Atividade Antimicrobiana de Fungos

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Louse Olivares

1/5/2024

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CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE HONGOS DE LA FAMILIA
Tricholomataceae FRENTE A AGENTES CAUSALES DE
DERMATOMICOSIS EN ANIMALES

LUIS DANIEL PRADA SALCEDO
PABLO VEGA VASQUEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C
Abril de 2008
ii

CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE HONGOS DE LA FAMILIA
Tricholomataceae FRENTE A AGENTES CAUSALES DE
DERMATOMICOSIS EN ANIMALES

LUIS DANIEL PRADA SALCEDO
PABLO VEGA VASQUEZ

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de

Microbióloga Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C
Abril de 2008

iii

NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los
conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de
tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las
tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar
la verdad y la justicia”.

iv
ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE HONGOS DE LA
FAMILIA Tricholomataceae FRENTE A AGENTES CAUSALES DE
DERMATOMICOSIS EN ANIMALES

LUIS DANIEL PRADA SALCEDO
PABLO VEGA VASQUEZ

APROBADO

________________________
Maria Ximena Rodriguez Ph. D
Directora

_______________________ ________________________
Melba linares Bacteriologa Claudia Cifuentes MS.c
Jurado Jurado

v
ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE HONGOS DE LA
FAMILIA Tricholomataceae FRENTE A AGENTES CAUSALES DE
DERMATOMICOSIS EN ANIMALES

LUIS DANIEL PRADA SALCEDO
PABLO VEGA VASQUEZ

APROBADO

Ingrid Schuler, Ph. D Janeth Arias Palacios, M.Sc-M.Ed
Decana Académica Directora Carreras de Microbiología
Facultad de Ciencias

Este trabajo de grado lo dedicamos a nuestros padres y hermanos
por apoyarnos y estar siempre a de nuestro lado para ayudarnos.
a Dios por protejernos y no desampararnos especiamente
en las salidas de campo

Luis Daniel Prada Salcedo
Pablo Vega Vasquez

vii
AGRADECIMIENTOS

A la Unidad de Investigaciones Agropecuarias (UNIDIA) de la Pontificia Universidad
Javeriana que permitió el desarrollo de este proyecto.

A Maria Ximena Rodriguez por ser la directora de tesis más adecuada para guiarnos en este
proyecto, ademas brindarnos apoyo y confianza, haciendo de ella una directora de
investigación tanto teorica como practica.

A Claudia Parra por su paciencia y todas las enseñanazas recibidas de ella para la
realización del proyecto.

A Jorge Robles y Amanda varela por su asesoria.

A la Profe Marcela Franco por estar simpre dispuesta a colaborarnos y resolvernos dudas.

A toda la gente de monitoria, lavado de material y obviamente a Inesita.

A nuestros compañeros de (UNIDIA) Ivan, Lina, William, Critian, Angelica y toda la nueva
promocion, Carolinas, Ruth, Susana, Diana … por su acompañamiento, colaboración y
aporte incondicional al este proyecto.

A nuestros amigos y familiares que estuvieron con nosotras dándonos su apoyo
constante…Y a los que nos faltó mencionar, pero que de una u otra forma, hicieron posible
que este proyecto, hoy sea una realidad!

