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I UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR ÁREA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS AGROPECUARIAS DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE AGRONOMÍA TESIS Identificación del agente causal de la mancha foliar en albahaca (Ocimum basilicum L.) y su control con extracto de Jatropha cinerea y bacterias antagonistas Que como requisito para obtener el título de: Ingeniero Agrónomo Presenta: Kassandra Margarita Rodríguez Macías Director interno Dra. Mirella Romero Bastidas Director externo Dr. Luis Guillermo Hernández Montiel La Paz, B.C.S. 8 de agosto de 2018 INDICE AGRADECIMIENTOS---------------------------------------------------------------------- I DEDICATORIA------------------------------------------------------------------------------- II RESUMEN-------------------------------------------------------------------------------------- III I. INTRODUCCIÓN------------------------------------------------------------------------- 1 II. OBJETIVO GENERAL------------------------------------------------------------------ 2 2.1. Objetivos específicos---------------------------------------------------------------------- 2 III. JUSTIFICACIÓN------------------------------------------------------------------------ 3 IV. HIPÓTESIS-------------------------------------------------------------------------------- 3 V. REVISIÓN DE LITERATURA--------------------------------------------------------- 4 5.1. La albahaca y sus usos-------------------------------------------------------------------- 4 5.2. Importancia económica de la albahaca-------------------------------------------------- 5 5.3. La producción de albahaca en México-------------------------------------------------- 5 5.4. Presencia de enfermedades que reducen su producción------------------------------ 6 5.5. Métodos de control------------------------------------------------------------------------ 7 5.6. Alternativas de manejo-------------------------------------------------------------------- 7 5.7. El uso de extractos vegetales con actividad antifúngica------------------------------ 8 5.7.1 Plantas de la familia Euphorbiaceae y sus propiedades microbianas--------- 9 5.7.2. El género Jatropha spp. ----------------------------------------------------------- 10 5.7.3. Distribución a nivel nacional de especies de Jatropha spp.------------------- 11 5.7.4. Usos---------------------------------------------------------------------------------- 12 5.7.5. Efecto antimicrobiano de Jatropha spp. ---------------------------------------- 12 5.7.6. Jatropha cinerea-------------------------------------------------------------------- 13 5.7.6.1. Descripción morfológica------------------------------------------------- 13 5.7.6.2. Beneficios de la planta--------------------------------------------------- 13 5.8. El papel del control biológico mediante microorganismos antagonistas----------- 14 5.8.1. Tipo de microorganismos con potencial antagónico--------------------------- 15 5.9. Bacillus spp.-------------------------------------------------------------------------------- 15 5.9.1. Morfología colonial---------------------------------------------------------------- 15 5.9.2. Mecanismo de acción contra patógenos----------------------------------------- 16 5.9.2.1. Antibiosis------------------------------------------------------------------ 16 5.9.2.2. Competencia por nutrientes---------------------------------------------- 17 5.9.2.3. Competencia por espacio------------------------------------------------- 17 5.9.2.4. Interacción directa con el patógeno------------------------------------- 17 5.9.2.5. Protección cruzada e inducción de resistencia------------------------- 18 VI. MATERIALES Y MÉTODOS--------------------------------------------------------- 19 6.1. Objetivo 1. Identificar morfológicamente el agente causal de la mancha foliar en albahaca------------------------------------------------------------------------------------------ 19 6.1.1. Muestreo de campo----------------------------------------------------------------- 19 6.1.2. Aislamiento del patógeno---------------------------------------------------------- 19 6.1.3. Identificación morfológica-------------------------------------------------------- 20 6.1.4. Pruebas de patogenicidad---------------------------------------------------------- 20 6.2. Objetivo 2. Determinar el efecto antifúngico a nivel in vitro del extracto de J. cinerea y tres bacterias antagonistas sobre el control del agente causal de la mancha foliar en albahaca.------------------------------------------------------------------------------- 21 6.2.1.Obtención de antagonistas microbianos y el extracto vegetal de J.cinerea 21 6.2.2. Obtención de extracto de J. cinerea---------------------------------------------- 21 6.2.3. Prueba in vitro de cepas bacterianas y el extracto de J. cinerea vs. A. alternata------------------------------------------------------------------------------------------ 22 6.2.3.1. Cepas bacterianas vs. A. alternata------------------------------------- 22 6.2.3.2. Extracto J. cinérea vs. A. alternata------------------------------------ 23 6.3. Objetivo 3. Determinar el efecto antifúngico a nivel in vivo del extracto de J. cinerea y tres bacterias antagonistas sobre el control del agente causal de la mancha foliar en albahaca-------------------------------------------------------------------------------- 24 6.3.1. Prueba in vivo de las cepas bacterianas y extracto de J. cinerea vs. A. alternata------------------------------------------------------------------------------------------ 24 VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN------------------------------------------------------ 25 7.1. Morfología del agente causal de la mancha foliar en albahaca---------------------- 25 7.2. Efecto antifúngico a nivel in vitro del extracto de J. cinerea y las tres cepas bacterianas--------------------------------------------------------------------------------------- 26 7.2.1. Extracto de J. cinerea vs. A. alternata------------------------------------------ 26 7.2.2 Cepas bacterianas vs. A. alternata------------------------------------------------ 29 7.3. Efecto in vivo del extracto de J. cinerea y cepas bacterianas sobre A. alternata-- 32 7.3.1. Extracto de J. cinerea contra A. alternata--------------------------------------- 32 7.3.2. Cepas bacterianas contra A. alternata------------------------------------------- 34 VIII. CONCLUSIONES---------------------------------------------------------------------- 37 IX. RECOMENDACIONES----------------------------------------------------------------- 38 X. LITERATURA CITADA----------------------------------------------------------------- 39 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. La albahaca y sus usos------------------------------------------------------------ 4 Figura 2. Principales estados productores de albahaca----------------------------------- 6 Figura 3. Jatropha Krusei. A) rama con flores y fruto inmaduro. B) flor estaminada. C) flor pistilada. D) estípula------------------------------------------------------------------ 10 Figura 4. Estimación de riqueza del género Jatropha spp. en México----------------- 11 Figura 5. Usos de Jatropha. A) Hoja y fruto. B y C) Frutos secos. D) aceites-------- 12 Figura 6. Morfología de la colonia de Bacillus subtilis. A) Colonia bacteriana y B) células bacterianas----------------------------------------------------------------------------- 16 Figura 7. Mecanismos deacción de Bacillus subtilis------------------------------------- 18 Figura 8. Mancha necrótica en hoja de albahaca----------------------------------------- 19 Figura 9. Aislamiento del patógeno-------------------------------------------------------- 20 Figura 10. Identificación morfológica----------------------------------------------------- 20 Figura 11. Pruebas de patogenicidad------------------------------------------------------- 21 Figura 12. Obtención del extracto vegetal de J. cinerea--------------------------------- 22 Figura 13. Siembra de cepas bacterianas vs. A. alternata ------------------------------- 23 Figura 14. Bioensayo con los extractos. A) Ext. de J. cinerea. B) siembra en cajas Petri---------------------------------------------------------------------------------------------- 23 Figura 15. Bioensayo in vivo con cepas bacterianas y el extracto de J. cinerea ----- 24 Figura 16. Morfología de Alternaria alternata-------------------------------------------- 26 Figura 17. Efecto in vitro del extracto de J. cinerea sobre el crecimiento de Alternaria alternata a través del tiempo---------------------------------------------------- 27 Figura 18. Efecto in vitro del extracto de J. cinerea sobre el crecimiento de A. alternata al 3er. día de evaluación---------------------------------------------------------- 28 Figura 19. Extracto de J. cinerea contra A. alternata a 3 dosis y 120hrs ------------- 29 Figura 20. Bioensayo de las tres cepas bacterianas contra A. alternata --------------- 29 Figura 21. Porcentaje de crecimiento micelial de A. alternata contra cepas bacterianas-------------------------------------------------------------------------------------- 30 Figura 22. Evaluación in vitro de las tres cepas bacterianas contra A. alternata.