REPORT Y EVALUACIÓN ECONÓMICA

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PROYECTO DE FIN DE GRADO 
 
MICROENCAPSULACIÓN DE LEVADURA CON 
ALGINATO EN SISTEMA SEMICONTINUO, Y 
ESTUDIO DE LA CINÉTICA DE FERMENTACIÓN. 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE CATALUÑA 
 GRADO EN INGENIERÍA QUÍMICA 
 AUTOR/A: SANTI GARRIDO TÉLLEZ 
 TUTOR/A: MANUEL JOSE LIS ARIAS 
 FECHA DE ENTREGA: 22 DE JUNIO DE 2022 
 
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RESUMEN 
 
La inmovilización de microorganismos, mediante la microencapsulación en una matriz biopolimérica, es 
actualmente un campo emergente por la funcionalidad de sus aplicaciones en medicina, alimentación, 
cosmética y textil, entre otros grandes campos industriales. 
En este proyecto se estudia el caso concreto de la microencapsulación de levadura (“Saccharomyces 
cerevisiae”) en una matriz de alginato de sodio (biopolímero), haciendo uso del método de gelificación 
iónica. Se han aplicado diferentes parámetros para las variables influyentes en la extrusión y gelificación 
de la gota para poder determinar su influencia en las características de las microcápsulas resultantes. Las 
variables estudiadas se centran en determinar el comportamiento reológico entre la fase de matriz 
envolvente de biopolímero y la fase interna de disolución del microorganismo. 
También se han determinado los efectos de la inmovilización de la levadura en la cinética de la 
fermentación alcohólica con D-glucosa, para ello se han contrastado los resultados de la cinética del 
microorganismo libre e inmovilizado. La ventaja que proporcionan las microcápsulas en el aspecto 
cinético es el control de la velocidad de reacción (limitada por difusión), empleando el microorganismo 
como un biocatalizador y obteniendo diferentes esquemas cinéticos en función de las características la 
microcápsula. 
 
 Palabras clave: Microencapsulación, alginato, inmovilización de microorganismos, gelificación 
iónica, fermentación alcohólica, difusión. 
 
ABSTRACT 
 
The immobilization of microorganisms, through microencapsulation in a biopolymeric matrix, is 
currently an emerging field due to the functionality of its applications in medicine, food, cosmetics and 
textiles, among other large industrial fields. 
In this project, the specific case of microencapsulation of yeast (“Saccharomyces cerevisiae”) in a matrix 
of sodium alginate (biopolymer) using the ionic gelation method, is studied. Different parameters have 
been applied for the influential variables in the extrusion and gelation of the drop in order to determine 
their influence on the characteristics of the resulting microcapsules. The variables studied are focused on 
determining the rheological behavior between the enveloping matrix phase of the biopolymer and the 
internal dissolution phase of the microorganism. 
The effects of yeast immobilization on the kinetics of alcoholic fermentation with D-glucose have also 
been determined, for which the results of the kinetics of the free and immobilized microorganism have 
been contrasted. The advantage provided by microcapsules in the kinetic aspect is the control of the 
reaction rate (limited by diffusion), using the microorganism as a biocatalyst and obtaining different 
kinetic schemes depending on the characteristics of the microcapsule. 
 
 Key words: Microencapsulation, alginate, immobilization of microorganisms, ionic gelation, 
alcoholic fermentation, diffusion. 
 
 
 
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AGRADECIMIENTOS 
 
Primeramente, agradecer al profesor J. Manel Lis Arias por su colaboración, su confianza y todos sus 
conocimientos aportados en este proyecto y durante todo el grado en general. 
Agradecer también a mis compañeros Arnau Adrover y Mireia Sans, por facilitarme sus proyectos, ya 
haya sido de primera mano o a través del depósito de proyectos de la universidad. Sin sus dos proyectos 
antecedentes habría sido mucho más laborioso realizar los procedimientos experimentales y comprender 
las variables que intervienen en este sistema complejo. 
Por último, agradecer a Kevin Torres por estar siempre dispuesto a ayudarme en el laboratorio y por 
aportarme su experiencia en este ámbito. Y a mi pareja y amigos por la comprensión en los momentos 
más difíciles y colaboración en los aspectos necesarios. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
ÍNDICE 
 
RESUMEN ...................................................................................................................................... 2 
ABSTRACT .................................................................................................................................... 2 
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................... 3 
ÍNDICE ........................................................................................................................................... 4 
LISTA DE TABLAS ....................................................................................................................... 5 
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................................... 6 
LISTA DE ECUACIONES ............................................................................................................. 11 
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 12 
1.1. Presentación .............................................................................................................. 12 
 
1.2. Objetivos .................................................................................................................... 12 
 
1.3. Alcance ...................................................................................................................... 13 
 
2. PARTE TEÓRICA .................................................................................................................. 14 
 
2.1. Microencapsulación ............................................................................................... 14 
 
2.1.1. Introducción a los sistemas de inmovilización de microorganismos .................. 14 
2.1.2. Métodos de microencapsulación ......................................................................... 15 
2.1.3. Aplicaciones industriales..................................................................................... 16 
 
2.2. Reactivos ................................................................................................................. 17 
 
2.2.1. Levadura (Saccharomyces Cerevisiae) ............................................................ 17 
 
 2.2.1.1 Características y propiedades ........................................................................ 17 
2.2.1.2 Funciones en el proyecto .............................................................................. 17 
 
2.2.2. Alginato de sodio .............................................................................................. 18 
 2.2.2.1 Características y propiedades ........................................................................ 18 
2.2.2.2 Funciones del proyecto ................................................................................ 19 
 
 
5 
 
2.2.2. Cloruro de calcio .............................................................................................. 20 
 
 2.2.3.1 Carácterísticas y propiedades ........................................................................ 20 
 2.2.3.2 Funciones en el proyecto ............................................................................... 20 
 
 2.2.3. D-Glucosa ........................................................................................................21 
 
 2.2.4.1 Características y propiedades ........................................................................ 21 
2.2.4.2 Funciones en el proyecto .............................................................................. 21 
 
2.2.4. Ácido 3,5-dinitrosalicílico ................................................................................. 22 
 
 2.2.5.1 Características y propiedades ........................................................................ 22 
2.2.5.2 Funciones en el proyecto .............................................................................. 22 
 
2.2.5. Tartrato sódico/potásico .................................................................................... 23 
 
 2.2.6.1 Características y propiedades ........................................................................ 23 
2.2.6.2 Funciones en el proyecto .............................................................................. 23 
. 
2.2.6. Hidróxido de sodio ............................................................................................ 23 
 
 2.2.7.1 Características y propiedades ........................................................................ 23 
2.2.7.2 Funciones en el proyecto .............................................................................. 23 
 
2.3. Métodos usados ............................................................................................................ 24 
 
2.3.1. Emulsión iónica ............................................................................................... 24 
2.3.2. Método DNS ................................................................................................... 25 
 
2.4. Modelización del sistema ............................................................................................. 26 
 
2.4.1. Montaje extrusor coaxial ................................................................................. 26 
2.4.2. Flujos en el extrusor ........................................................................................ 27 
2.4.3. Variables implicadas en el sistema .................................................................. 28 
2.4.4. Tamaño de las microcápsulas .......................................................................... 29 
2.4.5. Cinética de fermentación de la levadura ......................................................... 30 
 
 2.4.5.1 Cinética de reacción de la levadura sin encapsular ....................................... 30 
 2.4.5.2. Cinética de reacción de la levadura encapsulada ......................................... 31
 
6 
 
 
3. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................... 32 
 
3.2. Esferas de alginato ........................................................................................................ 32 
 
3.2.1. Objetivos .......................................................................................................... 32 
3.2.2. Reactivos .......................................................................................................... 32 
3.2.3. Equipos y herramientas .................................................................................... 33 
3.2.4. Metodología ..................................................................................................... 34 
 
 3.1.4.1 Producción de las esferas de alginato ............................................................ 34 
 3.1.4.2 Análisis óptico de las esferas ........................................................................ 37 
 
 3.1.4.2.1 Observación con microscopio y realización de fotografías .................... 37 
 3.1.4.2.2 Medición de diámetros con Image J ....................................................... 38 
 
3.2.5. Medición de la viscosidad en función de la concentración ............................. 39 
 
3.2.6. Resultados y conclusiones ............................................................................... 40 
 
 
3.3. Microcápsulas de levadura ........................................................................................... 41 
 
3.3.1. Objetivos……………………………………………………………………...41 
3.3.2. Reactivos……………………………………………………………………...41 
3.3.3. Equipos y herramientas ................................................................................... 42 
3.3.4. Metodología 1: Estudio de la influencia de las concentraciones ..................... 43 
 