viii
TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………...1
2. MARCO TEORICO…………………………………………………3
2.1 HONGOS MACROMICETOS COMO FUENTE DE COMPUESTOS
ACTIVOS...............................................................................................3
2.1.1 Diversidad biológica de los hongos …………………………….3
2.1.2 Generalidades de las setas, hongos macromicetos………….8
2.1.3 De la división Basidiomycota a la familia
Tricholomataceae…….………………………………………………….12
2.1.4 Aplicaciones de los metabolitos secundarios de
macromicetos……………….……………………………………………22
2.2 HONGOS CAUSANTES DE MICOSIS: Dermatofitos y Fusarium
sp………………………………………………………………………….26
2.2.1 Micosis en animales………………………………………………26
2.2.2 Tratamiento de hongos dermatofitos y Fusarium sp
causantes de micosis…………………………………………………...29
2.3 METODOLOGÍAS PARA LA EVALUACIÓN DE METABOLITOS
BIOACTIVOS…………………………………………………………..…..31
3. JUSTIFICACION……………………………………………...…..36
4. OBJETIVOS……………………………………………………….38
4.1 OBJETIVO GENERAL…………………………………………………...38
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS…………………………………………….38
5. METODOLOGIA…………..………………………………………39
5.1 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DE LA FAMILIA
Tricholomataceae EN CUNDINAMARCA………………………………...40
5.2 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE CUERPOS
FRUCTÍFEROS……………………………………………………………….40
5.3 OBTENCIÓN DE FRACCIONES DEL EXTRACTO CRUDO……….42

ix
5.4 IDENTIFICACIÓN DE GRUPOS FUNCIONALES DE LOS
EXTRACTOS ETANÓLICOS Y FRACCIONES…………………………..42
5.4.1 Pruebas químicas preliminares……………………………….42
5.4.1.1 Terpenoides (Lactonas y Sesquiterpenlactonas)………43
5.4.1.2 Cumarinas………………………………………………….43
5.4.1.3 Quinonas……………………………………………………44
5.4.1.4 Saponinas………………………………………………….44
5.4.1.5 Flavonoides………………………………………………..44
5.4.1.6 Glicósidos…………………………………………………..44
5.4.2 Cromatografía en capa delgada (TLC)……………………….45
5.5. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA, EVALUADA MEDIANTE
ENSAYOS EN PLACA CON LOS GENEROS Trichophyton,
Microsporum Y Fusarium………………………………………………….47
5.5.1 Medios, incubación de las cepas e inducción de
conidiacion………………………………………………………………47
5.5.2. Actividad antifúngica frente a dermatofitos………………..48
5.5.3. Actividad antifúngica frente a Fusarium sp………………..51
5.6 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA POR
BIOAUTOGRAFÍA……………………………………………………………52
6. RESULTADOS……..……………………………………………..53
6.1 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DE LA FAMILIA
Tricholomataceae EN CUNDINAMARCA………………………………..53
6.2 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANÓLICOS Y SUS
RESPECTIVAS FRACCIONES DE CUERPOS FRUCTÍFEROS………..56
6.3 IDENTIFICACIÓN DE GRUPOS FUNCIONALES DE LOS
EXTRACTOS CRUDOS ETANÓLICOS Y FRACCIONES……………….58
6.3.1 Resultados pruebas químicas preliminares………………..58
6.3.2 cromatografía en capa delgada (TLC)………………………..61
6.4. ENSAYOS CON HONGOS DERMATOFITOS DE LOS GÉNEROS
Trichophyton y Microsporum y Fusarium………………………………70
x
6.4.1 Evaluación de actividad antifúngica de anfotericina B y
extractos de macromicetos frente a hongos dermatofitos.........74
6.4.2. Evaluación de actividad antifúngica de extractos de
macromicetos frente a Fusarium……………………………………78
6.4.3 Evaluación de actividad antifúngica de los extractos de
macromicetos por bioautografía ……………………………………93
7. ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS……………….100
7.1 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DE LA FAMILIA
Tricholomataceae…………………………………………………………100
7.2 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANÓLICOS Y SUS
RESPECTIVAS FRACCIONES DE CUERPOS FRUCTÍFEROS………107
7.3 IDENTIFICACIÓN DE GRUPOS FUNCIONALES DE LOS
EXTRACTOS CRUDOS ETANÓLICOS Y FRACCIONES……………...1087.3.1 Resultados pruebas químicas preliminaries………………108
7.3.2 cromatografía en capa delgada (TLC)………………………110
7.4 BIOENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE EXTRACTOS DE
MACROMICETOS FRENTE A DERMATOFITOS ………………………115
7.5 BIOENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE EXTRACTOS DE
MACROMICETOS FRENTE A Fusarium sp. AGENTE CAUSAL DE
DERMATOMICOSIS………………………………………………………...119
7.6 METABOLITOS SECUNDARIOS CON ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA
HALLADOS EN LOS CUERPOS FRUCTÍFEROS……………………...123
7.7 MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS METABOLITOS
SECUNDARIOS……………………………………………………………..129
8. CONCLUSIONES………………………………………………..134
9. RECOMENDACIONES………………………………………….136
10. REFERENCIAS…………………………………………………138
11. ANEXOS……………………………………………………...…149
11.1 FORMATOS DE CAMPO PARA RECOLECCION DE HONGOS
xi
BASIDIOMICETES.................................................................................149
11.2 CARACTERÍSTICAS DE LOS DERMATOFITOS…………………150
11.3 DESCRICION CEPAS HAYADAS EN CAMPO Y SUS POSIBLES
GENEROS……………………………………………………………………153
11.4 DIAGRAMA DE FLUJO DEL FRACIONAMIENTO LIQUIDO-
LIQUIDO……………………………………………………………………..161
11.5 CROMATOGRAFIAS CON REVELADORES……………………..162
11.6 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS USADOS EN EL
TRABAJO DE GRADO…………………………………………………….183
11.7 HOJAS DE VIDA DE LAS CEPAS USADAS …………………….187
11.7.1 Dermatofitos…………………………………………………...187
11.7.2 Cepas de Fusarium sp……………………………………….192
11.8 MORFOLOGÍA DE AGARICALES, BOLETALES Y ALGUNOS
POLYPORALES……………………………………………………………196

