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1 Levaduras seleccionadas y fermentación alcohólica Antonio Palacios**, Sofía Silva*, Maria de Fátima* * Proenol SL; Travessa das Lages 267, Apart. 547. Canelas, Vilanova de Gaia, 4405-194 - Portugal. Tel: 00 351 227150840. proenol@proenol.pt ** Lallemand SA; Ctra. Logroño-Vitoria, Nº14, 26360 Fuenmayor, La Rioja. Tel: 941 451192 Fax: 941 451195; correo electrónico: apalacios@lallemand.com Introducción La elaboración de vino es uno de los procesos más antiguos en la tecnología alimentaría en Europa. Desde comienzos del siglo XVIII existe una gran progreso en la vinificación gracias a la investigación en los campos de la química, biología y física…. Hay que destacar los trabajos de Pasteur, quien fue el primero en mostrar que las levaduras son las responsables de la fermentación alcohólica y Chaptal es quien escribió en 1818 el primer tratado de Enología. Es bastante lógico pensar que la Biotechnology es una ciencia reciente que podría tener algunas aplicaciones interesantes en este proceso ancestral. Los investigadores han estado interesados siempre en encontrar nuevas cepas de microorganismos ¿Donde está el origen del vino?: en el viñedo o en el método de elaboración Cuando se habla con expertos, existe una tendencia general en la enología actual, centrándose todos los esfuerzos de comunicación acerca del significado y el origen del vino, en el viñedo como elemento determinante y clave en su elaboración. Sin duda, la vid es el origen de la materia prima y por lo tanto se merece dicha mención. Pero no sería justo menospreciar el trabajo que se realiza en la bodega como parte integrante de la definición del producto final. Debido a la importancia en el origen vitícola del producto, se podría afirmar que el vino es elaborado principalmente en la viña. En esta grandilocuente frase, que no falta en absoluto a la verdad, podríamos preguntarnos cual es la palabra más importante, “VIÑA” o “ELABORADO”. Obviamente existe una materia prima inicial que es la uva, fruto de la vid Vitis vinefera, que sin ser transformada por procesos metabólicos microbianos, no puede llegar jamás a ser vino. Debido a esta razón, cuanto más control ejerza el ser humano utilizando la tecnología biológica actual y más adecuada a la materia prima, mejor resultado se podrá obtener en el proceso de vinificación. Por lo tanto, ambas palabras tienen un significado profundo e importante para poder hablar de vino y ninguna de las dos es prescindible. La intervención humana, mediante el control del proceso fermentativo, ayuda a traducir todo el potencial del viñedo en vinos de calidad. Un ejemplo aclaratorio del equilibrio entre ambas palabras, es el caso del viñedo Clos de Vougeot en el corazón de la denominación de origen francesa Côte d’Or en Borgoña, viñedo muy conocida a nivel internacional por los vinos de calidad 2 elaborados. El viñedo es de pequeñas dimensiones, unas 50 hectáreas y pertenece a unos 80 propietarios diferentes. Las parcelas son muy pequeñas y cercanas entre sí, produciendo vinos absolutamente diversos y con personalidad propia a pesar de la homogeneidad del viñedo. La explicación está en que la intervención humana en la vinificación de la uva, empleando diferentes tecnologías y aplicando el saber hacer particular de cada elaborador, imprime notas diferenciales y características de identidad a cada vino, aunque estos procedan de materia prima muy parecida y homogénea. El trabajo técnico y humano tanto en la viña como en la bodega, determinará en perfecto equilibrio, si el potencial vitícola puede ser alcanzado o no en el producto final, que es el vino. Existen muchos factores que impactan en la calidad del mosto antes de ser transformado en vino. El estado sanitario de la uva, que puede verse mermado al sufrir ataques de hongos y otros parásitos propios de la vid como el mildiu o la botritys, determina de forma importante la calidad del mosto y su composición química final, transformando con sus actividades enzimáticas y metabólicas los componentes originales del mosto, provocando casi siempre pérdidas importantes de nutrientes, de acidez, incremento del pH, destrucción de precursores aromáticos y oxidaciones sobre los compuesto del color. En definitiva, las variedades de uva, las condiciones climáticas, la aptitud del terreno y las técnicas vitícolas, contemplado en su conjunto, determinan el potencial de la calidad de la uva y del mosto. Pero nos falta algo para poder llegar al producto final, el vino; y solo existe una alternativa para ello, la fermentación y el trabajo de los microorganismos en la bodega. Sin estos trabajadores invisibles, no