----- 31 Figura 23. Efecto in vivo del extracto de J. cinerea sobre A. alternata----------------- 32 Figura 24. Bioensayo in vivo del extracto de J. cinerea sobre A. alternata en el haz y envés de las hojas de Albahaca. A) haz de la hoja de albahaca con extracto y Alternaria, A1) envés de la hoja, B) haz de la hoja de albahaca con A. alternata, B1) envés de la hoja-------------------------------------------------------------------------------- 33 Figura 25. Bioensayo in vivo de cepas bacterianas contra A. alternata---------------- 34 Figura 26. Bioensayo in vivo de antagonistas contra A. alternata. A, B y C) Haz de la hoja de albahaca con las bacterias B1, B2, B3 respectivamente. D) Control de A. alternata---------------------------------------------------------------------------------------- 35 ÍNDICE DE CUADRO Cuadro 1. Principales enfermedades en albahaca (Tran, 2011)------------------------- 7 I AGRADECIMIENTOS Al Departamento Académico de Agronomía, por brindarme las facilidades para la realización de esta investigación dentro de sus instalaciones y por la oportunidad de trabajar dentro del Laboratorio de Fitopatología. A la Dra. Mirella Romero Bastidas, por todo su apoyo, por bridarme todo su conocimiento, por su tiempo y paciencia, y por confiar en mí para realizar este trabajo. Al Dr. Luis Guillermo Hernández Montiel, por proporcionarnos las herramientas necesarias para la realización del experimento, y por brindar su experiencia. A mi familia, a mi padre Margarito Rodríguez Álvarez, a mi madre, María Guadalupe Macías del Valle y a mi hermana, Yennifer Rodríguez Macías, por todo su apoyo incondicional, por confiar en mí, por hacer de mí una persona responsable, dedicada, por inculcarme valores, y las ganas de crecer y por siempre estar a mi lado. A mi esposo, por nunca dejarme sola y apoyarme en cada momento, por sus lindas palabras de aliento, por su gran amor y amistad incondicional, por siempre estar allí para mí en los buenos y malos momentos, y por recordarme siempre que sí puedo lograr lo que me proponga. A mis compañeros del laboratorio de fitopatología, al Ing. José de Jesús Castro González por apoyarme en la realización de mi experimento, y por iniciar juntos esta experiencia. A Dania Gisel Camacho y Cristian Madera, por su amistad, por compartir buenos momentos juntos y por hacer amena la estancia en el laboratorio. II DEDICATORIA Mi tesis la dedico con todo a mi amor a todas las personas tan maravillosas que me rodean, que confiaron en mí y me brindaron su apoyo y buena vibra, principalmente a mi amado esposo Saúl Daniel Sández España, por su comprensión, cariño y todo su amor, por esas palabras de aliento que me motivaron a seguir adelante, a mis queridos padres, Margarito Rodríguez Álvarez y María Guadalupe Macías del Valle, que jamás me dejaron a la deriva, que siempre estuvieron allí para mí, dándome consejos y las herramientas necesarias que me ayudaron a crecer en este proceso, por todas las fuerzas para superarme día a día como persona, y a mi linda hermana, Yennifer Rodríguez Macías, por llenarme de felicidad, y motivarme cada día a ser mejor estudiante y persona para ser un buen modelo a seguir. III RESÚMEN La albahaca, es una especie vegetal de gran importancia dentro de la agricultura, debido a la diversidad de usos que ésta contiene, tales como de tipo medicinal, culinario y cosmético. Por esta razón, es de gran interés proteger su producción del ataque de microorganismos que causan enfermedades como los daños de manchas foliares, los cuales reducen el rendimiento de la planta. En este proyecto, se llevó a cabo la identificación del agente causal de la mancha foliar de la albahaca, con el objetivo de identificar el microorganismo causante del daño. Así mismo, se evaluaron a nivel in vitro e in vivo, tres diferentes cepas bacterianas, tanto en cajas Petri como en hojas. Este se llevó a cabo, aplicando en follaje de albahaca, tanto las bacterias antagonistas como el extracto del Lomboy blanco (Jatropha cinerea). La finalidad fue determinar el efecto de los compuestos naturales y microbianos en la inhibición del patógeno. En el primer objetivo, se determinó mediante las claves fitopatológicas, que el patógeno causante del daño foliar correspondía al hongo Alternaria alternata, debido a la forma y color de su colonia, textura, así como tipo y forma de las esporas. Posteriormente, en el segundo objetivo se evaluó in vitro el efecto de las bacterias contra A. alternata, y los resultados mostraron que la bacteria B1 y B3, presentaron una inhibición significativa contra el hongo, mientras que en la bacteria B2, la inhibición fue menor a diferencia de las dos anteriores. En el caso del efecto in vivo, la respuesta no fue similar, debido a que solo la B3 inhibió el crecimiento del patógeno, mientras que la B1 y la B2, incitaron su desarrollo. En el caso del extracto de J. cinerea, su efecto a nivel in vitro e in vivo no fue efectivo, ya que en vez de inhibir al hongo, estimuló su crecimiento micelial. La identificación del hongo fue de gran relevancia en dicho estudio, debido a que se pudo determinar el agente causal del daño de la mancha foliar en albahaca. De esta manera, se puede implementar un control más específico y preciso al problema. Dos de las tres bacterias evaluadas, presentaron una eficacia considerable en la inhibición del hongo, lo que es de gran importancia, ya que con ello, se prueba una vez más que existen formas alternativas de control contra enfermedades, sin la necesidad de recurrir al uso constante de fungicidas sintéticos, los cuales comúnmente, mediante el uso indiscriminado, generan desastres ecológicos, tales como daños al ambiente y la generación de compuestos tóxicos para el hombre, entre otros. 1 I. INTRODUCCIÓN La Albahaca (Ocimumbasilicum L.), es una planta aromática que destaca por su rentabilidad económica, debido a su uso en la industria culinaria, cosmética, farmacéutica y antimicrobiana, lo que origina una gran demanda en el mercado internacional (Gilardi et al., 2013). En México, Baja California Sur es uno de los principales productores de este tipo de cultivos, donde el 100% de la producción se destina a exportación, lo que genera mayores divisas para el país (SAGARPA, 2014). Sin embargo, durante el desarrollo del cultivo, se presentan diversos patógenos que afectan el desarrollo de las plantas. Estos agentes, dañan significativamente la calidad de las mismas, disminuyendo así la producción y causando pérdidas económicas considerables a los productores (Garibaldi et al., 1997). Recientemente en el Estado, este cultivo ha presentado daños a nivel foliar, debido a la presencia de manchas necróticas en el haz de las hojas, las cuales demeritan el valor comercial del producto. Generalmente esta problemática se ha observado en etapa de plántula, generando pérdidas del 100% en vivero. Actualmente, se desconoce el agente causal de esta enfermedad, lo que provoca aplicaciones inapropiadas de productos químicos generando desastres ecológicos. Dentro de la agricultura sustentable, se ha considerado de gran relevancia la aplicación de métodos de control alternativos promisorios en el manejo de enfermedades, como el uso de productos naturales derivados de diferentes especies de plantas, donde se han determinado distintos principios químicos antimicrobianos (Silva et al., 2012). Otro método de control alternativo, es la utilización de microorganismos antagonistas, como hongos, bacterias y levaduras, los cuales son aprovechados como una forma de control biológico de patógenos vegetales. En Baja California Sur, existe una diversidad de plantas, tales como Lomboy blanco (Jatropha cinerea), el cual podría ser de interés en el estudio de sus compuestos con actividad antimicrobiana contra diferentes microorganismos fitopatógenos como el causante de la mancha foliar en albahaca. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo de investigación fue identificar el agente causal de la mancha foliar en albahaca y evaluar tanto in vitro como in vivo, el uso de extracto de J. cinerea y 3 cepas bacterianas para su control. 2 II. OBJETIVO GENERAL Identificar el agente causal de la mancha foliar en albahaca (Ocimum basilicum L.) y evaluar su control con extracto de J. cinerea y tres bacterias antagonistas. 2.1. Objetivos específicos a) Identificar morfológicamente el agente causal de la mancha foliar en albahaca. b) Determinar el efecto antifúngico a nivel in vitro del extracto de J. cinerea y tres bacterias antagonistas sobre el control del agente causal de la mancha foliar en albahaca. c) Determinar el efecto antifúngico a nivel in vivo del extracto de J. cinerea y tres bacterias antagonistas sobre el control del agente causal de la mancha foliar en albahaca. 3 III. JUSTIFICACIÓN La albahaca, es una planta medicinal y aromática de importancia económica a nivel mundial. Debido a la demanda constante en los mercados internacionales, la superficie de siembra se ha incrementado en varios países. En México, el aumento de esta planta aromática año con año, ha mejorado las divisas en el país. Tal es el caso de Baja California Sur, el cual es considerado uno de los principales productores, al presentar más de 490 ha, con un valor de producción de 62,053.89 millones de pesos anualmente. Sin embargo, la producción de este cultivo se ve seriamente afectada por patógenos fúngicos de tipo foliar que demeritan la calidad del follaje, llegando a provocar hasta un 40% de pérdidas. El desconocimiento del microorganismo presente, origina que se aumenten las aplicaciones de fungicidas sintéticos, incrementando los costos de producción, lo que a su vez contribuye en gran medida a la contaminación ambiental. Por lo tanto, es de gran interés determinar el agente causal de la mancha foliar y evaluar una alternativa de control mediante el uso de productos biológicos y/o naturales derivados tanto de plantas como de microorganismos antagonistas. IV. HIPÓTESIS a) El patógeno involucrado en la enfermedad foliar en albahaca, estará relacionado con un tipo de hongo de la clase de los deuteromicetes. b) De los tratamientos evaluados, se espera que al menos el extracto de J. cinerea y un antagonista, muestren una mayor efectividad tanto a nivel in vitro como in vivo en la inhibición del agente causal de la mancha foliar en albahaca. 