Analisis-de-cambios-de-la-microbiota-intestinal-en-pacientes-con-diabetes-tipo-2-tratados-con-metformina

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
PROGRAMA DE MAESTRIA Y DOCTORADO EN CIENCIAS 
MEDICAS, ODONTOLOGICAS Y DE LA SALUD 
 
 
 
 
Análisis de cambios en la microbiota intestinal en pacientes con diabetes tipo 2 tratados con 
metformina. 
 
 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE 
MAESTRA EN INVESTIGACION CLINICA EXPERIMENTAL EN SALUD 
 
 
 
PRESENTA: 
BIOL. DULCE KARINA RICO AMADOR 
 
 
 
TUTOR: 
DRA. MARIA TERESA VILLARREAL 
 
 
 
CIUDAD UNIVERSITARIA CD MX MAYO 2018 
Margarita
Texto escrito a máquina
PROGRAMA DE MAESTRIA Y DOCTORADO EN CIENCIAS
MEDICAS, ODONTOLOGICAS Y DE LA SALUD
Margarita
Texto escrito a máquina
Margarita
Texto escrito a máquina
Margarita
Texto escrito a máquina
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
I 
Indice 
I. RESUMEN 1 
II. INTRODUCCIÓN 2 
III. MARCO TEORICO 2 
3.1 Definición y diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2 (DT2) 2 
3.2 Tipos de diabetes mellitus 3 
a) Diabetes tipo mellitus 1 (DT1). 3 
b) Diabetes tipo 2 mellitus (DT2) 4 
c) Diabetes gestacional. 5 
3.3 Epidemiología de la diabetes mellitus tipo 2. 5 
3.4 Fisiopatología de la diabetes mellitus tipo 2. 6 
• Secreción de insulina 7 
• Acción periférica de la insulina 8 
3.5 Hiperinsulinemia y resistencia a la insulina 8 
3.6 Etiología de la diabetes mellitus tipo 2 9 
a) Factores genético 9 
b) Ambiente (estilo de vida): 10 
3.7 Microbiota intestinal 11 
3.8 Función de la microbiota 12 
3.9 Funciones metabólicas de la MI 12 
a) Microbiota intestinal y su función en el metabolismo de los carbohidratos. 12 
b) Microbiota intestinal y su función en el metabolismo de ácidos grasos. 13 
c) Microbiota intestinal y metabolismo de aminoácidos 13 
3.10 Funciones protectoras de la MI 14 
3.11 Funciones tróficas de la MI 15 
3.12 Factores que influyen sobre la composición de la microbiota intestinal 15 
3.13 Microbiota y obesidad 16 
3.14 Microbiota y diabetes tipo 2 17 
3.15 Metformina en el tratamiento de la diabetes tipo 2 19 
3.16 Metformina y microbiota intestinal 19 
IV. JUSTIFICACIÓN 22 
V. OBJETIVO GENERAL 22 
VI. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 22 
VII. MATERIAL Y MÉTODOS 23 
 
 
II 
7.1 Cuestiones éticas 23 
7.2 Población de estudio 23 
a) Criterios de inclusión 23 
b) Criterios de exclusión 23 
c) Criterios de eliminación 24 
7.3 Diagnostico de diabetes tipo 2 24 
7.4 Visitas 25 
7.5 Visita1 25 
7.5.1 Variables antropométricas 25 
7.5.2 Variables bioquímicas 25 
 
7.6 Muestra fecal para análisis de microbiota 26 
7.7 Intervención 26 
a) Dieta 26 
b) Tratamiento con metformina 27 
c) Cuestionario de adherencia al tratamiento 27 
7.11 Visitas de seguimiento 27 
7.12 Valoración de respuesta al tratamiento con metformina. 28 
7.13 Análisis de microbiota intestinal amplificación y secuenciación de los 
genes 16s RNA 28 
7.14 Análisis bioinformático 29 
7.15 Análisis estadístico 30 
VIII. RESULTADOS32 
8.1 Cambios en datos antropométricos, bioquímicos y de microbiota intestinal antes y 4 
meses después del tratamiento con metformina. 32 
8.2 Adherencia al tratamiento con metformina 34 
8.3 Respuesta al tratamiento 35 
8.4 Cambios en la microbiota intestinal 36 
8.5 Alfa diversidad análisis de rarefacción 37 
8.6 Beta diversidad 38 
8.7 Abundancia relativa a nivel phylum 39 
8.8 Relación Firmicutes/Bacteroidetes en T0 y T2 41 
 
 
III 
8.9 Cambios en géneros Akkermansia, Bifidobacterium, Escherichia e Intestinibacter 
 42 
8.10 Análisis de varianza multivariado permutacional 42 
8.11 Relación de los cambios de la microbiota intestinal con la respuesta al tratamiento 
(ΔHbA1c relativa) 43 
IX. DISCUSIÓN 45 
9.1 Tasa de respuesta y adherencia al tratamiento con metformina 45 
9.2 Cambios en la microbiota intestinal después del tratamiento con 
Metformina (4 meses) 46 
• Generalidades sobre la microbiota Intestinal en la población de estudio 47 
• Alpha diversidad 48 
• Beta diversidad, cambios a nivel género 48 
• Beta diversidad, cambios a nivel phylum 50 
9.3 Correlación de la abundancia relativa de Firmicutes (Δ HbA1c relativa) 51 
9.4 Análisis de varianza multivariado permutacional (ADONIS). 51 
9.5 Efecto de la dieta en la microbiota intestinal 52 
9.6 Limitaciones del estudio 52 
X. CONCLUSIONES 53 
XI. REFERENCIAS 55 
ANEXO 1. Tecnología, seguimiento y respuesta a metformina de diabéticos con datos 
genómicos y metagenómicos 64 
ANEXO 2. Protocolo de extracción de ADN de muestras fecales 73 
ANEXO 3. Protocolo de preparación de muestras de ADN microbiano para 
secuenciación 76 
ANEXO 4. Protocolo de purificación con las perlas magneticas ampure XP 79 
ANEXO 5. Diseño de primers 80 
ANEXO 6. Abundancia relativa de géneros bacterianos encontrados antes y después 81 
ANEXO 7 Parámetros bioquímicos y antropométricos antes y 4 mese después del 
tratamiento con metformina de todos los pacientes 84 
 
 
 
IV 
Índice Tablas 
 
Tabla 1. Primeros estudios reportando alteraciones en la microbiota intestinal en diabetes 
mellitus tipo 2 18 
Tabla 2. Comparación de parámetros antropométricos antes y después del tratamiento 
con metformina 33 
Tabla 3. Comparación de parámetros antropométricos antes y después del tratamiento 
con metformina de acuerdo al género. 34 
Tabla 4. Comparación de parámetros bioquímicos antes y después del tratamiento con 
metformina. 34 
Tabla 5 Comparación de parámetros bioquímicos antes y después del tratamiento con 
metformina de acuerdo al género 35 
Tabla 6. Abundancias Relativas de Akkermansia, Bifidobacterium, Escherichia e 
Intestinibacter Antes y Después del Tratamiento con Metformina. 43 
Índice Figuras 
 
Figura 1. Prevalencia de diagnóstico médico previo de diabetes por sexo 6 
Figura 2. Mecanismos de secreción de la insulina 8 
Figura 3. Descripción de Disbiosis 18 
Figura 4. Flujo de trabajo del análisis 30 
Figura 5. Distribución de los pacientes de acuerdo a la adherencia al tratamiento 36 
Figura 6. Porcentaje de pacientes con respuesta adecuada de acuerdo a la adherencia al 
tratamiento 37 
Figura 7. Graficas de calidad de las lecturas de las muestras 37 
Figura 8. Número de especies observadas por cada secuencia 38 
Figura 9. Promedio del número de especies observadas 39 
Figura 10. Grafico de componentes principales sin ponderar 39 
Figura 11. Grafico de componentes principales con ponderación 40 
Figura 12. Abundancia relativa de Phyla en muestras de microbiota intestinal. 40 
Figura 13. Porcentaje de cambio en la abundancia relativa de los 3 principales filotipos. 41 
Figura 14. Cambios en el promedio de las abundancias relativas de los 3 filotipos 42 
Figura 15. Razón Firmicutes/Bacteroidetes en T0 y T2 42 
Figura 16. Análisis de varianza multivariado pemutacional ADONIS 44 
Figura 17. Correlación de la abundancia relativa de Bacteriodetes con hemoglobina 
glucosilada antes y 4 meses después de tratamiento con metormina. 44 
Figura 18. Correlación de la abundancia relativa de los Firmicutes con el porcentaje de 
hemoglobina glucosilada 45
 1 
I. RESUMEN 
Estudios tanto en modelos animales como en seres humanos han aportado evidencia de que 
la composición de la microbiota intestinal (MI) puede contribuir al desarrollo de trastornos 
metabólicos como la obesidad y la diabetes tipo 2 (DT2). Se ha propuesto que algunos de los 
cambios descritos enla MI en individuos con DT2 podrían no estar asociados a la diabetes 
como tal, sino al efecto del tratamiento farmacológico. De manera reciente, se reportó que la 
metformina induce cambios en la MI que pudieran estar relacionados con su efecto 
terapéutico. El objetivo de este estudio fue analizar los cambios en la MI en respuesta al 
tratamiento con metformina en pacientes con diabetes tipo 2 sin tratamiento previo en 
población de origen maya, y buscar correlaciones entre los cambios en la MI e indicadores de 
control metabólico. El estudio incluyó 41 pacientes con DT2 de recién diagnóstico. En todos 
los pacientes se analizaron parámetros antropométricos, hemoglobina glucosilada, perfil de 
lípidos y microbiota intestinal, antes y 4 meses después de recibir tratamiento con metformina. 
La MI fue analizada por secuenciación de la región V4 del gen ribosomal 16S utilizando el 
programa QIIIMe. El 82.9% de los pacientes tuvieron adecuada adherencia al tratamiento 
(≥70%), y el 44.1% se consideraron no respondedores. Previo al tratamiento, se observó una 
abundancia relativamente alta de Protobacteria (6%), y una abundancia relativa muy baja de 
Akkermansia y Bifidobacterium, así como de E. Coli e Intestinibacter. Un análisis 
permutacional multivariado reveló que el género del individuo explica el 4.25% de la varianza 
de la microbiota (P=0.045). Las abundancias relativas de Akkermansia y Bifidobacterium 
aumentaron después del tratamiento con metformina, sin embargo las diferencias no fueron 
estadísticamente significativas. De manera interesante, la abundancia de Firmicutes previa al 
tratamiento correlacionó de manera negativa y marginalmente significativa con el cambio en la 
hemoglobina glucosilada después del tratamiento (P=0.08). Estos hallazgos sugieren que la 
MI presente antes de iniciar el tratamiento puede afectar la respuesta a la metformina. Es 
necesario realizar más estudios para confirmar estos hallazgos y entender mejor el papel de la 
MI en la respuesta a la metformina. 
 
