27 METODOS PARA LA CUANTIFICACION DE PROTEINAS

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27. Métodos para la cuantificación de proteínas 
 
Emilio Fernández Reyes y Aurora Galván Cejudo 
 
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, 
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba 
 
 
RESUMEN 
 
En esta práctica se utilizaran tres métodos para la cuantificación de 
proteínas: Biuret, Bradford y BCA. Para cada uno de los métodos se 
realizaran: una curva estándar, el cálculo del coeficiente de extinción y el 
rango de sensibilidad. Se realizará la cuantificación de dos muestras 
problemas de baja y alta concentración, respectivamente, y se discutirá 
las ventajas e inconvenientes de cada uno de los métodos. 
 
Palabras clave: cuantificación de proteínas, Biuret, Bradford, BCA 
 
Abreviaturas: BCA: ácido bicinconínico 
 
 
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 
 
1.1 Métodos para la cuantificación de proteínas: ventajas e 
inconvenientes 
 
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una 
técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una 
proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una 
preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para 
otros muchos propósitos. 
 
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de 
estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para 
absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la 
capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. En la Tabla I se 
recogen los métodos más usados así como sus respectivas sensibilidades. 
Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas e inconvenientes, las 
principales se recogen en la Tabla II. 
 
 
1 
 
Tabla I. Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de 
sensibilidad 
 
Método Rango de sensibilidad 
(µg) 
Coeficiente de extinción o Cálculo de la 
concentración 
Métodos de 
Absorción 
 A280
 A205
 A280 - A260 
 A235 - A280 
 A224 - A236 
 A215 - A225
 
100-3000 
3-100 
100-3000 
25-700 
5-180 
2-45 
 
 
ε280 = 1 mL/mg cm 
ε205 = 31 mL/mg cm 
Proteína (mg/mL) = (1.55A280 – 0.76A260) 
Proteína (mg/mL) = (A235 – A280)/2.51 
Proteína (mg/mL) = (A224 – A236)/0.6 
Proteína (µg/mL) = 144(A215 – A225)
 Métodos Derivados 
Colorimétricos 
 
 Biuret 1000-10000 ε545 = 0.06 mL/mg cm 
 Lowry 25-100 a 500 nm 
2-30 a 660 nm 
1-2 a 750 nm 
Usar curva estándar 
 Bradford 1-15 ε595 = 81 mL/mg cm 
 BCA 0.5- 10 Usar curva estándar 
Métodos Derivados 
Fluorimétricos 
 
 o-ftalaldehido 1-5 λexcitación a 340 nm 
λemisión a 475 nm 
Usar curva estándar 
 
 
 
 
 
 
Tabla II. Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales ventaja e 
inconvenientes 
 
Método Ventajas Inconvenientes 
Métodos de 
Absorción 
 
No se pierden las 
muestras 
Interfieren muchos compuestos que absorben 
en el UV 
 
 Métodos Derivados 
Colorimétricos 
 
 Biuret Bastante específico para 
proteínas 
Muestra pocas 
interferencias 
Es barato 
Tiene poca sensibilidad 
 Lowry Tiene bastante 
sensibilidad 
 
No todas las proteínas reaccionan igual 
Mustra muchas interferencias como 
detergentes no iónicos, sulfato amónico etc. 
 Bradford Muy sensible Muestra interferencias con detergentes 
 BCA Es el método mas sensible
Es el que muestra menos 
interferencias 
 
Métodos Derivados 
Fluorimétricos 
 
 o-ftalaldehido Muy sensible La interferencia de aminas contaminantes en 
la muestra 
No todas las muestras reaccionan igual 
 
 
 
2 
1.2. Método de Biuret 
 
 Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los 
grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 
4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad 
de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de 
manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy 
baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados 
muy concentrados (por ejemplo en suero). 
 
1.3. Método de Bradford 
 
 Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también 
Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos 
formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para 
formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor 
que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato 
y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que 
interfieren están los detergentes y las soluciones básicas. 
 
 
1.4. Método de BCA 
 
 El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un 
complejo púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo 
forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso 
producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino 
(reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un 
método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy 
sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros 
métodos. 
 