podríamos disfrutar del producto final, pues sin fermentación es todavía mosto. Sin levaduras no hay fermentación alcohólica y sin bacterias no hay fermentación maloláctica. En pleno siglo XXI, no existe una tecnología alternativa a estos complejos procesos biológicos. Dependemos de ellos y de su metabolismo completamente, para que pacientemente vayan transformando el azúcar en alcohol y además de esto, gracias a su metabolismo complejo, aparezcan más de 900 compuestos químicos diferentes, con los que se consigue complejidad aromática y gustativa, que luego se traduce en placer hedónico a la hora de saborear el vino. Importancia de la microbiología del viñedo y la bodega Existe una gran biodiversidad de microorganismos presentes en la uva y en el mosto. Esta biodiversidad ofrece microorganismos realmente muy interesantes para la calidad del vino, como suele ser el caso de Saccharomyces cerevisiae y Oenococcus oeni. Sin embargo, existen otras especies microbianas que pueden llegar a ser muy adversas e inoportunas por los efectos que provocan, especialmente cuando actúan de forma dominante. Levaduras apiculadas, bacterias acéticas, hongos filamentosos, flores del vino y levaduras contaminantes del tipo Brettanomyces y Zygosaccharomyces, pueden llegar a ser muy molestas y promover la aparición de aromas negativos o gustos indeseables. Situación muy contraria al objetivo hedónico que se debe impulsar con el consumo de vino de calidad. Contemplando este escenario microbiano tan complejo y desde el punto de vista profesional de la enología moderna, no debemos esperar para ver si somos afortunados o no con lo que nos ofrece la naturaleza en su azar biológico, sino 3 reaccionar para controlar y conducir el comportamiento de estos individuos invisibles durante la vinificación. Por otra parte, todo lo que nos ofrece la naturaleza es considerado como “natural”, pero no todo lo que se considera “natural” tiene que ser bueno a la fuerza para el hombre. Obviamente, los microorganismos que provocan enfermedades en el ser humano también son naturales, pero esta condición, no los libera de representar una amenaza de la que es ser humano debe huir y defenderse, desarrollando medicamentos y procesos de temprana detección y curación. De la misma forma, todo lo que nos ofrece el terruño o la viña es “natural”, pero desde el punto de vista técnico, el enólogo debe saber discernir y eliminar del factor terruño, aquello que represente una amenaza para la calidad del vino y elegir un escenario microbiano favorable y óptimo para obtener la calidad deseada en el vino. El control biológico durante la vinificación, no es solo una cuestión de procesos fermentativos optimizados, sino que también, dependiendo del estilo de vino que se quiere elaborar, constituye una herramienta muy apropiada. Los actores del escenario microbiano deben ser óptimos para mostrar un comportamiento acorde a los fines perseguidos en la vinificación. Para expresar todo el potencial del viñedo (concepto francés “terroir”), es un riesgo pensar que se puede conseguir dejando actuar libremente a la naturaleza por si misma en la bodega. Los elementos naturales deben ser comprendidos y después controlados por el técnico, para poder obtener así en el vino, la máxima expresión delterruño y la variedad de uva. Este control biológico pasa por definir plenamente y de forma preventiva que tipo de microorganismos van a estar presentes en la fermentación y como van a comportarse dependiendo de las condiciones técnicas empleadas en la vinificación. Importancia de las técnicas de elaboración Cuando las uvas llegan a la bodega, los enólogos tienen que pensar cual será la estrategia de vinificación más adecuada según la calidad de la uva y el estilo de vino a elaborar con ellas. El enólogo se enfrenta cada año a condiciones de maduración muy variables según parcelas y también de una vendimia a otra. Así que no es posible o nada fácil aplicar recetas de vinificación repetitivas año tras año, sino que dependiendo de distintos factores, temperatura de fermentación, intensidad de desfangado, tiempo de maceración con los hollejos, descubes, trasiegos, inoculación de levaduras y bacterias seleccionadas, adición de nutrientes y otras decisiones importantes de la vinificación, deben ser decididas en función de: • las condiciones higiénicas de la bodega • el estado sanitario de la vendimia • los niveles de nutrientes (nitrógeno asimilable, lípidos, vitaminas y minerales) • población en el mosto de levaduras contaminantes • composición química y grado de madurez • tratamientos prefermentativos realizados La tecnología avanza además en todos los campos y aparecen nuevos utensilios y maquinarias interesantes que cambian los procesos de vinificación. Estas técnicas, como la maceración prefermentativa, crianza sobre lías, macro y microoxigenación, vinificaciones en condiciones reductivas, ponen en condiciones límite a las levaduras y bacterias. Por lo que se hace necesario controlar la biología del vino de forma adecuada. 