 
 
 
 
 2 
II. INTRODUCCIÓN 
La diabetes mellitus representa un grave problema de salud pública a nivel mundial, ya que su 
prevalencia ha incrementado notablemente en las últimas décadas. Por esta razón, es motivo 
de numerosas investigaciones en distintos campos, que buscan entender la etiología de la 
enfermedad y mejorar la atención del paciente. Se conoce que factores genéticos y 
ambientales influyen en el desarrollo de esta patología, y actualmente ha surgido el interés del 
papel que puede tener la microbiota intestinal en esta enfermedad y en trastornos metabólicos 
relacionados. Recientemente se reportó que la metformina induce cambios en la microbiota 
intestinal, que pudieran estar relacionados con su efecto terapéutico. Sin embargo, la relación 
entre el tratamiento con metformina y la microbiota intestinal sigue siendo poco clara, y los 
estudios en humanos son escasos. 
 
III. MARCO TEÓRICO 
3.1 Definición y diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2 (DT2) 
La diabetes es un desorden metabólico de múltiples etiologías, caracterizado por 
hiperglucemia crónica con alteraciones en el metabolismo de los hidratos de carbono, grasas 
y proteínas, relacionado con dos eventos: defectos en la secreción de la insulina, defectos en 
la acción de la insulina o una combinación de ambos (Asociación Latinoamericana de 
Diabetes ALAD, 2013). La Federación Internacional de Diabetes (IDF por sus siglas en 
ingles), define el término diabetes mellitus (DM) como una enfermedad crónica degenerativa 
que se presenta cuando el páncreas no produce suficiente insulina, o bien, la insulina que se 
produce no es utilizada de manera eficiente por el organismo. La insulina es la hormona 
responsable de que la glucosa circulante pueda ser transportada hacia el interior de las 
células y dotar de energía al organismo (IDF, 2013). 
 La DT2 es un síndrome heterogéneo en el que existe una alteración común que la define: la 
elevación de la glucemia. Para hacer el diagnóstico, debe medirse la glucemia en ayuno 
(glucemia basal) en plasma venoso. Puede hacerse una determinación de glucemia en sangre 
capilar mediante tira reactiva y lectura en reflectómetro, el paciente debe estar en ayunas al 
 
 
 3 
menos 3 horas. Sin embargo, por su variabilidad y menor precisión, se debe confirmar el 
diagnóstico mediante determinaciones en un laboratorio clínico. 
Los criterios diagnósticos propuestos por la Asociación Americana de Diabetes (ADA) en 2014 
y aceptados por el comité asesor de la OMS son los siguientes: 
• Glucemia basal en plasma venoso ≥ 126 mg/dl (7 mmol/l). Debe realizarse una 
segunda determinación en un día diferente para confirmar el diagnóstico. 
• Síntomas típicos de diabetes y glucemia al azar ≥ 200 mg/dl (11,1 mmol/l). No es 
necesaria una segunda determinación. 
• Glucemia plasmática ≥ 200 mg/dl 2 horas después de la prueba de tolerancia oral a la 
glucosa (75 g). 
• Hemoglobina glucosilada ≥ 6.5% siempre y cuando la prueba sea realizada en 
laboratorios con metodología y estandarización avalada por la National 
Glycohemoglobin Standarization Program (NGSP). 
 
3.2 Tipos de Diabetes Mellitus 
Los diferentes tipos de diabetes se clasifican de acuerdo a su etiología y características 
fisiopatológicas. La clasificación de la diabetes contempla tres grupos: 1) Diabetes tipo I, 2) 
Diabetes tipo 2 y 3) Diabetes gestacional (Harris & Zimmet, 1997). 
a) Diabetes mellitus tipo 1 (DT1). La diabetes tipo 1, también conocida como diabetes 
insulinodependiente, inicia comúnmente desde la infancia y se considera una 
enfermedad inflamatoria crónica causada por la destrucción específica de las células β 
en los islotes del páncreas. Estas células tienen como función principal la secreción de 
insulina hacia el torrente sanguíneo en respuesta al incremento en la glucemia. Es 
mucho menos frecuente que la DT2, con una incidencia mundial calculada entre 1 y 11 
casos por 100,000 habitantes por año. Aunque la predisposición genética es un factor 
muy importante en la etiología de la DT1, no es suficiente para que se presente la 
enfermedad, y se conoce poco sobre los factores ambientales que pueden causar 
autoinmunidad que conllevan a la destrucción de los islotes pancreáticos (Achenbach 
et al., 2005). 
 
 
 4 
Durante la etapa previa al inicio de la diabetes tipo I, en el 80% de los individuos se 
detectan anticuerpos contra antígenos citoplasmáticos o membranales de las células β 
pancreáticas como la descarboxilasa del ácido glutámico 65 y 67 (GAD65 y 67), la 
proteína de choque térmico 65 (Hsp-65), y contra la insulina (Davis, 2006). Sin 
embargo, la mayor susceptibilidad para desarrollar diabetes tipo I es conferida por los 
genes del antígeno leucocitario humano (HLA clase II) del cromosoma 6. Mediante la 
identificación de estos anticuerpos en personas sanas, se establece el riesgo de 
desarrollar la enfermedad; por ejemplo, la presencia de anticuerpos contra insulina 
confiere un riesgo pequeño, mientras que la combinación de anticuerpos contra células 
de los islotes y contra GAD o contra insulina representa un riesgo alto para desarrollar 
diabetes tipo I (Davis, 2006). 
b) Diabetes mellitus tipo 2 (DT2). La diabetes tipo 2 es el tipo de diabetes más común y 
por lo general ocurre en adultos, aunque puede iniciar en la adolescencia y en raras 
ocasiones durante la niñez. En las últimas décadas, su incidencia ha incrementado 
notablemente a nivel mundial , representando un grave problema de salud pública. Las 
causas que desencadenan la diabetes tipo 2 son múltiples. Al parecer, influyen 
diversos factores como la herencia poligénica (en la que participa un número 
indeterminado de genes), junto con factores de riesgo que incluyen la obesidad, 
dislipidemia, historia familiar de diabetes, dieta rica en hidratos de carbono, factores 
hormonales y una vida sedentaria (Sharabi, 2012). Los pacientespresentan niveles 
elevados de glucosa y resistencia a la acción de la insulina en los tejidos periféricos. 
Del 80 al 90% de las personas tienen células β sanas con capacidad de adaptarse a 
altas demandas de insulina mediante el incremento en su función secretora y en la 
masa celular (Donath et al., 2005). Sin embargo, en el 10 al 20% de las personas se 
presenta una deficiencia de las células β en adaptarse, lo cual produce un agotamiento 
celular, con reducción en la liberación y almacenamiento de insulina (Maedler, 2008). 
c) Diabetes gestacional. La diabetes gestacional se presenta durante el embarazo, 
generalmente a partir de las 24-28 semanas de gestación. El embarazo normal se 
considera un estado diabetogénico o de resistencia progresiva a la insulina debido a los 
cambios en el patrón de secreción de la insulina y a las modificaciones ensensibilidad a 
la acción de la misma. El aumento de estrógenos y progesterona produce hiperplasia 
 
 
 5 
de las células β del páncreas y, por consiguiente afecta el metabolismo de los hidratos 
de carbono, aumentando la producción de somatostatina coriónica humana placentaria, 
prolactina, cortisol y glucagón, lo que contribuye a una diminución de la tolerancia a la 
glucosa y mayor resistencia a la insulina (Guzmán & Madrigal, 2003). La falta de control 
metabólico en la diabetes gestacional tiene riesgos potenciales tanto para el feto como 
para la madre. La elevación de la glucemia durante el embarazo puede causar 
macrosomía fetal y aumenta el riesgo de preeclampsia, que se caracteriza por 
elevación de la presión arterial, proteinuria y edema en la madre, representando un 
peligro para la salud de la madre y su hijo (ALAD, 2013). 
La diabetes gestacional normalmente desaparece después del nacimiento. Sin embargo, las 
mujeres que han tenido diabetes gestacional tienen un mayor riesgo de desarrollar diabetes 
gestacional en embarazos posteriores y de desarrollar diabetes tipo 2. Se ha observado que 
los bebés que nacen de madres con diabetes gestacional también tienen un mayor riesgo de 
obesidad y diabetes tipo 2 en la adolescencia o en la edad adulta temprana (ALAD, 2013). 
 