4 V. REVISIÓN DE LITERATURA 5.1. La albahaca y sus usos La albahaca, es originaria de Asia Meridional, y pertenece a la familia de las Lamiaceae (Amvam-Zollo, 1998). El género Ocimum, está representado por más de 150 especies y tiene una amplia distribución geográfica por todas las regiones de clima tropical y subtropical (Sobti et al., 1979). La albahaca, es de carácter anual, con tallos erectos y ramificados, frondosa que alcanza de 0.30 a 0.50 m de altura. Se propaga por estacas o semillas; se reproduce en climas áridos y semiáridos y se relaciona con el fotoperiodo, así como en un gradiente altitudinal de 0 a 1000 m (Enciso, 2004). Es un importante grupo de plantas aromáticas que contienen aceites esenciales ricos en diferentes constituyentes, como linalol, geraniol, citral, alcanfor, eugenol, timol, etc. Presenta un inmenso valor para la industria de perfumería, cosméticos, alimentaria y la farmacéutica (Cáseres, 1993) (Fig. 1). Se ha cultivado desde hace siglos por sus cualidades de sabor y propiedades terapéuticas. Se usan las hojas frescas o secas, al igual que sus aceites esenciales y semillas (Kopsell, 2005). En la edad media se encontraba entre las plantas medicinales mágicas, ya que por su contenido en aceites esenciales, taninos, glucósidos y saponinas la hacían muy efectiva en el tratamiento de los trastornos gástricos, respiratorios y urinarios (Barroso y Jerez, 2000). Figura 1. La albahaca y sus usos 5 5.2. Importancia económica de la albahaca Ocimum basilicum, es un cultivo de importancia económica global, con una producción mundial anual de 100 ton de aceites esenciales (Chirinos et al., 2009), almacenados y ubicados en diversos órganos de la planta, tales como flores, hojas, brotes, tallos y semillas, con una calidad que depende de factores externos (climáticos y agronómicos) e internos del cultivo (variedad, edad de la planta y órgano utilizado) (Werker et al., 1993). El interés por este tipo de compuestos ha aumentado recientemente debido a las aplicaciones industriales como la producción de pinturas, papel, cosméticos, fragancias, agentes curtientes, insecticidas, fungicidas, y en la industria alimentaria como aditivos, colorantes y conservantes (Taiz y Zeiger, 2006). La calidad del producto está determinada por la apariencia (color de la hoja y la ausencia de daños por insectos o patógenos), sabor, contenido de humedad para el mercado en fresco y el contenido de aceite volátil (Flavin, 1987). El rendimiento promedio de cada planta de albahaca es de 360 g durante su ciclo de producción que dura alrededor de 12 a 16 semanas. Los rendimientos de albahaca dulce son de 18-20 ton/ha en fresco y de forma deshidratada se puede obtener hasta 10 ton/ha de albahaca seca y cerca de 80 kg/ha de aceite esencial (Forero, 2010). 5.3. La producción de albahaca en México Existen más de cincuenta especies de albahaca que se diferencian en el tamaño, el color, la apariencia y el sabor (Sánchez-Verdugo y Lucero-Flores, 2012), siendo la especie O. basilicum la que produce mayor cantidad de aceite esencial. Generalmente este cultivo, es desarrollado bajo sistemasde producción orgánicos. A nivel nacional, la superficie que se cultiva orgánicamente para la producción comercial de hierbas aromáticas es de 8,351 ha, de las cuales 5% está dedicada a albahaca (SIAP, 2012). Los principales estados productores son: Baja California (invernadero), Morelos, Nayarit (convencional) y Baja California Sur (orgánico), siendo éste último, el mayor productor de ésta planta, la cual es destinada a la exportación (Sánchez-Verdugo y Lucero-Flores, 2012). La agricultura orgánica en México y en el mundo, muestra una tendencia acelerada de crecimiento en cuanto a superficie cultivad a y consumo (Rundgreen, 2004). Esta es una alternativa que ha mostrado bondades para los consumidores por la inocuidad de los alimentos, para los productores por su rentabilidad y para la sociedad por su efecto positivo en salud humana y ambiental (Moncayo, 2015) (Fig. 2). 6 Figura 2. Principales estados productores de albahaca 5.4. Presencia de enfermedades que reducen su producción Las enfermedades constituyen uno de los elementos limitantes dentro de la producción de cualquier cultivo. De aquí que su control, sea un factor a tener presente desde la siembra o trasplante hasta la cosecha (Cerqueira et al., 2016). Sin embargo, muchas veces al no tener un adecuado conocimiento de los posibles microorganismos y patologías asociadas a las distintas especies, y el no saber distinguir claramente la sintomatología que producen distintos hongos, bacterias o virus en las plantas, nos lleva a aplicar medidas de control inapropiadas. De aquí que dentro de un manejo integrado de enfermedades, el correcto diagnóstico del agente causal del problema, sea clave. El cultivo de la albahaca, es atacado por diferentes especies de patógenos, los cuales pueden llegar a causar pérdidas considerables en la producción, al reducir la calidad del follaje. Especialmente este tipo de patógenos, se presentan bajo condiciones de alta humedad. Dentro de las principales enfermedades que se han reportado en albahaca, se encuentran la marchitez por Fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. basilicum), mancha foliar (Alternaria spp.) Pudrición bacterial (Pseudomonas cichorii), moho gris (Botrytis cinerea), damping off (Rhizoctonia solani; Pythium spp.), mildiu velloso (Peronospora belbahrii), etc. (Tran, 2011) (Cuadro 1). 7 Cuadro 1. Principales enfermedades en albahaca (Tran, 2011). ENFERMEDAD PATÓGENO SÍNTOMA Marchitez por Fusarium Fusarium oxysporum f. sp. basilicum Plantas atrofiadas y marchitas con amarillamiento en las hojas son los síntomas iniciales que se desarrollan cuando las plantas tienen de 6-12 pulgadas de alto. Antes de esta etapa, los síntomas no son claros. Las plantas infectadas pueden crecer normalmente. En la fase tardía los tallos presentan síntomas de tejidos anormales y decoloración. Mancha bacteriana Pseudomonas cichorii Hojas con tejido necrosado y marchitez foliar. Tallos con presencia de humedad. Hojas con manchas irregulares en la parte de las venas. Esta enfermedad parece no ser tan severa en campo pero es devastadora en producción de plántula. Moho gris Botrytis cinerea El síntoma más característico es el crecimiento de micelio gris sobre las hojas y tallos. Este crecimiento aparece más densamente como micelio algodonoso similar al mildiu velloso. Las hojas enfermas mueren y eventualmente se caen de la planta. Si se desarrollan lesiones severas en el tallo principal, la planta puede morir. Pudrición de la raíz Rhizoctonia solani; Pythium spp. Esta enfermedad sucede en estado de plántula, cuando las plantas colapsan después de la germinación. El patógeno infecta la base del tallo de las plántulas, causando declinamiento del tallo. Mildiu velloso Peronospora belbahrii Amarillamiento inicial de las hojas típicamente en la vena media y se disemina a la mayoría de la superficie de la hoja. Conforme la enfermedad progresa los síntomas se vuelven más característicos. Estos presentan esporangios de color grisáceo sobre el envés de las hojas. Si la humedad permanece el patógeno se vuelve más severo. 5.5. Métodos de control El manejo de las enfermedades de cultivos menores como lo es la albahaca, es muy difícil debido a varios factores. Actualmente existe un número muy limitado de fungicidas con registro para su aplicación comparado con otros vegetales como algunas hortalizas (Gullino et al., 1994). Además cuando los fungicidas son efectivos, existen limitaciones en su uso debido a los problemas de residuos que estos pueden generar en el tejido. Debido a esto, el control de las enfermedades, sobre todos las foliares, es un problema constante y actualmente se maneja sin mucho éxito, mediante la utilización de prácticas culturales y cultivos protegidos (Leng, 1991). 5.6. Alternativas de manejo La seguridad alimentaria está presente a nivel mundial todo el tiempo. Teniendo repercusiones en la seguridad y nutrición de los alimentos a nivel físico, social y económico. Actualmente las consecuencias derivadas de la aplicación de fungicidas en los sistemas de producción agrícola tradicional para el control de enfermedades, han impactado negativamente en este ambiente (Martín, 2003). Desde tiempos pasados el uso de fungicidas para controlar las enfermedades en los cultivos ha contribuido a incrementar la producción de alimentos a nivel mundial. Sin embargo, su uso masivo ha tenido un impacto severo en 8 el ambiente. Los fungicidas sintéticos poseen un riesgo en la salud dentro de nuestra cadena de alimentos y se ha ligado a la ocurrencia incrementada de varios tipos de cáncer. Además este tipo de productos ha generado el surgimiento de nuevas especies resistentes. Por lo tanto urge el desarrollo de nuevas estrategias de control efectivas y amigables con el ambiente (McDonald y Linde, 2002). En este aspecto, el uso de extractos de plantas y microorganismos antagonistas, podrían representar una solución ideal al problema. Se ha encontrado que los extractos derivados de plantas poseen diferentes metabolitos secundarios con actividad antifungica los cuales pueden representar una alternativa promisoria para el manejo de enfermedades. Así mismo se ha comprobado que el uso de microorganismos antagonistas son fuentes potenciales en la reducción e inhibición de diferentes tipos de patógenos de importancia económica dentro de la agricultura. 