4 Otras modas tecnológicas que ponen en dificultad la estabilidad cualitativa del vino, son la no clarificación, no estabilización y no filtración del vino. En estos casos, es necesario conocer el estado microbiológico y químico del vino y los riesgos de desviaciones que puedan desarrollarse, para de esta forma poder prevenirlos y evitarlos, actuando en consecuencia y protegiendo el vino de su rápida evolución, para que no disminuya su longevidad en toda la vida comercial del producto. Utilización de levaduras seleccionadas en el control de la fermentación alcohólica Para evitar la aparición de estos defectos u de otros posibles, se utilizan en bodega microorganismos seleccionados de la naturaleza para poder controlar un escenario microbiológico tan complejo. La selección de levaduras se realiza teniendo en cuenta una serie de parámetros enológicos, tales como elevado poder fermentativo, baja acidez volátil, regularidad en la fermentación, ausencia de efectos olfativos, no formación de espuma, pocas exigencias nutricionales. También se puede hablar de criterios más específicos, tales como levaduras productoras de aromas, degradación de ácido málico o incluso proporcionar estabilidad al color. En base a todas estas afirmaciones científicas, el enólogo previamente a la vendimia debe elegir las cepas correctas y más adecuadas para dirigir sus fermentaciones según la materia prima que vaya a emplear, el estilo definido de vino y las tecnologías de vinificación de las que dispone. Si hablamos de vinos tintos y lo que se desea es elaborar un vino joven afrutado de maceración carbónica, existen cepas con alta capacidad de producción de ésteres afrutados y capaces de degradar parcialmente el ácido málico, eliminando sensaciones verdes. Si lo que se desea es todo lo contrario, una extracción fuerte mediante maceraciones largas, lo que se demanda a la cepa de levadura elegida es un potente efecto coloidal mediante la liberación de polisacáridos de pared y que además, favorezca la fermentación maloláctica. También dependiendo de los procesos enológicos empleados hay razones para utilizar cepas de levadura específicas. Por ejemplo, hay levaduras criotolerantes de la raza fisiológica Saccharomyces uvarum, que se adaptan muy bien a las maceraciones prefermentativas en frío o a las bajas temperaturas de fermentación. También hay cepas con autolisis acelerada, muy útiles para la crianza sobre lías, tanto en barrica como después de la segunda fermentación en botella de los vinos espumosos. Diversos estudios han demostrado que la adición de levaduras inactivas (Optired y Optiwhite) o bien restos de levaduras tratadas enzimáticamente con β-glucanasas, proporcionan una serie de aspectos positivos en la vinificación, actuando sobre la estabilidad coloidal en la composición polifenólica de los vinos, ya que algunos polisacáridos liberados durante la fermentación, tienen la capacidad de ligarse con antocianos y taninos. La aparición de estos nuevos complejos se traduce en una disminución de la astringencia de los vinos y sobre todo un aumento de la estabilidad del color. También se ha demostrado que estos polisacáridos actúan sobre la estabilización tartárica y sobre la estabilidad proteica en general. 5 Selección de levaduras para la vinificación -. Criterios clásicos Los criterios de selección de levaduras siempre han pretendido un mayor control tecnológico del proceso fermentativo adecuando la cepa a utilizar al sustrato en el que se van a inocular. En el caso general de la vinificación se ha buscado la adecuación a la fermentación vínica, proceso complejo por la elevada concentración azucarada de los mostos (especialmente en el caso de emplear uva muy madurada), para conseguir un mayor y en ocasiones mejor color, estructura y aroma en los vinos: -. Poder alcoholígeno -. Cinética fermentativa -. Producción de acidez volátil -. Resistencia al sulfuroso -. Metabolismo del azufre -. Criterios específicos La elaboración de vinos tintos jóvenes y destinados al envejecimiento tiene requerimientos especiales con respecto a otros tipos de vinificación. La selección de levaduras es una herramienta adecuada para la selección de cepas de Saccharomyces con aptitudes diferenciales que se ajusten a estos requerimientos. - Producción de