 3.2.4.1 Elaboración de las microcápsulas.................................................................. 43 
 3.2.4.2 Análisis óptico de las microcápsulas ............................................................. 45 
 
 3.2.4.2.1 Observación con microscopio y realización de fotografías .................... 45 
 
 3.2.4.2.1.1 Fotografías de las microcápsulas hidratadas ................................... 45 
 3.2.4.2.1.2 Fotografías de las microcápsulas deshidratadas .............................. 46 
 3.2.4.2.1.3 Comparación entre microcápsulas hidratadas y deshidratadas........ 47 
 
 3.2.4.2.2 Medición de diámetros con Image J ....................................................... 48 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
3.3.5. Metodología 2: Estudio de la influencia de los caudales ................................ 49 
 
 3.2.5.1 Elaboración de las microcápsulas.................................................................. 49 
 3.2.5.2 Análisis óptico de las microcápsulas ............................................................. 49 
 
 3.2.5.2.1 Observación con lupa esteroscópica y medición de diámetros .............. 49 
 3.2.5.2.2 Presentación de diámetros en función de la relación de caudales .......... 50 
 
3.3.6. Medición de la viscosidad en función de la concentración ............................. 51 
3.3.7. Resultados y conclusiones ............................................................................... 52 
 
3.4. Estudio de la cinética de reacción ................................................................................ 53 
 
3.4.1. Objetivos ......................................................................................................... 53 
3.4.2. Reactivos ......................................................................................................... 53 
3.4.3. Equipos y herramientas ................................................................................... 54 
3.4.4. Metodología 1: Recta de calibración del espectrofotómetro ........................... 55 
 
 3.3.4.1 Preparación del reactivo DNS ....................................................................... 55 
 3.3.4.2 Reacción con concentraciones de D-glucosa conocidas ............................... 56 
 3.3.4.3 Lectura de absorbancias con el espectrofotómetro ........................................ 57 
 3.3.4.4 Tratamiento de datos y obtención de la recta de calibración ......................... 58 
 
3.4.5. Metodología 2: Cinética de reacción de la levadura sin encapsular ................. 59 
 
 3.3.5.1 Preparación del reactor .................................................................................. 59 
 3.3.5.2 Estudio de la cinética ..................................................................................... 60 
 
3.4.6. Metodología 3: Cinética de reacción de las microcápsulas .............................. 63 
 
 3.3.6.1 Preparación del reactor .................................................................................. 63 
 3.3.6.2 Estudio de la cinética ..................................................................................... 64 
 
3.4.7. Resultados y conclusiones ................................................................................ 664. CONCLUSIONES DEL PROYECTO .................................................................................. 67 
5. EVALUACIÓN ECONÓMICA ............................................................................................ 68 
6. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................... 69 
 
 
 
 
8 
 
LISTA DE TABLAS 
 
Tabla 1. Clasificación de métodos de microencapsulación [1]. ...................................................... 15 
Tabla 2. Cociente de diámetros de las microesferas para ditintas concentraciones de alginato. ..... 38 
Tabla 3. Suma de diámetros de las microesferas en función de la viscosidad ................................ 38 
Tabla 4. Viscosidad del alginato en mPa·s para distintas concentraciones ..................................... 39 
Tabla 5. Validez de las microcápsulas en función de la concentración másica. ............................. 44 
Tabla 6. Media de diámetros para diferentes relaciones de caudales. Concentraciones de alginato y 
levadura de 2-5, 2-15 y 2.5-10 respectivamente. ............................................................................ 50 
Tabla 7. Viscosidad de la levadura en mPa·s. ................................................................................. 51 
Tabla 8. Lecturas de absorbancias ................................................................................................... 58 
Tabla 9. Datos de absorbancias de las lecturas (a 490 nm) de las muestras tomadas en diferentes 
instantes, y tratamiento de estos ...................................................................................................... 61 
Tabla 10. Datos de absorbancias de las lecturas (a 490 nm) de las muestras tomadas en diferentes 
instantes, y tratamiento de estos ...................................................................................................... 65 
Tabla 11. Coste de los reactivos empleados en el proyecto ............................................................ 68 
Tabla 12. Coste del consumo energético del proyecto .................................................................... 68 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1. Bacteria inmovilizada en matriz de alginato [17]. ........................................................... 14 
Figura 2. Tipos de inmovilización de compuestos activos [1] ........................................................ 14 
Figura 3. Microcápsulas de Omega-3 [18] ...................................................................................... 16 
Figura 4. Levadura, vista macroscópica [19] .................................................................................. 17 
Figura 5. Levadura, fotografía realizada con SEM [20] .................................................................. 17 
Figura 6. Monómeros M y G, respectivamente ............................................................................... 18 
Figura 7. Grupos GG, MM y GM respectivamente [1]. .................................................................. 18 
Figura 8. Viscosidad del alginato en función de su concentración, para distintos pesos 
moleculares. [1]. .............................................................................................................................. 18 
Figura 9. Microcápsula de alginato. ................................................................................................ 19 
Figura 10. Microcápsula de alginato con otros parámetros de alimentación ................................. 19 
Figura 11. Cloruro de Clacio usado en la parte experiental ............................................................ 20 
Figura 12. Estructura de Lewis del Cloruro de Calcio ionizado [21] .............................................. 20 
Figura 13. Estructura química de la glucosa. [8]. ............................................................................ 21 
Figura 14. Proyecciones de los enantiómeros de la Glucosa (izquierda D, derecha L) [22] ........... 21 
Figura 15. Estructura química del acido DNS [9]. .......................................................................... 22 
Figura 16. Ácido DNS usado en la parte experimental ................................................................... 22 
Figura 17. Fórmula molecular del hidróxido de sodio potasio [2]. ................................................. 23 
Figura 18. Hidróxido de sodio usado en la parte experimental ....................................................... 23 
Figura 19. Comportmiento estructural de la gelficación iónica [1]. ................................................ 24 
Figura 20. Cubeta del espectrofotómetro [23] ................................................................................. 25 
Figura 21. Reacción redox del DNS y la Glucosa [2] ..................................................................... 25 
Figura 22. Montaje del sistema extrusor. ........................................................................................ 26 
Figura 23. Flujos en el extrusor. [25] .............................................................................................. 27 
Figura 24. Radio de las microcápsulas (um) en función de la relación de caudales (Qd/Qc), para 
distintas concentraciones de alginato [1] ......................................................................................... 29 
Figura 25. Reacción de fermentación alcohólica [16] ..................................................................... 30 
Figura 26. Reactivos empleados en la parte experimental 1. .......................................................... 32 
Figura 27. Esferas de alginato obtenidas en el laboratorio .............................................................. 35 
Figura 28. Montaje para extrusión .................................................................................................. 35 
Figura 29. Disolución de alginato del 1% w/w. ................................................................................. 35 
Figura 30. Extrusor coaxial y jeringas de alimentación. ................................................................. 35 
Figura 31. Microscópio biológico y software.................................................................................. 37 
Figura 32. Esferas de alginato con concentración másica 1, 1.5, 2 y 2.5% respectivamente. ......... 37 
Figura 33. Imagen de esfera con escala. .......................................................................................... 38 
Figura 34. Viscosímetro de tambor rotatorio. ................................................................................. 39 
Figura 35. Viscosidad del alginato en función de su concentración ............................................... 39 
Figura 36. Suma de diámetros en función de la viscosidad. ........................................................... 40 
Figura 37. Cociente de diámetros en función de la viscosidad. ...................................................... 41 
Figura 38. Reactivos empleados en la parte experimental 2. .......................................................... 44 
Figura 39. Montaje para la extrusión de microcápsulas. .................................................................44 
Figura 40. Microcápsulas obtenidas en el laboratorio. .................................................................... 45 
 
