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Seminario de Histología 1UA de Histología, Embriología, Biología Celular y Genética Técnicas Histológicas Algunas definiciones: Célula: es la mínima porción de materia que posee vida independiente. Tejido: es el conjunto de las células y sus materiales extracelulares que contribuyen a cumplir una(s) función(es) común(es). Órgano: es el conjunto de tejidos que comparten una forma y un grupo de funciones comunes y más o menos independientes. Aparato: es el conjunto de órganos que contribuye a un grupo de funciones comunes. Sistema: el es el conjunto de órganos que contribuye a un grupo de funciones comunes y se distribuye en todo el organismo. Fibrae (fibra) Texturae (tejido) HISTOLOGÍA Técnica Histológica Técnica de rutina Técnicas especiales Como los tejidos animales contienen mucha agua, en cortes delgados, translúcidos, tienen poco contraste. Sólo se ven las estructuras que tienen color de por sí. Hay que crear contraste donde no lo hay para poder distinguir estructuras. Por eso se colorean los tejidos. Pasos de la técnica histológica de rutina 1) Obtención de la muestra 2) Fijación 3) Inclusión: a) Deshidratación b) Aclaración c) Inclusión propiamente dicha 4) Corte 5) Montaje preliminar 6) Coloración: a) Aclaración b) Rehidratación c) Coloración propiamente dicha 7) Montaje final a) Deshidratación b) Aclaración c) Montaje final propiamente dicho Obtención de la muestra Para observación mediata (post-mortem) = AUTOPSIA Para observación inmediata (in vivo) = BIOPSIA Puesto este órgano en un microscopio, ¿veríamos algo?... ¿lo atraviesa la luz?... …entonces hay que seccionarlo en rebanadas delgadas, muy delgadas (5-10 milésimas de milímetro)… para poder observarlo a trasluz con un microscopio… Fijación • Métodos de fijación • Físico: frío, calor • Químico: paraformaldehído, formol, formalina, glutaraldehído. • Inmersión • Perfusión Hay que indurar al órgano con sus tejidos, incluyéndolo en un material más duro que se pueda cortar más delgado Inclusión 50% 70% 96% 100% Post-fijación por inmersión Deshidratación en concentraciones crecientes de ETANOL Aclaración con XILOL Etanol 100% XILOL Inclusión Distintos tipos de parafinas se funden (son líquidas) a 45º-58º… …se sumerge la muestra de tejido en parafina líquida… …se incuba en estufa a 60º para que la parafina impregne todo el tejido Inclusión propiamente dicha Moldes de inclusión Taco de inclusión Se obtiene un taco de inclusión, sólido, con el tejido incluido en parafina. El taco se talla y se pasa al… Charles Sedgwick Minot (1852- 1914) Corte ¿Con qué se corta el taco de inclusión?... …con un MICRÓTOMO Corte Micrótomo rotatorio tipo Minot Taco Platina Taco Cuchilla Tira de cortes Grosor: 5-10 μm Montaje preliminar Portaobjetos de vidrio Corte de tejido Coloración Aclaración (desparafinización) con XILOL Rehidratación en concentraciones decrecientes de ETANOL Coloración propiamente dicha HEMATOXILINA + virado + EOSINA Deshidratación en concentraciones crecientes de ETANOL Aclaración con XILOL Montaje final propiamente dicho con Bálsamo de Canadá o similar Montaje final Corte sin colorear Corte coloreado sólo con EOSINA Corte coloreado con EOSINA y HEMATOXILINA Acidofilia y Basofilia con H-E Acidofilia y Basofilia con H-E Técnica de rutina: HE Hematoxilina Eosina Colorante básico Colorante ácico Azul metileno, azul toluidina, verde metilo, hematoxilina Azul de anilina, naranja G, eosina, fucsina ácida Tiñen componentes ácidos de la célula Tiñen componentes básicos de la célula Permiten visualizar núcleos, polirribosomas. Permiten visualizar componentes citoplasmáticos como organelas. Los componentes celulares afines con este colorante se llaman BASOFILOS. Los componentes celulares afines con este colorante se llaman ACIDOFILOS. Resumiendo… Pasos de la técnica histológica de rutina 1) Obtención de la muestra 2) Fijación 3) Inclusión: a) Deshidratación b) Aclaración c) Inclusión propiamente dicha 4) Corte 5) Montaje preliminar 6) Coloración: a) Aclaración b) Rehidratación c) Coloración propiamente dicha 7) Montaje final a) Deshidratación b) Aclaración c) Montaje final propiamente dicho CONCEPTOS ORTOCROMASIA: es la capacidad que tienen los colorantes básicos o ácidos de mantener invariable su espectro de absorción electromagnética al formar uniones salinas o electrostáticas con los