glicerina - Producción de 2,3-Butanodioles - Liberación de polisacáridos - Acitividad β-glucosidasa - Adsorción de antocianos - Influencia sobre las vitisinas - Producción de acetaldehído - Producción de alcoholes superiores - Producción de ésteres Influencia de la levadura en el color del vino: Hace mucho tiempo que se han observado diferencias de color entre vinos tintos fermentados con diferentes cepas de levaduras a partir del mismo mosto. Pero pocos trabajos han sido realizados para intentar explicar estas diferencias. En consecuencia, dos escuelas distintas existen en la actualidad: -una que explica la existencia de diferentes potenciales de extracción de una cepa a otra. -y otra que lo explica con las diferencias según la capacidad de absorción del color por las lías. Hoy todavía, ninguna actividad enzimática de la levadura ha ido descrita como capaz de extraer compuestos polifenólicos de las células vegetales. Del otro lado, la simple comparación del color de las lías de diferentes cepas de levaduras después la fermentación del mismo mosto, demuestra que existen efectivamente diferentes capacidades de absorción de una cepa a otra. 6 A lo largo de este artículo se describen diferentes acciones de la levadura sobre la fracción polifenólica de los vinos tintos. Además, la levadura tiene la posibilidad de actuar sobre la fracción aromática de los vinos, tanto tintos, rosados como blancos. Los aromas de un vino después de la fermentación alcohólica, pueden repartirse en dos categorías: -los aromas fermentativos, producidos durante la fermentación alcohólica a partir del metabolismo de los aminoácidos. -y los aromas varietales. Para este tipo de aromas, la levadura tiene la posibilidad de revelar algunas familias de aromas a partir de los precursores sin olor, utilizando paraello su material enzimático. Este artículo se propone también cubrir el papel de la levadura sobre la revelación aromática en los vinos tintos. Papel de la levadura sobre los polifenoles El efecto esponja La historia del descubrimiento de este efecto empezó con algunas experiencias realizadas en la variedad Gamay, que es una variedad a veces problemática con el color, así como el Pinot, el Sangiovese o el Tempranillo en la situación Riojana. El equipo de Dr Claude Cuinier (Loiseau et al., Cahier technique ITV, 1994) observó que después de la fermentación de un mismo mosto con diferentes cepas de levadura, los vinos tenían colores diferentes, y que al mismo tiempo, los colores de las lías eran diferentes. Este fenómeno se observó igualmente en Côtes du Rhône con la variedad Garnacha (ver fotografía 1). Cuando se hace una análisis más profundo del color, se notan diferencias en la concentración en antocianos, en el índice de color (DO 420 + 520 +620 nm) y en el índice de polifenoles totales (DO 280 nm) entre los vinos elaborados con diferentes cepas de levadura a partir de la misma materia prima, Fotografía 1: comparación del color de 3 lías de cepas de levadura diferentes obtenidas después de la fermentación alcohólica de un mismo mosto de la variedad Garnacha (foto cedida por “Institut Rhodanien”) Estas diferencias se observan con cualquier tipo de variedad de uva (ver figuras 1, 2, 3 y 4) tanto en situación septentrional (como en Borgoña) como meridional (por ejemplo Côtes du Rhône). 7 Estas diferencias de color y de composición polifenólica podrían estar explicadas gracias a una absorción diferente de algunos compuestos fenólicos sobre la pared de la levadura, sabiendo que la composición fina de estas paredes es diferente de una cepa a otra. Algunos trabajos (Loiseau et al., 1994) parecen confirmar esta hipótesis e intentan dar explicaciones a este fenómeno. Estos científicos han verificado que existía una diferencia significativa entre el índice de color de un mismo vino fermentado con dos cepas de levaduras diferentes: una conocida como una cepa que obtiene vinos de poco color, la cepa 71B y otra que da vinos con un índice de color más alto, la cepa L2056. Los extractos parietales de estas dos cepas han sido preparados e inoculados en el mismo vino durante 18h a temperatura de 20°C en la oscuridad. La medida del índice de color de las dos muestras obtenidas después de la incubación, mostraba diferencias significativas. Parece que la pared celular de la cepa 71B absorbe mas materia colorante que las de la cepa L2056. Este fenómeno de absorción se llama “efecto esponja”. El estudio de la hidrofobicidad de los extractos parietales obtenidos, parece mostrar que los constituyentes parietales de la cepa 71B son mas hidrofóbicos que los de la cepa L2056. La diferencia en la capacidad de absorción de las paredes