5.7. El uso de extractos vegetales con actividad antifungica Las plantas han desempeñado un papel fundamental en la vida del hombre, quien las ha utilizado para suplir necesidades básicas como alimento, medicina, vivienda y vestido, incluso en actos rituales. El uso de las plantas es una práctica que existe desde los inicios de la especie humana. La etnobotánica es la ciencia que investiga la relación entre las plantas y la cultura humana en diferentes ambientes, la cual surge como un instrumento para rescatar tradiciones milenarias sobre los diversos usos que el hombre le ha dado a estas y como alternativa de dar valor agregado a los recursos vegetales (Pino y Valois, 2004). Las plantas y sus derivados han mostrado efectos controladores contra ácaros, roedores, nematodos, bacterias, virus, hongos e insectos (Grainge y Ahmed, 1988). Especies de plantas como ajo (Allium sativum), ají (Capsicum frutecens), higuerilla (Ricinus comunis), nim (Azadirachta indica) y paraíso (Melia azedarach) son materia prima de varios insecticidas comerciales (Rodríguez y Nieto, 1997). En el caso de la acción fungicida, García et al. (2006), al realizar la evaluación de la actividad antifúngica con los aceites esenciales obtenidos en plantas aromáticas, determinaron una mayor actividad biológica con limonaria (Cymbopogum citratus) y tomillo (Thymus vulgaris). Así mismo, se realizó la evaluación fitotóxica sobre plantas de tomate de árbol, mostrando quela aplicación sistemática y en altas concentraciones no ocasionó ninguna lesión de las contempladas en las escalas de daño a las plantas evaluadas. Otra investigación fue la realizada por Stauffer et al. (2000), donde evaluaron los extractos de 98 especies vegetales pertenecientes a 46 familias botánicas (7 monocotiledóneas; 46 dicotiledóneas; 1 conífera y 2 pteridofitas) para determinar su posible 9 efecto fungicida o bactericida, con la factibilidad de ser utilizados en el control de enfermedades en plantas. Nueve de los extractos evaluados (ajo, cebolla, quebracho colorado, agrial, palo santo, chirca, guayaba, eucalipto y pino) demostraron inhibición de crecimiento de la bacteria Xanthomonas campestris pv. campestris. La inhibición del crecimiento fungoso solo se obtuvo con extractos de ajo y cebolla (utilizados como referencia), así como con el extracto de mamón contra Colletotrichum sp. El extracto de ajo tuvo efecto inhibidor sobre siete especies de hongos (Penicillium italicum, Aspergillus flavus, Fusarium sp., Rhizoctonia solani, Alternaria sp., Colletotrichum sp. y Pythium sp.). El efecto de la cebolla fue menor en intensidad y afectó sólo a Fusarium sp., Alternaria sp., Colletotrichum sp. y Pythium sp. A partir de los resultados anteriormente expuestos queda claro que es necesario desarrollar nuevos sistemas de manejo integrado basados en productos naturales de plantas, que reduzcan la dependencia de los productos sintéticos y, por tanto, menos contaminación ambiental y mayor calidad en los alimentos agrícolas producidos (Celis et al., 2008). 5.7.1 Plantas de la familia Euphorbiaceae y sus propiedades antimicrobianas La familia Euphorbiaceae ha sido reconocida como una de las más extensas y controvertidas de las Angiospermas, con más de 300 géneros y 5000 especies, ubicándose la mayoría de ellas en América y África tropical (Marticorena, 1990). Desde la antigüedad se han atribuido efectos curativos. Así por ejemplo Euphorbia fischeriana ha sido usada en la medicina tradicional China por más de 2000 años, como una droga anticancerígena (De-Ji et al., 1991). En estas plantas, se ha encontrado que poseen una amplia diversidad química por lo que abarca una gran gama de aplicaciones tales como: alimenticias, venenosas y medicinales entre otras. Los principales metabolitos secundarios detectados han sido los terpenos, seguidos de alcaloides y flavonoides (Payo et al., 2001). Entre los géneros de plantas más diversos, se encuentran Croton con 800 especies, y Jatropha con 175, ambos distribuidos principalmente en las regiones tropicales y subtropicales del mundo (Webster, 1994). En México se encuentran seis tribus y ocho géneros; dentro de éstos se encuentra Cnidoscolus, género cuyo mayor centro de diversificación se encuentra en el país, y Jatropha, con 45 especies, de las cuales el 77 % son endémicas de selvas bajas y matorrales xerófilos (Martínez et al., 2002). 10 5.7.2. El género Jatropha spp. El nombre del género Jatropha, deriva del griego iatros (doctor) y de trophe (alimento) que implica aplicaciones medicinales. (Heller (1996), señala que son “hierbas, arbustos o árboles, a veces carnosas en forma de cactáceas, generalmente con látex, hojas simples o compuestas en varias formas, generalmente alternas y a veces opuestas, con estípulas; inflorescencias variadas, a menudo condensadas aparentando una sola flor, en otras ciatios; flores unisexuales, monoicas y a veces dioicas, con frecuencia sumamente reducidas; perianto nulo; flores estaminadas con uno o muchos estambres libres o monadelfos; flores postiladas con o sin estaminodios, pediceladas; ovario súpero tricarpelar y trilocular con 1 ó 2 óvulos por lóbulo y basalmente unidos; fruto cápsula tricarpelar; semilla con endospermo (Fig. 3). Figura 3. Jatropha Krusei. A) rama con flores y fruto inmaduro. B) flor estaminada. C) flor pistilada. D) estípula. 11 5.7.3. Distribución a nivel nacional de especies de Jatropha spp. El género Jatropha es circuntropical, al distribuirse de manera disyunta en las zonas tropicales y subtropicales del viejo y nuevo mundo, particularmente en regiones estacionales secas (Dehgan y Webster, 1979); es el cuarto género más diverso de la familia Euphorbiaceae, pertenece a la subfamilia Crotonoideae y tribu Jatropheae (Steinmann, 2002). Por su localización geográfica, la especie no es endémica de México y se registra sólo en el continente americano, al menos, en tres áreas separadas; la primera y más grande se encuentra desde Arizona en el suroeste de los EEUU y el noroeste de México; en la península de Baja California, al sur de Baja California y en casi todo Baja California Sur; en el Pacífico por las costas de Sonora y Sinaloa (Arriaga y Ortega, 1988; Vega et al. 1989; Sánchez, 2002; Turner et al., 2005). Una segunda área está en Oaxaca. La tercera en Sudamérica en la región del Cusco en Perú. En el noroeste de México se distribuyen 17 especies de Jatropha, siendo las más representativas J. cinerea J. cuneata, J. cordata, J. cardiophylla, y J. malacophylla (Fresnedo y Orozco, 2013). Las regiones con mayor representatividad del género se encuentran en los estados de Puebla y Oaxaca (Reserva de la Biosfera Tehuacán-Cuicatlán y en la Región Terrestre Prioritaria 129 Sierra Sur y Costa de Oaxaca). (Fig. 4). Figura 4. Estimación de riqueza del género Jatropha spp. en México 12 5.7.4. Usos Los usos que tiene la familia son diversos, entre los que se encuentra géneros de uso alimenticios, productores de aceites, de substancias medicinales, venenosos, lactíferos, ornamentales y malezas. (Fig. 5). Jatropha spp., es un importante recurso fitogenético usado como alimento, medicina y biocombustible. Figura 5. Usos de Jatropha. A) Hoja y fruto. B y C) Frutos secos. D) aceites Las especies de Jatropha se han usado en la medicina tradicional en África, Asia, y América Latina. La conciencia mundial de los recursos energéticos sostenibles y alternativos ha impulsado la investigación sobre el aceite de Jatropha como materia prima para la producción de biodiesel y otro tipo de productos. En el futuro, puede ser que aumente la utilización de cultivo de plantas de Jatropha y el uso de sus subproductos agroindustriales en humanos, animales y otros organismos. Se ha establecido bajo diferentes estudios que las frutas, semillas, aceites, raíces, látex, cortezas y hojas en varias especies de jatropha poseen propiedades moluscicidas, farmaceuticas, insecticidas, rodenticidas, antimicrobianas y citotóxicas. 5.7.5. Efecto antimicrobiano de Jatropha spp. Los agentes antimicrobianos son sustancias que matan a los microorganismos o inhiben el crecimiento de los microorganismos. Estas sustancias, interrumpen los procesos microbianos o las estructuras que difieren de las del hospedero. Pueden dañar la síntesis de las membranas celulares y/o la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos de los patógenos. Así mismo bloquean las rutas metabólicas a través de la inhibición de enzimas claves. Un análisis fitoquímico del extracto y látex de Jatropha curcas revelaron la presencia de muchos metabolitos secundarios incluyendo esteroides, alcaloides y saponinas. Estas sustancias A B C D 13 presentaron un potente efecto antimicrobiano contra Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoea, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans, and Aspergillus flavus con una concentración mínima de 0.5mL. 5.7.6. Jatropha cinerea Jatropha cinerea, tiene como sinónimos Mozzina cinerea (Ortega.) M. canescens, Jatropha canescens (Benth.) Müll. Arg., y J. giffordiana.. Se le conoce con los nombres comunes de sangregado, sangrengado, sangringrada, lomboy y/o lomboy blanco (Fresnedo y Orozco, 2013). El sangregado o sa´apo o lomboy (J. cinerea) presentavariación en las formas de crecimiento a través de área de distribución en el noroeste de México, localmente se encuentra en una heterogeneidad de hábitats que van de sitios planos, pies de montaña, suelos erosionados, áreas perturbadas, etc., así como en suelos someros y profundos (Márquez et al., 2015). 