3.3 Epidemiología de la Diabetes Mellitus Tipo 2. 
La IDF estimó que en 2013 aproximadamente 8,3% de los adultos o 382 millones de personas 
padecían DT2 a nivel mundial, y la prevalencia de la enfermedad está aumentando en todos 
los países. Se calcula que 471 millones de personas padecerán DT2 en 2035. La IDF estimó 
que 1 de cada 12 personas adultas tiene diabetes, 1 de cada 2 personas con DT2 no sabe 
que tiene la enfermedad y cada 7 segundos muere una persona por complicaciones de este 
padecimiento. En América Central y del Sur hay aproximadamente 25 millones de personas 
con diabetes, con una prevalencia de 9.1%; mientras que en América del Norte y el Caribe 
hay una prevalencia de 11.4%. Las últimas cifras del Atlas de la Diabetes de la IDF causan 
preocupación sobre el impacto futuro de la diabetes como una de las principales amenazas 
para el desarrollo mundial (IDF, 2015). 
 
México tiene condiciones de alto riesgo debido a los estilos de vida poco saludables, y la alta 
prevalencia de obesidad y sobrepeso, principal factor de riesgo modificable de la diabetes. De 
acuerdo con la Encuesta Nacional de Salud de Medio Camino 2016, la prevalencia de 
 
 
 6 
diabetes en México ha ido en aumento, 6.5 millones de personas (9.4% de la población) 
habían sido diagnosticadas con la enfermedad (ENSANUTMC, 2016) (Figura 1). En el estado 
de Yucatán, la prevalencia de diabetes fue de 9.2% en 2012, mayor a la reportada en la 
ENSANUT 2006 (5.4%). En México la diabetes afecta principalmente a la población de bajos 
recursos económicos, asentada en las áreas urbanas, en donde el estilo de vida determina las 
conductas alimentarias. La OMS considera al estilo de vida como “la manera general de vivir 
que se basa en la interacción entre las condiciones de vida y los patrones individuales de 
conducta, los cuales están determinados por factores socioculturales y por características 
personales de los individuos” (ALAD, 2013). 
 
 
Figura 1. Prevalencia de diagnóstico médico previo de diabetes por sexo 
 
3.4 Fisiopatología de la Diabetes Mellitus Tipo 2. 
La homeostasis de la glucosa está controlada por tres mecanismos coordinados: la secreción 
de insulina, la captación de glucosa por músculo e hígado y la supresión de la producción de 
glucosa en el hígado (Briceño et al., 2007). La insulina es la hormona responsable de que la 
glucosa circulante pueda ser transportada hacia el interior de las células y dotar de energía al 
organismo (IDF, 2013). Como se había mencionado anteriormente, la diabetes es causada 
por defectos en la secreción de la insulina, defectos en la acción de la insulina o una 
combinación de ambos (ALAD, 2013). 
 
 
 7 
Secreción de Insulina: La insulina es secretada por las células β de los islotes de 
Langerhans del páncreas, y es regulada por nutrientes, neurotransmisores y hormonas. Entre 
estos tres factores, los nutrientes, particularmente la glucosa, son la señal estimulante más 
dominante para la secreción de insulina. La secreción de insulina es bifásica con una primera 
fase aguda que ocurre dentro de los primeros 10 minutos después de una carga de glucosa y 
una segunda fase más sostenida que alcanza una meseta muy rápidamente (Gerich, 1998). 
Los nutrientes, la glucosa, los aminoácidos, los ácidos grasos y los cuerpos cetónicos 
favorecen la secreción de insulina, al igual que la activación del receptor β2-adrenérgico y la 
estimulación del nervio vago, mientras que los receptores α2-adrenérgicos inhiben la liberación 
de insulina (Santulli et al., 2012). 
La liberación de insulina en respuesta a la glucosa es proporcional a la glucemia, que a su vez 
es regulada por la absorción intestinal, la producción y liberación hepática de glucosa y el 
metabolismo de los tejidos periféricos. Un modelo reciente para explicar el mecanismo de 
secreción de la insulina estimulada por la glucosa sustenta que la glucosa entra en las células 
beta a través del transportador de glucosa de alta capacidad 2 (GLUT2). A través de la acción 
de la glucocinasa, se convierte en glucosa 6 fosfato (G6P), que es el paso limitante de la 
glucólisis. La G6P entra a la vía de glucolisis para producir piruvato. Esta molécula entra al 
ciclo de Krebs donde produce ATP. El aumento en relación ATP/ADP en el citosol promueve 
el cierre de los canales de potasio sensibles al ATP (canales KATP), y el aumento de potasio 
intracelular causa la despolarización de la membrana de las células beta y la activación de los 
canales de Ca2+ dependientes del voltaje. La apertura de estos canales de calcio facilita la 
afluencia de Ca2+ extracelular, lo que conduce a un aumento en niveles de Ca2+ citosólico en 
la célula beta, lo que desencadena la exocitosis de la insulina contenida en vesículas (Zhuo et 
al., 2013). 
Este mecanismo denominado "dependiente del canal KATP" parece ser particularmente 
importante para la primera fase aguda de la liberación de insulina. Sin embargo, en la 
segunda fase más sostenida de la secreción de insulina, una vía "independiente del canal 
KATP" parece desempeñar un papel clave en la regulación de la secreción de insulina en 
conjunción con la vía dependiente del canal KATP (Ravier et al., 2009) (Figura 2). 
 
 
 8 
Acción Periférica de la Insulina: La insulina circulante, a través de la unión a su receptor, 
aumenta la captación de glucosa en el músculo y el tejido adiposo, inhibe la producción 
hepática de glucosa, estimula la glucólisis, la lipogénesis, la glucogénesis y la síntesis de 
proteínas e inhibe la β-oxidación de ácidos grasos, la glucogenólisis y la proteólisis (Cline et 
al., 1999). 
Cuando la insulina se une a su receptor en células del músculo, inicia una serie de vías de 
señalización complejas que permiten la translocacióndel transportador GLUT4 localizado en 
vesículas hacia la membrana plasmática para llevar a cabo su función de transportar la 
glucosa hacia el interior de la célula (Chen et al., 2012). La señalización del receptor termina 
cuando es fosforilado en los residuos de serina/treonina en la región intracelular para su 
desensibilización, y finalmente esto permite la internalización del receptor (Stöckli, 2009). 
 
Figura 2. Mecanismos de secreción de la insulina modificado de Cantley and Ashcroft (2015). 
 
3.5 Hiperinsulinemia y resistencia a la insulina 
La resistencia a la insulina se define como la incapacidad genética o adquirida de los tejidos 
periféricos de responder normalmente a la acción de la hormona circulante. La resistencia a la 
insulina conlleva primero a la hiperinsulinemia compensatoria con euglucemia, que 
posteriormente puede ser insuficiente para mantener la euglucemia, apareciendo la 
hiperglicemia. La insulino-resistencia puede inferirse por la presencia de concentraciones 
elevadas de insulina en ayunas, sin hipoglucemia concomitante (Serrano et al., 2005). 
 
 
 9 
La resistencia a la insulina, considerada como la plataforma más constante para el síndrome 
metabólico y el desarrollo de DT2, resulta de un mecanismo complejo y multifactorial que se 
asocia con múltiples alteraciones en diferentes niveles de la señalización de la insulina. 
Procesos como la inflamación, el estrés del retículo endoplásmico y la disfunción mitocondrial 
constituyen mecanismos clave asociados al desarrollo de la resistencia a la insulina. A nivel 
molecular, esta deficiente señalización puede ser causada por diferentes alteraciones, 
incluyendo mutaciones y/o modificaciones postraduccionales del receptor de insulina, de 
sustratos del receptor de la insulina (IRS) o de otras moléculas efectoras río abajo. Entre las 
alteraciones más comunes se encuentran la disminución en el número de receptores de 
insuina y de su actividad catalítica, el aumento en el estado de fosforilación en residuos de 
Ser/Thr del receptor de insulina y del IRS, el aumento en la actividad de fosfatasas de 
residuos de Tyr, la disminución de la actividad de cinasas y defectos en la expresión y función 
del receptor GLUT-4 (Gutiérrez-Rodelo et al., 2017). 
 