 
10 
 
 
Figura 41. Microcápsulas hidratadas de concentraciones de alginato y levadura 
de 2-5, 2-10, 2-15, 2.5-10 y 2.5-15 % w/w respectivamente ............................................................. 46 
Figura 42. Microcápsulas deshidratadas de concentraciones de alginato y 
levadura de 2-5, 2-10, 2-15, 2.5-10 y 2.5-15 % w/w respectivamente. ............................................. 47 
Figura 43. Cápsula deshidrata e hidratada, fotografías a la lente del microscópio biológico. ........ 49 
Figura 44. Fotografía a la lente de la lupa estereoscópica. .............................................................. 51 
Figura 45. Viscosidad en función de la concentración. ................................................................... 52 
Figura 46. Media de diámetros en función de la relación de caudales, para los pares 2-5 y 2-15. . 55 
Figura 47. Disoluciones realizadas para el reactivo DNS. .............................................................. 55 
Figura 48. Reactivo DNS. ............................................................................................................... 56 
Figura 49. Reacción en baño térmico y productos del reactivo DNS con concentraciones 
de D-Glucosa conocidas. ................................................................................................................. 57 
Figura 50. Absorbancia en función de la longitud de onda incidente (en nm) 
para concentraciones determinadas de Glucosa. ............................................................................. 58 
Figura 51. Recta de calibración del espetofotómetro. ..................................................................... 58 
Figura 52. Reactor tipo Batch de levadura libre. ............................................................................. 59 
Figura 53. Absorbancia en función de la longitud de onda incidente (en nm) 
para las concentraciones de Glucosa a distintos tiempos. ............................................................... 60 
Figura 54. Concentración de Glucosa en g/L en función del tiempo, para levadura libre. ............. 61 
Figura 55. Reactor tipo Batch de levadura inmovilizada. ............................................................... 63 
Figura 56. Absorbancia en función de la longitud de onda incidente (en nm) 
para las concentraciones de Glucosa a distintos tiempos. ............................................................... 64 
Figura 57. Concentración de Glucosa en g/L en función del tiempo, para levadura encapsulada .. 65 
Figura 58. Concentración de Glucosa en g/L en función del tiempo para levadura libre (azul) e 
inmovilizada (rojo). ......................................................................................................................... 66 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
LISTA DE ECUACIONES 
 
 
Ecuación 1. Reacción alginato sódico con catión bivalente de calcio [1] ....................................... 15 
Ecuación 2. Ley de Lambert-Beer [24] ........................................................................................... 25 
Ecuación 3. Número de Reynolds [1] ............................................................................................. 27 
Ecuación 4. Cinética del consumo de sustrato limitada por difusión [2] ........................................ 30 
Ecuación 5. Cinética del consumo de sustrato simplificada [2] ...................................................... 30 
Ecuación 6. Recta de calibración .................................................................................................... 58 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1 Presentación 
El proyecto presentado a continuación es mayoritariamente experimental. El método y las variables 
aplicadas son válidos para realizar las microcápsulas con las características deseadas y proporcionar el 
control de ciertos aspectos de la cinética de una reacción reacción bioquímica. Se han empleado los 
mismos equipos y métodos que en dos proyectos de fin de grado realizados por compañeros de la misma 
universidad [1], [2]. A diferencia de estos proyectos, se ha trabajado con un enfoque más funcional a 
nivel industrial. Teniendo presente que los parámetros experimentales de la alimentación, los de las 
microcápsulas obtenidas y los de la cinética de reacción, deberían ser aplicables para optimizar procesos 
bioquímicos existentes e incluso idear nuevos procesos que aprovechen el mayor control cinético que 
proporcionan las microcápsulas. 
 
1.2 Objetivos 
El objetivo del proyecto es la realización de microcápsulas de disolución de levadura con alginato como 
matriz envolvente. Se hará uso de un extrusor coaxial, alimentado con dos jeringas, y dos salidas 
concéntricas para generar gotas con la fase de la disolución de levadura en el interior. Se cuantificarán 
las variables fisicoquímicas del proceso y del resultado: 
- Concentración, caudal y viscosidad, de las disoluciones de alginato y levadura que alimentan al 
extrusor. 
- Diámetro y morfología de las microcápsulas obtenidas con los parámetros de alimentación 
cuantificados. 
Se hará uso de las variables mencionadas para determinar la influencia de los parámetros de la 
alimentación sobre los de las microcápsulas obtenidas, facilitando así la obtención de microcápsulas con 
las características deseadas para cumplir con los requisitos de la aplicación industrial. Las relaciones 
entre los parámetros de la alimentación del extrusor y las microcápsulas obtenidas se justificarán 
principalmente con el comportamiento reológico entre las fases de levadura y alginato. 
El segundo objetivo del proyecto consiste en determinar el efecto de las microcápsulas y sus 
características (diámetro) sobre la cinética de la fermentación alcohólica de la levadura con D-Glucosa. 
Se contrastará la cinética de reacción de la levadura sin encapsular frente a la de la levadura inmovilizada, 
para demostrar los efectos de la inmovilización sobre la velocidad de reacción, y se cuantificarán estos 
efectos mediante la constante cinética en determinados intervalos de tiempo. Mediante métodos 
matemáticos y la constante cinética se determinará el coeficiente de difusión de la levadura 
microencapsulada. Esta segunda parte es la de mayor interés a nivel industrial, ya que el control de la 
velocidad de reacción en una reacción biocatalizada, promueve la mayor eficiencia de los procesos 
bioquímicos ya existentes, e incluso, puede dar lugar a nuevos productos que aprovechen el control sobre 
los tiempos de reacción de los microrganismos. 
La cuantificación de las variables necesarias para cumplir el primer objetivo se realizará 
experimentalmente en todos los casos. Las viscosidades se obtendrán de la medida de un viscosímetro 
de tambor rotatorio, los caudales del avance de las jeringas de alimentación, y los diámetros de las 
microcápsulas resultantes de la observación con equipos ópticos. Para determinar el consumo de D-
Glucosa por parte del microrganismo se hará uso del método DNS, especificado en el proyecto, y que 
conlleva las lecturas de un espectrofotómetro de absorción atómica. Los resultados obtenidos se 
contrastarán bibliográficamente con los dos proyectos antecedentes y artículos que hacen estudio de las 
mismas variables para microcápsulas obtenidas con el mismo método y mismos componentes. 
 
13 
 
1.3 Alcance 
 
La metodología experimental del presente proyecto se llevará a cabo en trespartes: 
 
- Esferas de alginato. Se hará uso de la salida del centro del extrusor para trabajar solo con el 
alginato. Se realizarán esferas con distintas concentraciones y caudales de alginato para tener 
una idea previa del comportamiento de la gelificación iónica para los diferentes casos. Se hará 
uso de un viscosímetro para determinar la viscosidad del alginato a las diferentes 
concentraciones que se trabajará, y se realizarán fotos de las esferas resultantes con el 
microscopio y mediciones con un programa de procesado de imagen. El objetivo es obtener una 
referencia del tamaño y forma de las esferas en función de la viscosidad y del caudal de alginato. 
La influencia de la altura de caída de la gota y la concentración de la disolución iónica que 
permite la gelificación no se estudiarán en este proyecto, se aplicarán valores fijos y funcionales 
para estas dos variables. 
 
- Microcápsulas de levadura con alginato. Se alimentará el extrusor con las dos corrientes. Se 
realizarán microcápsulas para distintos caudales y concentraciones de alginato y levadura. Se 
hará uso de un viscosímetro para determinar la viscosidad de la levadura a las distintas 
concentraciones que se trabajará, y se realizarán fotos de las esferas resultantes con el 
microscopio y mediciones con un programa de procesado de imagen. El objetivo es cuantificar 
la influencia de la viscosidad y el caudal de ambas corrientes en el tamaño, forma y calidad de 
las microcápsulas resultantes. De nuevo no se estudiará el efecto de la altura de caída de la gota 
ni de la concentración de la disolución iónica dónde cae. 
 
- Estudio de la cinética. Se llevará a cabo con la levadura libre y con las microcápsulas del punto 
anterior que hayan dado mejores resultados. Se producirán las microcápsulas a mayor escala y 
se empleará un método analítico (DNS) para determinar el consumo de D-galactosa para la 
reacción de fermentación. Se estudiará el comportamiento de la cinética de reacción para obtener 
la constante cinética y, a partir de esta, se emplearán métodos matemáticos para obtener el 
coeficiente de difusión de la levadura microencapsulada. No se tendrá en cuenta la 
estequiometria de la reacción, al ser una reacción biológica con múltiples productos sería muy 
difícil de cuantificar, por lo que se realizará todo el estudio cinético en base al consumo de azúcar 
por parte del microorganismo. 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
2. PARTE TEÓRICA 
 