de diferentes Levadura indigena Levadura D Levadura C Levadura B Levadura A 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 antocianos (mg/L) Levadura indigena Levadura D Levadura C Levadura B Levadura A 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 antocianos (mg/L)antocianos (mg/L) Levadura indigena Levadura D Levadura C Levadura B Levadura A 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 1 1.05 IC Levadura indigena Levadura D Levadura C Levadura B Levadura A 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 1 1.05 IC Lev A Vino A Lev B Vino A Lev A Vino B Lev C Vino B Lev C Vino C Lev D Vino D 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 IC Lev A Vino A Lev B Vino A Lev A Vino B Lev C Vino B Lev C Vino C Lev D Vino D 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 IC antocianos (mg/L) Lev A Vino A Lev B Vino A Lev A Vino B Lev C Vino B Lev A Vino C Lev B Vino C 0 100 200 300 400 500 600 700 antocianos (mg/L) Lev A Vino A Lev B Vino A Lev A Vino B Lev C Vino B Lev A Vino C Lev B Vino C 0 100 200 300 400 500 600 700 0 100 200 300 400 500 600 700 Figura 2: influencia de la levadura sobre el índice de color (según Loiseau et al., Cahier technique ITV, 1994). Experiencias realizadas con Gamay, maceración 9 días a 28°C Figura 3: índice de color de tres vinos diferentes de Pinot Negro fermentados con diferentes cepas de levaduras (según BIVB, 1991). Figura 4: concentración en antocianos de tres vinos diferentes de Pinot Negro fermentados con diferentes cepas de levaduras (según BIVB, 1991) Figura 1: influencia de la levadura sobre la concentración en antocianos (según Loiseau et al., Cahier technique ITV, 1994). Experiencias realizadas en Gamay, maceración 9 días a 28°C 8 cepas de levadura, podría ser explicada por estos perfiles de hidrofobicidad diferentes de las paredes. Varios ensayos realizados en colaboración con el ITV (Institut Technique du Vin) y AWRI (Australian Wine Research Institute), confirman, en gran volumen, la existencia de este efecto esponja que se traduce siempre en una diferencia significativa en los índices de color, índices de polifenoles totales y en el contenido en antocianos de los vinos (Cuinier, 1994, Dillon et al. , 2001). Otros trabajos conducidos en Estados Unidos (Watson et al., 1996) muestran también que la cepa de levadura podría tener un efecto sobre el contenido en taninos de un vino. Con algunas cepas, es posible obtener vinos más ricos en catequinas, epicatequinas y ácido gálico (ver Figura 5). Figura 5: ejemplo de la acción de la levadura sobre la composición fina en polifenoles de un vino de Pinot (según Watson et al., 1996) Ninguna hipótesis permite explicar esta observación, aunque sí este fenómeno podría ser debido al mismo tipo de acción que el efecto esponja. Estabilización del color La pared de la célula de levadura esta compuesta por polisacáridos del tipo glucanos y manoproteínas. La composición fina de la pared parece ser especifica de la cepa de levadura. Es conocido desde hace mucho tiempo, que después de la muerte de la levadura, gracias al fenómeno de autolisis, se liberan en el medio la mayoría de los compuestos celulares incluyendo el material de la pared. Pero al final de los años 80, algunos científicos encontraron que se liberaban también durante la fermentación alcohólica polisacáridos de origen parietal (Canal- Llaubères, 1986) y recientemente fue demostrado que esta liberación de polisacáridos pariétales durante la fermentación alcohólica varia de una cepa a otra (Rosi et al., 1998) (Figura 6). Esta liberación diferencial tiene consecuencias sobre la composición polifenólica de los vinos. De hecho algunos de estos polisacáridos liberados durante la fermentación, tienen la capacidad de ligarse con antocianos y taninos (Escot et al., 2001). Parece que solamente algunas cepas de levadura tienen la capacidad de liberar polisacáridos de tanto interés. Eso podría ser debido al hecho que la composición fina de la pared varía de una cepa a otra y que la liberación de los constituyentes de estas paredes varía también en función de la cepa. Un análisis mas fino, después de la purificación de estos polisacáridos liberados durante y 0 50 100 150 ácido gálico catequinas epicatequinas fenoles polimerizados quercitines (glycosides)quercitinas (agliconas) malvidina antocianos (monoméricos) media Levadura A antocianos (poliméricos) 0 50 100 150 ácido gálico catequinas epicatequinas fenoles polimerizados quercitines (glycosides)quercitinas (agliconas) malvidina antocianos (monoméricos) media Levadura A antocianos (poliméricos) 9 0 10 20 30 40 50 60 I of PVPP (%) Control 100 mg strain1 FA 200 