 OH- 
 Proteína + Cu2+ → Cu1+
 
 
 
 Cu1+ + BCA → complejo púrpura BCA- Cu1+
 
 
1.5. Objetivos 
 
 Con esta práctica se pretende introducir al alumno en los diferentes 
métodos para la cuantificación de proteínas: su fundamento, sus ventajas e 
inconvenientes. Se utilizarán tres métodos (Biuret, Bradford y BCA), para cada 
uno de ellos se realizará una curva estándar, se determinará el coeficiente de 
extinción, el rango de sensibilidad, y se realizará la cuantificación de dos 
muestras problemas. 
 
2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO 
 
 Tubos de ensayo 
 Pipetas de automáticas regulables de 20-100 µl y de 200-1000 µl 
3 
 Espectofotómetro 
 Agua destilada 
 Soluciones estándar de proteína 
 Reactivo de Biuret 
 Reactivo de Bradford 
 Reactivo de BCA 
 
3. PROTOCOLO A REALIZAR 
 
3.1. Método de Biuret 
Añadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estándar y muestras problemas 
preparadas como se indica en la Tabla III. 
 Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al 
blanco. El color es estable 1 hora. 
 
Tabla III. Protocolo tipo para la cuantificación de proteínas por el método de Biuret 
 Reactivos Resultados 
Tubos Estándar 
(20 mg/ml) 
 
H2O 
 
R. Biuret 
A545 nm [proteína] 
Blanco 0 µl 100 µl 1 ml 
1 25 µl 75 µl 1 ml 
2 50 µl 50 µl 1 ml 
3 75 µl 25 µl 1 ml 
4 100 µl 0 µl 1 ml 
 Muestras 
M1 100 µl 0 µl 1 ml 
M2 100 µl 0 µl 1 ml 
 
- Representa la curva estándar. 
- Calcula el coeficiente de extinción. 
- Calcula las concentraciones de proteínas de las muestras M1 y M2. 
 
3.2. Método de Bradford 
 
Añadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estándar y muestras 
problemas preparadas como se indica en la Tabla IV. 
Dejar a temperatura ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al 
blanco. El color es estable 1 hora. 
 
 
Tabla IV. Protocolo tipo para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford 
 Reactivos Resultados 
Tubos Estándar 
(0,5 mg/ml) 
 
H2O 
 
R. Bradford 
A595 nm [proteína] 
Blanco 0 µl 100 µl 1 ml 
1 25 µl 75 µl 1 ml 
2 50 µl 50 µl 1 ml 
3 75 µl 25 µl 1 ml 
4 100 µl 0 µl 1 ml 
 Muestras 
M1 100 µl 0 µl 1 ml 
M2 100 µl 0 µl 1 ml 
 
4 
- Representa la curva estándar. 
- Calcula el coeficiente de extinción. 
- Calcula las concentraciones de proteínas de las muestras M1 y M2. 
 
3.3. Método de BCA 
 
Añadir 1 ml del reactivo de trabajo de BCA a los tubos estándar y 
muestras problemas preparadas como se indica en la Tabla V. 
Incubar 10 min a 60 ºC y leer Absorbancia a 562 nm frente al blanco. 
 
Tabla V. Protocolo estándar para la cuantificación de proteínas por el método de BCA 
 Reactivos Resultados 
Tubos Estándar 
(0,1 mg/ml)H2O 
 
R. BCA 
A562 nm [proteína] 
Blanco 0 µl 100 µl 1 ml 
1 25 µl 75 µl 1 ml 
2 50 µl 50 µl 1 ml 
3 75 µl 25 µl 1 ml 
4 100 µl 0 µl 1 ml 
 Muestras 
M1 100 µl 0 µl 1 ml 
M2 100 µl 0 µl 1 ml 
 
- Representa la curva estándar. 
- Calcula el coeficiente de extinción. 
- Calcula las concentraciones de proteínas de las muestras M1 y M2. 
 
3.4. Compuestos que interfieren en la determinación de proteínas 
 Repetir las curvas estándar para cada uno de los tres métodos pero 
 incluyendo se pueden incluir : 
 10 µl de 1M EDTA , 
 10 µl de Tritón X-100, ó 
 10 µl de SDS 20% 
 
 Determinar cómo estos compuestos afectan a la cuantificación de 
proteínas por uno u otro método. 
 