2.1 Microencapsulación 
2.1.1 Introducción a los sistemas de inmovilización de microorganismos 
El proceso de encapsulación consiste en la incorporación de una matriz polimérica con la finalidad de 
controlar la interacción de un compuesto activo (en este caso un microorganismo) con el exterior. Las 
partículas y compuestos són recubiertos de manera homogénia o heterogenia mediante diferentes 
métodos para obtener como producto cápsulas de unos pocos micrómetros hasta 1000um (equivalente a 
1mm). Se diferencia la fase interna o núcleo, que contiene el compuesto activo, de la fase externa con 
forma de membrana fina y semipermeable. Las propiedades de ambas fases dependen de las propiedades 
fisicoquímicas de los compuestos que las forman y de la técnica de encapsulación empleada [2], [3]. 
Los compuestos activos inmovilizados con una matriz polimérica se clasifican en microesferas y 
microcápsulas. Las microesferas se caracterizan por tener el pricipio activo disperso en la matriz en 
forma de moléculas o partículas. Las microcápsulas, en contraste, tienen un solo núcleo sólido o líquido 
recubierto por una película polimérica que actua de fase externa. Esta película puede estar compuesta 
por una membrana simple, múltiples membranas o múltiples núcleos entre membranas, y puede presentar 
formas esféricas o irregulares (Figura1). Para obtener la matriz polimérica se usan hidrocoloides, ya que 
són substáncias inocuas, capaces de absorber y retener agua y proporcionan rigidez estructural una vez 
emulsionados. En este caso el compuesto elegido para la parte experimental es el alginato de sodio, pero 
se podría haber hecho uso de otros biopolímeros con los mismos aspectos funcionales como la goma 
Guar, e incluso existen métodos de encapsulación que usan lípidos o proteínas como matriz externa [1], 
[2], [3]. 
El control de la interacción entre el principio activo y el medio, mediante una matriz polimérica, permite 
retrasar reacciones con el exterior que podrían degradar el pricnipio activo, augmentando así la vida útil. 
También permiten la liberación controlada del principio activo, o la absorción controlada del medio 
reactivo, objeto de estudio de este proyecto. Para el envasado y transporte de principios activos poco 
estables se usan para favorecer la manipulación en formato sólido y de morfología (macroscópica) 
ajustable a las necesidades del envasado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Bacteria inmovilizada en matriz de alginato [17]. Figura 2. Tipos de inmovilización de compuestos activos [1]. 
 
 
15 
 
2.1.2 Métodos de microencapsulación 
Existen varias técnicas de microencapsulación. La elección del método adecuado para una determinada 
aplicación se realiza considerando el tamaño de partícula objetivo y las propiedades fisicoquímicas del 
agente encapsulante y del principio activo a encapsular, así como el mecanismo de liberación deseado y 
los costes requeridos. Estos métodos pueden ser clasificados en tres grupos según si sus principios son 
físicos, químicos o fisicoquímicos [1]. La tabla presentada a continuación (Tabla 1) muestra los métodos 
de encapsulación existentes y su clasificación. 
 
Tabla 1: Clasificación de métodos de microencapsulación [1]. 
 
Para la microencapsulación llevada a cabo en este proyecto se usará el método de gelificación iónica. 
Este proceso de encapsulación se basa en la insolubilidad del biopolímero en un medio con iones 
inorgánicos, aldehídos, ácido cítrico, isocianato u otros. En el caso concreto del alginato sódico, se 
disuelve en agua dando lugar al polianión alginato, que posteriormente se insolubiliza en un medio con 
cationes bivalentes, en este caso Ca2+ procedente de CaCl2 [1]. 
Para aprovechar la reacción química de gelificación con el objetivo de envolver una fase interna es 
necesaria la aplicación de un método físico para obtener microgotas con las dos fases líquidas (quedando 
la fase del principio activo en el interior y la de alginato en el exterior). Las microgotas obtenidas se 
precipitan (“dripping” o goteo) sobre la disolución iónica con cationes bivalentes, propiciando la 
reacción iónica que desolubiliza el alginato. Se forma una capa insoluble en agua y permeable, que 
envuelve el núcleo y restringe la interacción entre este y el exterior [1]. La reacción que tiene lugar es la 
siguiente: 
2 Na – Alginato + Ca2+ → Ca – Alginato + 2 Na+ 
Ecuación 1: Reacción alginato sódico con catión bivalente de calcio [1]. 
Este método es muy indicado para la industria alimentaria debido a su inocuidad y bajo coste, aunque el 
estudio de las variables implicadas en la formación y gelificación/emulsión de la microgota resulta 
complicado. El comportamiento entre las dos superficies de fases líquidas (relogía) y el de la emulsión 
iónica están detallados en los apartados 2.4.2 y 2.3.1 respectivamente. 
 
 
 
 
16 
 
2.1.3 Aplicaciones industriales 
Las microcápsulas tienen múltiples aplicaciones en industrias de los campos de alimentación, 
farmacéutica, textil, cosmética, agrícola, entre otros. Se usan con varios fines como puede ser la 
liberación controlada de un principio activo, la conservación de alguna substancia frente a agentes 
externos, o facilitar el envasado y manipulación de ciertos productos. 
Su aparición en la industria se remonta al 1931. Cuando se realizó la primera investigación relacionada 
con la microencapsulación para la industria farmacológica,que consistía en la preparación de 
microesferas de gelatina mediante el proceso de coacervación. Posteriormente, el papel de copia sin 
carbón se convirtió en el primer producto comercial que surgió como resultado de la tecnología de 
microencapsulación [1]. 
Las microcápsulas realizadas en este proyecto son adecuadas para el sector alimenticio, ya que el alginato 
es un compuesto inocuo para nuestro organismo y en el proceso de encapsulación no interviene ningún 
agente perjudicial. La encapsulación en este caso se realiza con el objetivo de controlar, a partir de la 
difusión, la cinética de reacción de la levadura con el medio, obteniendo características deseadas en el 
producto fermentado o un proceso más óptimo. La encapsulación del microorganismo también favorece 
la estabilidad frente a agentes externos (pH, temperatura, medio reactivo e impurezas) propiciando una 
mayor vida útil a la dispersión de levadura. En el sector alimenticio también se usan microcápsulas como 
aditivos, con el fin de enriquecer los alimentos con vitaminas, minerales, ácidos grasos, polifenoles, 
fibras, enzimas, entre otros. En la imagen de esta página (Figura 3) se muestran cápsulas de Omega-3 
que se usan como aditivo para productos cárnicos, aportan un mejor valor nutricional sin variar las 
propiedades organolépticas del alimento. 
Otro campo de aplicación a destacar sería la industria farmacéutica. En este caso se realizan mirocápsulas 
del principio activo. Las características de las microcápsulas son estudiadas para que la liberación del 
principio activo se produzca en el lugar deseado del organismo (diferentes medios) y a la velocidad 
requerida para su óptima asimilación. De esta manera se encapsulan sustancias y también 
microorganismos probióticos, prebióticos y antibióticos, con los mismos fines mencionados 
anteriormente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Microcáspulas de Omega-3 [18]. 
 
17 
 
2.2 Reactivos 
 
2.2.1 Levadura (Sacharomyces Cerevisiae) 
 
2.2.1.1 Características y propiedades fisicoquímicas 
Levadura es el nombre común que hace referencia a una variedad de hongos unicelulares que producen 
enzimas capaces de provocar reacciones biológicas de descomposición de carbohidratos. Las levaduras 
están constituidas por Proteínas, Polisacáridos, Polifosfatos, Lípidos y Ácidos nucleicos y se reproducen 
rápidamente en medios favorables. La mayoría de las levaduras son sensibles a temperaturas altas y a un 
medio de acidez/basicidad considerable, llegando a tolerar valores de pH entre 3-10 [1], [2], [5]. 
Actualmente se conocen unas 500 especies de levadura con distintas aplicaciones para procesos de 
panificación, destilación y fermentación. En este proyecto se inmovilizará una levadura de la especie 
“Sacharomyces Cerevisiae”. Esta especie se usa sobretodo en sector alimenticio para la producción de 
pan, vino y cerveza. En un medio con presencia de azúcar, lo metaboliza obteniendo energía y 
produciendo dióxido de carbono y etanol, dando lugar a un producto fermentado, carbonatado y 
alcohólico, que tiene ciertas características aromáticas gracias a los fenoles y otros subproductos de la 
fermentación alcohólica. Ante la ausencia de azúcar en el medio, la levadura puede seguir otros caminos 
metabólicos, comprometiendo así su estabilidad para una reacción concreta, se debe conservar a una 
temperatura próxima a los 5ºC y en un medio seco, con el mínimo contacto con el aire. 
2.2.1.2 Funciones en el proyecto 
En este proyecto se inmovilizará levadura del tipo Sacharomyces Cerevisiae, esta actuará como núcleo 
activo de la microcápsula y se estudiará la cinética de su reacción en un medio rico en azúcar (D-
Glucosa). Cumpliendo entonces la función de reactivo encapsulado, se suspenderá en agua para tener 
una fase líquida homogénea y activada, lista para reaccionar en un medio con presencia de azúcar. Las 
ventajas de encapsular este microorganismo serán el control de la cinética de fermentación (detallado en 
el apartado 2.4.5.2) y el aumento de la estabilidad y, por ende, la vida útil. Los dos aspectos mencionados 
son los más interesantes de controlar, ya que este microorganismo sin encapsular presenta una cinética 
de reacción (detallada en el apartado 2.4.5.1) poco óptima y baja estabilidad frente a medios reactivos, 
como el mismo aire. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Levadura, vista macroscópica [19]. Figura 5. Levadura, fotografía realizada con SEM [20]. 
 
