Microbiota intestinal

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ANÁLISIS DE MICROBIOTA INTESTINAL EN 
POBLACIÓN ADULTA COLOMBIANA 
ASOCIADA A FACTORES DE RIESGO DE 
DIABETES MELLITUS TIPO 2 Y OBESIDAD 
 
 
Claudia Lorena Cruz Hernández 
 
 
Universidad Nacional de Colombia 
Facultad de Ciencias, Instituto de Biotecnología (IBUN) 
Bogotá, Colombia 
 
2022
 
 
 
ANÁLISIS DE MICROBIOTA INTESTINAL EN 
POBLACIÓN ADULTA COLOMBIANA 
ASOCIADA A FACTORES DE RIESGO DE 
DIABETES MELLITUS TIPO 2 Y OBESIDAD 
 
 
 
 
 
Claudia Lorena Cruz Hernández 
 
 
 
Tesis de Maestría como requisito parcial para optar al título de: 
Magister en Ciencias Microbiología 
 
 
Directora: 
 PhD. Martha Nancy Calderón Ozuna. 
 
 
 
 
Línea de Investigación: 
Comunicación Bacteriana 
Grupo de Investigación: 
Bioquímica y Biología Molecular de las Micobacterias (BBMM) 
 
 
 
 
Universidad Nacional de Colombia 
Facultad de Ciencias, Instituto de Biotecnología (IBUN) 
Bogotá, Colombia 
2022 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabajo a todos los que se 
esfuerzan por construir y compartir ciencia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estoy absolutamente convencido de que la 
ciencia y la paz triunfan sobre la ignorancia y 
la guerra, que las naciones se unirán a la larga 
no para destruir sino para edificar, y que el 
futuro pertenece a aquellos que han hecho 
mucho por el bien de la humanidad. 
 
Louis Pasteur 
 
 
 
 
Declaración de obra original 
Yo declaro lo siguiente: 
 
He leído el Acuerdo 035 de 2003 del Consejo Académico de la Universidad Nacional. 
«Reglamento sobre propiedad intelectual» y la Normatividad Nacional relacionada al 
respeto de los derechos de autor. Esta disertación representa mi trabajo original, excepto 
donde he reconocido las ideas, las palabras, o materiales de otros autores. 
 
Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación, he 
realizado su respectivo reconocimiento aplicando correctamente los esquemas de citas y 
referencias bibliográficas en el estilo requerido. 
 
He obtenido el permiso del autor o editor para incluir cualquier material con derechos de 
autor (por ejemplo, tablas, figuras, instrumentos de encuesta o grandes porciones de 
texto). 
 
Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica, definida 
por la universidad. 
 
 
_________________ 
Claudia Lorena Cruz Hernández 
 
Fecha 06/05/2022 
 
 
 
Agradecimientos 
Dedico esta tesis de maestría a todos los que me acompañaron y me animaron a continuar 
este proceso. A mi familia especialmente a mis padres Claudia Elena Hernández Ortiz y 
Omar Cruz Suarez por su apoyo incondicional y su paciencia con cada decisión que tomo. 
A mis hermanos, Omar Antonio Cruz Hernández.y Lina María Cruz Hernández, por su 
compañía, sus consejos, su alegría y su forma de asumir la vida con la mejor disposición, 
a mi hermana le agradezco su asesoramiento estadístico para la realización de este 
trabajo. A mis tías Alicia y Olga por su constante apoyo, a mis primas Karen y Natalia por 
ser mi mejor equipo en la realización de mis sueños. 
 
A la Universidad Nacional de Colombia por la formación académica otorgada, a la 
Vicerrectoría de investigación, al Instituto de Biotecnología y al Departamento de Química. 
Al programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el desarrollo (CyTED), como 
proyecto de la red IBEROBDIA (918PTE0540) y a nivel nacional al Ministerio de Ciencia y 
Tecnología de Colombia (MINCIENCIAS) por permitirme financiar mis estudios de 
maestría y permitir la realización de una estancia de investigación internacional. Agradezco 
a cada uno de mis docentes y administrativos de la maestría por participar en mi proceso 
de formación. 
 
Al grupo de investigación de Bioquímica y Biología Molecular de las Micobacterias (BBMM) 
por permitirme realizar mi proyecto de investigación, especialmente a la docente Martha 
Nancy Calderón Ozuna por dirigir mi trabajo de tesis, por fortalecer mis capacidades 
investigativas, por la confianza brindada en la ejecución de este proyecto y por exigirme 
académicamente. 
 
A los compañeros del grupo de investigación en disbiosis, Haiver Antonio Rodríguez, 
Julieth Daniela Buell Acosta por compartirme de sus conocimientos en medicina, 
agradezco también a todos los demás médicos que nos acompañaron en las jornadas de 
 
 
 
salud y especialmente al Doctor Sergio Bermeo por su disposición a colaborar y el apoyo 
a la investigación. Quiero agradecer a mi amiga y compañera Ginneth Lorena Riaño Ayala 
por compartir sus conocimientos químicos conmigo, por su apoyo, la compañía y la 
invaluable amistad que me brindo durante toda mi maestría. 
 
Al Laboratorio de Higiene, Inspección y Control de Alimentos (LHICA), del Departamento 
de Veterinaria de la Universidad Santiago de Compostela (España-Lugo), especialmente 
a la Doctora Alejandra Cardelle Cobas por su asesoramiento académico en el análisis 
bioinformático y brindarme herramientas útiles para una carrera investigativa futura, al 
Doctor Alberto Cepeda por acogernos y a los demás miembros del grupo de investigación. 
Agradezco especialmente a la estudiante de doctorado Laura Isabelle Sinisterra por su 
guía y su asesoría en técnicas de secuenciación, también por su amistad, su paciencia y 
sus consejos. 
 
Agradezco a las entidades y a las personas que nos brindaron la confianza y un espacio 
para la realización de las jornadas de salud. A cada uno de los voluntarios que participó 
en las jornadas por su disposición, colaboración y su interés en mejorar sus condiciones 
de salud. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resumen y Abstract VII 
 
 
 
Resumen 
 
ANÁLISIS DE MICROBIOTA INTESTINAL EN POBLACIÓN ADULTA COLOMBIANA 
ASOCIADA A FACTORES DE RIESGO DE DIABETES MELLITUS TIPO 2 Y 
OBESIDAD 
 
La microbiota intestinal es la comunidad de microorganismos vivos del tracto 
gastrointestinal, la pérdida del equilibrio en ésta se ha relacionado con diabetes mellitus 
tipo 2 (DM2) y obesidad; dos enfermedades de alta comorbilidad en las últimas décadas. 
El objetivo fue estudiar perfiles filogenéticos de la microbiota intestinal en adultos 
colombianos entre 40 y 70 años. Se realizaron jornadas de salud para el reclutamiento de 
voluntarios; se realizó valoración clínica a 535 participantes, que incluyó medidas de 
composición corporal y antropometría. Se aplicó la escala de riesgo FINDRISC y se extrajo 
muestra sanguínea para análisis bioquímicos; se recibió una muestra de materia fecal, 
para la extracción del ADN de la microbiota intestinal. El 70% de la población enrolada 
presentó alteración en el índice de masa corporal (IMC), el 50% riesgo a desarrollar DM2 
y el 66% presentó riesgo metabólico. 
 
Se seleccionaron 85 voluntarios para el estudio de microbiota intestinal, mediante 
secuenciación del gen 16S rRNA, utilizando la plataforma Ion Torrent de ThermoFisher. 
Los análisis bioinformáticos se realizaron sobre los resultados de 40 muestras 
discriminadas según IMC y el comportamiento glucémico, utilizando el Software QIIME 
2TM, los análisis de biodiversidad y de biomarcadores microbianos se realizaron en el 
Software MicrobiomeAnalyst. Los filos bacterianos más abundantes fueron Firmicutes 
(49%), Bacteroidetes (39%) y Proteobacteria (7%); se observó que predominaron taxones 
microbianos asociados a un patrón de alimentación occidental. Se logró identificar catorce 
biomarcadores microbianos diferentes en cada subgrupo; se encontró relación estadística 
significativa entre familias, géneros y especies con diferentes parámetros clínicos 
asociados a disbiosis y de riesgo metabólico. 
 
 
Palabras clave: Factores de riesgo metabólico, Microbiota intestinal, obesidad, diabetes 
mellitus tipo 2, secuenciación de nucleótidos. 
 
 
 
Resumen y Abstract VIII 
 
 
 
 
Abstract 
GUT MICROBIOTA ANALYSIS IN COLOMBIAN ADULT POPULATION ASSOCIATED 
WITH RISK FACTORS OF TYPE2 DIABETES MELLITUS AND OBESITY 
 
The gut microbiota is the community of living microorganisms of the gastrointestinal tract, 
the loss of balance in it has been related to type 2 diabetes mellitus (DM2) and obesity; two 
diseases with high comorbidity in recent decades. The objective was to study phylogenetic 
profiles of the intestinal microbiota in Colombian adults between 40 and 70 years old. 
Health sessions were held to recruit volunteers; A clinical assessment was performed on 
535 participants, which included measurements of body composition and anthropometry. 
The FINDRISC risk scale was applied, and a blood sample was taken for biochemical 
analysis; a stool sample was received for DNA extraction from the intestinal microbiota. 
70% of the enrolled population presented an alteration in the body mass index (BMI), 50% 
risk of developing DM2 and 66% presented metabolic risk. 
 
85 volunteers were selected for the intestinal microbiota study, by sequencing the 16S 
rRNA gene, using ThermoFisher's Ion Torrent platform. The bioinformatic analyzes were 
carried out on the results of 40 samples discriminated according to BMI and glycemic 
behavior, using the QIIME 2TM Software, the biodiversity and microbial biomarker analyzes 
were carried out in the MicrobiomeAnalyst Software. The most abundant bacterial phyla 
were Firmicutes (49%), Bacteroidetes (39%) and Proteobacteria (7%); it was observed that 
microbial taxa associated with a western feeding pattern predominated. Fourteen different 
microbial biomarkers were identified in each subgroup; a significant statistical relationship 
was found between families, genera and species with different clinical parameters 
associated with dysbiosis and metabolic risk. 
 