3.6 Etiología de la diabetes mellitus tipo 2 
La diabetes mellitus tipo 2 es una enfermedad de etiología compleja, donde intervienen 
factores tanto genéticos como ambientales. 
a) Factores genéticos Una gran cantidad de estudios han demostrado que factores 
genéticos y ambientales contribuyen al desarrollo de la diabetes, se calcula de manera global 
la heredabilidad de la DT2 es alrededor del 50% (Das et al. 2006). Los esfuerzos iniciales para 
identificar genes de susceptibilidad para la DT2 se basaron en análisis de ligamiento en 
familias y estudios de genes candidatos, con resultados modestos. Los estudios de asociación 
de genoma completo (GWAS por sus siglas en inglés) han identificado más de 78 loci de 
riesgo para desarrollar DT2, y aunque esto representa un gran avance en el área de la 
medicina, solo explican una pequeña parte de la heredabilidad estimada para la DT2 . La 
utilización de esta información genética aún se encuentra en etapas tempranas (Esparza-
Castro et al., 2015). 
La mayoría de los loci de susceptibilidad confieren riesgo a través de la función de las células 
beta del páncreas como lo son: KCNJ11, TCF7L2, WFS1, HNF1B, IGF2BP2, CDKN2A-
 
 
 10 
CDKN2B, CDKAL1, SLC30A8, HHEX/IDE, KCNQ1, THADA, TSPAN8/ LGR5, 
CDC123/CAMK1D, JAZF1, MTNR1B, DGKB/TMEM195, GCK, PROX1, ADCY5, SRR, 
CENTD2, ST6GAL1, HNF4A, KCNK16, FITM2- R3HDML-HNF4A, GLIS3, GRB14, ANK1, 
BCAR1, RASGRP1 y TMEM163 (Steinthorsdottir et al., 2007; Saxena et al. 2012), o aquellos 
relacionados directamente con la acción de la insulina como PPARγ, ADAMTS9, IRS1, GCKR, 
RBMS1/ ITGB6, PTPRD, DUSP9, HMGA2, KLF14, GRB14, ANKRD55 y GRK536-39. Aunque 
el FTO y el MC4R se han asociado más a obesidad, se conoce también su influencia para el 
desarrollo de (Binh et al., 2013). 
Cabe mencionar que la mayoría de los GWAS en pacientes con DT2 se han realizado en 
poblaciones de ancestría europea. La mayoría de los polimorfismos descritos en estas 
poblaciones también se asocian a DT2 en la población mexicana. Sin embargo, se han 
identificado algunos genes nuevos de susceptibilidad en nuestra población como la variante 
R230C del gen ABCA1 (Villarreal-Molina et al., 2008), SLC16A11 (SIGMA Diabetes Type 2 
Consortium, 2014) y el polimorfismo Gly972Arg del gen IRS1 asociado a DT2 en individuos 
delgados (Burguete-García et al., 2010). 
b) Ambiente (Estilo de Vida): En las últimas décadas las enfermedades metabólicas 
como el sobrepeso, la obesidad y el síndrome metabólico se han convertido en un gran 
problema mundial por su magnitud. La obesidad es uno de los principales factores de riesgo 
para el desarrollo de la DT2. Este aumento en la prevalencia de obesidad coincide con 
cambios importantes en el estilo de vida durante las últimas décadas, principalmente en el 
estilo de vida sedentario y hábitos dietéticos inadecuados, así como el consumo de sustancias 
toxicas como el alcohol y el tabaco, que influyen en gran manera en el desarrollo de la 
enfermedad y la aparición temprana de complicaciones que perjudican gravemente el 
bienestar físico y emocional del individuo (Ramírez Ordoñez et al., 2011; Salas-Salvado et al., 
2011). 
3.7 Microbiota Intestinal 
El cuerpo humano está habitado por una gran diversidad de bacterias y arqueas, así como 
hongos, protozoos y virus. Estos microorganismos habitan en varios nichos dentro de las 
diferentes partes del cuerpo humano y son colectivamente conocidos como la microbiota 
 
 
 11 
humana, mientras que sus genomas colectivos forman el metagenoma humano (Hooper & 
Gordon, 2001). El término microbioma lo acuñó en 2001 Joshua Lederberg, biólogo molecular 
que realizaba estudios genéticos en bacterias. Originalmente, el terminó “microbioma” se 
refiere al conjunto de genes de nuestros microorganismos comensales que forman la 
microbiota, pero hoy en día ambos términos se usan como sinónimos (Lederberg & McCray, 
2001). 
Se define como microbiota intestinal (MI) al conjunto de microorganismos que están en el 
intestino humano y que establecen relaciones simbióticas entre ellos y el huésped. Este 
ecosistema es parcialmente responsable del mantenimiento de la salud del huésped. La 
densidad microbiana en las zonas proximal y media del intestino delgado es relativamente 
baja, pero aumenta en gran medida en la parte distal de éste y en el colon. El número de 
bacterias alcanza valores diez veces superiores al de células del organismo, lo que constituye 
colectivamente un órgano activo, cuyo metabolismo influye de forma decisiva en el 
mantenimiento de la homeostasis del individuo (Hooper et al, 2002). 
La microbiota intestinal humana está representada por varios phyla o filotipos: los Firmicutes y 
Bacteroidetes con una abundancia media del 38.8% y 27.8% respectivamente, seguidos de 
los phyla Actinobacteria 8.2%, Proteobacteria 2.1%, Verrucomicrobia 1.3% y Euryarchaeota 
0.9% (Arumugam et al., 2011). El phylum Firmicutes comprende alrededor de 274 géneros 
donde predominan los gram‐positivos. Está dividido en tres clases: Clostridia (anaerobios), 
Bacilli (facultativos: Lactobacillus y Enterococcus) y Mollicutes. El phylum Bacteroidetes está 
compuesto por tres grandes clases de bacterias gram‐negativas: Cytophaga, Flavobacterium 
y Bacteroidetes. Dentro de la clase Bacteroidetes, el género Bacteroides es el que tiene 
mayor representación de este phylum en el intestino humano. En tercer lugar, el phylum 
Actinobacteria comprende bacterias gram‐positivas e incluye el género Bifidobacterium, que 
es ampliamente utilizado como probiótico. Cada uno de estos phyla está representado en la 
microbiota intestinal por una serie de géneros bacterianos específicos(Greiner & Bäckhed, 
2011) 
La composición y actividad de la microbiota intestinal se codesarrolla en el huésped desde el 
nacimiento y está sujeta a una interrelación compleja que depende del genoma del huésped, 
de la nutrición y del estilo de vida. La microbiota intestinal está involucrada en la regulación de 
 
 
 12 
múltiples vías metabólicas del huésped, dando lugar a interacciones con el huésped en 
procesos metabólicos, de señalización y de inmunidad, lo que conecta al intestino 
fisiológicamente con el hígado, el músculo y el cerebro (Qin et al., 2010). 
 
3.8 Función de la microbiota 
La microbiota interviene en gran cantidad de procesos que afectan a la salud del huésped por 
lo que conocer su funcionamiento puede ser de utilidad para conocer y/o evitar ciertas 
enfermedades. La microbiota intestinal tiene una relación de simbiosis con su huésped y en él 
desempeña tres importantes funciones que son: funciones metabólicas, funciones protectoras 
y funciones tróficas (Prakash et al., 2011). 
 
3.9 Funciones metabólicas de la MI 
La microbiota intestinal participa en la adquisición de nutrientes, almacenamiento de energía, 
y también participa en un gran número de vías metabólicas del huésped (Nicholson et al., 
2012). También puede afectar al metabolismo de todo el organismo y alterar los parámetros 
fisiológicos en múltiples compartimentos corporales (Zhao et al., 2010). Así, la microbiota 
intestinal es importante para el mantenimiento de la homeostasis. 
a) Microbiota intestinal y su función en el metabolismo de los hidratos de carbono. 
Los hidratos de carbono son un componente alimentario fundamental para los 
humanos. El organismo humano absorbe azúcares simples como la glucosa y 
galactosa en el yeyuno proximal, a través de transportadores glucídicos específicos con 
ayuda de enzimas que hidrolizan disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa) y los 
almidones a sus monosacáridos constituyentes. Sin embargo, la capacidad para 
hidrolizar otros polisacáridos es limitada. Un ejemplo son gran parte de los 
polisacáridos de plantas como la celulosa, xilano, pectina y almidón. Estos 
polisacáridos llegan a las comunidades microbianas en el intestino distal, que contienen 
genes que codifican para una variedad de enzimas que permiten la degradación de una 
 
 
 13 
gran variedad de polisacáridos de la dieta, sin tener que desarrollar enzimas complejas 
para este fin (Cantarel et al., 2012). 
 