 
18 
 
2.2.2 Alginato de sodio 
 
2.2.2.1 Características y propiedades fisicoquímicas 
El alginato es un polisacárido lineal poliiónico e hidrofílico (soluble en agua) extraído de las algas pardas. 
Su forma comercial es un polvo marrón, blanco o amarillento, sin sabor e inodoro, y se vende en 
droguerías como aditivo alimentario [2]. El proceso de obtención del alginato se basa en la extracción 
del ácido algínico de las algas y la posterior incorporación de sales inorgánicas (carbonato sódico o 
hidróxido de sodio) para la neutralización del ácido obtención de un producto estable y soluble en agua 
(sal de alginato de sodio) [1]. El alginato se considera un hidrocoloide debido a su capacidad de formar 
un gel en disolución, siendo capaz de adherirse como matriz y estabilizar o espesar otro compuesto. [6]. 
La estructura polimérica del alginato está compuesta por dos monómeros (Figura 6), ácido β-D-
mannurónico (M) y ácido α-L-gulurónico (G), ligados con enlaces glucosídicos. La distribución de los 
monómeros (Figura 7) se da en bloques G o M o bloques con M y G alternados, y una mayor 
concentración de G produce el ordenamiento en zigzag de las cadenas poliméricas y una mayor 
concentración de M favorecerá que el polímero sea lineal. Según la dominancia de los bloques M y G, 
su disposición en la cadena polimérica y el peso molecular promedio del polímero, el gel de alginato 
presentará valores distintos de flexibilidad o rigidez, solubilidad viscosidad y estabilidad [1], [2]. La 
viscosidad del alginato será objeto de estudio debido a su influencia en los aspectos reológicos 
fundamentales para la extrusión y gelificación de las microcápsulas, el comportamiento de esta variable 
frente a la concentración de alginato y al peso molecular se muestra en la Figura 8. 
Su estructura química también permite la unión selectiva de cationes multivalentes. En disolución 
acuosa, la sal sódica del alginato se disocia en sodio y el polianión alginato. La unión de cationes 
bivalentes a dos grupos de la cadena polimérica cargados negativamente es lo que ocasiona el fenómeno 
de gelificación [1]. 
 
 
 
 
Figura 6. Monómeros M y G, respectivamente [2]. Figura 7. Grupos GG, MM y GM respectivamente [2]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Viscosidad del alginato en función de su concentración, para distintos pesos moleculares [1]. 
 
19 
 
2.2.2.2 Funciones en el proyecto 
El alginato se usará como agente encapsulante, aprovechando su capacidad selectiva para reaccionar 
iónicamente con cationes bivalentes (en el caso particular, Ca2+) para formar una fase de gel alrededor 
del núcleo activo. El método y las variables que intervienen en esta reacción están especificados en el 
apartado 2.3.1, mientras que los parámetros y procedimientos experimentales se detallan y realizan en el 
apartado 3.2.4.1. Sus propiedades hidrocoloides mencionadas proporcionan una elevada viscosidad en 
disolución, necesaria para la extrusión de la fase externa de la gota, y la capacidad de retener agua, 
necesaria para la integridad y estabilidad de las microcápsulas con el microrganismo disperso en fase 
acuosa. 
La concentración de la disolución de alginato, igual que su peso molecular y el caudal relativo respecto 
a la fase interna, influirán de manera directa sobre las cápsulas. La concentración y el peso molecular 
determinarán, a parte de la viscosidady solubilidad del alginato, la capacidad de reaccionar vía iónica 
obteniendo la fase sólida, estas variables también dependerán de la estructura molecular del alginato en 
cuestión. En la parte experimental 2 (apartado 3.2 del proyecto), se estudiará el tamaño y la morfología 
de las microcápsulas obtenidas en función de la concentración y relación de caudales respecto a la fase 
interna de la gota. El efecto de la relación de caudales sobre el diámetro de las cápsulas obtenidas se 
detalla en el apartado 2.4.4, mientras que en el apartado 3.2.7 se verifica experimentalmente esta 
afectación, entre otras variables influyentes. Los efectos del peso molecular promedio y de la estructura 
de los bloques de la cadena polimérica no se contrastarán debido a que solo se dispone de una calidad de 
alginato, siendo estos parámetros fijos. 
En las imágenes expuestas en esta página (Figura 9 y Figura 10) se observan, desde la óptica del 
microscopio, las microcápsulas de alginato con una fase interna de dispersión de microorganismo 
obtenidas en el laboratorio. Estás microcápsulas están obtenidas con diferentes parámetros de 
concentración y relación de caudales y se aprecian de manera clara las diferencias morfológicas entre 
ellas. Este efecto sobre la morfología será el objeto de estudio de la Experimentación 2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Microcápsula de alginato. Figura 10. Microcápsula de alginato con otros parámetros de alimentación. 
 
 
 
20 
 
2.2.3 Cloruro de calcio 
 
2.2.3.1 Características y propiedades fisicoquímicas 
Número CAS: 10043-52-4 
Es una sal inorgánica de fórmula molecular CaCl2., con aspecto de sal de grano grueso y color blanco 
(Figura 10). Al ser un compuesto iónico y polar, es muy soluble en agua, disocindose y dando lugar a 
iones Cl- y Ca2+. Se usa en industria alimentaria y farmacéutica, en el primer caso permite el uso de 
métodos como el de la emulsión iónica, y en el segundo se usa como fuente de calcio para el organismo. 
Al manipularlo hay que tener en cuenta las siguientes indicaciones de riesgo y seguridad: [7]. 
- R36. Irrita los ojos [4]. 
- S2. Manténgase fuera del alcance de los niños [4]. 
- S22. No respirar el polvo [4]. 
- S24. Evítese el contacto con la piel [4]. 
 
2.2.3.2 Funciones en el proyecto 
Se usará en disolución para proporcionar los cationes bivalentes que propician la emulsión iónica del 
alginato. Es preferible el uso de esta sal entre otras sales de metales bivalentes, ya que el calcio tiene 
buena afinidad por los grupos negativos del alginato y es inocuo para el organismo a diferencia del Sr2+ 
y Ba2+. A parte de ser reactivo con el alginato para la formación de microcápsulas vía iónica (reacción 
detallada en apartado 2.3.1), hay que tener en cuenta los iones de cloro presentes en la disolución después 
de la emulsión, generan presión electrostática en la superficie de la microcápsula (también detallado en 
el apartado 2.3.1), reslutando óptimo para la conservación y vida útil de las microcápsulas. 
Para la disolución de esta sal, se usará la concentración usada por los proyectos antecedentes [1] y [2] y 
que resultó funcional para la producción de microcápsulas con el mismo método, reactivos y equipos. 
Esta concentración del 2.5% en massa se usará de manera fija para toda la parte experimental, siempre 
que requiera la producción de microcápsulas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Cloruro de Clacio usado en la parte experiental. Figura 12. Estructura de Lewis del Cloruro de Calcio ionizado [21]. 
 
21 
 
2.2.4 D-Glucosa 
 
2.2.4.1 Características y propiedades fisicoquímicas 
Número CAS: 50-99-7 
Es un monosacárido, isómero de la galactosa, de fórmula molecular C6H12O6. Es el compuesto orgánico 
más abundante en la naturaleza e interviene en procesos bioquímicos indispensables para la vida como 
la respiración celular. Se encuentra presente en la fruta y en la miel de forma libre, y combinada en 
polímeros como la celulosa, el almidón o el glucógeno. Se obtiene con buen rendimiento como producto 
la hidrólisis enzimática del almidón del trigo o maíz. Existen dos enantiómeros de la glucosa (Figura 
14), la D-Glucosa y la L-Glucosa, en este proyecto se usará la D-Glucosa, pero cualquier azúcar libre 
(sacarosa, fructosa, galactosa, entre otros) sería apto para estudiar la cinética del consumo de este por 
parte de la levadura. [8]. 
Se presenta en forma de polvo blanco de grano fino, aunque también hay presentaciones líquidas y 
combinaciones de isómeros que se usan en industria alimentaria con un fin concreto, como en repostería 
el azúcar invertido. Este producto es una combinación de glucosa y fructosa orientada para obtener 
distintas propiedades frente a los azúcares convencionales. 
2.2.4.2 Funciones en el proyecto 
La Glucosa se usa en este proyecto con el fin de generar un medio reactivo para el microorganismo 
encapsulado. Permitiendo de esta manera estudiar la influencia de la inmovilización de la levadura en la 
cinética del consumo de azúcar. La reacción de fermentación que tendrá lugar entre la glucosa y la 
levadura está detallada en el apartado 2.4.5.1 y la misma reacción, pero con la levadura inmovilizada en 
el apartado 2.4.5.2. En esta reacción la levadura no actúa como reactivo ya que no se consume, pero se 
podría decir que actúa como biocatalizador, propiciando que el reactivo (glucosa) se consuma y de lugar 
a los productos de la fermentación. Durante la reacción la levadura adquiere energía y se reproduce, este 
efecto también se detallará en el apartado pertinente, aunque no se tendrá en cuenta para la 
experimentación que determinará cinética del consumo de azúcar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Estructura química de la glucosa [8] Figura 14. Proyecciones de los enantiómeros de la Glucosa (izquierda D, derecha L)[22] 
 