 
Keywords: Metabolic risk factors, Gut microbiota, obesity, type 2 diabetes mellitus, 
nucleotide sequencing. 
 
 
 
Contenido IX 
 
 
 
Contenido 
 Pág. 
Resumen ........................................................................................................................ VII 
Lista de Figuras ............................................................................................................... XI 
Lista de Tablas ............................................................................................................... XII 
Lista de Símbolos y Abreviaturas .................................................................................... 13 
Introducción ..................................................................................................................... 16 
1 Marco Teórico .......................................................................................................... 20 
1.1 Composición y distribución de la Microbiota intestinal ...................................... 20 
1.2 Funciones de la microbiota intestinal ................................................................ 23 
1.2.1 Digestión y metabolismo de nutrientes ......................................................... 23 
1.2.2 Protección de la mucosa intestinal ................................................................. 24 
1.2.3 Regulación de la respuesta inmune ............................................................... 25 
1.3 Asociación de la microbiota intestinal con DM2 y obesidad .............................. 25 
1.3.1 Generalidades de la DM2 y la obesidad ........................................................ 25 
1.3.2 Relación de la disbiosis en el desarrollo de DM2 y obesidad ......................... 27 
1.4 Biomarcadores de Microbiota intestinal en DM2 y obesidad ............................. 28 
1.5 Secuenciación de nucleótidos en la microbiota intestinal ................................. 30 
2 Objetivos .................................................................................................................. 32 
2.1 Objetivo General .............................................................................................. 32 
2.2 Objetivos Específicos ...................................................................................... 32 
3 Materiales y métodos ............................................................................................... 33 
3.1 Reclutamiento de voluntarios ........................................................................... 33 
3.1.1 Criterios de inclusión ..................................................................................... 33 
3.1.2 Criterios de exclusión..................................................................................... 34 
3.2 Protocolo de reclutamiento ............................................................................... 34 
3.3 Cuestionario de frecuencia de alimentos .......................................................... 35 
3.4 Toma de muestra sanguínea y PTOG .............................................................. 35 
3.5 Recolección de muestra de materia fecal ......................................................... 36 
3.6 Análisis bioquímicos ......................................................................................... 36 
3.7 Extracción de ADN de materia fecal ................................................................. 37 
3.8 Secuenciación de ADN .................................................................................... 37 
3.9 Análisis bioinformáticos .................................................................................... 38 
3.10 Análisis estadísticos ......................................................................................... 40 
4 Resultados y discusión ............................................................................................. 42 
4.1 Características generales de los voluntarios .................................................... 42 
4.2 Análisis bioquímicos ......................................................................................... 46 
4.3 Análisis de índices aterogénicos y FINDRISC .................................................. 49 
Contenido X 
 
 
 
4.4 Análisis taxonómico de la microbiota intestinal mediante el gen 16S rRNA ....... 53 
4.4.1 Frecuencias de abundancia relativa a nivel de filo ......................................... 54 
4.4.2 Frecuencias de abundancia relativa a nivel de género .................................. 57 
4.4.3 Frecuencias de abundancia relativa a nivel de especie ................................. 66 
4.5 Análisis de diversidad α y β en las muestras de microbiota .............................. 71 
4.6 Biomarcadores de la microbiota intestinal asociados a DM2 y obesidad ........... 75 
4.7 Análisis nutricional y asociación con los perfiles bacterianos. ........................... 84 
5 Conclusiones y recomendaciones ............................................................................ 87 
5.1 Conclusiones .................................................................................................... 87 
5.2 Recomendaciones ............................................................................................ 91 
6 Anexos ..................................................................................................................... 93 
6.1 Anexo A1. Aprobación comité de ética USC Lugo-España ...................................... 93 
6.2 Anexo A2. Aprobación comité de ética Facultad de Ciencias UNAL ........................ 94 
6.3 Anexo B. Consentimiento informado ........................................................................ 95 
6.4 Anexo C. Cuestionario FINDRISC ........................................................................... 99 
6.5 Anexo D. Cuestionario de frecuencia de consumo de alimentos ............................ 100 
6.6 Anexo E. Base de datos de voluntarios seleccionados para el estudio de microbiota 
intestinal........................................................................................................................103 
6.7 Anexo F. Tamaño de la librería e identificación de biomarcadores microbianos 
mediante el software MicrobiomeAnalyst ...................................................................... 107 
6.8 Anexo G. Análisis de correlación entre los perfiles bacterianos y parámetros clínicos 
mediante el Software R ................................................................................................. 109 
Bibliografía .................................................................................................................... 110 
 
Lista de Figuras XI 
 
 
 
Lista de Figuras 
 Pág. 
Figura 1-1: Distribución de la microbiota a lo largo del tracto gastrointestinal.. .............. 23 
Figura 1-2: Principales pasos en la secuenciación de microbiota. ................................. 31 
Figura 3-1: Flujograma de trabajo en el análisis taxonómico de muestras de ADN. ....... 39 
Figura 4-1: Comparación del perímetro de cintura alterado entre hombres y mujeres….45 
Figura 4-2: Colesterol LDL en la población analizada.. ............................................... …48 
Figura 4-3: Análisis de frecuencia de abundancia (FAR) a nivel de filo.. ........................ 55 
Figura 4-4: Análisis de frecuencia de abundancia (FAR) a nivel de género.. ................. 58 
Figura 4-5: Relación entre el género Dialister y la grasa visceral .................................. 59 
Figura 4-6: Relación entre el género Bacteroides y la grasa visceral . ........................... 62 
Figura 4-7: Relación entre el género Prevotella y el IMC (Kg/m2).. ............................... 63 
Figura 4-8: Relación entre el género Parabacteroides y el IMC.. ................................... 64 
Figura 4-9: Relación entre el género Desulfovibrio y la glucosa preprandial .. ............... 65 
Figura 4-10: Relación entre la especie Prevotella copri y el IMC . ................................. 69 
Figura 4-11: Relación entre la especie Parabacteroides distasonis y el IMC (Kg/m2).... 71 
Figura 4-12: Relación entre la diversidad α (Índice De Shannon) entre subgrupos. ....... 73 
Figura 4-13: Relación entre la diversidad α (índice de Chao 1) entre subgrupos.. ......... 73 
Figura 4-14: Curvas de rarefacción en la secuenciación de microbiota intestinal.. ......... 74 
Figura 4-15: Análisis PCoA para evaluar la diversidad β en la microbiota intestinal.. ..... 75 
Figura 4-16: Taxones bacterianos identificados como biomarcadores entre subgrupos..77 
Figura 4-17: Relación entre la familia Ruminococcaceae y la glucosa preprandial. ....... 77 
Figura 4-18: Relación la familia Christensenellaceae con metabolitos e IMC................. 80 
Figura 4-19: Abundancia relativa de la especie Bacteroides Caccae 78 
Figura 5-1: Representación de filos, géneros y especies con mayor abundancia. 89 
 
 
 
 
 
 
Lista de Tablas XII 
 
 
 
 
 
Lista de Tablas 
 Pág. 
 
Tabla 1-1: Estudios de biomarcadores microbianos para DM2 y obesidad ..................... 29 
Tabla 4-1: Caracterización clínica de los voluntarios ...................................................... 43 
Tabla 4-2: Análisis bioquímicos en la población de estudio ............................................ 49 
Tabla 4-3: Descripción de índices aterogénicos y FINDRISC ......................................... 50 
Tabla 4-4: Descripción de los voluntarios del análisis de microbiota ............................... 53 
Tabla 4-5: Abundancia relativa de los géneros más abunadantes .................................. 67 
Tabla 4-6: Abundancia raltiva a nivel de especie ............................................................ 68 
Tabla 4-7: Resumen del análisis LEfSe .......................................................................... 84 
Tabla 4-8: Consumo diario de energía,macronutrientes y colesterol ............................... 84 
 
 
 
 
Lista de símbolos y abreviaturas 13 
 
 
 
Lista de Símbolos y Abreviaturas 
 
Símbolos 
 
Símbolo Término 
µL Volumen microlitros 
mg Unidad de masa miligramo 
dL Unidad de volumen decilitro 
ng Unidad de masa nanogramo 
g Unidad de masa gramo 
x ց Gravedades 
γ Gamma 
α Alfa 
β Beta 
 
Abreviaturas 
 
Abreviatura Término 
ADA Asociación Americana de Diabetes 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
AGCC Ácidos grasos de cadena corta 
ASVs 
Variantes de secuencias amplificadas (del inglés, amplicon sequence 
variants) 
BCAA 
Aminoácidos de cadena ramificada (del inglés, branched chain amino 
acid) 
BSH Enzima hidrolasa de sales biliares 
CD14 Cluster de diferenciación 14 
c-HDL Colesterol HDL 
c-LDL Colesterol LDL 
CT Colesterol total 
c-VLDL Colesterol VLDL 
CyTED Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el desarrollo 
DM2 Diabetes mellitus tipo 2 
dNTP Desoxirribonucleótido trifosforilado 
EC Enfermedades cardiovasculares 
ENSIN Encuesta Nacional de Situación Nutricional 
F/B Relación Firmicutes/Bacteroidetes 
FAR Frecuencia de abundancia relativa 
FFQ Cuestionario de frecuencia de alimentos 
FINDRISC Encuesta Finnish Diabetes Risk Score 
G+C Guanina y citocina 
Lista de símbolos y abreviaturas 14 
 
 
 