Los géneros de bacterias intestinales se pueden clasificar con respecto a su capacidad 
para utilizar los hidratos de carbono, derivados tanto de la dieta como del huésped 
(Calvani et al., 2010). Se ha demostrado que el género Bacteriodetes asimila fácilmente 
hidratos de carbono de la dieta. Sin embargo, en situaciones de inanición de hidratos 
de carbono, estas bacterias intestinales pueden catabolizar mucinas en el tracto 
gastrointestinal como fuente de hidratos de carbono, lo cual podría comprometer la 
capa de mucosa adyacente al epitelio (Sonnenburg et al., 2005). Además de los 
Bacteroides, las cepas del género Bifidobacterium contienen genes que codifican 
enzimas que pueden degradar glicanos derivados del huésped que les permiten 
adquirir nutrientes. Además, las bacterias intestinales han desarrollado la capacidad de 
degradar numerosos glucoconjugados como glucosaminoglucanos de plantas 
incluyendo celulosa, sulfato de condroitina, ácido hialurónico, mucinas y heparina 
(Turroni et al., 2010). 
 
b) Microbiota intestinal y su función en el metabolismo de ácidos grasos. Las 
bacterias intestinales producen una amplia gama de ácidos grasos que pueden tener 
efectos benéficos para la salud. Las bifidobacterias intestinales producen ácido linoleico 
conjugado (CLA), que en modelos murinos parece modular la composición de ácidos 
grasos en el hígado y el tejido adiposo (O’Shea et al., 2012). Además de los ácidos 
grasos conjugados y libres, las bacterias intestinales generan ácidos grasos libres de 
cadena corta (AGCC) es decir, acetato, butirato y propionato mediante la fermentación 
de hidratos de carbono de la dieta (fibra), que los seres humanos no pueden digerir por 
sí mismos. En el modelo murino, se demostró que los ratones libres de gérmenes están 
desprovistos de AGCC, lo que indica la importancia de la flora intestinal en la 
producción de AGCC en el intestino (Martin et al., 2008). El acetato es el tipo 
dominante de ácido graso de cadena corta en seres humanos, que tiene un papel 
interesante en la modulación de la actividad de la proteína cinasa activada por AMP y 
la infiltración de macrófagos en el tejido adiposo. Los AGCC tales como el propionato 
 
 
 14 
se pueden utilizar para la síntesis de novo de glucosa o lípidos y servir como fuente 
energética para el huésped (Cho et al., 2012). 
 
c) Microbiota intestinal y metabolismo de aminoácidos. Algunos microorganismos 
como las bifidobacterias y los lactobacilos producen compuestos biológicamente 
activos derivados de aminoácidos, que incluyen una variedad de aminas biogénicas 
mediante diferentes enzimas microbianas. Las descarboxilasas de aminoácidos son 
muy abundantes, y al combinarse con el sistema de transporte de aminoácidos, enlaza 
a los compuestos dietarios con el metabolismo microbiano y con la señalización de la 
mucosa intestinal. Por ejemplo, L. reuteri, es capaz de convertir la L-histidina de la dieta 
en histamina mediante la histidina descarboxilasa, que está presente en algunas 
bacterias fermentativas incluyendo los lactobacilos probióticos. La señal 
inmunorreguladora de la histamina puede suprimir la producción de la citoquina 
proinflamatoria TNF a través de receptores de histamina tipo 2 en el epitelio intestinal 
(Thomas et al., 2012). La identificación de estos metabolitos bacterianos bioactivos y 
sus correspondientes mecanismos de acción con respecto a la inmunomodulación 
puede conducir a mejores estrategias antiinflamatorias para enfermedades crónicas 
mediadas por el sistema inmune. 
3.10 Funciones protectoras de la MI 
Se han descrito múltiples mecanismos por los que la MI protege al huésped de infecciones 
oportunistas, como la competencia por sitios de adhesión, la competencia por nutrientes, la 
producción de condiciones ambientales hostiles para el crecimiento de patógenos que 
involucran cambios en el pH, la producción de compuestos antimicrobianos (desde 
metabolitos tóxicos hasta sustancias bactericidas) y la generación de señales que intervienen 
en la expresión génica (Ouwehand et al., 2006). El epitelio intestinal tiene una barrera 
secretora que evita que las bacterias patógenas entren en contacto con la superficie de los 
enterocitos, y representa una barrera física por medio de una capa de moco epitelial, regula la 
tasa de recambio de los enterocitos, promueve el desarrollo y diferenciación de las células 
epiteliales, fortifica la barrera intestinal y mantiene el buen funcionamiento de la inmunidad de 
la mucosa intestinal mediante la inducción de la secreción de IgA (Mahida et al., 2004). Desde 
 
 
 15 
el punto de vista del huésped, la unión física, química e inmunitaria de la barrera intestinal es 
un pilar en el mantenimiento de las poblaciones microbianas y de los efectos benéficos en la 
salud que ello conlleva (Yu et al., 2012). 
Las bacterias también desempeñan un papel esencial en el desarrollo del sistema inmune. 
Los animales criados en condiciones de asepsia estricta muestran baja concentración de 
células linfoides en la mucosa del intestino delgado, la estructura de los folículos linfoides esta 
atrofiada y la concentración de inmunoglobulinas circulantes es muy baja. Inmediatamente 
después de la exposición a la microbiota convencional, aumenta el número de linfocitos de la 
mucosa, los centros germinales crecen en número y tamaño, apareciendo rápidamente en los 
folículos linfoides y células productoras de inmunoglobulinas, y observándose un aumentoen 
las concentraciones séricas de inmunoglobulinas (Yu et al., 2012). 
 
3.11 Funciones tróficas de la MI 
Las bacterias intestinales pueden controlar la proliferación y la diferenciación de las células 
epiteliales (Falk et al., 1998). En animales criados con estrictas condiciones de asepsia se 
observa una disminución del recambio de células epiteliales en comparación con animales 
control colonizados por microbiota convencional. La diferenciación celular en el epitelio es 
regulada en gran medida por la interacción con los microorganismos residentes como se 
demuestra por la expresión de una diversidad de genes en los animales asociados a cepas 
bacterianas específicas (Hooper & Gordon,, 2001) . 
 
3.12 Factores que influyen sobre la composición de la microbiota intestinal 
El primer factor que influye sobre la composición y diversidad de la microbiota intestinal es la 
forma de nacimiento (parto o cesárea), ya que al nacer el tracto gastrointestinal se coloniza 
inmediatamente. Además el tipo de alimentación del lactante (seno materno o fórmula) 
determina diferencias en la microbiota intestinal (Penders et al., 2006). Los perfiles fecales 
microbianos del lactante muestran semejanzas con los perfiles bacterianos del canal de parto 
y de la leche materna. Durante la infancia y a lo largo de la vida, la composición microbiana 
 
 
 16 
también cambia de acuerdo con la edad y la dieta. En los primeros 2 años de vida, la 
microbiota está dominada por las bifidobacterias. Posteriormente, la composición microbiana 
se diversifica y alcanza su máxima complejidad en el adulto, con cientos de filotipos 
dominados por Bacteroidetes y Firmicutes (Rajilic-Stojanovic et al., 2009). Una vez 
establecida la microbiota en un individuo, suele permanecer estable en el tiempo. Las 
características de la dieta también son importantes para el mantenimiento de la composición 
microbiana del intestino, los hábitos alimenticios de una persona pueden explicar hasta el 57% 
de la variación en la microbiota intestinal esto indica que la dieta juega un papel importante en 
el cambio de poblaciones clave de la microbiota intestinal pudiendo transformar el fenotipo 
saludable en una entidad inductora de enfermedad o viceversa (Brown et al., 2012). 
 
3.13 Microbiota y obesidad 
Ya se ha mencionado que la prevalencia de la obesidad ha ido en constante aumento en las 
últimas décadas. Aunque la obesidad resulta de un desbalance entre el consumo y gasto de 
energía, de manera más reciente se ha propuesto que la microbiota intestinal puede ser otro 
factor que contribuye a que se desarrolle esta condición. Algunos estudios han encontrado un 
aumento en la razón Firmicutes/Bacteroidetes en la microbiota intestinal de humanos y 
ratones obesos (Ley et al., 2006), pero otros estudios no han podido confirmar esta 
observación (Duncan et al., 2008). Sin embargo, más consistentemente, la mayoría de los 
estudios informan que la microbiota intestinal de individuos obesos tiene menor diversidad 
filogenética y un número reducido de genes bacterianos en comparación con los sujetos no 
obesos (Turnbaugh et al., 2009). Además, la baja riqueza microbiana también se ha 
correlacionado con otros parámetros metabólicos tales como los niveles de insulina sérica, 
resistencia a la insulina (HOMA-IR) y niveles de ácidos grasos libres y triglicéridos en el 
plasma (Le Chatelier 2013). Aunque no se entiende del todo cómo la microbiota intestinal 
puede influir en la obesidad, su papel en el desarrollo de esta enfermedad se puede deducir 
de los experimentos de trasplante fecal. El trasplante de microbiota fecal de ratones obesos a 
ratones no obesos libres de gérmenes resultó en un fenotipo obeso de los ratones receptores, 
mientras que los ratones que recibieron la microbiota intestinal de ratones delgados 
permanecieron delgados (Turnbaugh et al., 2006; Turnbaugh et al., 2009). 
 
 
 17 
3.14 Microbiota y diabetes tipo 2 
La microbiota y sus alteraciones también parecen estar implicados en la patogénesis de 
diversas enfermedades como las enfermedades gastrointestinales, cáncer y algunos 
trastornos metabólicos como la diabetes mellitus (Hooper, 2002). Desde el punto de vista 
metabólico, la microbiota intestinal puede modular la acumulación de lípidos, el contenido de 
lipopolisacáridos y la producción de ácidos grasos de cadena corta, que afectan la 
señalización de la insulina. 
 