xii
INDICE DE FIGURAS

Figura 2.1 Diversidad reino fungi................................................................4
Figura 2.2 Diversidad reino fungi……………………………………………. .4
Figura 2.3. Desarrollo de un basidio típico…………………………………..6
Figura 2.4 Ciclo de vida de la división Basidiomycota……………………...7
Figura 2.5. Esquema de basidiomas………………………………………..11
Figura 2.6. Ubicación y conformación del basidioma……………………..11
Figura 2.7. Rutas metabólicas de síntesis de algunos metabolitos
secundarios producidos por hongos y plantas……………………………..24
Figura 2.8. Macroconidias de Microsporum sp.........................................28
Figura 2.9. Estructura de la anfotericina B………………………………….30
Figura 5.1 diagrama de flujo metodología general………………………...39
Figura 5.2 Filtración tras 48 horas de agitación y rota evaporación
extractos………………………………………………………………………...41
Figura 5.3 diagrama de flujo preparación extracto etanòlico……………..41
Figura 5.4 metodología prueba anfotericina B……………………………..49
Figura 6.1.1 División Política Cundinamarca……………………………….53
Figura 6.1.2 Municipios muestreados en Cundinamarca…………………54
Figura 6.2 Laccaria sp. tras el proceso de secado………………………..56
Figura 6.3 Fraccionamiento extracto crudo………………………………...57
Figura 6.4 Fracciones tras el proceso de lavado con solventes…………57
Figura 6.5 Cromatografía de capa delgada de los diferentes extractos y
fracciones……………………………………………………………………….65
Figura 6.6.1 Crecimiento Microsporum cookei en diferentes medios de cultivo
(PDA y MH, Mueller Hinton) y temperaturas………………………..70
Figura 6.6.2 Crecimiento Microsporum canis en diferentes medios de cultivo
(PDA y MH, Mueller Hinton) y temperatura…………………………71
Figura 6.6.3 Crecimiento Microsporum gypseum en diferentes medios de
cultivo (PDA y MH, Mueller Hinton) y temperaturas………………………..71
Figura 6.6.4 Crecimiento Trichopyton rubrum en diferentes medios de cultivo
(PDA y MH, Mueller Hinton) y temperaturas………………………..72
Figura 6.6.5 Crecimiento Trichophyton mentagrophytes en diferentes medios
de cultivo (PDA y MH, Mueller Hinton) y temperaturas…………..72
Figura 6.7 Diferencias macroscópicas de M. gypseum en medio PDA y agar
avena ……………………………………………………………………..73
Figura 6.8 Microscopia M. canis en medio avena…………………………74
Figura 6.9 Clasificación de la actividad de los extractos de macromicetos
sobre los dermatofitos…………………………………………………………75
Figura 6.11 Crecimiento de Fusarium sp. sin influencia de extractos de
macromicetos…………………………………………………………………..79
Figura 6.12 Efecto de las fracciones de Cheimonophyllum sobre Fusarium
sp. ……………………………………………………………………………….79
xiii
Figura 6.13.1 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 108 frente a las fracciones
de Laccaria sp……………………………………………………82
Figura 6.13.2 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 121 frente a las fracciones
de Laccaria sp……………………………………………………83
Figura 6.13.3 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 155 frente a las fracciones
de Laccaria sp……………………………………………………83
Figura 6.13.4 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 160 frente a las fracciones
de Laccaria sp……………………………………………………84