GABA Neurotransmisor ácido gamma-aminobutírico 
GC Grasa corporal 
GT Grasa total 
GV Grasa visceral 
HbA1c Hemoglobina glicosilada 
HMP Human Microbiome Project 
IDF Federación Internacional de Diabetes 
IDL Lipoproteínas de densidad intermedia 
IFN-γ Interferón gamma 
IgA Inmunoglobulina A 
IgAS Inmunoglobulina isotipo A secretora 
IMC Índice de Masa Corporal 
RI Resistencia a la insulina 
ISFET Ion-Sensitive Field-Effect Transistor 
LDA Análisis discriminativo lineal 
LDL Lipoproteínas de baja densidad 
LEfSe Análisis estadístico de discriminación lineal 
LPL Lipoproteína lipasa 
LPS Lipopolisácaridos 
MetaHit Metagenomics of the Human Intestinal Tract 
N Glu Voluntarios normoglicémicos 
NF-κB Cadenas κ de las células B activadas 
NGS 
Tecnologías de secuenciación de nueva generación (del inglés, Next 
generation sequencing) 
NOS Enzima óxido nítrico sintasa 
NP Voluntarios con normopeso 
NP N Glu Voluntarios en normopeso-normoglucémico 
NP Pre DM2 Voluntarios en normopeso-prediabéticos 
OB Voluntarios con obesidad 
OB DM2 Voluntarios con obesidad y DM2 
OB N Glu Voluntarios con obesidad y glucosa normal 
OB Pre DM2 Voluntarios con obesidad-prediabéticos 
OMS Organización Mundial de la Salud 
OTUs Unidades taxonómicas operativas abreviadas 
PC Perímetro de cintura 
PCoA Análisis de coordenadas principales 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa 
Pre Glu Voluntarios prediabéticos 
PTOG Prueba de tolerancia oral a la glucosa 
PUFA Ácidos grasos poliinsaturados 
PYY Péptido YY 
R Coeficiente de correlación de Pearson 
Rho Coeficiente de correlación de Spearman 
ROS Especies reactivas de oxígeno 
SB Síndrome de Behcet 
Score Puntaje 
SP Voluntarios con sobrepeso 
SP N Glu Voluntarios con sobrepeso-prediabéticos 
SP Pre DM2 Voluntarios con sobrepeso y DM2 
TAD Tensión arterial diastólica 
Lista de símbolos y abreviaturas 15 
 
 
 
TAS Tensión arterial sistólica 
TG Triglicéridos 
TGF-β Factor de crecimiento transformador-beta 
Th17 Células colaboradoras 17 (del inglés T helper 17) 
TLR4 Receptor tipo Toll 4 
TMAO N-óxido de trimetilamina 
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa (del inglés, tumor necrosis factor) 
USD Dólares 
V1-V9 Regiones hipervariables 
VLDL Lipoproteínas de muy baja densidad 
VR Valor de referencia 
IL-6 Interleuquina 6 
GLP-2 Glucagón-2 
GLP-1 Glucagón-1 
IL-1 Interleuquina 1 
IL-1β Interleuquina 1β 
16S rRNA Gen que codifica para la subunidad pequeña del ribosoma bacteriano 
918PTE0540 Proyecto de la redIBEROBDIA del CyTED 
Introducción 16 
 
 
 
Introducción 
El término microbiota hace referencia a la comunidad de microorganismos vivos residentes 
en un nicho ecológico determinado, como lo es el tracto gastrointestinal. [1]. La 
composición de la microbiota del intestino humano es específica de cada persona, 
evoluciona a lo largo de la vida y es susceptible a modificaciones exógenas y endógenas. 
Dentro de las modificaciones endógenas está el sexo, la edad, el sistema inmune y la 
genética propia de cada individuo; en las modificaciones exógenas se encuentran la dieta, 
la exposición a medicamentos y las cirugías [1]. 
 
La metagenómica y la ciencia de la microbiota son la vanguardia de la biología, se han 
desarrollado dos grandes proyectos a nivel mundial para evaluar la composición del 
microbioma intestinal y su relación con diversas enfermedades. El primero de los proyectos 
fue el Human Microbiome Project (HMP) que se aprobó en mayo de 2007 y que fue 
ejecutado por el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos. La investigación incluyó 
el análisis de 242 muestras de adultos y se reportaron 5177 perfiles taxonómicos [2] [3]. El 
segundo fue el proyecto Metagenomics of the Human Intestinal Tract (MetaHit) de la Unión 
Europea iniciado en el año 2008 [4]. Estos estudios demostraron que el tracto 
gastrointestinal contiene alrededor de 1014 microorganismos y el número de genes 
microbianos supera de 150 a 500 veces al número de genes humanos [5]. 
 
La microbiota intestinal consta de más de 1500 especies bacterianas, distribuidas en más 
de 50 filos diferentes; se tiene documentado que Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, 
Proteobacteria, Verrucomicrobia y Fusobacteria son los filos más dominantes y 
representan hasta el 90% de la población microbiana de una persona adulta [6]. La 
microbiota intestinal ejerce diferentes funciones que van a beneficiar la salud del 
hospedero, entre ellas la protección de la colonización de las superficies mucosas de 
diferentes patógenos [6], la secreción de sustancias antimicrobianas reforzando el sistema 
inmune [7], funciones nutricionales y metabólicas [8], mantenimiento de la integridad de la 
mucosa intestinal, la proliferación y diferenciación de células epiteliales [9] y la participación 
en la comunicación cerebro-intestino interviniendo en el estado mental y neurológico 
[8][9][10]. 
 
Introducción 17 
 
 
 
Cuando se pierde la dinámica entre las especies bacterianas intestinales por diferentes 
situaciones asociadas al hospedero ocurre un proceso denominado disbiosis [11]. En esta 
alteración el aumento de bacterias patógenas modifican funciones metabólicas afectando 
la homeostasis general y específicamente la del epitelio intestinal, el desarrollo de células 
inmunes, el soporte de angiogénesis, la digestión de alimentos, metabolismo de las grasas 
y los carbohidratos [12]. La disbiosis puede producirse en cuestión de días, particularmente 
después de la ingesta de antibióticos, pero también está directamente relacionada con la 
dieta de cada individuo [13]. Los procesos de disbiosis microbiana se han vinculado a 
enfermedades intestinales y extraintestinales como la diabetes y la obesidad [11][13]. 
 
La obesidad se define como una enfermedad metabólica caracterizada por el aumento de 
la grasa corporal [14]. Datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) indican que 
para el año 2016 el sobrepeso y la obesidad alcanzaron una prevalencia del 39% y el 13% 
respectivamente, se estima que hay más de 650 millones de personas obesas en el mundo 
[15]. En Colombia la última Encuesta Nacional de Situación Nutricional (ENSIN) en el año 
2015, reportó que en la población de 18 a 64 años uno de cada tres jóvenes y adultos 
tiene sobrepeso (37,7%), mientras que uno de cada cinco es obeso (18,7%) llegando a la 
alarmante cifra de que el 56,4% de la población colombiana presenta exceso de peso [16]. 
Este estudio sugirió que la obesidad es más frecuente en las mujeres (22,4%) que en los 
hombres (14,4%) [16]. Esta enfermedad se clasifica según el índice de masa corporal 
(IMC), que es la relación entre el peso en kilogramos y la talla en metros elevado al 
cuadrado. Un IMC superior a 30 kg/m2 es indicativo de obesidad [17]. Diferentes reportes 
han demostrado que la obesidad es uno de los principales factores de riesgo para el 
desarrollo de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) [18]. 
 
Introducción 18 
 
 
 
 
La diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es un desorden metabólico caracterizado por altos niveles 
de glucosa en la sangre como resultado de la combinación de una insuficiente secreción 
de la insulina pancreática o la resistencia a la acción de esta hormona [19]. De acuerdo 
con la Federación Internacional de Diabetes (IDF), en su Atlas del año 2021 se reportó que 
537 millones de adultos entre 20 y 79 años tienen diabetes, de ellos el 79,4% viven en 
países de ingresos bajos y medios. En América del Sur y América central 341 millones de 
personas tienen diabetes y 39 millones presentan intolerancia a la glucosa [20]. Los 
pacientes con DM2 pueden tener complicaciones agudas y crónicas que la convierten en 
una de las enfermedades más costosas, a nivel global se invierten 966 billones de dólares 
(USD) en su tratamiento [20]. En Colombia la mayor proporción de casos incidentes de 
diabetes está en el grupo etario de 55 a 69 años con el 43,77%, situación preocupante 
tratándose de una población económicamente activa [21]. Los principales factores de 
riesgo para el desarrollo de obesidad y DM2 son (i) genéticos; (ii) una ingesta de alimentos 
ricos en calorías representados por azúcares, pero pobres en vitaminas, minerales, fibra y 
otros micronutrientes; y (iii) llevar un estilo de vida sedentario con poca actividad física 
[22][23] 
 
En los últimos años diversas investigaciones han estudiado el papel fundamental de la 
microbiota intestinal en el desarrollo de obesidad y DM2; sin embargo, no se ha logrado 
llegar a un consenso sobre que grupos bacterianos están asociados directamente con el 
desarrollo de estas dos enfermedades metabólicas [24][25]. La complejidad de los estudios 
indica que la microbiota es dependiente de factores genéticos y epigéneticos propios de 
cada población [26]. La aparición de las tecnologías de secuenciación de nueva generación 
(NGS) han facilitado el estudio del gen 16S rRNA bacteriano, permitiendo la descripción 
metagenómica de estas comunidades microbianas [27]. En Colombia son pocos los 
reportes relacionados con la microbiota intestinal y se debe profundizar en la 
caracterización de las relaciones de diversidad bacteriana para relacionarla con las 
alteraciones metabólicas que presenta la población [28]. 
 