Figura 3. Descripción de disbiosis, (Modificada de Round & Mazmanian, 2009) 
Los primeros estudios que reportan cambios en la microbiota intestinal asociados a la DT2 no 
tomaron en cuenta la posibilidad del efecto del tratamiento farmacológico en la microbiota. 
Sus hallazgos se resumen en la Tabla 1. Estos estudios se realizaron en diferentes tipos de 
poblaciones y utilizaron diferentes métodos para el análisis de la microbiota intestinal, lo cual 
podría explicar algunas de las diferencias en sus resultados. Larsen et. al. (2010) observaron 
que los pacientes con diabetes presentaban un aumento en la abundancia relativa de 
Firmicutes y Betaproteobacterias, y una disminución en la abundancia relativa de la clase 
Clostridiales. Qin et al. (2012) reporta que existe una disbiosis moderada en pacientes chinos 
con diabetes y registraron un aumento en la abundancia de bacterias productoras de butirato 
y bacterias oportunistas como Clostridium y Akkermansia muciniphila. Además, un análisis 
SIMBIONTES
COMENSALES PATOBIONTES
REGULACIÓN INFLAMACIÓN
REGULACIÓN INFLAMACIÓN
SIMBIONTES COMENSALES PATOBIONTES
PATOGÉNOS
Equilibrio Inmunológico
Desequilibrio Inmunológico
 
 
 18 
de las funciones de genes bacterianos mostró un aumento de las funciones en el intestino en 
respuesta al estrés oxidativo. En mujeres europeas mayores de 70 años, Karlsson et al. 
(2013) encontraron una mayor abundancia relativa de Lactobacillus en DT2, que correlacionó 
positivamente con glucosa y hemoglobina glucosilada; además de una menor abundancia 
relativa de Clostridium que correlacionó negativamente con la glucemia, hemoglobina 
glucosilada, insulina, péptido C y triglicéridos. Por último Sato et al. (2014) en pacientes 
japoneses con DT2 observó un aumento en la abundancia relativa de Lactobacillus y 
observaron la presencia de bacteremia, por lo que sugieren una translocación de bacterias del 
intestino al torrente sanguíneo. Estos resultados sugieren que hay un cierto grado de disbiosis 
en el intestino de los pacientes con diabetes, aunque hay diferencias en las especies 
alteradas (Figura 3). Estas diferencias podrían ser atribuibles a las diferencias en 
localizaciones geográficas, edad, género, población, hábitos alimenticios, e incluso en 
cuestiones metodológicas o experimentales. 
Tabla 1. 
Primeros Estudios Reportando Alteraciones en la Microbiota Intestinal en Diabetes Mellitus Tipo 2 
POBLACIÓN MÉTODO 
CAMBIOS EN LA 
MICROBIOTA EN DT2 OTROS HALLAZGOS REFERENCIA 
18 hombres con 
diagnóstico de DT2 
18 controles 
qPCR 
Pirosecuenciación 
del gen 16s rRNA 
↓% Philum Firmicutes ↓ % 
Clase Clostridia 
↑ Betapoteobacteria en 
diabéticos 
• Bacteriodetes/Firmicutes 
correlaciona con glicemia. 
• Bacteroidetes Prevotella/ C 
cocoides correlaciona con 
Glicemia. 
Larsen et. al., 
2010 
145 mujeres europeas 
mayores de 70 años: 
• 53 con DT2 
• 49 con 
Intolerancia 
Glucosa 
• 43 con 
tolerancia 
glucosa 
normal 
Metagenoma ↑ Lactobacillus ↓Clostridium en el grupo DT2. 
• Abundancia de Lactobacillus 
correlaciona (+) con glucosa 
y HbA1c. 
• Abundancia de Clostridium 
correlaciona (-) con glucosa, 
HbA1c, insuina, péptido C, 
TG. 
• Modelo matemático para MI 
identifica en mujeres 
Europeas, pero no en 
chinos. 
Karlsson et. al., 
2013 
345 Chinos (ambos 
sexos): 
• 71 con DT2 
• 74 Controles 
• 100 con 
(MetaHit) 
• 100 controles 
(MetaHit) 
Estudio de 
Asociación de 
Metagenoma 
(casos vs controles, 
2 etapas) 
Disbiosis Moderada 
↑Bacteriasproductoras de 
Butirato 
↑Bacterias oportunistas 
(Bacteroides caccae, 
Clostridium, Akkermansia 
muciniphila, Desulfovibrio sp. 
3_1_syn3) 
El análisis de las funciones de genes 
bacterianos indica que hay un 
aumento de las funciones relativas en 
el intestino en respuesta al estrés 
oxidativo. 
Qin et. al., 2012 
100 japoneses (ambos 
sexos). 50 
50 controles 
PCR (RT-qPCR) 
Analizan bacterias 
en heces y sangre 
↑ Lactobacillus en los 
diabéticos 
Se detectaron bacterias en sangre en 
una proporción más alta de casos 
(gram +). Sugiere una translocación 
de bacterias del intestino al torrente 
sanguíneo. 
Sato et al., 2014 
 
 
 19 
 
3.15 Metformina en el tratamiento de la diabetes tipo 2 
La metformina se usa comúnmente como la primera línea de medicamentos para el 
tratamiento del síndrome metabólico y la DT2. La metformina es un agente antidiabético 
común de la clase biguanida y es conocido por disminuir la producción de glucosa en el 
hígado, aumentar la sensibilidad a la insulina, y mejorar la captación periférica de glucosa en 
el músculo esquelético y hepático (Rotella et al., 2006). Se ha descrito que la metformina 
también reduce los niveles de triglicéridos y de colesterol LDL en diabéticos y que tiene 
efectos favorables en el peso corporal y en los niveles plasmáticos de lípidos (Nathan et al., 
2009). 
El mecanismo de acción mejor estudiado de la metformina en el organismo humano es el 
aumento de la actividad de la proteína cinasa activada por AMP (AMPK). Esta enzima juega 
un papel importante en el equilibrio de energía y el metabolismo de la glucosa, porque regula 
positivamente la oxidación de ácidos grasos y la absorción de glucosa en el músculo, inhibe la 
síntesis de ácidos grasos y la gluconeogénesis en el hígado. Además, mantiene la relación 
AMP / ATP en la célula mediante el aumento de consumo de ATP y la disminución de la 
producción de ATP, que se asocia con la activación de AMPK (Hardie et al., 2012), y regula la 
gluconeogénesis hepática (Kim et al., 2008). 
 
3.16 Metformina y microbiota intestinal 
Algunos estudios han evaluado si la metformina podría ejercer un efecto metabólico favorable 
a través de la modificación de la microbiota intestinal. Shin et al., (2014) observaron que el 
tratamiento con metformina en ratones con obesidad inducida por dieta dio como resultado 
modificaciones en la abundancia de 29 géneros de la MI y también observaron un aumento 
marcado en la abundancia de la bacteria Akkermansia muciniphila, que a su vez se asoció 
con un incremento de células caliciformes productoras de mucina en el epitelio intestinal. 
Además, la administración oral de Akkermansia a ratones con dieta alta en grasa, aún en 
ausencia de metformina, mejoró significativamente la tolerancia a la glucosa. 
 
 
 
 20 
Lee y Ko (2014) estudiaron cambios en el perfil metabólico y en la MI inducidos por el 
tratamiento con metformina en ratones con obesidad por una dieta alta en grasas. En los 
ratones con obesidad se observó un perfil metabólico favorable después del tratamiento con 
metformina, mientras que los ratones con dieta normal no presentaron cambios significativos 
en los parámetros metabólicos. En lo que se refiere a la MI, la metofmina causó una 
disminución en la diversidad alfa y en la diversidad beta en los ratones con obesidad. 
Además, la metformina modificó la relacion Firmicutes/Bacteroidetes, indujo un aumento en la 
abundancia relativa de los phyla Bacteroidetes y Verrucomicrobia, y causó un aumento 
significativo en las abundancias relativas de Akkermansia y Clostridium coleatum. También 
observaron que en cultivos bacterianos la metformina induce el crecimiento acelerado de 
Akkermansia muciniphila. Estos autores sugieren que es importante seguir estudiando el 
papel que juega esta bacteria en la MI debido a que los cambios en la microbiota intestinal 
correlacionaron con un mejor perfil metabólico. 
Napolitano et al. (2014) administraron metformina por dos vías a personas con diabetes tipo 2 
y demostraron que los efectos de la metformina para bajar los niveles de glucosa no son 
exclusivamente por la activación de la enzima AMPK. Reportaron que la metformina tiene 
efectos sobre el metabolismo de ácidos biliares, debido a que inhibe su reabsorción mediante 
la alteración de la función del transportador intestinal. También reportaron que la metformina 
tiene efecto sobre la secreción de hormonas entero-endócrinas y activa los receptores FXRs y 
TGR5 que actúan en el intestino y el hígado por la secreción de ácidos biliares. La metformina 
también indujo cambios en la microbiota intestinal, principalmente afectó la razón 
Firmicutes/Bacteroidetes que correlacionó favorablemente con los niveles de glucosa y HDL 
en suero de los pacientes. Estos cambios en la microbiota intestinal podrían ser el resultado 
de fluctuaciones en las concentraciones de ácidos biliares primarios, que no excluye la 
posibilidad de un ciclo de retroalimentación entre el ácido cólico y la relación de Bacteroidetes 
y Firmicutes. 
Más recientemente, Forslund et al., (2015) presentó datos de un meta análisis en humanos 
que sugiere que los medicamentos antidiabéticos podría estar confundiendo los cambios en 
microbiota intestinal previamente reportados en DT2, por lo que propusieron analizar con 
detalle los efectos de la metformina sobre la microbiota. En este estudio transversal, tomando 
 