5.7.6.1. Descripción morfológica Se describe como un arbusto o árbol pequeño de entre 1 y 6 m de alto, con corteza café o blanquecina. El porte tiene un crecimiento articulado, caracterizado por un incremento anual de la extensión de las yemas con distinta discontinuidad morfológica o articulación entre cada incremento, presenta un dimorfismo de brotes. Hojas de 2 a los 7 cm. de ancho, más o menos cordadas en la base, cordiforme, hastiforme, reniforme, espatulada enteras o más o menos onduladas; los brotes son cortos, presentan de 3 a 5 lóbulos, se caracterizan por presentar grándulas estipitadas sobre los márgenes del folio, cáliz lobulado, estipulas, peciolos y brácteas, que inicia la presencia de glándulas sobre el crecimiento joven que sigue de la dormancia. La inflorescencia consta de una simple flor pistilada, estaminada. Están presentes por 2 o 3 flores individuales terminales en la yema apical; los colores son rosados o blancos; el fruto es una cápsula de entre 2-2.5 cm., de ancho. 5.7.6.2. Beneficios de la planta J. cinerea, es una especie con importancia ecológica, etnobiológica y ambiental; ecológicamente es clave al regular procesos de descomposición de la materia orgánica. Es colonizadora de sitios perturbados, asociada con hongos micorrizas, que evitan erosión eólica y ayuda a la estabilización de suelos; es hospedera trófica y pupal del lepidóptero Rothschildia cincta, especie de importancia cultural para grupos humanos del noroeste de México y suroeste de EEUU; para grupos humanos tiene usos medicinales e industriales. 14 Ambientalmente puede ser empleado como biocombustible por sus semillas con un alto contenido de aceites; que contribuiría en reducir el calentamiento global; potencialmente tiene empleo como fungicida, al inhibir el crecimiento de los hongos; es de uso forrajero; y ha formado parte de programas de reforestación en mariposarios, solares y parcelas de la comunidad indígenas de las Culebras, Guasave y Capomos, El Fuerte Sinaloa; Paredones, Navojoa, Sonora. Debido a que Jatropha curcas y Jatropha cinerea son muy similares, es posible que ambas posean compuestos activos similares. A diferencia de J. curcas, en J. cinera no se ha encontrado información suficiente sobre su efecto antifungico contra patógenos de plantas, por lo cual, sería interesante evaluar su actividad en la inhibición de hongos fitopatógenos comunes en el campo, como los que se presentan en follaje de plantas. 5.8. El papel del control biológico mediante microorganismos antagonistas Mucho antes de terminar el siglo XX había una clara conciencia de la importancia de encontrar métodos de control más sostenibles ya que en base a varias estimaciones, las pérdidas de cosecha por la acción de plagas, enfermedades y malas hierbas había aumentado a pesar de haber multiplicado el empleo de productos fitosanitarios. A la par ya existía la necesidad de introducir criterios de sostenibilidad en las prácticas agrícolas, incluidos aquellos criterios con tendencia a disminuir su impacto en el ambiente. De allí se derivó una creciente actividad de investigación científica, basada fundamentalmente en criterios ecológicos, orientada a conocer mejor, por una parte, los agroecosistemas y, por otra, a aumentar la eficacia de métodos de control distintos al uso de plaguicidas, donde el control biológico ha ocupado un lugar preferencial (Bettiol et al., 2002). Actualmente se entiende por biocontrol la reducción de la intensidad o las actividades productoras de enfermedades de un patógeno o parásito, lograda mediante la manipulación del ambiente, del hospedero o de los antagonistas del patógeno o plaga que se quiere controlar. Los microorganismos antagonistas comprenden cualquier organismo que interfieren en la supervivencia o desarrollo de los patógenos. En los últimos años, el control biológico ha sido objeto de estudio y ha demostrado ser efectivo en el control de enfermedades. La razón principal por la cual muchos productos agrícolas no son destruidos completamente por las plagas y las enfermedades es la presencia natural de agentes de control biológico: organismos capaces de antagonizar con las plagas o 15 patógenos, reduciendo sus efectos nocivos. El desarrollo y aplicación de este potencial de la naturaleza cobra cada vez mayor importancia, y seguramente tendrá un gran impacto en la agricultura en el futuro cercano (Serrano y Galindo, 2007). 5.8.1. Tipo de microorganismos con potencial antagónico Los microorganismos antagonistas tales como, bacterias, levaduras y hongos, han demostrado tener la capacidad de ejercer un efecto de control biológico sobre diferentes patógenos de interés y se han empleado para controlar diversas enfermedades en frutos y vegetales (De Costa y Erabadupitiya, 2005). 5.9. Bacillus spp. El género Bacillus, independientemente de su ubicación taxonómica, se encuentra entre los agentes más adecuados para el control biológico debido a cualidades tanto morfológicas como fisiológicas que permiten su ubicuidad en la naturaleza (Meadows et al., 1992). Este género además ha tenido mucho éxito en la prevención de patologías vegetales causadas por hongos (Osburn et al., 1995). Dada la diversidad genética en el género Bacillus, tanto en el suelo como en la rizosfera, se considera a estos microorganismos como colonizadores eficaces (Kim et al., 1997). En algunos trabajos se ha determinado el efecto de Bacillus sp. sobre la germinación y el desarrollo de semillas de tomate infectadas con Fusarium oxysporium var cubensis (Brada et al. 1995); también se realizaron pruebas in vitro con Pseudomonas sp. y B. subtilis aislados de plátano y arroz, respectivamente (Torres et al., 2001). Estos microorganismos mostraron la capacidad de inhibir el crecimiento de hongos fitopatógenos del suelo, tales como Fusarium oxysporium, f. s. lycopersici, Pythium ultimun, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Phytophtora nicotianae, Fusarium moniliforme y Fusariun solani. 5.9.1. Morfología colonial En el caso de Bacillus subtilis, es uno de los bioagentes más importantes utilizados para el manejo de enfermedades en plantas. Este es una bacteria gram positiva, móvil, aeróbica, de forma ovalada. Es un organismo presente en la naturaleza actuando como saprofito comúnmente en agua, suelo materia en descomposición. La colonia de Bacilllus es tradicionalmente circular, de coloración crema a blanco. Posee la capacidad de formar endosporas que la protegen de factores ambientales desfavorable (Alexander, 1977) (Fig. 6). 16 Figura 6. Morfología de la colonia de Bacillus subtilis. A) Colonia bacteriana y B) células bacterianas. 5.9.2. Mecanismo de acción contra patógenos En general, los antagonistas no tienen un único modo de acción y la multiplicidad de éstos es una característica importante para su selección como agentes de control biológico. Si el antagonista posee varios modos de acción reduce los riesgos de desarrollo de resistencia en el patógeno. Este riesgo de resistencia también se reduce mediante el uso de combinaciones de antagonistas con diferente modo de acción (Fig. 7) (Basamma y Shripad, 2016). Es importante comprender el mecanismo de acción de los antagonistas para un mejor uso de los mismos, y para la selección de nuevos antagonistas efectivos. Hasta ahora, los conocimientos sobre los mecanismos de acción involucran: la antibiosis, producción de enzimas líticas, parasitismo, competencia por los nutrientes y espacio e inducción de resistencia. Cabe destacar que engeneral más de un mecanismo puede estar implicado en el efecto de biocontrol (Janisiewicz y Korsten, 2002). Algunos de estos mecanismos se describen a continuación: 5.9.2.1. Antibiosis Bacillus produce compuestos químicos como los péptidos, los cuales tienen acción variada y representan un grupo no muy heterogéneo entre sí de metabolitos activos que afectan directamente a algunos fitopatógenos. La actividad antimicrobiana de los lipopéptidos se da por la interacción con la membrana de las células diana, en la cual se modifica la permeabilidad y la composición de los lípidos de la membrana con la formación de pequeñas 17 vesículas y la agregación de partículas intramembranosas, de esta forma inhiben el crecimiento del micelio y el desarrollo de los hongos (Aranda et al., 2011). 5.9.2.2. Competencia por nutrientes La competencia más común es por nutrimentos esenciales para el desarrollo de las funciones microbianas vitales; reproducción, nutrición, respiración y/o metabolismo, de esta manera se delimita la colonización de otras especies patógenas (Cook y Baker, 1983). 5.9.2.3. Competencia por espacio El desarrollo de un microorganismo sobre determinada área, inhibe de cierto modo la invasión de otros (Cook y Baker, 1983). 