Figura 6.13.5 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 108 frente a las fracciones
de Clitocybe sp…………………………………………………...84
Figura 6.13.6 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 121 frente a las fracciones
de Clitocybe sp……………………………………………………85
Figura 6.13.7 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 155 frente a las fracciones
de Clitocybe sp…………………………………………………….85
Figura 6.13.8 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 160 frente a las fracciones
de Clitocybe sp…………………………………………………….86
Figura 6.13.9 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 108 frente a las fracciones
de L. edodes…………………………………………………........86
Figura 6.13.10 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 121 frente a las fracciones
de L. edodes……………………………………………………….87
Figura 6.13.11 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 155 frente a las fracciones
de L. edodes……………………………………………………….87
Figura 6.13.12 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 160 frente a las fracciones
de L. edodes……………………………………………………….88
Figura 6.13.13 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 108 frente a las fracciones
de Cheimonophyllum sp………………………………………….88
Figura 6.13.14 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 121 frente a las fracciones
de Cheimonophyllum sp………………………………………….89
Figura 6.13.15 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 155 frente a las fracciones
de Cheimonophyllum sp………………………………………….89
Figura 6.13.16 Crecimiento de Fusarium sp. cepa 160 frente a las fracciones
de Cheimonophyllum sp………………………………………….90
Figura 6.14.1 Crecimiento (área bajo la curva) de las cepas de Fusarium sp.
Frente a la fracción de éter de petróleo y extracto crudo de Laccaria sp.
……………………………………………………………………………….90
Figura 6.14.2 Crecimiento (área bajo la curva) de las cepas de Fusarium sp.
Frente a la fracción de éter de petróleo y extracto crudo de Clitocybe
sp..……………………………………………………………………………….91
Figura 6.14.3 Crecimiento (área bajo la curva) de las cepas de Fusarium sp.
frente a la fracción de éter de petróleo y extracto crudo de Lentinula
edodes…………………………………………………………………………91
Figura 6.14.4 Crecimiento (área bajo la curva) de las cepas de Fusarium sp.
frente a la fracción de éter de petróleo y extracto crudo de Cheimonophyllum
sp…………………………………………………………..92
xiv
Figura 6.14.5 Crecimiento (área bajo la curva) de las cepas de Fusarium sp.
frente a la fracción de éter de petróleo………………………………….92
Figura 6.15 Asperción de la suspensión de conidios sobre cromatogramas
para montaje de bioautografía…………………………….93
Figura 6.16.1 Bioautografía de extractos de Laccaria sp. versus cepas de
Fusarium………………………………………………………………………..98
Figura 6.16.2 Bioautografía de extractos de Clitocybe sp. versus cepas de
Fusarium……………………………………………………………………..…98
Figura 6.16.3 Bioautografía de extractos de L. edodes versus cepas de
Fusarium……………………………………………………………………......99
Figura 6. 16.4 Bioautografía de extractos de Cheimonophyllum sp. versus
cepas de Fusarium…………………………………………………………..99
Figura 7.1 Compuestos precursores de la síntesis de terpenoides……125