Por lo justificado anteriormente se planteó como objetivo principal, el estudio de los perfiles 
filogenéticos de la microbiota intestinal en adultos colombianos entre 40 a 70 años con 
factores de riesgo a DM2 y obesidad. El desarrollo y ejecución de la presente Tesis de 
Maestría hizo parte del macroproyecto “Obesidad y diabetes en Iberoamérica: Factores de 
Introducción 19 
 
 
 
riesgo y nuevos biomarcadores patogénicos y predictivos”, financiado por el programa 
Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el desarrollo (CyTED), como proyecto de la 
red IBEROBDIA (918PTE0540). A nivel nacional fue financiado por el Ministerio de Ciencia 
y Tecnología de Colombia (MINCIENCIAS) y la Vicerrectoría de Investigación de la 
Universidad Nacional de Colombia. Las actividades de reclutamiento de voluntarios y la 
caracterización de cada uno de ellos a nivel bioquímico y antropométrico se comparten con 
otros trabajos de investigación. 
Capítulo 1. Marco teórico 20 
 
 
 
 Marco Teórico 
1.1 Composición y distribución de la Microbiota intestinal 
En la actualidad existen tecnologías ómicas que ayudan en la elucidación de marcadores 
específicos de enfermedadesy nuevos objetivos de diagnóstico, también para describir 
alteraciones funcionales en la fisiopatología de varias enfermedades y analizar la relación 
entre la microbiota intestinal y los metabolitos del hospedero [29]. El término microbioma 
hace referencia al conjunto formado por los microorganismos, sus genes y sus metabolitos; 
el complejo formado por el material genético del microbioma y del hospedero se conoce 
como metagenoma [27]. La metagenómica es el análisis del material genético de las 
bacterias intestinales [30][31]. 
La microbiota humana es un ecosistema complejo que incluye bacterias, hongos, arqueas, 
protozoos y virus; estos microorganismos logran una sinergia con su hospedero [30]. La 
organización, distribución y localización de la microbiota intestinal no es uniforme a lo largo 
del tracto gastrointestinal. La conformación de un ecosistema intestinal dinámico depende 
de varias propiedades fisicoquímicas como los diferentes gradientes de pH, micronichos y 
presiones parciales de oxígeno [32]. Actualmente se sabe que la microbiota intestinal 
también es dependiente de factores que van a determinar la diversidad y la estabilidad de 
la microbiota saludable. Estos factores son el modo de parto, patrones de alimentación del 
neonato, la genética del hospedero, ubicación geográfica, el estrés, consumo de dietas 
occidentalizadas, actividad física, el envejecimiento, estados patológicos (uso inapropiado 
de antibióticos) y una serie de factores intrínsecos especialmente la secreción de ácido 
gástrico, la secreción de inmunoglobulina A, la producción de péptidos antimicrobianos y 
la motilidad gástrica [26]. 
 
La colonización microbiana y el establecimiento de una microbiota intestinal se da 
principalmente durante el parto natural, los recién nacidos son colonizados por los 
microorganismos vaginales y rectales maternos. Las bacterias que hacen parte de esa se 
describen principalmente como E. coli, Streptococcus, Lactobacillus y Prevotella; esta 
Capítulo 1. Marco teórico 21 
 
 
 
microbiota va a generar unas condiciones que permiten el establecimiento de una mayor 
diversidad, como lo son los miembros del filo Bacteroidetes [33]. En un parto por cesárea 
son las bacterias presentes en la piel materna las que van a colonizar el intestino del recién 
nacido como Streptococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Staphylococcus y 
Enterococcus [34]. 
 
El tipo de alimentación influirá en el establecimiento de la microbiota, cuando un bebé es 
alimentado con leche materna aumenta el género Bifidobacterium ejerciendo un efecto 
beneficioso intestinal; mientras que los neonatos que son alimentados con fórmula tienen 
una microbiota intestinal más diversa con la presencia de Bacteroides, Lactobacillos y 
Clostridium, sin embargo, se ha asociado a eventos repetitivos de alteración 
gastrointestinal [33]. La microbiota intestinal fluctúa durante los tres primeros años de vida 
con una variabilidad interindividual y una baja diversidad que se va volviendo más estable 
con el tiempo a medida que se van introduciendo diferentes alimentos en la dieta. A la 
edad de dos años la microbiota intestinal está conformada principalmente por los filos 
Firmicutes y Bacteroidetes, empezando a parecerse más a la microbiota de una persona 
adulta [35]. 
 
En la microbiota intestinal de una persona adulta el 90% de las bacterias pertenecen a dos 
filos principalmente, Bacteroidetes y Firmicutes. Las Actinobacterias, Proteobacterias, 
Fusobacterias y Verrucomicrobia completan el 10% restante [32]. El grupo de los 
Firmicutes incluye bacterias Gram positivas, anaerobias obligadas con un bajo contenido 
de los nucleótidos guanina y citocina (G+C). Los principales géneros que se describen en 
el filo de los Firmicutes son Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus y Butyrivibrio [36]. El 
segundo filo más abundante, los Bacteroidetes, incluye bacterias Gram negativas, 
anaerobias o aerobias y los géneros principalmente descritos son Bacteroides, Prevotella 
y Porphyromonas [37]. Las Actinobacterias son bacterias Gram positivas, con un alto 
contenido de G+C, anaerobias obligadas que cuenta con los géneros Bifidobacterium, 
Colinsella y Atopobium [38]. 
La carga microbiana a lo largo del tracto gastrointestinal humano no tiene un 
comportamiento homogéneo y a medida que se recorre desde el esófago hasta el recto 
distal hay una marcada diferencia en la diversidad y el número de bacterias [33]. El número 
Capítulo 1. Marco teórico 22 
 
 
 
de microbios presentes por gramo en el esófago es de 101, en el estómago y en el duodeno 
de 103, de 104 a 107 en el yeyuno y finalmente de 1011 a 1014 en el colon [39]. En el esófago 
distal, el duodeno y el yeyuno el género bacteriano dominante es Streptococcus, en el 
estómago la mayoría de las bacterias no sobreviven por el pH bajo del medio, sin embargo, 
podemos encontrar los géneros bacterianos Prevotella, Veillonela, Rothia y la especie 
Helicobacter pylori [33] [40]. La microbiota del colon es la más diversa constituyendo más 
del 70% de todos los microorganismos que se encuentran en el cuerpo y está compuesta 
principalmente por bacterias anaerobias siendo los géneros predominantes Bacteroides, 
Bifidobacterium, Clostridium, Lactobacillus, Ruminococcus, Enterococcus y también la 
familia Enterobacteriaceae. En la figura 1-1 se describe la distribución de la microbiota a 
lo largo del tracto gastrointestinal 
 
La literatura científica reporta que la dieta tiene un efecto rápido sobre la composición de 
la microbiota de una persona adulta, promoviendo el crecimiento de ciertos grupos 
bacterianos sobre otros [41]. La dieta mediterránea se caracteriza por una combinación de 
fibra (carbohidratos complejos), ácidos grasos poliinsaturados, compuestos bioactivos 
como flavonoides, fitoesteroles, terpenos y polifenoles; este tipo de dieta se ha asociado 
con el aumento de las familias Lachnospiraceae, Ruminococcaceae y Bifidobacteria. Se 
describe una mayor diversidad bacteriana que favorece un mejor funcionamiento y control 
de la permeabilidad intestinal [42]. 
 
La dieta occidental se caracteriza por un alto contenido de grasas saturadas, cereales 
refinados, azúcar, sal, proteína animal, alcohol junto con un consumo reducido de frutas, 
verduras, micronutrientes como las vitaminas A, C, D, E y oligoelementos como el zinc, el 
fósforo, calcio, magnesio y potasio [42]. Esta dieta se ha asociado con una menor 
diversidad microbiana y con la abundancia del género Prevotella y Xylanibacter, así como 
también de bacterias tolerantes a la bilis, como Alistipes, Bilophila y Bacteroides [43]
Capítulo 1. Marco teórico. 23 
 
 
 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1-1: Distribución de la microbiota a lo largo del tracto gastrointestinal. Tomado de Tungland, 
et al, 2018 [33]. 
 
1.2 Funciones de la microbiota intestinal 
La microbiota intestinal cumple múltiples procesos beneficiosos para la salud del 
hospedero, participa directamente en la digestión de nutrientes, en el balance energético, 
la protección de la mucosa intestinal, la regulación del sistema neuroendocrino y del 
sistema inmunitario; en la producción de metabolitos y vitaminas vitales en el desarrollo 
del hospedero [5][30][44]. 
1.2.1 Digestión y metabolismo de nutrientes 
Una parte de los carbohidratos que se consumen en la dieta como los oligosacáridos, la 
fibra dietética (polisacáridos no amiláceos como celulosas, hemicelulosas, pectinas y 
gomas) no son digeridos completamente por acción de las enzimas humanas. Esos 
residuos de oligosacáridos llegan al colon y son fermentados por la microbiota intestinal 
anaerobia que produce ácidos grasos de cadena corta (AGCC), de estructuras diversas 
como el formiato, propionato, acetato, butirato, valerato, isovalerato, hexanoato; otros 
ácidos orgánicos como el lactato y el succinato; la producción de alcoholes como el 
Capítulo 1. Marcoteórico. 24 
 
 
metanol y el etanol; así también la liberación de gases como metano, hidrógeno y dióxido 
de carbono [45]. 
Los AGCC predominantes son el acetato, el propionato y el butirato. El acetato se 
encuentra en la sangre, sirve como fuente de energía para los tejidos periféricos en la 
lipogénesis y la biosíntesis de colesterol en el hígado [45]. El butirato sirve como fuente de 
energía de los colonocitos; en la regulación de la homeostasis energética, al estimular las 
células enteroendocrinas intestinales para la producción de leptina proveniente de los 
adipocitos; en la producción del péptido similar al glucagón en las células L y se ha visto 
también que reduce el efecto de los metabolitos nocivos de los ácidos biliares y los fenoles 
[46]. El propionato es transportado a través de los colonocitos y dirigido hasta el hígado 
donde es derivado a acetato [45]. Las bacterias que se reconocen como principales 
productoras de AGCC son Roseburia spp, Eubacterium rectale, Eubacterium hallii, 
Faecalibacterium prausnitzii y los grupos Clostridiales IV y XIV [47]. La microbiota intestinal 
produce vitamina K, y contribuye con las vitaminas del complejo B (B1, B8, B9 y B12). Se 
han reconocido que las cepas de bifidobacterias son las principales productoras de 
vitaminas del complejo B [48]. 
1.2.2 Protección de la mucosa intestinal 
 
El tracto gastrointestinal es una barrera selectiva que incluye enterocitos (90-95%), células 
enteroendocrinas, calciformes, M o de Peyer y de Paneth. Las células calciformes son las 
encargadas de secretar glicoproteínas de mucina, las células de Paneth son las 
responsables de la secreción de péptidos antimicrobianos como las defensinas y las Reg-
gamma que van a inhibir el crecimiento de determinados microorganismos [32]. La 
microbiota intestinal comensal es aquella habita de manera constante, siendo autóctona y 
que no provoca daño en el hospedero [49]. Esta microbiota regula la expresión de los 
genes que codifican la mucina (MUC-2, MUC-3) modificando su patrón de glicosilación, 
producción de péptidos antimicrobianos regulando la adhesión y la colonización de 
bacterias patógenas [32][50]. La microbiota intestinal comensal produce señales captadas 
por el sistema inmune innato ejerciendo un efecto trófico colaborando con la proliferación 
de células epiteliales y el mantenimiento de las uniones intercelulares estrechas 
fortaleciendo la integridad y la función del epitelio como barrera física frente a la entrada 
de bacterias patógenas [50][51]. 
Capítulo 1. Marco teórico. 25 
 
 
1.2.3 Regulación de la respuesta inmune 
 
La microbiota intestinal comensal se encuentra en un continuo estado de simbiosis con su 
hospedero, condición denominada eubiosis. Multiples factores como el consumo 
prolongado de diversos medicamentos entre ellos los antibióticos, el estrés, factores 
genéticos, dietas ricas en grasas o con un alto índice glúcemico y el estilo de vida pueden 
inducir a que se pierda este equilibrio simbiotico. En este estado hay perdida de la 
diversidad microbiana, situación conocida como disbiosis. Cualquier alteración en la 
microbiota que genere disbiosis repercute directamente en el favoreciminto de diferentes 
patologias entre ellas la DM2 y la obesidad [32]. 
 