 
 
22 
 
2.2.5 Ácido 3,5-dinitrosalicílico 
 
2.2.5.1 Características y propiedades fisicoquímicas 
Número CAS: 609-99-4 
Es un ácido orgánico, presenta dos grupos nitro y uno hidróxido unidos a un único anillo bencénico, a 
parte del carboxilo. Su fórmula molecular es C7H4N2O7 (Figura 15) y se obtiene a partir de la nitración 
del ácido salicílico con ácido nítrico. Se presenta en formato sólido y color amarillo claro en condiciones 
normales (Figura 16). Se usa generalmente como método de análisis para la determinación de azúcares 
reductores. Al manipularlo hay que tener en cuenta las siguientes indicaciones de riesgo y seguridad: [9]. 
- R22. Nocivo por ingestión [4]. 
- R37. Irrita la piel [4]. 
- R38. Irrita las vías respiratorias [4]. 
- S22. No respirar el polvo [4]. 
- S24. Evítese el contacto con la piel [4]. 
- S25. Evítese el contacto con los ojos [4]. 
 
2.2.5.2 Funciones en el proyecto 
El Ácido 3,5-dinitrosalicílico, también conocido como DNS, se empleará para hacer el análisis de 
azúcares reductores presentes en una disolución y así cuantificar la cinética del consumo de azúcar por 
parte de la levadura. El método de análisis de azúcares reductores mediante el ácido DNS se basa en la 
reacción redox que tiene lugar entre ambos. El ácido DNS se reduce en ácido 3-amino-5-nitrosalicílico 
cambando de color amarillo rojizo. Haciendo uso de un espectrofotómetro (equipo detallado en apartado 
2.4.2) se cuantificará la absorbancia del color resultante y en base a esta con los métodos pertinentes la 
concentración de azúcares reductores de una muestra. El método analítico que se lleva a cabo y la 
reacción del DNS con los azúcares reductores están especificados en el apartado 2.3.2. 
Cabe tener en cuenta que, para que se produzca la reacción redox entre el DNS y los azúcares reductores, 
hay que propiciar las condiciones idóneas. En consecuencia, será necesaria la incorporación de Tartrato 
sódico potásico e hidróxido de sodioal reactivo, y se deberá aumentar la temperatura. Las funciones del 
tartrato y del hidróxido de sodio están especificadas también en el apartado 2.3.2, el proceso de 
preparación del reactivo DNS y los parámetros aplicados están especificados en el apartado 3.3.4.1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15. Estructura química del acido DNS [9]. Figura 16. Ácido DNS usado en la parte experimental. 
 
23 
 
2.2.6 Tartrato sódico/potásico 
 
2.2.6.1 Características y propiedades fisicoquímicas 
Número CAS: 868-18-8 
También conocido como sal de Rochelle, es la sal sódica y potásica del ácido tartárico. Su fórmula 
molecular es C4H10NaKO6 (Figura 17) y tiene aspecto de polvo blanco. Tiene múltiples usos industriales, 
desde el sector alimenticio hasta el electrónico. [10]. 
2.2.6.2 Funciones en el proyecto 
En este proyecto se emplea la forma tetrahidratada del tartrato para impedir la disolución de oxígeno en 
el reactivo para el método DNS y así facilitar que el oxígeno cedido por los grupos reductores (azúcares) 
reaccionen con el ácido DNS dando lugar al cambio de color y posterior análisis espectrofotométrico. 
La interacción del tartrato con la disolución reactiva está especificada en el apartado 2.3.2 y su 
concentración y volumen para producir el reactivo en el apartado 3.3.4.1. 
2.2.7 Hidróxido de sodio 
 
2.2.7.1 Características y propiedades fisicoquímicas 
Número CAS: 13-10-73-2 
También conocido como sosa caustica, su fórmula molecular es NaOH. Se presenta en condiciones 
normales en estado sólido cristalino y se le aplica el formato de lentejas para su comercialización (Figura 
18). Su disolución en agua es muy exotérmica y al manipularlo hay que tener en cuenta las siguientes 
indicaciones de riesgo y seguridad: [11]. 
- R35. Provoca quemaduras graves [4]. 
- S22. S26 En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y 
acúdase a un médico [4]. 
- S45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, 
muéstresele la etiqueta) [4]. 
- S37/39 Úsense guantes adecuados y protección para los ojos/la cara [4]. 
 
2.2.7.2 Funciones en el proyecto 
En este proyecto se usa el hidróxido de sodio para generar un medio básico que propicie la reacción del 
ácido DNS con un azúcar reductor. Esto es debido a que en un medio básico el ácido no tenderá a mostrar 
su forma protonada y favorecerá su reducción y cambio de color. La interacción del hidróxido de sodio 
con la disolución reactiva está especificada en el apartado 2.3.2 y su concentración y volumen para 
producir el reactivo en el apartado 3.3.4.1. 
 
 
 
 
Figura 17. Fórmula molecular del hidróxido de sodio potasio [2]. Figura 18. Hidróxido de sodio usado en la parte experimental. 
 
24 
 
2.3 Métodos aplicados 
 
2.3.1 Emulsión iónica 
Es un método de inmovilización basado en el recubrimiento de un principio activo por una capa de un 
hidrocoloide insolubilizado. En este caso se emplea el alginato como hidrocoloide y se insolubiliza con 
iones Ca2+ procedentes del CaCl2, resultando en una matriz polimérica que envuelve la fase interior 
activa. Para que está reacción se produzca en el exterior de la microcápsula, será necesario un método 
de extrusión de cápsulas líquidas (detallado en el apartado 2.4.1) con alginato en su exterior, y que entren 
en contacto con iones Ca2+ desde una fuente externa. La presencia de esta fase externa inmovilizando al 
microrganismo permite tener control cinético sobre las reacciones bioquímicas en las que este actúa 
como biocatalizador, obteniendo mejores rendimientos de reacción. Las microcápsulas obtenidas con 
este método y reactivos también actúan de barrera entre el principio activo y el medio, protegiendo a la 
fase activa de medios poco favorables. 
La reacción que tiene lugar (Figura 19) se inicia en la parte más superficial de la fase del hidrocoloide y 
se produce hacia el interior, los cationes Ca2+ desplazan a los cationes Na+, que tienen mayor afinidad 
con el Cl- de la disolución salina con cationes bivalentes. La gelificación del alginato tiene lugar cuando 
los cationes bivalentes se enlazan en a dos bloques G de la estructura polimérica del alginato, con la 
unión de estos bloques se obtiene una estructura más reticulada, insoluble en agua y con la porosidad 
necesaria para retener microrganismos en su interior, pero permitir la entrada y salida de reactivos para 
los procesos biológicos. Las microcápsulas que se obtendrán de esta manera no dependen solo de la 
cantidad relativa de bloques G, sino también del peso molecular del alginato, la concentración y por ende 
la viscosidad y la cantidad de emulsión, la concentración de cationes Ca2+ y, por último, la cantidad 
reactiva de fase interna. 
Una vez gelificado y precipitado, el alginato de calcio se encuentra estable en la propia disolución iónica 
que ha producido la reacción, esta estabilidad es debida a la presión electrostática sobre su superficie, 
producida por los iones restantes en la disolución. El alginato emulsionado es poco estable en 
condiciones normales, el agua atrapada por las propiedades hidrocoloidales se evapora, dando lugar a 
una estructura de biopolímero seca, pero aún con la fase interna presente, aunque también deshidratada. 
En las dos primeras partes experimentales de este proyecto (apartados 3.1 y 3.2) se estudia el 
comportamiento de la emulsión iónica frente a las variables implicadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 19. Comportamiento estructural de la gelficación iónica [1]. 
 