xv
INDICE DE TABLAS

Tabla 2.1. Algunos géneros de hongos de la familia Tricholomataceae
reportados en Colombia……………………....................................................15Tabla 2.2. Productos bioactivos de origen microbiano de naturaleza no
antibiótica……………………………………………………………………….….23
Tabla 2.3. Compuestos producidos por basidiomicetos con antividad
antimicrobiana……………………………………………………………………..26
Tabla 5.1 Reveladores utilizados para evidenciar grupos funcionales……...46
Tabla 6.1 Características de las fracciones de los macromicetos…………...58
Tabla 6.2.1 Resultados pruebas preliminares para saponinas……………....58
Tabla 6.2.2 Resultados pruebas preliminares para quinonas………………..59
Tabla 6.2.3 Resultados pruebas preliminares para cumarinas………….…...59
Tabla 6.2.4 Resultados pruebas preliminares para flavonoides……………..60
Tabla 6.2.5 Resultados pruebas preliminares para glucósidos………………60
Tabla 6.2.6 Resultados pruebas preliminares para terpenos………………...61
Tabla 6.3 Solventes ensayados para los corridos cromatográficos………....62
Tabla 6.4.1 Bandas características del grupo funcional, evidenciado por los
reveladores de las fracciones de Laccaria sp………………………..……..….65
Tabla 6.4.2 Bandas características del grupo funcional, evidenciado por los
reveladores de las fracciones de Clitocybe sp…………………………….…...66
Tabla 6.4.3 Bandas características del grupo funcional, evidenciado por los
reveladores de las fracciones de L.edodes…………………………….………67
Tabla 6.4.4 Bandas características del grupo funcional, evidenciado por los
reveladores de las fracciones de Cheimonophyllum sp……………………….68
Tabla 6.5.1 Actividad Anfotericiana B frente a dermatofitos y Candida
parapsilopsis…………………………………………………………………….…75
Tabla 6.5.2 Actividad de fracciones de Laccaria sp frente a
dermatofitos…………………………………………………………………….….76
xvi
Tabla 6.5.3 Actividad de fracciones de Clitocybe frente a
dermatofitos…………………………………………………………………….….77
Tabla 6.5.4 Actividad de fracciones de L. edodes frente a
dermatofitos………………………………………………………………….…….77
Tabla 6.6.1 Crecimiento (área bajo la curva) de Fusarium frente a extractos
de Laccaria sp. (Valor F por ANOVA y agrupamientos por prueba de
Duncan)…………………………………………………………………………….80
Tabla 6.6. 2 Crecimiento (área bajo la curva) de Fusarium frente a extractos
de Clitocybe sp, (Valor F por ANOVA y agrupamientos por prueba de
Duncan)……………….……………………………………………………………80
Tabla 6.6.3 Crecimiento (área bajo la curva) de Fusarium frente a extractos
de L. edodes (Valor F por ANOVA y agrupamientos por prueba de
Duncan)…………………………………………………………………………....80
Tabla 6.6. 4 Crecimiento (área bajo la curva) de Fusarium frente a extractos
de Cheimonophyllum sp. (Valor F por ANOVA y agrupamientos por prueba
de Duncan) ………………………………………………………………………..81
Tabla 6.7 Porcentajes de inhibición de crecimiento micelial de Fusarium
frente a los extractos de macromicetos………………………………………...81
Tabla 6.8 Porcentajes de inhibición de crecimiento micelial de Fusarium
frente a solventes…………………………………………………………………82
Tabla 6.9.1 RF´s y posibles metabolitos de Laccaria sp, involucrados en la
zona de actividad contra las cepas de Fusarium spp………………………....94
Tabla 6.9.2 RF´s y posibles metabolitos de Clitocybe sp, involucrados en la
zona de actividad contra las cepas de Fusarium spp……………………........95
Tabla 6.9.3 RF´s y posibles metabolitos de L. edodes, involucrados en la
zona de actividad contra las cepas de Fusarium spp………………………....96
Tabla 6.9.4 RF´s y posibles metabolitos de Cheimonophyllum sp,
involucrados en la zona de actividad contra las cepas de Fusarium spp…...97
Tabla 7.1 Metabolitos a partir de hongos de la familia
Tricholomataceae…………………………………………………………….…..127
Tabla 7.2 Factores de trascripción que regulan y/o interactúan con los genes
de la ruta biosintética de fenilpropanoides, potencialmente involucrados en
mecanismos de defensa………………………………………………………...124
Tabla 7.3 Terpenoides oxigenados con actividad antimicrobiana contra
hongos filamentosos y levaduriformes…………………………………………131

