naturales, 
tal como describe Pérez-Hedo et al. (2021 a) en plantas de tomate. Sin embargo, en 
citrange Carrizo los genes ICS y CM1 no activan dicha vía, ya que con ningún volátil 
presentan sobreexpresión comparados con el tratamiento control. Y como se ha 
mencionado en el párrafo anterior, exclusivamente el gen PAL se sobreexpresa con dos 
volátiles, por lo que solo empleando estos volátiles se consigue activar una de las vías 
del salicílico aguas arriba, la vía PAL. 
En cuanto a los resultados acerca de la expresión de los genes marcadores de la vía 
SA aguas abajo, el gen NPR1 se ve claramente sobreexpresado en el patrón naranjo 
amargo con los cinco volátiles ensayados en comparación con el control, mientras que 
el gen PR5 en el mismo patrón únicamente muestra una sobreexpresión con el volátil 
(Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP] y una expresión por debajo del tratamiento control 
con el volátil metil salicilato [MeSa]. En citrange Carrizo ambos genes presentan un 
comportamiento similar, ya que ninguno ve incrementada su expresión con los volátiles 
ensayados, con la excepción del gen PR5, que solo aumenta su expresión con el volátil 
(Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP]. 
Estos resultados implican que el gen NPR1 activa la vía SA aguas abajo con los cinco 
volátiles utilizados para el ensayo en naranjo amargo, por lo que se activan mecanismos 
de defensa tras la exposición a los volátiles. Respuestas defensivas que en ensayos 
con planta de tomate disminuyeron la oviposición e influyeron negativamente en el 
comportamiento de alimentación de Bemisia tabaci y aumentaron la atracción del 
parasitoide Encarsia formosa, lo que mejoró su parasitismo sobre B. tabaci (Yang, 
2020). Mientras que el gen PR5 únicamente activa esta vía, y por tanto los mecanismos 
de defensa, empleando el volátil (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP]. Por el contrario, 
en citrange Carrizo solamente el gen PR5 activa la vía SA aguas abajo con el (Z)-3-
hexenil propanoato [(Z)-3-HP] también, ya que el gen NPR1 no se expresa con ninguno 
de los volátiles ensayados y por ello no activa esta vía. 
Los resultados referentes a la respuesta transcripcional del gen LOX2 marcador de la 
vía JA indican que se produce un incremento de la expresión de este gen en el patrón 
naranjo amargo empleando los volátiles 1-hexanol [(Z)-3-HL], (Z)-3-hexenil butanoato 
[(Z)-3-HB], (Z)-3-hexenil propanoato [(Z)-3-HP] y metil salicilato [MeSa] comparados con 
el tratamiento control. En citrange Carrizo, sin embargo, no se produce una 
sobreexpresión del gen LOX2 con ningún volátil de los utilizados en el ensayo, siendo 
el volátil (Z)-3-hexenil acetato [(Z)-3-HA] el único que muestra una expresión del gen 
menor que la del tratamiento control. 
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33 
 
Esto significa que la vía del ácido jasmónico se verá activada en naranjo amargo por el 
gen LOX2 utilizando todos los volátiles del ensayo, con la excepción del volátil (Z)-3-
hexenil acetato [(Z)-3-HA], el cual no muestra una gran expresión respecto al control. 
Esto provocará la activación de defensas a través de la vía JA que, como describe 
Bouagga et al. 2020, en las plantas de pimiento dulce, la regulación de esta vía 
desencadenada por la fitofagia de los míridos redujola acumulación del virus del 
bronceado del tomate (TSWV) en las plantas picadas por los mismos. Por contra, en 
citrange Carrizo no se produce la activación de la vía JA por el gen LOX2, y por tanto, 
no se activaran las respuestas defensivas de la planta con ninguno de los volátiles 
ensayados. 
Por lo que respecta a los resultados acerca de la respuesta transcripcional de los dos 
péptidos antimicrobianos estables SAMP y LAMP, ambos presentan el mismo 
comportamiento tanto en el patrón naranjo amargo como en citrange Carrizo. En el 
primero, ni SAMP ni LAMP muestran sobreexpresión con ninguno de los volátiles 
empleados en comparación con el tratamiento control. Mientras que en citrange Carrizo 
ambos genes ven incrementada su expresión con el volátil (Z)-3-hexenil butanoato [(Z)-
3-HB] exclusivamente. 
Este tipo de péptidos se ha visto como pueden ser capaces de inhibir el crecimiento de 
bacterias fitopatógenas como es el huanglongbing o HLB (Huang et al. 2021), por lo que 
sería de interés profundizar si la utilización de estos u otros volátiles pudieran aumentar 
los niveles de estos péptidos en otros patrones o en otras combinaciones 
patrón/variedad. 
En resumen, en este trabajo por primera vez se ha demostrado que la exposición a 
volátiles de origen vegetal puede activar mecanismos de defensa, medidos en este 
ensayo como la cuantificación de la expresión de genes marcadores de defensa, en los 
patrones cítricos, naranjo amargo y citrange Carrizo. 
 
 
 
 
 
 
 
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7. Conclusiones 
Las conclusiones del presente trabajo son: 
- La exposición a volátiles de origen vegetal activa mecanismos de defensa, en 
los patrones cítricos, naranjo amargo y citrange Carrizo, aunque de manera 
diferencial para cada uno de estos patrones. 
 
- El naranjo amargo mostró una mayor respuesta que el citrage Carrizo para 
activar los genes relacionados con las rutas del SA y del JA. 
 
- En Citrange Carrizo únicamente la exposición al (Z)-3 hexenil butanoato 
consiguió sobreexpresar los péptidos antimicrobianos SAMP y LAMP, mientras 
que en naranjo amargo ningún volátil tuvo efecto sobre los péptidos. 
 
- Los resultados obtenidos en este trabajo abren las puertas a la utilización de 
volátiles en cítricos como una nueva herramienta de control de plagas y 
enfermedades. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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8. Líneas futuras 
En este sentido hay tres vías a explorar en este campo: 
1. Conocer el efecto de la activación obtenida sobre plagas y enfermedades de los 
cítricos. 
 
2. Ampliar estos resultados conociendo el efecto de esta activación sobre otros 
patrones y sobre otras combinaciones de patrones/variedad. 
 
3. Explorar otros volátiles como activadores de defensas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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