5.9.2.4. Interacción directa con el patógeno Se destacan dos tipos de interacción directa entre los antagonistas y los patógenos, el parasitismo y la predación (Lecuona, 1996), la primera se considera por varios autores como una simbiosis antagónica entre organismos; la capacidad que posee uno de ellos denominado antagonista de alimentarse de otro microorganismo, que en el contexto del biocontrol es un agente patógeno. Este mecanismo esta mediado básicamente por la lisis enzimática, la cual permite la degradación de las estructuras fúngicas parasitadas para su utilización como fuente de factores nutricionales ya que son exoproteasas principalmente que hidrolizan los enlaces peptídicos hasta dipéptidos, tripéptidos y aminoácidos libres que usa el antagonista para su alimentación, dentro de las más importantes las quitinasas, celulasas, proteasas y la β- 1,3 glucanasa. Existen por tanto dos tipos de lisis: la endolisis y la exolisis, la primera consiste en la destrucción del citoplasma de una célula por sus propias enzimas y la segunda se produce debido a enzimas o toxinas de otros organismos (Vega y Fernández, 2001). Por otro lado la predación; consiste en la utilización de materia orgánica como fuente nutricional por parte del antagonista, de la que puede hacer parte el patógeno, lo cual es muy ocasional. Como ejemplo, en estudios anteriores se ha descrito la presencia de amebas en suelo que ejercen efectos supresores de enfermedad y lo protegen de la proliferación de microorganismos no deseados al alimentarse de las hifas de hongos patógenos (Campell, 1989). 18 5.9.2.5. Protección cruzada e inducción de resistencia Los seres vivos incluidas las plantas han desarrollado mecanismos de defensa contra los patógenos invasores en el transcurso del tiempo y el proceso evolutivo. Por tal motivo las plantas presentan mecanismos bioquímicos, físicos y estructurales de resistencia los cuales están muy relacionados con la capacidad de éstas para inhibir el desarrollo de una enfermedad por fitopatógenos con los que no han estado en contacto mediadas por los mecanismos preexistentes desencadenados por otro patógeno similar, conocido como el fenómeno de la protección cruzada. La resistencia inducida es un tipo particular de este fenómeno, en la cual los mecanismos de defensa reconocen y responden a amenazas similares y están preparados antes de la amenaza real dada por la llegada del patógeno, esta protección cruzada puede por tanto estar dada por la inducción de resistencia u otros mecanismos antagónicos (Campell, 1989). Figura 7. Mecanismos de acción de Bacillus subtilis 19 VI. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1. Objetivo 1. Identificar morfológicamente el agente causal de la mancha foliar en albahaca. 6.1.1. Muestreo de campo Para el muestro de tejido infectado, se seleccionaron zonas productoras de albahaca ubicada en San José del Cabo y Todos Santos, donde se presentaban este tipo de problemáticas en follaje. En el lugar de muestreo, se tomaron al azar 10 hojas con síntomas de mancha foliar. Las muestras fueron depositadas en bolsas plásticas, rotuladas y posteriormente se colocaron en hieleras para que se conservaran frescas. Éstas se llevaron al Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Autónoma de Baja California Sur (UABCS) para su análisis correspondiente (Fig.8). Figura 8. Mancha necrótica en hoja de albahaca. 6.1.2. Aislamiento del patógeno De las muestras de hojas infectadas, se realizaron cortes pequeños de aproximadamente 0.5 cm2, los cuales fueron desinfectados con hipoclorito de sodio al 10%, enjuagados en agua destilada estéril y posteriormente se depositaron en cajas Petri con medio Papa Dextrosa Agar (PDA, Bioxon®). Las cajas se incubaron a 28°C, hasta que se presentó el desarrollo del patógeno. Posteriormente se realizaron re-siembras hasta obtener cultivos puros (Fig.9). 20 Figura 9. Aislamiento de patógeno 6.1.3. Identificación morfológica Cuando el hongo presentó el 100% de crecimiento micelial en las cajas Petri, en estado puro, éstas fueron utilizadas para la realización de montajes donde se fijaron en lactofenol y fueron observadas en el microscopio óptico compuesto para determinar las características morfológicas (tipo y color de micelio, forma y tamaños de las esporas) tomando como base las claves propuestas por (Barnett y Hunter, 1972; Dick, 1990; Erwin y Ribeiro, 1996; Gallegly y Hong, 2008; Leslie and Summerell, 2006; Sneh et al.,1998) (Fig. 10). Figura 10. Identificación morfológica 6.1.4. Pruebas de patogenicidad Para las pruebas de patogenicidad, se llevaron a cabo inoculaciones en hojas de albahaca. Para ello, se tomaron 10 hojas previamente desinfectadas superficialmente con alcohol y se depositaron en una cámara húmeda. A las hojas se les realizó pequeñas heridas con una aguja estéril. Posteriormente se depositaron sobre el haz de la hoja, 3 discos con crecimiento micelial del hongo. Otro grupo de hojas solo se colocó un disco de agar sin inoculo y se 21 consideró como grupo control. Las hojas inoculadas se colocaron en una cámara de crecimiento a una temperatura de 28ºC y una humedad relativa de 90%. Diariamente se realizaron observaciones hasta que aparecieron síntomas de mancha foliar. Del tejido infectado, se realizaron de nuevo aislamientos, siembras y purificaciones del patógeno presente para corroborar que pertenezca al patógeno inicial identificado (Fig. 11). Figura 11. Pruebas de patogenicidad 6.2. Objetivo 2. Determinar el efecto antifúngico a nivel in vitro del extracto de J. cinerea y tres bacterias antagonistas sobre el control del agente causal de la mancha foliar en albahaca. 6.2.1. Obtención de antagonistas microbianos y el extracto vegetal de J. cinerea Para la prueba in vitro e in vivo, se utilizaron cepas bacterianas antagonistas, del tipo Bacillus, las cuales fueron proporcionadas por el Laboratorio de Fitopatología del Departamento Académico de Agronomía, aisladas previamente de hojas de J. cinerea y la rizósfera de cítricos. En el caso del extracto de J. cinerea, este fue obtenido como se presenta a continuación. 6.2.2. Obtención de extracto de J. cinerea Para la extracción, primero se tomaron muestras de hojas de lomboy, posteriormente se seleccionaron aquellas con igual tamaño y forma, se lavaron con agua corriente y desinfectaron con alcohol y finalmente se picaron. Las hojas previamentepicadas, se colocaron en matraces y se cubrieron con una solución de alcohol al 96%, sin desnaturalizar, 22 esto para extraer mayormente los metabolitos secundarios presentes en los tejidos. Esta solución se dejó en obscuridad constante por una semana. Una vez pasado los 7 días, se filtró el compuesto en vasos de precipitado y se depositó en bandejas para la evaporación del alcohol. Posteiormente se obtuvo la sustancia en sólido y se guardo en tubos estériles hasta su posterior uso (Fig.12). Figura 12. Obtención del extracto vegetal de J. cinerea 6.2.3. Prueba in vitro de cepas bacterianas y el extracto de J. cinerea vs. A. alternata El experimento in vitro realizado con los antagonistas y el extracto vegetal, se llevó a cabo en el Laboratorio de Fitopatología, perteneciente al Departamento Académico de Agronomía de la UABCS, ubicado sobre la carretera al sur, km. 5.5, en La Paz, BCS. 6.2.3.1. Cepas bacterianas vs. A. alternata Para el experimento con los microorganismos antagonistas, se realizaron siembras del patógeno y los antagonistas en una misma caja Petri con medio PDA para ver la inhibición de crecimiento micelial en el tiempo, mediante la técnica de cultivo dual. Para ello, cepas puras del patógeno con 7 días de crecimiento, fueron utilizadas para la realización de discos de 0.5cm de diámetro. Posteriormente un disco de medio de cultivo con el hongo, se depositó en el centro de una caja Petri con PDA. Inmediatamente después, se realizó la siembra de las bacterias antagonistas por el método de rayado en los cuatro lados de la caja Petri (Martínez et al., 1998). En los tratamientos testigo, las cajas Petri, únicamente tuvieron el crecimiento del hongo sin antagonistas. La variable a evaluar fue el porcentaje de crecimiento micelial del hongo a través de los días. En dicho experimento se utilizó un diseño 23 estadístico de dos factores con medidas repetidas en el tiempo (Factores: Fitopatógeno y tiempo), con 4 tratamientos, donde cada tratamiento tuvo 5 repeticiones. Los datos se analizaron mediante el paquete estadístico Prism 7.0 (Fig.13). Figura 13. Siembra de cepas bacterianas vs. A. alternata 6.2.3.2. Extracto J. cinerea vs. A. alternata El hongo se sembró en ex plantes discoidales de 8 mm de diámetro tomados con un sacabocados de una colonia de siete días de desarrollo y se colocaron en el centro de las cajas Petri. Posteriormente se colocaron 3 discos estériles de papel filtro alrededor del disco con el hongo en la caja Petri, a cada disco se agregaron 10µl del extracto, el cual estaba presente en tres diferentes dosis (50, 250 y 500 ppm). Como tratamientos controles se utilizó el agua destilada estéril, fungicida y etanol. Las cajas con los extractos se incubaron a 28ºC (Fig. 14). Figura 14. Bioensayo con los extractos. A) Ext. de J. cinerea. B) siembra en cajas petri 24 El crecimiento micelial se evaluó midiendo diariamente en mm el diámetro de la colonia. Con ello, se determinó el porcentaje de crecimiento micelial (PCM) a través del tiempo al final del experimento, empleando la fórmula de Abbot (1925); 6.3. Objetivo 3. Determinar el efecto antifúngico a nivel in vivo del extracto de J. cinerea y tres bacterias antagonistas sobre el control del agente causal de la mancha foliar en albahaca. 