 
 21 
el tratamiento como una variable confusora, los autores reportan que los pacientes con 
diabetes tienen una depleción de taxa que producen butirato como Roseburia spp., 
Subdoligranulum spp. y Clostridiales spp. además de cambios en la abundancia de varios 
Firmicutes no clasificados. El tratamiento con metformina se asoció con un aumento 
significativo de Escherichia spp. y una disminución en la abundancia de Intestinibacter spp., 
además de cambios en Firmicutes. Los cambios en la composición y funcionalidad de la 
microbiota intestinal en los pacientes con tratamiento podrían estar relacionados a efectos 
secundarios gastrointestinales de la metformina. Los resultados indican la mediación parcial 
de ambos efectos: terapéuticos y adversos del antidiabético. 
De la Cuesta-Zuluaga y colaboradores (2017) compararon la microbiota intestinal en 28 
pacientes con diabetes mellitus (14 con y 14 sin tratamiento con metformina), y 84 controles 
pareados por edad, género e índice de masa corporal, y reportaron una asociación entre la 
diabetes y la microbiota intestinal modificada por el uso de metformina. Los participantes 
diabéticos tratados con metformina tuvieron mayor abundancia relativa de Akkermansia 
muciniphila en comparación con los controles sanos, así como mayor abundancia de varios 
géneros productores de AGCC, como Butyrivibrio, Bifidobacterium bifidum, Megasphaera y 
una unidad taxonómica operativa de Prevotella. En contraste, los pacientes con diabetes sin 
tratamiento con metformina tenían mayor abundancia relativa de Clostridiaceae y una unidad 
taxonómica operativa distinta de Prevotella, así como menor abundancia de Enterococcus 
casseliflavus en comparación con los pacientes con diabetes sin tratamiento con metformina. 
Wu et al. (2017) fueron los primeros en hacer un estudio doble ciego, donde analizaron 
pacientes diabéticos sin tratamiento previo, haciendo una intervención con metformina en un 
grupo, y placebo en otro grupo. Encontraron que el tratamiento con metformina cambió 
significativamente la abundancia relativa de 86 cepas bacterianas, la mayoría de las cuales 
pertenecían a las gamma-proteobacterias y a los Firmicutes. Encontraron además un 
aumento de Escherichia y una disminución de la abundancia relativa de Intestinibacter. 
Realizaron además transferencia de muestras fecales de donantes tratados con metformina 
(obtenidas antes y 4 meses después del tratamiento) a ratones libres de gérmenes y se 
demostró que la toleranciaa la glucosa mejoró en ratones que recibieron la microbiota 
alterada con metformina. Además investigaron directamente las interacciones metformina-
 
 
 22 
microbiota en un simulador de intestino, y demostraron que la metformina afectó las vías con 
funciones biológicas comunes en especies de dos phyla diferentes, y muchos de los genes 
regulados por metformina en estas especies codificaban metaloproteínas o transportadores de 
metales. 
En su conjunto, estos hallazgos apoyan la idea de que la microbiota intestinal puede mediar 
algunos de los efectos antidiabéticos de la metformina. 
 
IV. JUSTIFICACIÓN 
Varios estudios indican que la composición de la microbiota intestinal puede contribuir al 
desarrollo de trastornos metabólicos. También se ha reportado que la metformina induce 
cambios en la microbiota intestinal, que pudieran estar relacionados con su efecto 
terapéutico. Se ha propuesto que algunos de los cambios reportados en la microbiota 
intestinal en individuos con DT2 podrían no estar asociados a la diabetes como tal, sino al 
efecto del tratamiento farmacológico. Sin embargo, la relación entre el tratamiento con 
metformina y la microbiota intestinal sigue siendo poco clara, y los estudios en humanos 
son escasos. 
V. OBJETIVO GENERAL 
Analizar cambios en la microbiota intestinal en individuos con diagnóstico reciente de diabetes 
mellitus tipo 2, antes de iniciar el tratamiento y 4 meses después de recibir tratamiento con 
metformina. 
VI. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
• Describir la composición de la microbiota intestinal en individuos con diagnostico 
reciente de diabetes tipo 2, sin tratamiento previo. 
• Analizar los cambios en la microbiota intestinal después de 4 meses de tratamiento con 
metformina. 
• Buscar correlaciones entre los cambios en la composición de la microbiota e 
indicadores de control metabólico (IMC, HbA1c, perfil de lípidos). 
 
 
 
 23 
VII. MATERIAL Y MÉTODOS 
7.1 Cuestiones éticas 
Este proyecto fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Instituto Nacional de 
Medicina Genómica, Dictamen número CEI 2015/26. Todos los participantes firmaron una 
carta de consentimiento informado (Anexo 1). 
 
7.2 Población de estudio 
Los pacientes con diagnóstico de DT2 se reclutaron por personal del Centro de 
Investigaciones Regionales Dr. Hideyo Noguchi, a través el Seguro Popular del Ayuntamiento 
de Mérida, Yucatán, y en Ferias Regionales de Salud organizadas por el Gobierno del Estado 
de Yucatán. A los pacientes que cumplieron con los criterios de inclusión se les invitó a 
participar en el estudio y se solicitó que firmaran el consentimiento informado (Anexo 1) 
a. Criterios de Inclusión: 
• Individuos que sin tener conocimieto previo de padecer DT2, al ser estudiados en las 
Ferias Regionales y en visitas médicas cumplieron con los criterios diagnósticos de 
esta enfermedad ( ADA 2014). 
• Sin tratamiento previo 
• No emparentados 
• Mujeres y Hombres 
• Edad 30 a 60 años 
• Ascendencia Maya (que tengan al menos un apellido maya y que hablen la lengua) 
• No haber utilizado antibióticos en al menos 3 meses antes de la toma de muestra. 
 
b. Criterios de Exclusión: 
• Embarazo 
• Enfermedades gastrointestinales (gastritis, gastroenteritis, hepatitis, colitis, síndrome de 
mal abasorción intestinal, infecciones bacterianas, virales o parasitarias, etc.) 
• Presencia de enfermedades sistémicas (cáncer, autoinmunes, endocrinológicas, 
infecciosas, etc.) 
 
 
 24 
• Infección reciente (4 semanas) (respiratoria, gastrointestinal o sistémica) 
• Uso de medicamentos que pueden modificar o alterar la mucosa gastrointestinal 
 
c. Criterios de Eliminación 
• Falla al acudir a visitas de seguimiento 
• Presencia de efectos adversos severos después del tratamiento con metformina 
(diarrea, vómito, mareo, acidosis láctica) 
• Deseo del paciente de retirarse del estudio 
7.3 Diagnostico de diabetes mellitus tipo 2 
Ante sospecha clínica de DT2 puede medirse la concentración de glucosa en sangre capilar 
mediante tira reactiva y lectura en reflectómetro. El paciente debe estar en ayunas al menos 3 
hrs. Sin embargo, por su variabilidad y menor precisión, siempre se debe confirmar el 
diagnóstico mediante determinaciones de laboratorio de análisis clínico. 
Los criterios diagnósticos fueron los propuestos por la Asociación Americana de Diabetes 
(ADA) en 1997 y que han sido aceptados por la OMS. 
• Glucemia basal en plasma venoso ≥ 126 mg/dl (7 mmol/l). Debe realizarse una 
segunda determinación en un día diferente para confirmar el diagnóstico. 
• Síntomas típicos de diabetes y glucemia al azar ≥ 200 mg/dl (11,1 mmol/l). No es 
necesaria una segunda determinación. 
• La hemoglobina glucosilada es ≥ 6.5% siempre y cuando la prueba sea realizada en 
laboratorios con metodología y estandarización avalada por la National 
Glycohemoglobin Standarization Program (NGSP). 
En los potenciales participantes de este estudio, inicialmente se midió la glucemia en ayunas 
en sangre capilar con el sistema ACCUCHECK (Roche). Posteriormente se pidió al paciente 
una muestra de sangre para confirmar el diagnóstico y para hacer medición de hemoglobina 
glucosilada. El criterio para confirmar el diagnóstico de DT2 fue un nivel sérico de 
hemoglobina glucosilada ≥ 6.5%. 
 
 
 
 25 
7.4 Visitas 
Para poder llevar un control adecuado de la información se hicieron tres visitas médicas de 
seguimiento. Para este proyecto se hizo una colaboración con la Universidad Autónoma de 
Yucatán en donde se hicieron todas las visitas, mediciones antropométricas y bioquímicas 
7.5 Visita 1 
7.5.1 Variables antropométricas: 
En la primera visita médica, personal médico calificado tomó mediciones antropométricas 
basales (peso, talla, IMC). Con cinta métrica se midió la circunferencia de cintura en el punto 
medio entre el borde inferior de la última costilla palpable y la parte superior de la cresta ilíaca, 
al final de una espiración normal, con los bazos relajados a cada lado. Se midió además la 
cirunferencia de la cadera de forma horizontal a nivel de la protrusión de máximo tamaño a 
nivel de los glúteos. La tensión arterial se medió en posición sedente, después de por lo 
menos cinco minutos de reposo, con esfigmomanómetro, en 3 ocasiones tomando el 
promedio de las tres mediciones para el análisis de resultados. A las mujeres en edad 
reproductiva se les realizó una prueba de embarazo en orina. 
7.5.2 Variables bioquímicas: 
Se tomó una muestra de sangre para hacer pruebas bioquímicas basales en suero (glucosa, 
urea, creatinina, hemoglobina glucosilada y perfil de lípidos) en el Laboratorio de Análisis 
Clínicos de Servicio a la Comunidad de la Facultad de Química de la Universidad 
Autónoma de Yucatán (UADY). Este laboratorio cuenta con una certificación otorgada por 
Control de Calidad de la empresa Quality System Consulting. La determinación de colesterol 
total, triglicéridos y glucosa en plasma, se realizaron en un autoanalizador, utilizando estuches 
enzimáticos comerciales (Roche Diagnostics, Manhheim Alemania y Wako Chemicals, USA). 
El colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (C- HDL) se determinó mediante un método 
enzimático homogéneo (Roche Diagnostics, Manhheim Alemania). El colesterol de las 
lipoproteínas de baja densidad (C-LDL) se calculó con la formula Friedewald modificada por 
De Long. También se pidió una muestra de sangre para extracción de ADN genómico. 
 