4. RESULTADOS ESPERADOS 
 
 El método de Biuret (poco sensible) permitirá cuantificar la cantidad de 
proteínas en la muestra M1 pero no en la M2. Por el contrario los métodos mas 
sensibles (Bradford y BCA) permitirán cuantificar la muestra M2, pero la M1 se 
saldrá de rango. Para poder cuantificar la muestra M1 haría falta hacer 
diluciones de la misma. 
 
5. EJERCICIOS, DISCUSIÓN Y COMENTARIOS 
 
- ¿Qué método es el más sensible?, y ¿el menos sensible?. 
- ¿Qué problemas tienes para determinar la concentración de 
proteínas de las muestras M1 o M2. con cada una de estos 
métodos?. ¿Cómo lo resolverías?. 
 
- Discute tus resultados de acuerdo con los datos de la Tabla VI . 
 
5 
- Decide qué método de determinación de proteínas elegirías para la 
cuantificación de proteínas en: suero, orina, LCR, durante una 
purificación enzimática, en un extracto bacteriano concentrado, en 
preparaciones de membranas plasmáticas solubilizadas con SDS, en 
preparaciones de membranas mitocondriales solubilizadas con Tritón 
X-100. 
 
Tabla VI. Algunos compuestos que interfiren en la determinación de proteínas 
Compuesto Interferencia en el Método de 
BCA 
Interferencia en el Método de 
Lowry 
50 mM EDTA Si Si 
4 M Cloruro de guanidina N0 Si 
1% Triton X-100 No Si 
40% Sacarosa No Si 
20% Sulfato amónico Si Si 
3% Sulfato amónico No Si 
 
 
ANEXO 1: REACTIVOS 
 
 Reactivo de Biuret 
Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 
6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita añadir 200 ml de 
NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de 
plástico. 
 
 Reactivo de Bradford 
 Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie 
 Blue G-250 con 10 ml de fosfórico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto. 
 Añadir H2O hasta 100 ml. Filtrar a través de papel de filtro y guardar en 
 la oscuridad. 
 
 Reactivo de BCA 
 Reactivo preparado del siguiente modo. 
Reactivo A: BCA 1%, Na2CO3 2%, tartrato sódico 0,16%, NaOH 
0,4% y NaHCO3 0,95%. Ajustar a pH 11,25 con NaOH. 
Reactivo B: CuSO4 al 4% 
Reactivo de trabajo: mezclar 100 volúmenes de A con 2 
volúmenes de B. 
 
Soluciones estándar de proteínas 
 Seroalbúmina bovina 20 mg/ml 
 Seroalbúmina bovina 0,5 mg/ml 
 Seroalbúmina bovina 0,1 mg/ml 
 
Muestras M1 y M2 
 La muestra M1 debe tener una concentración de proteínas entre 
10 – 20 mg/ml 
La muestra M2 debe tener una concentración de proteínas entre 
0,1- 0,5 mg/ml 
 
 
 
6 
6. BIBLIOGRAFÍA 
 
Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of 
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. 
Anal Biochem. 72: 248-254. 
Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein 
using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85. 
Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editorial, John Wiley & 
Sons, New York. 
 
7 
	27. Métodos para la cuantificación de proteínas
	Emilio Fernández Reyes y Aurora Galván Cejudo
	Tabla I. Principales métodos para la cuantificación de prote
	Método
	Métodos de Absorción
	Método
	Métodos de Absorción
	1.2. Método de Biuret
	1.3. Método de Bradford
	1.4. Método de BCA
	Tabla III. Protocolo tipo para la cuantificación de proteín
	Reactivos
	Resultados
	Tubos
	Tabla IV. Protocolo tipo para la cuantificación de proteínas
	Reactivos
	Resultados
	Tubos
	Tabla V. Protocolo estándar para la cuantificación de prote
	Reactivos
	Resultados
	Tubos
	4. RESULTADOS ESPERADOS
	5. EJERCICIOS, DISCUSIÓN Y COMENTARIOS
	Tabla VI. Algunos compuestos que interfiren en la determinac
	Compuesto
	ANEXO 1: REACTIVOS
	6. BIBLIOGRAFÍA
	Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the qua
	Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): Measuremen
	Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editorial, John Wiley ( Sons, New York.