6.3.1. Prueba in vivo de las cepas bacterianas y extracto de J. cinerea vs. A. alternata Semillas de albahaca var. Nuffar, fueron sembradas en charolas de 200 cavidades con un sustrato de la marca comercial “Peat moss” y se depositaron bajo una malla sombra para su desarrollo. Cuando éstas presentaron las primeras hojas verdaderas bien desarrolladas se inició el bioensayo con los diferentes tratamientos. Para ello se tomaron 10 hojas, las cuales fueron previamente desinfectadas con alcohol. A cada una se le agrego una gota de 10µl del extracto y las cepas bacterianas por separado. Posteriormente se depositó sobre éstas un disco de 0.5 cm de diámetro de crecimiento con el hongo. Los tratamientos controles fueron discos de PDA con el hongo y gotas de 10µl de agua destilada estéril (Fig.15). Figura 15. Bioensayo in vivo con cepas bacterianas y el extracto de J. cinerea Cada grupo de hojas con sus tratamientos se depositaron en cámaras húmedas para favorecer el desarrollo del hongo. La evaluación de la eficacia de los tratamientos se realizó mediante observaciones diarias del crecimiento del patógeno. Al aparecer los primeros síntomas de 25 necrosis se llevó a cabo la cuantificación de la incidencia de la mancha foliar a través del tiempo y la medición del halo necrótico. VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1. Morfología del agente causal de la mancha foliar en albahaca En los resultados que se obtuvieron en el primer objetivo, se observó que la cepa fúngica obtenida presentó un crecimiento micelial en forma de círculos concéntricos de color verde olivo a gris con una textura algodonosa. En la parte inferior de la colonia se puede observar un color más intenso. Bajo el microscopio óptico se observó la presencia de un micelio color café, con septos. En el caso de las esporas se observó que estas tenían forma alargada y uno de sus extremos era más angosto que el otro. Estas Presentaban de 7 a más divisiones transversales y de 1 a 2 divisiones longitudinales. El color de las mismas era café (Fig. 16). Todas las características previamente descritas coinciden con el hongo Alternaria alternata. Figura 16. Morfología de Alternaria alternata La morfología de nuestros resultados coinciden con los de Taba et al. (2009), ya que su hongo presentó colonias en medio PDA, color olivo pálido u oscuro, con micelio aéreo. Conidióforos de color pálido a café ligero, ramificado o en cadenas, y el ápice con 2-4 septos. 26 Conidios con forma ovoide o elipsoidal con 1-7 septos transversales y 1-3 longitudinales u oblicuos. Con un extremo corto de forma cónica o cilíndrica. Con color que va de café a café ligero y están presentes en cadenas cortas. El micelio crece a 5-35ºC en PDA, con un óptimo de 25-30ºC. El agente causal de la mancha foliar en albahaca encontrado en plantas cultivadas en campos agrícolas en Baja California Sur fue Alternaria alternata, esto de acuerdo a la comparación con las características mostradas en las claves fitopatológicas de Barnett y Hunter (1972) y a lo reportado por Taba et al. (2009), donde menciona a Alternaria alternata como principal agente causal de la mancha foliar en albahaca en Japón, donde la sintomatología en plantas que este autor reporta, coincide con las de nuestro estudio, al encontrar lesiones necróticas en las hojas, donde finalmente la planta muere varios días después del primer desarrollo de lesiones. En el caso de nuestra colonia de Alternaria alternata, las características morfológicas fueron similares a las mencionadas por este autor. Bomfim et al. (2015), menciona que Alternaria alternata, Colletotrichum spp., Moniliophthora perniciosa, Crinipellis perniciosa, son fitopatógenos representativos que causan pérdidas económicas tanto en Brasil como en muchas otras áreas del mundo. Así mismo, este autor menciona que Alternaria alternata es un patógeno oportunista, el cual es responsable de provocar manchas foliares y marchites en más de 300 especies de plantas. Garibaldi et al. (2011), también encontró la presencia de Alternaria alternata en albahaca en Italia afectando hasta un 10% de plantas de 60 días de crecimiento, provocando lesiones de color marrón oscuro a marrón claro rodeadas por un halo amarillo desarrollado a partir de los márgenes y las puntas de las hojas más viejas que conducen a la defoliación progresiva de las plantas, rara vez seguida de la muerte de la planta. 7.2. Efecto antifúngico a nivel in vitro del extracto de J. cinereay las tres cepas bacterianas. 7.2.1. Extracto de J. cinerea vs. A. alternata El extracto de Lomboy, no presentó efecto de inhibición en el crecimiento micelial de A. alternata en ninguna de las 3 dosis evaluadas. La figura 18, muestra el desarrollo del hongo a través del tiempo de evaluación. Los resultados muestran que este tipo de planta, no presenta efectos antifúngicos contra el hongo evaluado o tal vez las dosis y el tipo de tejido 27 no fueron favorables, ya que su patrón de comportamiento fue similar o mayor que en el tratamiento testigo, el cual junto con el resto presentó 96 y 100% de crecimiento micelial a los 3 días después de la siembra. Mientras que en el caso del tratamiento con fungicida, se observó una clara inhibición del patógeno, donde solo se presentó un 36% de crecimiento micelial (Fig. 17). En el primer día se observó en el fungicida un 28% de crecimiento micelial del hongo en el medio de cultivo. Mientras que en el resto de los tratamientos, la respuesta de crecimiento fue similar, mostrando un 36% el agua, un 35% el etanol, un 34% la Dosis 1, un 36% la Dosis 2, y un 38% la Dosis 3. Para el segundo día se nota una diferencia significativa entre el fungicida y el resto de los tratamientos, donde se pudo notar, en el caso del fungicida un 32% de crecimiento del hongo en el medio de cultivo, y en la Dosis 2 tiene un 73%, en los otros tratamientos, tales como el etanol, Dosis 3, Dosis 1 y Agua mostraron un 66%,70%,68%,69%, respectivamente. Continuando con esta diferencia hasta el tercer día. Figura 17. Efecto in vitro del extracto de J. cinerea sobre el crecimiento de Alternaria alternata a través del tiempo. 28 Al tercer y último día de evaluación se observó que nuevamente el fungicida (36%) mostró una reducción marcada del crecimiento micelial de A. alternata a diferencia del resto de los tratamientos, donde el agua, el etanol y la Dosis 3 mostraron un 96% de crecimiento, mientras que la Dosis 1 un 93% y la Dosis 2 un 100% (Fig. 18). Figura 18. Efecto in vitro del extracto de J. cinerea sobre el crecimiento de A. alternata al 3er. día de evaluación. El extracto de J. cinerea, utilizado en este trabajo no tuvo una gran presencia de inhibición contra A. alternata, sin embargo por el contrario estimuló el crecimiento del patógeno (Figura 19). Bassey et al. (2013), evaluaron el extracto de Jatropha curcas contra Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus y Fusarium oxysporium a tres diferentes dosis (5.8 y 10%), donde obtuvo que el extracto al 10% presentó una inhibición desde 56 a 98% en los diferentes patógenos. Estos resultados muestran datos diferentes a los obtenidos en nuestro estudio, tal vez debido a que la especie de Lomboy fue diferente, así como los hongos evaluados. Por otro lado Stangarlin et al. (2011), evaluaron extractos de plantas medicinales tal como el eucalipto, neem, ajo, citronela, menta, ruda, jengibre, albahaca etc. Los patógenos evaluados fueron, Alternaria spp., Bipolaris spp., Crinipellis spp., Corynespora spp. y Colletotrichum spp., encontrando una variación en la 29 inhibición es decir unas controlaron en menor medida que otras. Esto debido tal vez, a las diversas concentraciones utilizadas. Figura 19. Extracto de J. cinerea contra A. alternata a 3 dosis y 120hrs 7.2.2 Cepas bacterianas vs. A. alternata En el bioensayo de microorganismos antagonistas contra Alternaria se observó que a las 24 horas, todos los tratamientos presentaron un crecimiento similar. Sin embargo a partir de las 30 48 horas se pudo determinar una pequeña diferencia entre el tratamiento control (37%) y B2 (33%), contra el resto de los tratamientos, los cuales estuvieron entre 45 y 57% (Fig. 20). Figura 20. Bioensayo de las tres cepas bacterianas contra A. alternata A partir de las 72 horas el crecimiento del control fue en un acenso constante hasta llegar a 96% de crecimiento fúngico. Mientras que el resto de los tratamientos no superó el 60% de crecimiento micelial hasta el último día de evaluación. Esto muestra la capacidad antagónica de las tres bacterias evaluadas, principalmente la B1 (51%) y B3 (49%) (Fig. 21). Figura 21. Porcentaje de crecimiento micelial de A. alternata contra cepas bacterianas 31 En la imagen de la figura 22, se puede observar que en la B1 y B3 el crecimiento micelial fue más marcado que en la B2, la cual al final de la evaluación tomó una forma cuadrada, mientras que las anteriores se presentaron de forma radial. En el caso del control como se menciona anteriormente, este fue constante en su crecimiento hasta llenar completamente la caja Petri. Figura 22. Evaluación in vitro de las tres cepas bacterianas contra A. alternata. De manera general, se puede observar que las tres bacterias presentaron una respuesta diferente en cuanto a la inhibición del patógeno. Dicha respuesta podría estar relacionada a posible variación de las especies presentes o a los compuestos que de manera particular cada una produce. Los resultados obtenidos en relación al porcentaje de inhibición, se asemejan a lo obtenido por Grata y Nabrdalik (2009), donde evaluaron una cepa bacteriana de tipo Bacillus contra Alternaria spp. Éstos evaluaron el efecto de la edad del cultivo en relación a su capacidad antagónica y determinaron que al incrementar la edad del cultivo bacteriano la inhibición se reduce, mostrando una inhibición del crecimiento de 12 al 80%. En su estudio, ellos concluyeron que las propiedades de Bacillus dependen de la edad del cultivo, especie de Bacillus, composición del medio, duración del experimento y susceptibilidad del hongo. 