 
 
 26 
7.6 Muestra fecal para análisis de microbiota: 
A los pacientes se les proporciono un kit para colectar la muestra fecal, este kit contenía un 
frasco de coprocultivo estéril un abate lenguas de plástico estéril y un instructivo de cómo 
colectar las muestras en el frasco. La muestra fue transportada en menos de 1 hora a la 
UADY, se etiquetó y se congeló a -20°C, y fue transportada en hielo seco al INMEGEN. 
El ADN total bacteriano se extrajo de lamuestra fecal en el INMEGEN, usando el kit comercial 
(QIAamp DNA Stool Mini kit-Quiagen) de acuerdo a los protocolos de manufactura para la 
detección de patógenos. Para determinar la concentración y pureza del ADN, se realizó una 
cuantificación en un espectrofotómetro Nanodrop 2000c (Thermo Scientific®). La técnica se 
describe en el Anexo 2. 
7.7 Intervención 
d) Dieta 
El requerimiento energético total (Valor Calórico Total) se determinó tomando en cuenta el 
Gasto Energético Basal (GEB), el Efecto Térmico de los Alimentos (ETA) y el Nivel de 
Actividad Física (AF) (ADA, 2008). El Gasto Energético Basal, se calculo a partir de la fórmula 
de Mifflin- StJeor, que considera factores como el sexo, el peso (kg), la estatura (cm) y la edad 
(años) (Mifflin et al., 1990). 
Ecuaciones Mifflin-StJeor 
Hombres: GEB (Kcal) = [10 x peso (kg)] + [6.25 x talla (cm)] – [5 x edad (años)] +5 
Mujeres: GEB (Kcal) = [10 x peso (kg)] + [6.25 x talla (cm)] – [5 x edad (años)] - 161 
Todas las dietas se generaron en modo de plantillas donde se plasmaron siete menús 
divididos en desayunos, almuerzos, cenas, colación de media mañana y colación de medio 
día. 
 
 
 
 
 27 
e) Tratamiento con metformina 
El tratamiento con metformina se estableció siguiendo la Norma oficial Mexicana para el 
manejo de la DT2 (http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/m015ssa24.html). El 
tratamiento farmacológico seleccionado es metformina, para lo cual la norma establece: 
“11.9.4.3 Se utiliza preferentemente metformina; se recomienda iniciar el tratamiento con una 
dosis de 500 a 850 mg al día, ajustando la dosis de acuerdo con la respuesta sin exceder de 3 
g al día.” 
Se aplicaron cuestionarios estandarizados a todos los participantes, para obtener información 
demográfica, nivel de escolaridad, historia familiar, hábitos dietarios actividad física, uso de 
medicamento y suplementos. 
f) Cuestionario de adherencia al tratamiento 
Se aplicó un cuestionario para conocer el porcentaje de apego al tratamiento se hizo un 
conteo de pastillas que se tomaba el paciente. Los frascos que se les proporcionaron en cada 
visita contenían 30 pastillas. Al final se hizo un conteo de pastillas para determinar la 
adherencia al tratamiento, lo cual se estableció de la siguiente manera: quien tomó las 30 
pastillas proporcionadas de cada frasco tuvo una adherencia de 100 %. También se aplicaron 
cuestionarios estandarizados a todos los participantes, para obtener información sobre apego 
a la dieta. 
7.7 Visitas de seguimiento 
Se hicieron 2 visitas de seguimiento: una a los 45 días de estar tomando el tratamiento con 
metformina y la última a los 4 meses de estar tomando el tratamiento con metformina. En 
estas visitas se hizo un registro de mediciones antropométricas (peso, talla, IMC, 
circunferencia de cintura, circunferencia de cadera), así como mediciones bioquímicas en 
suero [glucosa, urea, creatinina, insulina, colesterol total (CT), lipoproteínas de alta densidad 
(HDL-C), lipoproteínas de baja densidad (LDL-C), triglicéridos (TG), y hemoglobina 
glucosilada], y se valoró el apego a la dieta y al tratamiento médico mediante cuestionarios. 
 
 
 28 
En la última visita de seguimiento se les solicitó otra muestra de materia fecal para analizar la 
microbiota intestinal después del tratamiento. 
7.8 Valoración de respuesta al tratamiento con metformina. 
Para evaluar la respuesta al tratamiento se calcularon 2 parámetros: el cambio absoluto de 
hemoglobina glicosilada después del tratamiento (ΔHbA1c), y el cambio cambio relativo de 
hemoglobina glucosilada después de 4 meses de tratamiento con metformina [ΔHbA1c(%)= 
(HbA1c T0 – Hba1c T2)/ Hba1c T0]. De cuerdo con criterios previamente considerados para 
estudios farmacogenéticos en DT2 (Hosseyni-Talei et al, 2017; Shokri et al., 2016), los 
individuos con ΔHbA1c < 1.0 fueron considerados como no respondedores. 
7.9 Análisis de microbiota intestinal: amplificación y secuenciación de los genes 16s 
RNAr 
Para secuenciar la microbiota intestinal, se amplificó la región V4 del gen 16s RNAr de las 
bacterias presentes en la materia fecal de los participantes en 2 pasos. Para la primera 
amplificación se usaron oligonucleótidos específicos para la región V4 (515F: GTG CCA GCM 
GGC GCG GTA A, 806R: GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT), incluyendo 24 diferentes 
secuencias código de barras en el primer reverso. En esta primera amplificación se usa el 
mismo primer “forward” y 24 diferentes primers “reverse” (Anexo 5). Las condiciones de 
ciclado se describen en el Anexo 3. Los amplificados se purificaron con perlas Ampure XP de 
acuerdo con la técnica descrita en el Anexo 4 siguiendo el protocolo de purificación de 
productos de PCR. 
 
En la segunda amplificación se hizo un pool de los 24 amplicones y posteriormente una 
segunda PCR para agregar los adaptadores. Los amplicones purificaron nuevamente con 
perlas Ampure XP, y se hizo un pool equimolar de estos amplicones para hacer la 
secuenciación en la plataforma Miseq Illumina®, en la Unidad de Secuenciación del 
INMEGEN. Esta plataforma permite obtener lecturas de hasta 250 bases con una alta 
cobertura. 
 
 
 
 
 29 
7.10 Análisis bioinformático 
El proceso general de secuenciación de la micribiota intestinal y el análisis bioinformático se 
describe en la Figura 4. 
. 
 
 
Figura 4. Flujo de trabajo del análisis bioinformático 
 
El análisis de la microbiota intestinal se realizó a través de las secuencias de 16S rRNA 
usando el programa de QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology). QIIME es una 
herramienta bioinformática de código abierto diseñada para hacer el análisis de microbiomas 
a partir de datos crudos generados en Illumina u otras plataformas de secuenciación a través 
de gráficos y estadísticas de calidad. Este análisis incluye la remoción de los códigos de 
barras para separar las secuencias por individuo, el filtrado de calidad, remoción de quimeras, 
la alineación, la identificación y selección de Unidades Taxonómicas Operacionales (OTUs), 
asignación taxonómica, asi como análisis y visualización de la diversidad. QIIME utiliza el 
estándar de la Matriz de Observación Biológica del Consorcio de Estándares Genómicos 
(BIOM) para representar las OTUs. 
 
El análisis inició con los archivos en formato FASTQ que fueron proporcionados por la Unidad 
de Secuenciación del INMEGEN. Sobre los archivos en formato FASTQ, se separaron las 
 
 
 30 
muestras por individuo y se filtraron las secuencias de baja calidad (split_libraries_fastq.py). 
El llamado de una base se consideró de baja calidad cuando el Phred score (Q) < 30. El 
Phred score se puede expresar con la fórmula Q=-10log10P, donde un valor de Q = 30 indica 
que la probabilidad de que el llamado de la base sea incorrecto es de 1 en 1000. 
 
Para el análisis general se creó un archivo llamado “mapping file” o archivo de mapeo, 
incluyendo todos los metadatos por muestra, como información técnica, primers y códigos de 
barras. Para este proyecto, los metadatos incluyeron un identificador del individuo, un punto 
de tiempo (tratamiento), así como los datos clínicos y bioquímicos, la respuesta al tratamiento 
y la adherencia al tratamiento. 
 
El siguiente paso consistió en identificar y seleccionar las OTUs, que se hizo en la modalidad 
agrupación de referencia cerrada (pick_closed_reference_otus.py). Brevemente, se alinearon 
las secuencias contra la base de datos Greengenes con un porcentaje de similitud del 97%, y 
las secuencias no alineadas fueron descartadas. Posteriormente se asignó la taxonomía, y se 
generaron tablas OTU (make_otu_table.py), que indican el número de veces que cada unidad 
taxonómica operacional fue observada en cada muestra. 
 
Por último se ejecutó un análisis de alpha y beta diversidad utilizando los comandos 
alpha_rarefaction.py, beta_diversity_through_plots.py, summarize_taxa_through_plots.py,