En eubiosis existe una comunicación constante entre el sistema intestinal y el inmune, 
debido a que la barrera intestinal contiene altas concentraciones de inmunoglobulina 
isotipo A secretora (IgAS), producida por las células de Peyer en la luz intestinal. Esta 
inmunoglobulina va a formar complejos específicamente con las bacterias comensales que 
pertenecen a la luz intestinal para empezar a presentar selectivamente los componentes 
bacterianos a las células dendríticas que inducen la producción de IL-10 de propiedades 
antiinflamatorias [52]. 
 
1.3 Asociación de la microbiota intestinal con DM2 y 
obesidad 
1.3.1 Generalidades de la DM2 y la obesidad 
La DM2 es una enfermedad metabólica caracterizada por la presencia de niveles altos de 
glucosa en sangre (hiperglucemia) [20], esta condición se da por el desarrollo de 
resistencia a la insulina (RI) [53]. La insulina es una hormona secretada por el páncreas 
con acciones fisiológicas principalmente en el hígado, el músculo y el tejido adiposo 
responsables del metabolismo y almacenamiento de energía en el organismo [54]. 
La RI causa que las células β pancreáticas secreten más insulina en un proceso conocido 
como hiperinsulinemia compensatoria, que a la larga ocasiona un deterioro de las células 
β dando lugar a una hiperglucemia sostenida [54]. Adicionalmente va a contribuir al 
desarrollo de dislipidemia, hipertensión y aterosclerosis. A nivel molecular la RI es el 
Capítulo 1. Marco teórico. 26 
 
 
resultado de alteraciones en la señalización de la hormona, debido a mutaciones o 
modificaciones postraduccionales de su receptor o de proteínas efectoras localizadas 
corriente abajo del mismo [55]. 
Los criterios de diagnóstico para DM2 establecidos por la Asociación Americana de 
Diabetes (ADA) son glucosa en sangre en ayunas ≥126 mg/dL, una prueba de tolerancia 
oral a la glucosa (PTOG) ≥ 200 mg/dL, hemoglobina glicosilada (HbA1c) ≥ 6,5% y una 
glucometría aleatoria ≥ 200 mg/dL [56]. La condición de prediabetes hace referencia a un 
estado metabólico intermedio entre la homeostasis normal de la glucosa y la DM2 [57]. 
Son indicadores de prediabetes valores alterados de glucosa en sangre en ayunas entre 
100 y 125 mg/dL, una PTOG entre 140 y 199 mg/dL y valores de 5,7% a 6,4% de HbA1c 
[56]. La prediabetes es un estado metabólico reversible, por ello es importante su detección 
y tratamiento temprano para evitar la progresión a DM2. Los parámetros más importantes 
en el manejo de la prediabetes son los cambios en el estilo de vida, valoración de los 
factores de riesgo cardiovasculares, medidas para normalizar el peso y el tratamiento de 
la hiperglucemia [58]. 
Una herramienta de tamizaje del riesgo a desarrollar DM2 es la encuesta Finnish Diabetes 
Risk Score (FINDRISC), diseñada en el año 2001 en un estudio prospectivo en población 
finlandesa [59]. Esta encuesta consta de preguntas relacionadas con la edad, medidas 
antropométricas, antecedentes familiares, estilo de vida, consumo de medicamentos para 
hipertensión arterial y control glucémico. A cada respuesta se le asigna un puntaje cuyo 
valor total se relaciona directamente con el porcentaje de factor de riesgo al desarrollo de 
DM2 en diez años. En Colombia la guía de práctica clínica de DM2 indica que un FINDRISC 
≥12 puntos ya es de alerta por lo es recomendable control glicémico preprandial (en ayuno) 
[60]. 
La obesidad se define como la acumulación excesiva o la distribución anormal de la grasa 
corporal, que lleva a la liberación de citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis 
tumoral alfa (TNF-α), interleuquina 1β (IL-1β) e interleuquina 6 (IL-6). La consecuencia del 
aumento en esas citoquinas promueve el estrés oxidativo, con disminución en la regulación 
de las especies reactivas de oxígeno (ROS) que conlleva a un estado inflamatorio 
permanente [61]. La obesidad se clasifica en obesidad grado I o moderada con un IMC de 
30,0-34,9; obesidad grado II o severa con un IMC de 35,0-39,9 y de grado III o mórbida 
con un IMC ≥ 40,0 [22][62]. La obesidad aumenta el riesgo de trastornos asociados con 
Capítulo 1. Marco teórico. 27 
 
 
alta mortalidad y morbilidad, como diabetes, hipertensión, cardiopatía coronaria, 
dislipidemia, enfermedad de la vesícula biliar y ciertas neoplasias malignas [63]. 
1.3.2 Relación de la disbiosis en el desarrollo de DM2 y obesidad 
La evidencia de que la microbiota intestinal podría estar implicada en el desarrollo de DM2 
y obesidad inició con estudios en modelos murinos [5]. Se transplantó heces de ratones 
con microbiota intestinal en condiciones fisiologicas a ratones libres de germenes; se 
observóque estos últimos aumentaron en un 60% su tejido adiposo, desarrollaron RI, 
además de detectarse un incremento en los niveles de leptina y glucosa [64]. También se 
estudió la microbiota intestinal de ratones obesos con deficiencia en leptina, éstos 
presentaron bacterias con mayor expresión génica para enzimas que participan en la 
extracción de nutrientes, aumento de la fermentación a nivel intestinal y disminución de las 
calorías residuales en las deposiciones. Al trasplantar la materia fecal de ratones 
deficientes de leptina a ratones normopeso, estos últimos desarrollaron obesidad [65]. 
 
La disbiosis favorece el desarrollo de endotoxemia metabólica por los lipopolisácaridos 
(LPS) provenientes de bacterias Gram negativas; éstos aumentan cuando hay una ruptura 
de la barrera intestinal y una elevada permeabilidad intestinal [66]. Los LPS son 
trasportados al torrente sanguíneo por medio de quilomicrones, que están elevados a raíz 
de dietas ricas en grasas [67][68]. Los LPS promueven el estado inflamatorio debido a que 
son reconocidos por dos receptores de membrana el Cluster de diferenciación 14 (CD14) 
y el receptor tipo Toll 4 (TLR4), expresados en la superficie de la membrana plasmática de 
los macrófagos; este reconocimiento activa la ruta de señalización del factor nuclear 
potenciador de las cadenas κ de las células B activadas (NF-κB) lo que lleva a la liberación 
de citocinas proinflamatorias (TNFα, IL-1, IL-6) [69]. 
 
En condición de eubiosis se promueve la producción de AGCC, éstos son ligandos de los 
receptores GPR41 y GPR43 que se encuentran en las células L enteroendocrinas 
intestinales. La respuesta efectora a la unión ligando-receptor, estimula la producción del 
péptido similar al glucagón-1 (GLP-1), del péptido similar al glucagón-2 (GLP-2) y el péptido 
YY (PYY) [70]. El aumento de GLP-1 promueve la secreción de insulina dependiente de la 
glucosa, la biosíntesis de insulina, la inhibición de la secreción del glucagón, el vaciado 
Capítulo 1. Marco teórico. 28 
 
 
gástrico, disminuye la inflamación y la apoptosis [71]. El GLP-2 interviene en el ensamblaje 
lipídico, mejora la función de la barrera intestinal y se cree que accede a distintas reservas 
de lípidos en el intestino para su movilización; el PYY se relaciona con el aumento del 
tránsito intestinal y la reducción del apetito [72][73]. En condición de disbiosis se altera la 
homeostasis metabólica dado que se pierde la regulación hormonal intestinal mencionada 
anteriormente. 
 
El metabolismo de lípidos y lipoproteínas también se ve alterado en la situación de 
disbiosis. La microbiota intestinal participa en el metabolismo de ácidos biliares primarios 
a ácidos biliares secundarios, éstos se unen a los receptores FXR y TGR5 en el hígado. 
La señalización de la unión a los receptores FXR y TGR5 promueve el ensamblaje de 
lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), de densidad intermedia (IDL) y de baja 
densidad (LDL) [74]. 
 