xvii
CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE HONGOS DE LA FAMILIA
Tricholomataceae FRENTE A AGENTES CAUSALES DE
DERMATOMICOSIS EN ANIMALES

La potencial actividad antimicrobiana de cuatro diferentes extractos
etanólicos de cuerpos fructíferos de la familia Tricholomataceae, contra
algunos agentes causantes de dermatomicosis aislados de ganado, fue
evaluada. Tres de los especímenes colectados en campo, fueron
taxonómicamente correlacionados con especies de los géneros Laccaria,
Clitocybe y Cheimonophyllum, respectivamente. Una cepa comercialmente
disponible de Lentinula edodes fue investigada también. Las fracciones
etanolicas fueron fraccionadas usando tres solventes de diferente polaridad,
con el fin de determinar posibles efectos de sinergismo o sobrelapamiento en
la bioactividad de los metabolitos secundarios presentes en los extractos.
Nuestros resultados demostraron, mediante técnicas de difusión en placa
modificada, y bioautografía, un efecto inhibitorio producido por las fracciones
crudas y etéreas contra los hongos causantes de dermatomicosis
enfrentados. La cromatografía en capa delgada permitió determinar que la
actividad antifúngica detectada está asociada a la presencia de compuestos
tipo terpenoide y cumarina en los especímenes estudiados. La significativa
inhibición de crecimiento fúngico producido por la fracción etérea, tal vez sea
debido a la naturaleza hidrofóbica de estos compuestos, permitiendo
interactuar con la membrana celular de los hongos causantes de
dermatomicosis. Especificamente, las fracciones etéreas de Laccaria sp,
Clitocybe sp, Cheimonophyllum sp y L. edodes demostraron unos
porcentajes de inhibición de valores superiores al 25% contra cepas del
genero Fusarium sp.

xviii
Palabras clave: Dermatomicosis, Metabolitos secundarios, Tricholomataceae,
Antifúngica.

CHARACTERIZATION AND EVALUATION OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY
FROM TRICHOLOMATACEAE FRUITING BODY’S ETHANOLIC
EXTRACTS AGAINST DERMATOLOGICAL PATHOGENIC AGENTS IN
ANIMALS