mg strain1 FA 100 mg strain2 FA 200 mg strain2 FA 100 mg strain1 aut 200 mg strain1 aut 100 mg strain2 aut 200 mg strain 2 aut después del fin de la fermentación, ha permitido confirmar que la naturaleza de estos elementos es esencialmente manoproteínica. El hecho más sorprendentede estos estudios es, que en función de la cepa y de su momento de liberación, las manoproteínas liberadas no tienen la misma capacidad de ligarse con los diferentes elementos polifenólicos de un vino (ver Figuras 7 y 8). En general, las manoproteínas liberadas durante la autolisis provenientes de cualquiera cepa, pueden formar un complejo con los taninos permitiendo una disminución muy significativa del índice de gelatina, que mide la reactividad de los taninos. Pero solamente algunas manoproteínas liberadas por cepas especificas durante la fermentación alcohólica y después de la muerte de la célula, permiten una combinación con los taninos y los antocianos. Figura 6: medida de la cantidad de polisacáridos liberados por diferentes cepas durante la fermentación de un mosto sintético (20% azúcares, 25°C) La aparición de estos nuevos complejos (ver Figura 9) se traduce por una disminución de la astringencia de los vinos y sobre todo por un aumento de la estabilidad del color. El resultado de esto, es que los vinos fermentados con estas cepas particulares, han sido juzgados como más suaves que los vinos testigos por un panel de cata. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 po ly sa cc ha ri de s (m g/ l) L M N O P Q R S T U V W X Y POLYSACCHARIDES PRODUCTION IN SYNTHETIC MUST BY DIFFERENT YEAST STRAINS 0 10 20 30 40 50 60 70 I o f g el at in (% ) Con tro l 10 0 m g s tra in1 F A 20 0 m g s tra in1 F A 10 0 m g s tra in2 F A 20 0 m g s tra in2 F A 10 0 m g s tra in1 au t 20 0 m g s tra in1 au t 10 0 m g s tra in2 au t 20 0 m g s tra in 2 a ut Figura 7: Variación de los índices de gelatina de un vino joven de Pinot Noir no filtrado con adición de distintas manoproteínas (S. Escot et al., 2000). FA: fermentación alcohólica, Aut: autolisis. Figura 8: Variación de los índices de PVPP de un vino joven de Pinot Noir no filtrado con adición de distintas manoproteínas (S. Escot et al., 2000), FA: fermentación alcohólica, Aut: autolisis. 10 Figura 9: hipótesis de la acción de polisacáridos sobre los taninos (Saucier et al., 1996) Acción de β-glicosidasas Por fin y resumiendo, es importante acordarse que las levaduras Saccharomyces cerevisiae expresan actividades enzimáticas del tipo β-glicosidasas, incluso en presencia del glucosa o fructosa en el mosto. De hecho, estas actividades localizadas en su mayoría en el espacio periplásmitico, no son inhibidas por los azúcares. La presencia de estas actividades conduce a una disminución en los vinos de la concentración de la forma glicosilada de los antocianos y entonces a una precipitación del color, la forma aglicona de los antocianos es inestable. Fue demostrado por algunos equipos científicos (Sponholz, 1992), que algunas levaduras fermentativas no tenían tal actividad. Estos mutantes naturales permiten de esta manera, proteger el potencial del color de un mosto limitando los fenómenos de hidrólisis de los antocianos. Papel de la levadura sobre los aromas Como ya ha sido presentado en la introducción de este artículo, la levadura puede actuar sobre el perfil aromático de un vino tinto con la producción de aromas fermentativos, pero también gracias a la revelación de aromas varietales de uvas aromáticas o nobles a partir de precursores sin olor. La producción de aromas fermentativos no será discutida aquí. En resumen, esta producción depende de la cepa de levadura utilizada, de la temperatura de fermentación y de la concentración en nitrógeno fácilmente asimilable del mosto (y entonces del régimen de nutrición en nitrógeno). La levadura gracias a su metabolismo puede a partir de una fuente de aminoácidos y de azúcares producir cetoacidos a través una vía de transaminacion. Estos cetoacidos pasan después por una vía de decarboxilacion y reducción y son transformados en alcoholes superiores. Gracias a algunas actividades enzimáticas del tipo esterasas, la levadura puede combinar estos alcoholes con ácidos grasos para producir esteres de ácidos grasos que participan en el perfil aromático de los vinos. El papel de la levadura sobre los aromas varietales ha sido mas estudiado en las variedades de vinos blancos que en las de vinos tintos. Pero lo que pasa en los precursores de aromas en el vino blanco se aplica también en los de vinos tintos. Por ejemplo, en el caso de los norisoprenoides, que se encuentran en variedades como la syrah, el mecanismo de revelación