1.4 Biomarcadores de Microbiota intestinal en DM2 y 
obesidad 
 
Un biomarcador es un evento que se produce en un sistema biológico y se interpreta como 
indicador del estado de salud o del riesgo de enfermedad [75]. Se ha detectado en 
obesidad y DM2 un aumento del filo Firmicutes, sobre el filo Bacteroidetes [76]. En general 
los estudios indican que hay una disminución de las bacterias productoras de butirato, 
especialmente Roseburia intestinalis y Faecalibacterium prausnitzii; paralelamente se 
reporta el aumento de patógenos oportunistas como Clostridium clostridioforme, 
Clostridium hathewayi, entre otros [77]. La tabla 1-1 describe biomarcadores de microbiota 
intestinal que se han correlacionado como posibles indicadores de obesidad y DM2. 
Capítulo 1. Marco teórico. 29 
 
 
 
Tabla 1-1: Estudios de biomarcadores microbianos para DM2 y obesidad 
Tipo de estudio Participantes Indicadores clínicos. Biomarcadores microbianos encontrados. Referencia 
Estudio analítico, 
transversal. 
Género: masculino y 
femenino 
n=20 gemelos 
monocigóticos con DM2 y 
obesidad 
Edad:30-48 años 
 
IMC, glucosa, perfil lipídico, insulina, 
HbA1c, PCR, ALT, AST, albumina 
↑ del filo Firmicutes principalmente el género 
Roseburia. 
 
↓ del filo Verrucomicrobia especialmente la especie 
Akkermansia muciniphila 
[78] 
Estudio 
experimental, 
transversal 
 
Género: femenino 
n= 145 
Edad: ≥ 70 años 
 
Glucosa, PTOG,HbA1c,Péptido C, Perfil 
lipídico. 
Voluntarias con DM2: ↑ Clostridium clostridioforme, 
Lactobacillus gasseri, Streptococcus mutans 
Clostridium hathewayi 
 
[79] 
Estudio 
experimental, 
transversal 
Género: masculino y 
femenino 
n= 123 normopesos y 
169 obesos 
 
IMC, leptina, adiponectina 
perfil lipídico, ácidos grasos libres, 
insulina y PCR. 
Voluntarios obesos: ↑ Bacteroides, Parabacteroides, 
Ruminicoccus, Campylobacter, Porphyromonas, 
Staphylococcus, Anaerostipes 
[80] 
Estudio 
experimental, 
transversal 
 
Género: masculino y 
femenino 
n= 441 
Edad: ≥ 18 a 62 años 
Perfil lipídico, glucosa 
HbA1c,PCR, proteína de unión a LPS, 
IMC, 
perímetro de cintura. 
 
Voluntarios sanos: ↑ Akkermansia-Bacteroidales y 
Ruminococcaceae 
 
Voluntarios obesos: ↑ Escherichia coli y 
Enterobacter hormaechei 
[28] 
Estudio de 
cohorte 
Género: masculino y 
femenino 
n= 484 
Edad: ≥18 a 59 años 
Insulina,HbA1c,HOMA-
B,glucosa,PTOG,vitamina D. 
 
Voluntarios prediabéticos y diabeticos: ↑ Clostridium 
clostridioforme y Clostridium bolteae 
 
↓ Faecalibacterium, Alistipes, Pseudoflavonifractor, 
Oscillibacter 
[81] 
Estudio 
experimental, 
transversal 
Género: masculino y 
femenino 
n= 32 obesos y 32 
normopeso 
Edad: 18 a 25 años 
Glucosa 
Perfil lípidico 
Niveles de LPS en suero. 
Voluntarios obesos: ↑ Clostridium leptum y el 
género Lactobacillus. 
 
↓ Prevotella y la especie E. coli 
[82] 
En la columna de biomarcadores ↑ indica el aumento y ↓ indica la disminución del filo, género o especie.
Capítulo 1. Marco teórico 30 
 
 
 
1.5 Secuenciación de nucleótidos en la microbiota 
intestinal 
La metodología utilizada tradicionalmente para el estudio de bacterias intestinales es el 
cultivo, sin embargo, éste presenta grandes limitaciones como el tiempo requerido para el 
aislamiento bacteriano, la baja sensibilidad, y la reproducibilidad de los resultados [83]. 
Actualmente, gracias al avance de técnicas moleculares se ha logrado identificar que solo 
entre un 10% al 30% de las bacterias intestinales son cultivables [84]. 
Las técnicas moleculares han permitido el estudio y la secuenciación del gen que codifica 
para la subunidad pequeña del ribosoma bacteriano (16S rRNA) [85]. Este gen 16S rRNA 
tiene una longitud de aproximadamente 1.550 pb y está compuesto por regiones 
hipervariables y conservadas; es utilizado con fines filogenéticos ya que tiene una 
estructura caracterizada por regiones hipervariables (V1-V9), flanqueadas por regiones 
ultraconservadas críticas para las funciones ribosómicas. Las regiones hipervariables 
actúan como marcadores filogenéticos para la diferenciación de especies bacterianas, 
mientras que las regiones conservadas sirven para el diseño y la unión de primers o 
cebadores universales [83]. Para llevar a cabo el proceso de secuenciación se seleccionan 
regiones al comienzo del gen, en la región de 540 pb o al final de la secuencia completa 
del gen en el diseño de los primers [86]. 
Durante este siglo se desarrollaron las tecnologías de secuenciación de próxima 
generación (NGS, del inglés next-generation sequencing). Se caracterizan por el aumento 
exponencial en la producción de datos de secuenciación, gracias a que se analizan masiva 
y paralelamente varias muestras a la vez. Las plataformas de segunda generación o de 
“lectura corta” tienen como principales representantes al sistema Illumina y al sistema Ion 
Torrent [87][88]. La tecnología de secuenciación Ion Torrent utiliza un chip semiconductor 
yse basa en la detección de iones de hidrógeno cargados positivamente que van a generar 
un cambio de pH y de voltaje que son detectados por un sensor ISFET (Ion-Sensitive Field-
Effect Transistor) [89]. 
Para lograr la secuenciación en estudios de microbiota intestinal con Ion Torrent, se debe 
realizar una librería genética que incluye la fragmentación del ADN, la amplificación del 
ADN con primers específicos del gen 16S rRNA, ligación de adaptadores (barcoding), 
reparación del ADN y la preparación de un templado que se obtiene mediante PCR
Capítulo 1. Marco teórico 31 
 
 
 
(proceso de reacción en cadena de la polimerasa) en emulsión. En esa metodología de 
PCR, cada fragmento de ADN se deposita en micromicelas, que provienen de una 
emulsión aceite - agua [89][90]. Las reacciones de secuenciación se realizan en fase 
sólida, al adicionar microesferas que en su superficie están marcadas con la secuencia 
complementaria de los adaptadores. Se promueve la unión de los millones de fragmentos 
ADN a secuenciar con las microesferas; la muestra enriquecida es cargada dentro de los 
pozos del Ion Chip. La amplificación de las secuencias se realiza incorporando un único 
desoxirribonucleótido trifosforilado (dNTP), con liberación del anión pirofosfato y un ion de 
hidrógeno. Ese protón genera el cambio de voltaje que se detecta como la lectura del 
nucleótido incorporado. La figura 1-2 esquematiza los principales pasos para la 
secuenciación de la microbiota [87]. 
Figura 1-2: Principales pasos en la secuenciación de microbiota. En (1) el ADN extraído de las 
heces se utiliza para amplificar las regiones hipervariables de la subunidad 16S ribosomal; en (2) 
los amplificados son codificados por la unión a secuencias de marcaje conocidas; en (3) esas 
codificaciones o librerías se purifican y se ajusta su concentración mediante PCR en tiempo real; 
(4) las librerías se amplifican mediante PCR en emulsión y (5) se realiza la secuenciación de 
nucleótidos en la plataforma Ion Torrent. 
 
Las plataformas Ion Torrent fueron las primeras de secuenciación comercial que no 
requirieron de fluorescencia ni luminiscencia, que dio como resultado una mayor velocidad 
de secuenciación, maneja diferentes chips que difieren en cuanto a la cantidad de pozos 
permitiendo una producción de datos hasta máximo de 50 Gb/día, el tiempo de 
secuenciación oscila entre 7 a 19 horas [91]. Dentro de las desventajas que presenta la 
secuenciación con Ion Torrent es que debido a su principio de detectar iones de hidrógeno, 
se dificulta la detección de varias bases idénticas consecutivas en un fragmento de ADN 
conocidas como homopolímeros [90]. 
Capítulo 2.Objetivos. 32 
 
 
 
 
 Objetivos 
2.1 Objetivo General 
Estudiar perfiles filogenéticos de la microbiota intestinal en adultos colombianos entre 40 
a 70 años con factores de riesgo a diabetes mellitus (DM2) y obesidad. 
 2.2 Objetivos Específicos 
2.2.1 Analizar el perfil genético de la microbiota intestinal en muestras de materia fecal. 
2.2.2 Identificar perfiles diferenciales de la microbiota intestinal y su relación patogénica 
con DM2 y obesidad. 
2.2.3 Correlacionar la microbiota intestinal con los parámetros nutricionales de los 
voluntarios. 
2.2.4 Correlacionar la microbiota intestinal con los parámetros clínicos de los voluntarios. 
 
Capítulo 3. Materiales y métodos. 33 
 
 
 
 Materiales y métodos 
La ejecución de este proyecto se desarrolló en el grupo de investigación de Bioquímica y 
Biología Molecular de Micobacterias (BBMM) del Departamento de Química de la 
Universidad Nacional de Colombia, y en el Laboratorio de Higiene Inspección y Control de 
Alimentos (LHICA). de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Santiago de 
Compostela (Lugo-España). 
 
El desarrollo de las actividades experimentales obtuvo dictamen favorable con código de 
registro 2018/270 del 20 de septiembre de 2018 del Comité Autonómico de Ética de 
Investigación de Galicia (Santiago de Compostela) (Anexo A1) y por el Comité de Ética de 
la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia por medio del acta 02 del 
año 2019 (Anexo A2). El diseño experimental del presente estudio es de tipo descriptivo, 
analítico y de corte transversal. Se hizo el reclutamiento de voluntarios provenientes de 
diferentes geografías del país, de ellos se obtuvieron las muestras biológicas de sangre 
para los análisis bioquímicos y de heces para análisis genómicos. 
 