32 Así mismo, Siddig et al. (2012), evaluaron in vitro e in vivo los efectos antifúngicos de cuatro especies de Bacillus (B. subtilis, B. megaterium, B. pumilus and B. cereus) obtenidos de la rizósfera de tomate contra Alternaria alternata. Sus resultados mostraron que la tasa de crecimiento del hongo siempre fue menor cuando fue tratado con algunos de los cuatro Bacillus en comparación con los controles. El potencial de Bacillus spp. para sintetizar una amplia variedad de metabolitos con actividad antifúngica es bien conocida y en años recientes ha sido sujeto de varias investigaciones (Ahimou et al., 2000). La mayoría de estas sustancias está relacionada a los lipopéptidos, especialmente de surfactina, iturna y diferentes clases de fengicina. Los antibióticos del grupo de las iturinas fueron encontrados a actuar sobre los esteroles presentes en la membrana citoplasmática del hongo e inhibir la biosíntesis de ergoesterol, de ahí el control del desarrollo del hongo y la muerte de los patógenos (Worthington, 1988; Basamma y Shripad, 2016). 7.3. Efecto in vivo del extracto de J. cinerea y cepas bacterianas sobre A. alternata 7.3.1. Extracto de J. cinerea contra A. alternata En la siguiente figura (23), se puede observar que el tratamiento, extracto de J. cinerea sobre Alternaria alternata en hojas de Albahaca, mostro un halo necrótico de 0.76cm de diámetro, mientras que solo Alternaria alternata inoculada en la hoja de albahaca, presentó un halo de 0.42cm de diámetro, en este caso con una respuesta de crecimiento menor del hongo que el tratamiento anterior. Dejando ver que el extracto de Jatropha cinera no mostro evidencia de inhibición del hongo A. alternata sobre hojas de albahaca, más bien promovió el crecimiento del micelio. Figura 23. Efecto in vivo del extracto de J. cinerea sobre A. alternata 33 La siguiente figura (24), muestra el crecimiento de Alternaría en las hojas de albahaca en los tres tratamientos. En el primer tratamiento (Extracto de J. cinerea + Alternaria), se puede observar tanto en el haz como en el envés de la hoja, un crecimiento significativo del halo necrótico provocadopor el hongo, producido en la mayor parte de la hoja. En el segundo tratamiento (solo Alternaría), tanto en el haz como en el envés de la hoja, se observa un diámetro de crecimiento menor el cual no cubre la superficie, Cabe señalar que en los dos primeros tratamientos, a pesar de las diferencias en cuanto al daño de necrosis, en ambos se presentó un 100% de incidencia del patógeno. Figura 24. Bioensayo in vivo del extracto de J. cinerea sobre A. alternata en el haz y envés de las hojas de albahaca. A) Haz de la hoja de albahaca con extracto y Alternaria, A1) envés de la hoja, B) haz de la hoja de albahaca con A. alternata, B1) envés de la hoja. Estos resultados muestran la variación de la respuesta de esta especie de Jatropha en relación a la poca efectividad sobre la inhibición del patógeno evaluado, comparado con otros estudios realizados. Debido tal vez, a que los principios activos de este tipo de plantas no se encuentran precisamente en la hoja, sino en otros tejidos y el patógena no muestra susceptibilidad frente a estos compuestos. Tal es el caso del experimento realizado por Gaikwad et al. (2012), donde evaluaron extractos derivados de hoja, tallo, raíz, látex y aceite de varias especies de Jatropha tales como, Jatropha curcas, J. glandulufera, J. integerrima y J. gossypofolia, para determinar su efecto contra un complejo de bacterias y hongos 34 fitopatogenos, como; Alternaria alternata, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, y Rhizoctonia solani. Así como las bacterias Erwinia carotovora pv. Carotovora, Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas campestris pv. Citri y Xanthomonas campestris pv. Mangiferae indicae. Donde sus resultados mostraron un grado considerable de variación sobre la actividad antifungica de las diferentes partes de las plantas de Jatropha. 7.3.2. Cepas bacterianas contra A. alternata Los resultados mostrados en el bioensayo in vivo sobre las bacterias antagonistas contra A. alternata, muestran que el efecto antagónico de las bacterias no fue el esperado, ya que las bacterias B1 y B2 no presentaron la inhibición deseada sobre el patógeno. Su respuesta a nivel in vivo fue diferente al resultado obtenido a nivel in vitro, donde se pudo observar que las tres cepas bacterianas redujeron significativamente el crecimiento del hongo. En el caso de la evaluación en las hojas de albahaca se observó que ninguna bacteria redujo el efecto de necrosis sobre el tejido. En la gráfica 25, se puede apreciar que la bacteria 1 (B1) no inhibió el desarrollo de A. alternata permitiendo un crecimiento del halo necrótico de 0.5cm de diámetro, en el caso del tratamiento con la bacteria 2 (B2) mostro un reducido control contra el patógeno, generando este un mayor daño en el tejido, siendo el halo (0.7cm), no así la bacteria 3 (B3), quien presentó una mayor inhibición con respecto a los otros tratamientos bacterianos, presentando un menor diámetro en el halo necrótico (3.8). En el caso del tratamiento control, el cual solo se sembró A. alternata sin los microorganismos antagonistas, se observó un crecimiento de 0.4 cm, es decir menor que las dos primeras bacterias antagonistas. Figura 25. Bioensayo in vivo de cepas bacterianas contra A. alternata 35 La Figura 26, muestra el resultado obtenido del bioensayo in vivo del crecimiento de A. alternata en las hojas de albahaca con las tres bacterias evaluadas. En éste, se puede observar que la bacteria B2, mostró poco efecto de inhibición contra A. alternata, donde se observa que en el hongo genero un mayor daño de necrosis en el tejido del haz de la hoja. En el caso de la bacteria B1, aunque la incidencia del hongo fue menor, también se mostró una inhibición limitada del patógeno. Mientras que la bacteria 3 (B3), el daño de A. alternata disminuyó, mostrando un diámetro menor en el halo de necrosis foliar. Figura 26. Bioensayo in vivo de antagonistas contra A. alternata. A, B y C) Haz de la hoja de albahaca con las bacterias B1, B2, B3 respectivamente. D) Control de A. alternata. La diferencia de la respuesta de las tres cepas bacterianas, tanto a nivel in vivo como in vitro, proporciona información relevante respecto a la reacción de estos microorganismos cuando se establecen en diferentes tipos de sustratos. La nula respuesta de inhibición del patógeno en las hojas de albahaca, demuestra y coincide con lo señalado por Leifert et al. (1995), los cuales evaluaron la producción de antibióticos y la actividad de biocontrol de Bacillus subtilis y Bacillus puminlis contra Alternaria brassicicola y Botrytis cinérea, y encontraron que la producción de antibióticos por los dos tipos de Bacillus dependió del sustrato en que éstos fueron desarrollados. Así mismo se determinó que la actividad antibiótica encontrada dependió de la concentración y el pH del medio. La producción de antibióticos se indicó claramente como el modo de acción del control biológico in vivo por las diferentes cepas bacterianas contra los patógenos evaluados, debido a que una cepa mutante negativa de antibiótico no mostró actividad en bioensayos de plántulas in vivo. 36 En relación a las diferentes bacterias utilizadas, se observó que aunque éstas no mostraron una inhibición considerable en el patógeno, la respuesta entre éstas varió, mostrando que en la combinación de A. alternata con la B3, redujo más el daño de necrosis foliar provocado por el patógeno, respecto a la B1 y B2, lo que demuestra la variabilidad en la actividad microbiana de los microorganismos evaluados. Estos resultados coinciden con lo obtenido por Mitoi et al. (2012), al evaluar dos especies de bacterias; Bacillus licheniformis y Pseudomonas aeruginosa contra A. alternata, encontrando que P. aeruginosa tendió a adherirse a lo largo de la hifa, mientras que Bacillus formo agrupados alrededor de la misma. Además en la interacción con Bacillus, las células fúngicas liberaron gránulos electrodensos o vesículas con contenido fibrilar. Mientras que en la presencia de P. aeruginosa las paredes celulares del hongo fueron recubiertos por una red de microfilamentos y fibrillas. La mayoría de las células fúngicas tienen paredes celulares corrugadas, muy gruesas y muy melanificadas, características de las esporas y son separadas espacialmente por bacilos. En la interacción con Pseudomonas, las células fúngicas estaban rodeadas por bacterias y presentaban desprendimiento de las membranas plasmáticas, coalescencia del citoplasma y degradación del sistema de membrana intracelular. La destrucción y desorganización del contenido celular en hifas y conidios también se observó en la última etapa del cultivó con bacilos. Los resultados indican que los dos tipos de bacterias tienen diferentes mecanismos de acción contra el hongo patógeno evaluado. 37 VIII. CONCLUSIONES - Se identificó que Alternaria alternata fue el causante de la mancha foliar en albahaca. Este patógeno se ha reportado a nivel mundial como uno de los que comúnmente dañan el cultivo de la albahaca. - La bacteria 3, presentó mayor inhibición contra Alternaria alternata in vitro e in vivo. Esto demuestra que algunos microorganismos pueden responder de manera diferencial en diferentes tipos de sustratos lo que conduce a que se lleven a cabo estudios más profundos y variados al respecto. - El extracto de J. cinerea no presentó inhibición contra Alternaria alternata tanto in vitro como in vivo. Por el contrario éste estímulo más su crecimiento, debido tal vez al alto índice de azúcares que pudiera contener el tejido de este tipo de plantas. 38 IX. RECOMENDACIONES Las bacterias evaluadas presentaron una respuesta interesante durante la interacción con A.