25 
 
2.3.2 Método analítico DNS 
Es un método de análisis para la determinación de azúcares reductores, se usa principalmente para 
estudiar concentraciones de azúcar en sangre y orina, para el ámbito médico. También se usa para el 
estudio cinético de las reacciones biológicas que consumen azúcar, a partir del propio consumo, como 
es el caso de fermentación que se estudiará en este proyecto. Este método consiste en aplicar un reactivo 
oxidante a la disolución con azúcares reductores y posteriormente realizar un análisis colorimétrico del 
producto. 
Los reactivos empleados en este método son el ácido 3,5-dinitrosalicílico (ácido DNS) el hidróxido de 
sodio y el tartrato de sodio y potasio. La reacción en la que se basa este método es la reducción de un 
grupo nitro del ácido DNS por parte de los azúcares obteniendo un grupo amino (Figura 21), este ácido 
es originalmente de color amarillo, una vez reducido da lugar a un compuesto de tono rojizo, del cual se 
cuantificará la absorbancia por espectrofotometría. Para que esta reacción tenga lugar de manera óptima 
y poder realizar una cuantificación valida, será necesario aplicar el ácido DNS en exceso, aparte de 
favorecer la reacción con los dos otros reactivos. El tartrato de sodio y potasio evitará la disolución de 
oxígeno libre en el medio reactivo, esto favorecerá que todo el oxígeno proporcionado por el grupo 
carbonilo del azúcar reductor reaccione con el grupo nitro. El hidróxido de sodio se aplica al reactivo 
para generar un medio básico, evitando así la forma protonada del ácido que podría generar reacciones 
iónicas no deseadas. Para que la reacción redox se produzca es necesario también aplicar un baño térmico 
para favorecer esta reacción endotérmica frente a otras reacciones secundarias que presentan más 
espontaneidad en condiciones normales. 
Una vez obtenidos los productos de reacción, se cuantifica la intensidad del color haciendo uso de un 
espectrofotómetro de absorción atómica, realizando la lectura de las absorbancias a 540nm. Este equipo 
irradia la muestra con longitudes de onda determinadas (190-700nm) y con un sensor al otro lado de la 
muestra cuantifica la cantidad de luz que ha sido absorbida por la estructura molecular, respecto a un 
blanco de referencia que en caso de disoluciones acuosas es agua destilada.Según la composición 
química y concentración de la muestra se obtendrán distintos valores de absorbancia, para determinar la 
concentración de azúcares reductores de una muestra será necesario haber realizado una recta de 
calibración con las lecturas de las absorbancias para valores de concentración conocidos. Los valores de 
absorbancia se comportan siguiendo la ley de Lambert-Beer, que relaciona la concentración del 
componente colorido (c), la distancia de recorrido de la luz en la disolución (l) y un coeficiente de 
extinción específico de cada compuesto (𝜀) con el valor de absorbancia resultante (A). La absorbancia 
es directamente proporcional a la concentración siempre y cuando se mantengan valores fijos de longitud 
de recorrido y de coeficiente de extinción. Se debe trabajar con muestras diluidas, que su absorbancia no 
sea mayor a 1 para ninguna longitud de onda del espectro aplicado, manteniendo así un valor de 𝜀 
constante. La ley de Lambert-Beer esta presentada a continuación (Ecuación 2). 
A= 𝜀 · c ·l 
Ecuación 2. Ley de Lambert-Beer. [24]. 
 
 
 
 
 
 
Figura 20. Cubeta del espectrofotómetro [23]. Figura 21. Reacción redox del DNS y la Glucosa [2]. 
 
26 
 
2.4 Modelización del sistema 
2.4.1 Montaje extrusor coaxial 
El extrusor de gotas es parte imprescindible del proceso de producción de microcápsulas con matriz 
externa, ya que antes de producirse la emulsión del hidrocoloide se debe obtener una gota bifásica con 
el agente encapsulante en el exterior i el activo en el interior. Para ello, este dispositivo extrusor dispone 
de dos entradas perpendiculares para la alimentación de las dos fases, y dos salidas concéntricas para 
obtener gotas con la disposición de las fases requerida para la encapsulación. El flujo continuo de este 
dispositivo en funcionamiento permite el control de los caudales de alimentación, a partir del avance 
lineal de las jeringas en este caso, o de las tuberías de alimentación para una escala industrial. 
Las microcápsulas obtenidas de esta manera son relativamente grandes, con un tamaño mínimo 
aproximado de 0.5 mm. Debido a la modelo de este método de encapsulación, la interacción entre las 
fases líquidas es de suma importancia, siendo objeto de estudio las variables fisicoquímicas que 
interfieren en el comportamiento de la extrusión y caída de las gotas bifásicas. El caudal de alimentación, 
la viscosidad y la tensión superficial de ambas fases determinarán las características de las microcápsulas 
debido al comportamiento reológico de los dos líquidos en el momento de la extrusión de la gota. El 
comportamiento de los fluidos en el sistema extrusor se detalla en el siguiente apartado 2.4.2 y su 
influencia en el tamaño de las microcápsulas se detalla en el apartado 2.4.4. 
El montaje que requiere el extrusor de 
microgotas se forma por dos jeringas en posición 
perpendicular (para este modelo de extrusor) y 
los soportes mecánicos necesarios para tener las 
jeringas fijadas en esta posición, en este caso un 
soporte vertical con dos brazos aguantados con 
nueces y pinzas en sus extremos. El extrusor se 
monta encajado con las salidas de las jeringas de 
alimentación y todo el sistema se coloca a cierta 
altura de la disolución iónica con la salida del 
extrusor ubicada encima. En la imagen de esta 
página (Figura 21) se observa el montaje del 
extrusor realizado en el laboratorio, haciendo 
énfasis en el propio extrusor coaxial. Esta pieza 
mecánica permite que el sistema de 
encapsulación empleado sea semicontínuo, ya 
que podemos alimentar de manera continua al 
extrusor y obtener gotas bifásicas de manera 
continua, pero la emulsión iónica tendría lugar 
en un sistema Batch. Con la incorporación de un 
método continuo de retirada de las cápsulas de 
la disolución iónica se podría obtener un sistema 
completamente continuo y en consecuencia un 
gran avance en el rendimiento de producción de 
las microcápsulas por el método de emulsión 
iónica. 
 Figura 22. Montaje del sistema extrusor. 
 
27 
 
2.4.2 Flujos en el extrusor 
El estudio de los flujos de alimentación, en la salida y en el interior del extrusor (Figura 23) es importante 
para comprender la dependencia del tamaño y las características de las microcápsulas con variables 
fisicoquímicas concretas de los dos fluidos. El concepto de la interacción entre las dos superficies de los 
fluidos inmiscibles (o poco miscibles) y las variables que implica es conocido como reología o 
microfluídica, estos aspectos mecánicos se detallan en este apartado. 
Antes de alimentar al extrusor, hay que tener en cuenta que un flujo laminar de alimentación favorecerá 
el control de los caudales de alimentación y la correcta interacción en la interfase de los dos fluidos 
dentro del extrusor. Si el flujo fuera turbulento habría más mezcla de las dos fases en la salida del 
extrusor, obteniendo una interfase indefinida y en consecuencia una cápsula menos estable. La manera 
más óptima de obtener un flujo laminar (número de Reynolds bajo) será disminuir la longitud de las 
tuberías o jeringas de alimentación, ya que la longitud es inversamente proporcional al número de 
Reynolds. Este parámetro adimensional es la relación las fuerzas inerciales y las viscosas, por lo tanto, 
los cambios en el caudal de alimentación y las concentraciones de cada disolución (viscosidades) serán 
determinantes en la formación de una gota bifásica definida empleando el extrusor. El diámetro de 
alimentación y salida también influye en el número de Reynolds (Ecuación 3), pero está fijado por los 
elementos mecánicos del sistema extrusor, quedando fuera del alcance del estudio [1]. 
Para la formación de gotas en sistemas microfluídicos el parámetro adimensional más relevante es la 
capilaridad. Este parámetro es la relación entre la viscosidad y la tensión interfacial [1]. Una elevada 
capilaridad significa una viscosidad del fluido encapsulante elevada respecto a la tensión interfacial con 
la fase interior, lo que produciría un menor tamaño de gota y, por ende, menor tamaño de microcápsula. 
En cambio, una capilaridad baja favorecerá el tamaño de las gotas que se produzcan, dominando la 
tensión interfacial sobre la viscosidad. Centrándonos solo en la fase externa, se puede concluir que una 
mayor viscosidad en el fluido encapsulante genera un menor tamaño de gota, y que una elevada 
viscosidad en el fluido de la fase interna, en cambio, favorece la tensión de la interfase sobre el fluido 
encapsulante generando una gota de mayor tamaño. 
Tanto el número de Reynolds como la capilaridad son necesarios para estudiar el mecanismo de 
formación de las microgotas, y las características de las microcápsulas dependen de esta extrusión. Es 
necesario destacar que para la producción de microcápsulas no es suficiente con tener un Reynolds bajo 
y ajustar la capilaridad al tamaño gota deseado, estos parámetros adimensionales tienen solo tienen un 
intervalo de valores concreto y una correlación concreta entre ambos, para los cuales se tendrá que ajustar 
el método. Pasa lo mismo con los parámetros de las disoluciones, un claro ejemplo sería tener como 
objetivo disminuir el tamaño de la microcápsula y para ello aumentar la concentración de la fase externa 
para que presente mayor viscosidad. La solubilidad del compuesto usado como matriz externa podría 
limitar el aumento de la concentración, y en consecuencia limitaría la disminución del tamaño de la 
microcápsula. 
 