3.1 Reclutamiento de voluntarios 
Los voluntarios se reclutaron de marzo del 2019 a marzo del 2020, se usó material de 
divulgación que incluyó un video interactivo, folletos, pendones y volantes informativos que 
se compartieron en el correo institucional de la Universidad Nacional, con familiares de 
pacientes diabeticos de la Asociación Colombiana de Diabetes y redes sociales. Se 
realizaron jornadas de salud gratuitas desarrolladas en las ciudades de Bogotá, Medellín 
e Ibagué y en los municipios de Cáqueza, La Vega, Usme y Une del departamento de 
Cundinamarca y también en Circasia (Quindío). Con la llegada de la emergencia sanitaria 
por Covid-19 no fue posible realizar jornadas en otras zonas geográficas colombianas. 
3.1.1 Criterios de inclusión 
Se seleccionaron voluntarios hombres y mujeres colombianos que cumplieron con los 
siguientes criterios de inclusión (i) un rango de edad entre 40 y 70 años; (ii) sin diagnóstico 
Capítulo 3. Materiales y métodos. 34 
 
 
 
de diabetes y sin medicación para esta patología y (iii) estar en estado de ayuno no mayor 
a 8 horas. 
3.1.2 Criterios de exclusión 
Los criterios de exclusión de la investigación incluyó a voluntarios con las siguientes 
características (i) ser menor de 40 años o mayor de 70 años; (ii) mujeres en estado de 
embarazo; (iii) personas con discapacidad mental; (iv) con consumo reciente o a la fecha 
de la toma de muestra de medicamentos hipoglucemiantes, antibióticos, antihipertensivos, 
alfa-adrenérgicos, anfetaminas, betabloqueadores, calcio-antagonistas, opiáceos, 
neurolépticos, fenotiazinas y antidepresivos tricíclicos y también probióticos, prebióticos 
como tratamiento médico; (v) voluntarios que no entregaban muestras de heces o la 
cantidad fue insuficiente para el análisis; (vi) voluntarios con historias clínicas o con el 
cuestionario de frecuencia de alimentos incompleto. 
 
Los voluntarios recibieron un documento que contenía la información del proyecto y el 
consentimiento informado (Anexo B). En éste se describían las muestras biológicas que 
serían donadas a la investigación y los procedimientos a realizar; también se indicaba la 
posibilidad de abandonar el proyecto en cualquier momento. Cada voluntario con su firma 
autorizó la toma de muestras, los procedimientos de análisis y el tratamiento de datos 
según la ley 1581 del año 2012. A cada consentimiento informado se le asignó un código 
para la identificación de las muestras biológicas. Este documento quedo bajo custodia del 
grupo de investigación. 
3.2 Protocolo de reclutamiento 
Luego de firmar el consentimiento informado cada voluntario pasaba a la valoración médica 
que incluyó, (i) la medida de la tensión arterial (tensiómetro Welch Allyn); (ii) la talla 
(tallímetro-estadímetro portátil SECA modelo 213); (iii) el perímetro de cintura se midió 
entre el borde inferior de la décima costilla y el borde superior de la cresta ilíaca en 
espiración, el procedimiento se realizó después de una espiración normal con una cinta 
métrica plástica con una precisión de 1mm (LORD) LDC-338; (iv) diligenciamiento de la 
historia clínica; (v) glucometría en ayunas (glucómetro Roche y kit Accu-chek). 
Capítulo 3. Materiales y métodos. 35 
 
 
 
Las medidas antropométricas se realizaron en una balanza Omron modelo Hbf-514c 
(healthcare, Inc USA). Luego de ser calibrado el equipo, a cada voluntario se le solicitó el 
retiro de calcetines, y elementos metálicos, colocando los piessobre los electrodos de la 
balanza, en posición erguida con mirada al frente y empuñando los electrodos para cerrar 
el circuito. En el formulario se diligenciaron los valores de masa corporal (Kg), IMC (Kg/m2), 
porcentajes de grasa corporal total, grasa visceral y musculo. 
Con los datos correspondientes se diligenció el cuestionario FINDRISC (Anexo C), según 
el puntaje obtenido en este cuestionario se le explicó a cada voluntario su nivel de riesgo 
a desarrollar DM2 en 10 años. 
El universo de la población reclutada fue 620 mujeres y hombres colombianos, de éstos 
completaron el protocolo 535 voluntarios. Se seleccionaron para el análisis genómico de 
microbiota 85 voluntarios, en general caracterizados por FINDRISC, antecedentes 
familiares de DM2 e IMC. 
3.3 Cuestionario de frecuencia de alimentos 
Cada voluntario diligenció un cuestionario de frecuencia de alimentos (FFQ) validado en 
población colombiana anteriormente para conocer la ingesta de macro, micronutrientes y 
el consumo energético en kilocalorías (kcal) [92]. Este cuestionario consta de una lista de 
60 alimentos agrupados según su contenido nutricional, con una frecuencia de consumo 
diaria, semanal, mensual y anual (Anexo D), para calcular la ingesta individual de 
nutrientes se usó la herramienta NutCal® versión 1.2. Hasta la fecha se han analizado 511 
voluntarios, el proceso de alimentación del Software continua bajo la asesoría del Doctor 
Oscar Fernando Herrán de la Universidad Industrial de Santander 
3.4 Toma de muestra sanguínea y PTOG 
Los voluntarios que accedieron a donar muestra sanguínea se les extrajo sangre por 
punción venosa utilizando el sistema vacutainer en tubos secos tapa amarilla con gel 
separador para extraer suero. Luego de la formación del coagulo las muestras de sangre 
se centrifugaron a 1600 x g por 10 minutos para la separación de suero que fue 
almacenado a -70°C en alícuotas de 500 µl hasta su uso. 
 
Capítulo 3. Materiales y métodos. 36 
 
 
 
Los voluntarios que presentaron FINDRISC ≥ 12 con glucometría < 126 mg/dl, y que 
accedieron realizar la prueba de tolerancia oral a la glucosa (PTOG), se les suministró una 
carga de glucosa del 21,4% (75g GLU anhidra en 350 mL de agua) inmediatamente 
después de la extracción de sangre venosa. A estos voluntarios se les indicó que no 
consumieran ningún tipo de alimento o bebida, que no fumaran y que permanecieran en 
estado de reposo por 2 horas. Al cabo de este tiempo se les volvió a tomar una muestra 
sanguínea, en tubo seco, para determinar la concentración de glucosa en suero como 
confirmación de un posible diagnóstico de DM2 o intolerancia oral a la glucosa [60]. 
 
3.5 Recolección de muestra de materia fecal 
Previo a la fecha de la jornada de salud, a cada voluntario se le solicitó traer una muestra 
de materia fecal lo más fresca posible. Las cajas coprológicas fueron entregadas con 
anterioridad a la jornada y se acompañó de un boletín con las indicaciones para la 
recolección de la muestra recalcando un previo aseo, que se evitara la contaminación con 
orina y que la muestra se entregara marcada con el nombre del voluntario y con la fecha 
de recolección. Para las muestras recolectadas varias horas antes se les solicitó que 
fueran refrigeradas hasta el momento de la entrega, estas se codificaron de acuerdo con 
el consentimiento informado de cada voluntario y se congelaron a -80°C hasta el momento 
de su uso. 
3.6 Análisis bioquímicos 
A cada voluntario se le determinaron los siguientes metabolitos en suero, glucosa (GLU), 
colesterol total (CT), triglicéridos (TG), colesterol HDL (c-HDL), colesterol LDL (c-LDL) y 
colesterol VLDL (c-VLDL). Para el protocolo de análisis de estos metabolitos se utilizó kits 
de la casa comercial Spinreact, cuyo mecanismo es de reacciones enzimático 
colorimétricas y con detección espectrofotométrica a 505 nm . Todas las determinaciones 
bioquímicas se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante; en cada prueba se 
incorporaron controles normales y patológicos de marca Spinreact. El cálculo del colesterol 
VLDL se realizó dividiendo el valor de los TG entre 5, dado que el resultado fue expresado 
en términos de mg/dL. Para el cálculo del colesterol LDL se aplicó la fórmula de Friedewald 
[93], que indica que esta lipoproteína es igual al resultado proveniente de sumar el c-HDL 
con el c-VLDL y ese valor restarlo del CT, [c-LDL = CT-(c-HDL+c-VLDL)]. 
Capítulo 3. Materiales y métodos. 37 
 
 
 
3.7 Extracción de ADN de materia fecal 
Mediante el kit DNeasy Power Soil (Qiagen, Inc Alemania) se realizó la extracción de ADN 
presentes en las heces, siguiendo las instrucciones del fabricante, con algunas 
modificaciones que permitieron optimizar la concentración y pureza del ADN. El protocolo 
inició pesando aproximadamente 300 mg de las heces en los tubos que contienen las 
perlas de vidrio. Para la fase de lisis se incubaron las muestras con 60 µl de la enzima 
lisozima a 10 mg/ml por 10 minutos a temperatura ambiente; se adicionaron 60 µl de SDS 
al 10% y junto con la acción mecánica de las perlas de vidrio y vortex fuerte por 10 minutos 
se garantizó la lisis bacteriana. Luego de centrifugar a 10.000 xɡ por 1 minuto se hizo la 
recolección del sobrenadante en un tubo eppendorf estéril; se realizó la fase de 
pretratamiento con reactivos precipitantes para eliminar restos celulares, diferentes 
macromoléculas y residuos sólidos que fueron retirados por centrifugación. Se garantizó la 
solubilidad total del ADN mediante cloruro de guanidinio - isopropanol (buffer de unión), 
esta disolución se aplicó a la columna de sílica gel retirando el filtrado por centrifugación. 
La fase de lavado de la sílica- ADN se realizó con etanol al 70%, mediante centrifugación. 
La elución del ADN se realizó con 100 µl del buffer Tris HCl 20mM pH 8,5. Se midió la 
concentración y calidad del ADN en términos de las relaciones de absorbancia 260/280 y 
260/230 por espectrofotometría (NanoDrop) y fluorométricamente mediante el sistema 
Qubit (kit 1X dsDNA High Sensitivity). Las muestras de ADN fueron almacenadas a -20°C 
hasta su uso. 
3.8 Secuenciación de ADN 
Se utilizó la plataforma Ion Torrent S5 de ThermoFisher y el kit Ion 16 STM Metagenomics 
de catálogo A26216, para la secuenciación de nucleótidos de la población bacteriana 
proveniente de la microbiota de los voluntarios. Las regiones hipervariables del gen 16S 
rRNA se amplificaron mediante el kit Ion 16STM Metagenomics (ThermoFisher Scientific, 
Inc USA), por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El kit consta de dos 
juegos de primers específicos del gen 16S rRNA, patentados por la casa comercial. El 
primer grupo de primers está dirigido a las regiones hipervariables 2, 4 y 8; el segundo 
grupo está dirigido a las regiones hipervariables 3,6,7 y 9, por lo que se amplifican 7 
regiones hipervariables, generalmente para el primer set de primers se tienen longitudes 
de amplicones de ~ 250 pares de bases (pb), ~ 288 pb y ~ 295 pb, respectivamente y para 
Capítulo 3. Materiales y métodos. 38 
 
 
 
el segundo juego de primers se tienen longitudes de amplicon de ~ 215 pb, ~ 260 pb, y ~ 
209 pb. Estos juegos de primers fueron diseñados para cubrir >80% de las secuencias 
encontradas en diferentes bases de datos [94]. Se usó como control positivo de 
amplificación ADN proveniente de la cepa E.coli DH10B y como control negativo agua 
grado molecular. Los experimentos de amplificación se realizaron por duplicado para las 
muestras y controles, el procedimiento se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. 
 