componentes celulares y extracelulares. METACROMASIA: es la capacidad que tienen ciertos colorantes básicos o catiónicos derivados de las tiazinas de virar su espectro de absorción electromagnética al formar uniones salinas o electrostáticas con ciertos componentes celulares y extracelulares que son polímeros polianiónicos. Colorantes metacromáticos: azul de metileno, azul de toluidina, violeta de metilo, azul de tionina, azur A Metacromasia Es una propiedad de los colorantes básicos derivados de las tiazinas (Azul de metileno; Azul de toluidina; Azur; Violeta de cresilo; Gallocianina) Características del tejido: poseer polímeros polianiónicos (ej: heparina) que hacen “virar” el azul original del colorante a un púrpura-violáceo = metacromasia Metacromasia (mastocitos; oreja de ratón) H&E Azul de toluidina Coloraciones tricrómicas: Tricrómico de Mallory (azul de anilina + naranja G + fucsina ácida; todos ácidos; se desconoce el fundamento) Frank Burr Mallory (1862-1941) Cirrosis Tricrómico de Mallory Azul de Anilina + Naranja G + Fucsina ácida Coloraciones tricrómicas: Tricrómico de van Giesson (ácido pícrico + fucsina ácida + hematoxilina férrica de Weigert) Tricrómico de Masson-Lillie (fucsina Ponceau + verde luz + hematoxilina de Mayer) Tricrómico de Masson (fucsina Ponceau + azul de anilina + hematoxilina de Mayer) Técnicas histoquímicas: Localización de polisacáridos Técnica de PAS (peryodic acid-Schiff) 1) El ácido peryódico (HIO4) oxida a los glúcidos (sobre grupos 1-2 glicol de las hexosas) y expone grupos aldehídos. 2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por anhídrido sulfuroso) H&E PAS Células caliciformes Técnicas histoquímicas: Localización de ADN Técnica de Feulgen 1) Hidrólisis ácida débil con HCl que elimina bases purínicas del ADN (A y G) y expone grupos aldehído. 2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por anhídrido sulfuroso) Ácidos nucleicos (raíz de cebolla) H&E Feulgen Técnicas histoquímicas: Localización de lípidos Nervio, mielina (OsO4) Tinción por solubilidad diferencial (método físico, no químico) Sudán III grasas (naranja) Sudán IV (rojo escarlata) grasas neutras (rojo vivo), ést. de colest. (rosa) Sudán negro B fosfolípidos Aceite rojo O triacilglicéridos Azul de Nilo fosfolípidos Tetróxido de osmio (OsO4) mielina (marrón o negro) Adipocitos (H&E) Adipocitos (Sudán rojo) Glándula mamaria (OsO4- verde de metilo) Técnicas histoquímicas: Localización de enzimas Fosfatasa alcalina (bazo; técnica de Gomori) Demostración de lectina PNA que se une a galactosil-N-acetilgalactosamina de glucoproteínas por reacción de la peroxidasa-DAB (epitelio respiratorio) Fundamento: localización de la reacción enzimática por demostración del lugar en el que se encuentra una enzima que transforma un sustrato en un producto; el producto, con un reactivo agregado, forma un compuesto insoluble y coloreado Demostración de NADPH-diaforasa (deshidrogenasa; corteza frontal, neuronas nitrérgicas) (Boccoli, Loidl, López-Costa, Pistone Creydt, Ibarra, Goldstein (2008) Brain Res) Técnicas de impregnación argéntica: Depósito de sales de plata metálica Método de del Río Hortega (microgliocito) Método de Cajal para neurofibrillas (neurona) Impregnación argéntica de Gomori para fibras reticulares (hígado) Método deGolgi (neurona) Técnica de de Olmos (amino- cupro-argéntica; neuronas en degeneración)Aparato de Golgi (enterocitos) Inmunohistoquímica: Se basa en: la detección de reacciones antígeno-anticuerpo por medio de la marcación de los anticuerpos. Sirve para: detectar sustancias (principalmente proteínas), muy específicamente, que pueden estar en muy bajas concentracioens en el tejido en estudio. Métodos: existen dos grupos, el directo y el indirecto. Tipos de anticuerpos: policlonales y monoclonales Ludwig A. Sternberger Albert H. Coons (1912-1978) Ac. con fluoresceína (1941) Técnica de PAP (1970) César Milstein (1927-2002) Georges Köhler (1946-1995) Ac. monoclonales (1975) Inmunohistoquímica: Inmunohistoquímica: Nf-200 (neurona, c. frontal; Evrard, Duhalde-Vega, Tagliaferro, Mirochnic, Caltana, Brusco (2006) Exp Neurol) MTCO2, marcador de mitocondrias humanas (glioblastoma humano) Células en cultivo marcadas para actina, tubulina y núcleo GluR4 (neurona glutamatérgica, hipocampo) SMI 131 (neurona, corteza motora)
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