es del mismo tipo que el descrito para los terpenoles en uvas blancas, a saber que: Catequinas y epicatequinas Polimerización y agregacion en presencia de etanal Precipitación Estabilización acción de gelatina = etapa de encolado Acción de polisacáridos manoproteínas Catequinas y epicatequinas Polimerización y agregacion en presencia de etanal Precipitación Estabilización acción de gelatina = etapa de encolado Acción de polisacáridos manoproteínas 11 -estas moléculas se encuentran en el mosto en forma de precursores sin olor y ligados a una fracción glicosídica. -la levadura gracias a su potencial enzimático en glicosidasas puede actuar sobre estos precursores para cortar la fracción de azúcar y liberar la parte volátil de la molécula que aparece ya como aromática. -este potencial enzimático varía de una cepa de levadura a otra, lo que significa que en función de la cepa de levadura utilizada, el potencial aromático varietal del mosto será mas o menos revelado (ver Figuras 10 y 11). Figura 10: Evolución de la población y de la actividad β-glucosidasa de 3 cepas de levadura, datos obtenidos en syrah, escala laboratorio. (Garcia et al., 1998). Figura 11: efecto de la levadura sobre la revelación de norisoprenoides, ensayos hechos en escala piloto en Bordeaux. (Gerland et al., 2001) En el caso de la variedad Merlot, la acción de la levadura está constatada pero no demostrada desde un punto de vista científico. En esta variedad, hay una familia de moléculas aromáticas relativamente bien conocidas: el furaneol y homofuraneol que tienen aromas de fresa y caramelo. Estos compuestos existen también en el mosto sobre la forma de precursores sin olor. Aunque si hoy la acción exacta de la levadura no es conocida, se observa una producción diversa en los vinos obtenidos de un mismo mosto de Merlot con diferentes cepas de levadura (todos los otros parámetros de vinificación sean idénticos) (ver figura 12). En consecuencia, la elección de la cepa de levadura (y el conocimiento de su potencial de revelación), será importante por la valorización de su matera prima. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 25 34 50 74 98 Temps de fermentation no m br e de c el lu le s (m ill io ns / m l) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 nk at / m g de p ro té in es l Population souche 1 Population souche 2 Population souche 3 Activité souche 1 Activité souche 2 Activité souche 3 Levadura 1 la mas eficaz por la revelación de los C13-norisoprenoides 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 25 34 50 74 98 Temps de fermentation no m br e de c el lu le s (m ill io ns / m l) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 nk at / m g de p ro té in es l Population souche 1 Population souche 2 Population souche 3 Activité souche 1 Activité souche 2 Activité souche 3 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 25 34 50 74 98 Temps de fermentation no m br e de c el lu le s (m ill io ns / m l) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 nk at / m g de p ro té in es l Population souche 1 Population souche 2 Population souche 3 Activité souche 1 Activité souche 2 Activité souche 3 Levadura 1 la mas eficaz por la revelación de los C13-norisoprenoides 100 600 1100 1600 2100 2600 3100 Lev. 1 Lev.2 Lev. 3 Lev. 4 norisoprenoides ng/L 100 600 1100 1600 2100 2600 3100 Lev. 1 Lev. 2 Lev. 3 Lev. 4 norisoprenoides ng/L 12 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 Lev. 1 Lev. 2 Lev. 3 Lev. 4 furanéol/homoF µg/L 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 Lev. 1 Lev. 2 Lev. 3 Lev. 4 furanéol/homoF µg/L Utilización de levaduras inmovilizadas en bodega Para ilustrar estas contribuciones, se puede dar dos ejemplos de problemas que se pueden resolver con una solución que viene desde un concepto biotecnológico y de investigación fundamental: los problemas de corrección de la acidez del vinos y la segunda fermentación de los vinos espumosos. Una solución interesante es proteger a la levadura inmovilizándolas en perlitas de alginato de doble capa. La idea de inmovilizar células en un gel de alginato es bastante vieja. Los objetivos principales son aumentar la concentración creciente de células en el reactor y facilitar la separación de medio (fase líquida) y biomasa activa (fase sólida). La doble capa impide la liberación de células jóvenes al medio de cultivo. Actualmente, la empresa portuguesa Proenol, compañía especializada en biotecnología enológica, ha hecho posible la producción industrial y el secado de las perlitas. Siendo posible entonces almacenar durante 6 meses a 1 año. La ventaja práctica de las levaduras inmovilizadas es que pueden