Los amplicones fueron purificados usando el kit de perlas magnéticas Agencourt AMPure 
XP (Beckman Coulter, Inc USA) y etanol al 70%; éstos fueron cuantificados mediante el 
sistema Qubit. La producción de las librerías genéticas se realizó utilizando el kit Ion Plus 
Fragment Library (ThermoFisher Scientific) y 80 ng de cadaamplicon en un volumen de 
79µl. Las librerías se caracterizan por el marcaje de cada amplicon con unas secuencias 
cortas de ADN conocidas como barcodes que permiten la diferenciación entre muestras. 
Luego del proceso de marcaje se hace una purificación usando el kit de perlas AMPure XP 
y etanol al 70%. Con el objetivo de determinar la concentración de la librería genética de 
la microbiota, previamente se preparó una curva de calibración utilizando como patrón 
cuatro diluciones seriadas en base 10 de la librería de E. coli DH10B 6,8 pM (estándar 
incluido en el kit Ion Universal Library Quantitation de ThermoFisher Scientific). Se preparó 
una dilución 103 de las librerías de microbiota y junto con las diluciones del patrón se 
amplificaron, por duplicado, mediante qPCR en el equipo QuantStudio 12K Flex 
(ThermoFisher Scientific), siguiendo el protocolo del fabricante. Luego del procesamiento 
de los datos, las librerías de microbiota se ajustaron a una concentración de 10 pM. 
 
El proceso de secuenciación de nucleótidos se realizó en el equipo Ion Torrent S5; 
previamente se utilizaron los kits Ion One Touch2TM y el Ion PGMTM Hi-QTM que incluye 
las Ion esferas (contienen las secuencias complementarias de las regiones hipervariables). 
Junto con estas Ion esferas y las librerías de microbiota diluidas hasta 0.064 pM se generó 
el templado que fue cargado en el Ion chip utilizando Ion 520TM Chip Kit (Thermo Fisher 
Scientific, Taiwan). En cada Ion Chip la cantidad máxima de muestras que se pueden 
secuenciar son 48 y el tiempo total de secuenciación la plataforma Ion S5 es de 7 horas. 
 
3.9 Análisis bioinformáticos 
 
Capítulo 3. Materiales y métodos. 39 
 
 
 
Se utilizó el sistema operativo Ubuntu para la instalación del software QIIME 2 TM necesario para 
el análisis de los resultados de la secuenciación de nucleótidos. Los archivos en formato BAM y 
en formato FASTQ se obtuvieron del software Torrent suit (v.5.12.2.), las secuencias en formato 
FASTQ fueron analizadas por el software QIIME 2TM versión 2021.8 [92]. Para obtener el número 
de lecturas y la visualización de la calidad, los archivos FASTQ fueron comprimidos y 
demultiplexados dado el uso de barcodes en el sistema Ion Torrent. EL algoritmo DADA2 permitió 
filtrar las secuencias en función de su calidad, en este caso se eliminaron aquellas con un Q 
score ≤ 30, lo que permite eliminar el ruido o posibles quimeras. Las secuencias únicas que 
presentaron una abundancia total menor de diez taxones fueron removidas, asimismo, aquellas 
que solo aparecían en una única muestra también fueron eliminadas. Finalizado el proceso de 
denoising o de limpieza se llevó a cabo la asignación taxonómica utilizando “qiime feature-
classifier classify-consensus-vsearch” por comparación con la base de datos Greengenes (13_8) 
con el 99% de identidad de secuencias. Se generaron barplots interactivos en QIIME 2 de las 
unidades taxonómicas (OTUs), para la visualización de la clasificación taxonómica. El flujo de 
trabajo para los análisis taxonómicos se describe en la figura 3-1. 
 
Figura 3-1: Flujograma de trabajo en el análisis taxonómico de muestras de ADN.(adaptada del 
software QIIME 2TM V. 2021.8 [95]. 
 
Capítulo 3. Materiales y métodos. 40 
 
 
 
3.10 Análisis estadísticos 
 
Los datos básicos y los resultados de las pruebas bioquímicas obtenidos de las muestras 
de suero de los voluntarios fueron analizados estadísticamente en el Software 
STATGRAPHICS Centurion XVI.I. La distribución se determinó variable a variable, el IMC 
y su discriminación en normopeso (NP), sobrepeso (SP) y obesidad (OB) fue la variable 
con la que se contrastaron las demás. Se aplicó la prueba de Kolmogórov-Smirnov para 
determinar la normalidad de los datos. El cálculo de p permitió determinar las diferencias 
estadísticamente significativas entre los grupos; se utilizó el test de análisis de varianza 
ANOVA para variables con distribución normal, para el calculó de p. El test de Kruskal 
wallis para variables con una distribución no normal fue utilizado para el cálculo de p. Se 
asignó el rango para p ≤ 0,05 en un intervalo de confianza ≥ del 95% [96]. 
 
En el análisis de microbiota se determinó la posible relación entre las frecuencias de 
abundancia relativa (FAR) de los taxones microbianos con diferentes variables de interés. 
Se utilizó el Software de uso libre R 4.1.2, para conocer si las variables tenían una 
distribución normal o no, se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk, esto con el fin de saber que 
coeficiente de correlación se adecuaba más con los datos. Se concluyó que el coeficiente 
de correlación de Spearman (rho) era el indicado para el análisis a excepción del análisis 
que se realizó con la familia Ruminococcaceae en relación con los niveles de glucosa de 
los voluntarios con el que se usó el coeficiente de correlación de Pearson, debido a que 
las dos variables presentaron una distribución normal (Anexo G). 
 
Los análisis diversidad alfa y beta de los perfiles génicos del 16S rRNA se realizaron en el 
Software MicrobiomeAnalyst. Se aplicó un análisis estadístico ANOVA, en la determinación 
de los índices de Shannon y el Chao1 para evaluar la diversidad alfa. Se realizó un análisis 
PERMANOVA con la prueba de Barty Curtis para calcular la diversidad beta. Estas pruebas 
estadísticas se realizaron a nivel de las OTUs Se usaron los archivos correspondientes a 
la taxonomía en formato.txt, la OTU/ASV tabla y un archivo “Metadata”, con la información 
de las muestras, también en formato txt, obtenidas en el análisis bioinformático. 
Los posibles biomarcadores diferenciales de la microbiota intestinal fueron valorados 
mediante la prueba estadística LEfSe que aplica un análisis discriminativo lineal (LDA). 
Basado en el efecto del tamaño. Para que sea significativo se empleó un algoritmo del LDA 
Capítulo 3. Materiales y métodos. 41 
 
 
 
score de 2.0 con aplicación de corrección del valor p valor por el método FDR (False 
Discovery Rate), con un nivel de significancia del 90% (Anexo F). 
Capítulo 4. Resultados y discusión 42 
 
 
 
 Resultados y discusión 
4.1 Características generales de los voluntarios 
La población de voluntarios atendidos en las jornadas de salud fue de 620, mujeres y 
hombres con edad entre 40 y 70 años. Luego de la valoración médica que incluyó las 
medidas de glucometría, tensión arterial, antropométricas e historia clínica se excluyó el 
14% de los participantes (n=85). Generalmente estos voluntarios padecían de 
enfermedades crónicas o agudas diagnosticadas previamente, y/o estaban consumiendo 
medicación para éstas. Se excluyeron aquellos que no donaron muestra de sangre o fue 
insuficiente para completar los análisis bioquímicos; de igual forma, quienes no donaron la 
muestra de materia fecal también debieron ser excluidos. 
 
Los voluntarios que cumplieron el protocolo básico de reclutamiento (para análisis 
metabólico) fueron 535 (86%); de éstos 348 (65%) correspondieron a mujeres y 187 (35%) 
fueron hombres. Las características generales de la población se describieron en términos 
de las medidas realizadas en la valoración médica (tabla 4-1), los análisis bioquímicos 
(tabla 4-2) y FINDRISC e índices aterogénicos (tabla 4-3). 
 
Las medidas de masa corporal según el género muestran que las mujeres tuvieron un 
promedio de 66,4 ± 11,7 Kg y los hombres de 75,8 ± 13,2 Kg; la asociación de los datos 
entre cada grupo tiene una significancia estadística con valor p = < 0,0001. La tabla 4-1 
muestra diferencia estadística entre la masa corporal desde los voluntarios normopesos a 
los obesos . Los valores promedio para la talla (1,56 a 1,60 m) reflejan una estatura media 
baja dada a la alta participación de mujeres en el estudio. La estatura promedio en los 
hombres fue de 1,67 ± 0,07 m y en las mujeres de 1,54 ± 0,7 m. 
 
Capítulo 4. Resultados y discusión 43 
 
 
 
Tabla 4-1:Caracterización