 
 
 
Figura 23. Flujos en el extrusor [25]. Ecuación 3. Número de Reynolds [1]. 
 
28 
 
2.4.3 Variables implicadas en el sistemaEn este apartado se explicarán todas las variables del sistema y la correlación entre ellas, y se detallará 
cuales serán objeto de estudio en la parte experimental y cuales estarán fijadas ya sea por montaje 
mecánico o funcionalidad experimental. 
De las dos corrientes de alimentación se pueden controlar las variables fisicoquímicas, dentro de ciertas 
limitaciones, en base a la concentración de la disolución. A partir de la variación concentración se pueden 
obtener diferentes valores de viscosidad, tensión superficial, densidad, reactividad en caso del alginato 
y actividad en caso de la levadura, que van a afectar a las características de las microcápsulas resultantes 
y a su cinética de reacción. En el caso del alginato se trabajará con concentraciones másicas del 0.5 al 
2.5%, conforme se aumente la concentración se adquirirá una mayor viscosidad y reactividad frente a 
cationes bivalentes, lo que favorecerá la emulsión, consiguiendo una fase de recubrimiento más 
reticulada y obteniendo una cápsula de menor tamaño por efecto de la capilaridad (comentado en el 
apartado anterior, 2.4.2). Hay que tener en cuenta que la concentración no se puede aumentar 
indefinidamente, sino que se ve limitada por la solubilidad, a concentraciones más elevadas el alginato 
se insolubiliza, formando grumos que obstruyen el sistema extrusor e imposibilitan la producción. A su 
vez la solubilidad es dependiente de la temperatura, esto puede permitir trabajar con concentraciones 
altas a las que el alginato sería insoluble a temperatura ambiente. Este aumento de temperatura estaría 
limitado por la degradación del biopolímero, en consecuencia, no se podría calentar a mucho más que la 
temperatura ambiente sin tener cambios en la estructura molecular. En el caso de la levadura, se usarán 
concentraciones másicas del 1, 5, 10 y 15% y la concentración jugará un papel distinto sobre las 
microcápsulas resultantes, aunque de ella dependan las mismas propiedades fisicoquímicas mencionadas 
anteriormente para el alginato. Una mayor concentración de la disolución de levadura estará ligada a una 
mayor viscosidad y densidad de la fase interna, lo que produce más tensión superficial en la interfase 
disminuyendo la capilaridad de esta, y obteniendo una cápsula de mayor tamaño. Una mayor 
concentración de levadura también promoverá una mayor densidad celular y actividad biológica. 
También tendrán influencia los caudales de alimentación de ambas disoluciones, como se ha mencionado 
en el apartado anterior (apartado 2.4.2) tener un Reynolds bajo y en consecuencia un flujo laminar es 
necesario para la correcta producción de las microcápsulas. Las viscosidades elevadas favorecerán el 
flujo laminar, pero también es necesario trabajar con caudales bajos para asegurar que no se produce 
turbulencias en el flujo. Si se produjeran turbulencias en la alimentación al extrusor, el flujo turbulento 
en la formación de la gota produciría una interfase indefinida, perdiendo la fase externa resistencia 
mecánica debido a la menor capacidad de emulsión y en consecuencia una cápsula de estructura poco 
estable. Los caudales no se van a calcular por separado en la fase experimental, debido a que el sistema 
semicontinuo que se emplea no permite alimentar de manera manual con un caudal constante, se trabajará 
con la relación de caudales (Q levadura/Q alginato) y se obtendrá a partir del volumen empleado de cada 
disolución. Las limitaciones generadas por el Reynolds se deberán cumplir empleando el factor humano, 
ya que presionando las dos jeringas con cierta fuerza se obtendrán caudales distintos y se observará 
directamente el efecto de la presión ejercida sobre las microcáspulas producidas. Es decir, si uno de los 
dos flujos resulta turbulento debido a la presión aplicada, las cápsulas resultantes serán estructuralmente 
frágiles y la tensión superficial que genera la fase interna será superior a la que la estructura del alginato 
pueda mantener retenida en su interior, abriéndose la fase externa y resultando una cápsula abierta sin 
contenido. A concentraciones fijas de las dos disoluciones, la relación de caudales será crucial para 
determinar el tamaño de las microcápsulas, esta relación va directamente ligada a la tensión producida 
en la interfase y la cantidad relativa de agente encapsulante dispuesta en cada cápsula. Los efectos de 
esta relación de caudales sobre el tamaño de las microcápsulas resultantes está detallada en el siguiente 
apartado (2.4.4). 
 
29 
 
Una vez extruidas las microgotas las únicas variables influyentes serán la concentración de la disolución 
iónica que produce la emulsión del alginato y la altura de caída de la gota. En estos casos se han fijado 
valores funcionales para la producción. Se han usado los valores aplicados en los dos proyectos 
antecedentes [1] y [2], confirmando previamente la viabilidad de estos. La disolución iónica de CaCl2 se 
realizará con una concentración másica del 2.5% y la altura de caída de las microgotas, desde la salida 
del extrusor hasta la superficie de la disolución iónica será de aproximadamente 6.5cm. 
2.4.4 Tamaño de las microcápsulas 
Existen estudios presentados en el proyecto antecedente [1] que demuestran la influencia de la relación 
de caudales sobre el tamaño de las microcápsulas producidas. Cuanto mayor sea el caudal relativo de la 
fase interior mayor será el tamaño de la microcápsula obtenida, esto se debe a la mayor tensión interfacial 
que produce la fase interna y a la menor capacidad de contención que presentará un caudal relativo menor 
de la fase externa. El efecto producido se puede volver a estudiar con el concepto de capilaridad, ya que 
con menos caudal de la fase externa se produce menos tensión superficial en la interfase en dirección al 
interior, en cambio la fase interna producirá más tensión superficial hacia el exterior. Esto favorecerá 
que la tensión interfacial hacia fuera crezca respecto la viscosidad (constante a concentración y 
temperatura constante) de a fase envolvente, resultando en menor capilaridad de esta fase y en 
consecuencia mayor tamaño de microcápsula. 
Este tipo de estudios no valoran el efecto de las concentraciones de las disoluciones, que como se ha 
justificado en el apartado anterior (apartado 2.4.3) también es influyente en el tamaño de las 
microcápsulas resultantes. En la experimentación 2 realizada en este proyecto (apartado 3.2) se pretende 
demostrar el efecto de las concentraciones de ambas fases y la relación de caudales en el tamaño de las 
microcápsulas producidas. En el gráfico presentado en esta página (Figura 24) se puede observar la 
disminución del radio de las microcápsulas en función de la relación de caudales donde Qd (fase 
dispersa) es el caudal de alimentación de alginato y Qc el caudal de levadura (fase continua). Cabe 
destacar que en la experimentación 2 se trabajará con la inversa de esta relación de caudales para trabajar 
con proporcionalidad directa y se le dará relevancia también a la concentración de la fase continua. El 
tamaño de las microcápsulas tendrá efectos sobre la cinética de reacción, estos efectos están detallados 
en el apartado 2.4.5.2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 24. Radio de las microcápsulas (um) en función de la relación 
de caudales (Qd/Qc), para distintas concentraciones de alginato [1].
 
30 
 
2.4.5 Cinética de la reacción de fermentación 
 
La segunda parte de este proyecto consiste en estudiar el comportamiento reactivo (como biocatalizador) 
del microorganismo libre e inmovilizado. Para ello se debe de conocer el comportamiento biológico del 
microorganismo en el medio al cual se va a exponer. 
 
2.4.5.1 Cinética de reacción de la levadura sin encapsular 
 
Las levaduras son capaces de usar carbohidratos para obtener energía, en el caso de la experimentación 
3 (apartado 3.3) se la expondrá a un medio rico en glucosa, el azúcar por el cual