ser fácilmente introducidas y extraídas del mosto-vino en fermentación, ya que éstas se encuentran inmovilizadas en cápsulas de alginato contenidas en bolsas. Además, durante la inmovilización industrial, las levaduras son aclimatadas al medio donde deben trabajar, como es el caso del alcohol, de esta forma las levaduras pueden ser introducidas directamente en el vino con problemas de paradas o para realizar una segunda fermentación. Las levaduras de la especie Schizosaccharomyces pombe ofrece una nueva manera para controlar la acidez de mostos y vinos. El ácido málico es uno de los ácidos orgánicos importantes presente en las uvas. Este ácido tiene una influencia muy fuerte sobre la calidad organoléptica de los vinos. La fermentación maloláctica es una vía biológica para transformar el ácido málico en láctico, reduciendo la acidez del vino. Las cepas de levadura Schizosaccharomyces son bien conocidas para tener una capacidad fuerte en la degradación del ácido málico mediante la fermentación malo-alcohólica. Estas levaduras son capaces de usar el ácido málico produciendo etanol. Es claro que estas levaduras son también capaces de desempeñar la fermentación alcohólica de azúcares y cuando esto sucede pueden aparecen aromas negativos en el vino. La inmovilización de este levaduras hizo posible el control biológico de su metabolismo. Figura 12: efecto de la levadura sobre la revelación de los aromas varietales del Merlot (Gerland et al., 2001). Ensayos conducidos a escala piloto en Bordeaux. 13 Otro ejemplo a ilustrar es la aplicación en la elaboración de vinos espumosos. Según el método tradicional, que es el método usado en el proceso de Champaña. Se trabaja con la adición de azúcar en el vino blanco seco (20-24 g/L) y la inoculación de levaduras (3-4 millones de células/mL). Esta mezcla se embotella y se guardan en un lugar seco fresco. Después de 9 meses, el azúcar se ha convertido en CO2 y alcohol. El problema es eliminar las células de levadura después de los 9 meses. Para eliminar estas levaduras, el método más frecuentemente usado es el “remuage”: poco a poco las botellas son inclinadas para que el sedimento de levadura se acumule en el cuello de la botella. Este sedimento, que es más o menos de 4 mL se congela en el cuello de la botella y posteriormente se elimina y después la botella se llena entonces con una mezcla de vino y azúcar. Es obvio que este método es difícil administrar: toma mucho espacio en la sala de elaboración y toma mucho tiempo y mano costosa de obra. La solución aportada esta vez consiste en la inmovilización de levaduras Saccharomyces bayanus en doble capa de alginato. Primero, el azúcar y el vino blanco seco se mezclan y se embotellan. Después unas 300 perlitas de levadura se agregan por botella. Después de la fermentación y el almacenaje requerido, las botellas se ponen el posición vertical para que las perlitas bajen en simplemente unos segundos al cuello de la botella. Después esto, el proceso es como antes, las perlitas se congelan en un bloque de hielo y se eliminan en el degüello. Conclusiones • La selección y utilización de levaduras en vinificación no solo ayuda a mejorar un proceso microbiano industrial, si no también a definir perfiles y estilos de vinos determinados. • La levadura tiene una acción sobre la composición polifenólica de los vinos tintos, tanto a nivel de los antocianos como de los taninos: -Efecto Esponja. -Acción de algunos polisacáridos parietales sobre los antocianos y taninos. -Acción de β-glicosidasas sobre los antocianos libres y glicosidados. • La levadura tiene también un efecto sobre la fracción aromática de los tintos. -Acción demostrada sobre los terpenoles y C13-norisoprenoides -Acción constatada sobre la familia de los furaneoles. -Ninguna acción sobre las moléculas de tipo pirazina (familia de aroma varietal de la variedad Cabernet franc y Cabernet sauvignon y que tiene olor de pimiento verde). • Las levaduras inmovilizadas ayudan a simplificar y economizar en ciertas técnicas muy específicas fermentativas, lo que permite también un mejor control sobre los procesos. • Es importante no olvidar también que la levadura produce durante la fermentación alcohólica aromas fermentativos. Entonces gracias a las diferentes acciones durante la fermentación alcohólica la levadura, puede actuar sobre el color, la textura y el perfil aromático de los vinos tintos. En consecuencia, su elección debería estar considerada de manera seria y eso en función del objetivo del enólogo en termino de vino, del potencial de su matera prima y por fin, del equipamiento de su bodega. 14
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