The potential antimicrobial activity of four different Tricholomataceae fruiting
bodies ethanolic extracts, against dermathological pathogenic agents
Trichophyton spp, Microsporum spp and Fusarium spp, isolated from cattle,
were investigated. Three of the specimens were collected from several
natural environments located at the Cundinamarca region of Colombia, which
were taxonomically correlated whit Laccaria, Clitocybe and Cheimonophyllum
genera. A commercially available strain of Lentinula edodes was investigated
as well. The ethanolic fractions were fractioned by using three non pollar
organic solvents, in order to determine any possible synergistic or overlapping
bioactivity effects between the secondary metabolites presents into the
ethanolic extracts. Our results demonstrated, via modificated agar-diffusion
and bioautographyc methods, an inhibitory effect produced by the crude
etanolic and ehtereus fractions, against dermathological pathogenic fungy
challenged. Thin layer chromatography method, allowed to determine the
presence of terpenoid like, and coumarin like coumponds produced by every
single Tricholomataceae specimen evaluated in this study, which were
present into the ethereus and crude fractions, to be responsible for the
antifungal bioactivity against dermathological pathogenic agents. The
significative fungal growth inhibition activity produced by the ethereus fraction,
may be was due to the high affinity of the mayor portion of the secondary
metabolites to this solvent, what indicates the hidrophobic nature of those
compounds, which may belong to the fruiting bodie´s essential oils portion.
xix
Specifically, Laccaria sp, Clitocybe sp, Cheimonophyllum sp and L. edodes,
demostrate higher percentages of inhibition at 25 % against strain of
Fusarium sp.

Key words: Dermatomicosis, secondary metabolism, Tricholomataceae,
Antifungal

xx
1
1.INTRODUCCIÓN

Colombia, debido a su ubicación geográfica, variedad climática y diversidad
en su vegetación, ha facilitado el desarrollo de gran diversidad de hongos
macromicetos. La región Andina, y en especial el altiplano cundiboyacense,
favorece el desarrollo de dichos hongos debido a factores como la humedad,
tasa fluvial, presencia de bosques y un rango de temperatura que oscila entre
los 10 y 25ºC. Sin embargo, no se reportan investigaciones realizadas en
Colombia en cuanto al uso de hongos macromicetos o sus metabolitos, como
herramienta de tratamiento basada en sus propiedades antimicrobianas.

En Colombia, como en todo el mundo, se han reportado micosis, lesiones en
la dermis causadas por hongos dermatofitos y algunas especies de
Fusarium, debido a su capacidad queratinolítica. Las micosis, hoy día, son
consideradas un problema sanitario de alcance mayor por ser una patología
zoonótica y oportunista. Los tratamientos existentes para esta patología
aunque son de uso exfoliante, tópico o sistémico, no han sido diseñados
específicamente para animales, presentando un costo alto por su
adquisición. Desde este punto de vista, se hace necesario investigaciones
que presenten nuevas alternativas de tratamiento, con el fin de plantear
soluciones que resuelvan el problema de manera específica para animales.

Por otro lado, existe literatura que reporta la existencia de algunos hongos
macromicetos con capacidad de sintetizar compuestos con actividad
antimicrobiana y antitumoral, lo que supone un potencial para el desarrollo de
nuevas alternativas para combatir las micosis en animales, volcándose así la
atención sobre este grupo de hongos como herramienta de interés para la
potencial solución a esta problemática.

2
Específicamente, este trabajo se enfoca en la búsqueda de hongos
pertenecientes a la familia Tricholomataceae, debido a la gran cantidad de
géneros pertenecientes a esta familia reportados por Franco, calle y Uribe en
el 2000 y paralelo a esto los reportes de autores como Brizuela en 1998,
donde menciona géneros como Pleurotus, Marasmius, y Clitocybe, con
actividad antimicrobiana y antiviral. Esto conlleva a implementar una
estrategia que permita evidenciar la presencia de metabolitos con potencial
actividad biológica frente a cepas de dermatofitos y Fusarium sp. aisladas de
dermatomicosis en animales.

3
2. MARCO TEORICO

2.1 HONGOS MACROMICETOS COMO FUENTE DE COMPUESTOS
ACTIVOS

2.1.1 Diversidad biológica de los hongos

Debido a los nuevos avances tecnológicos, la taxonomía del reino fungi está
en constante cambio, por las clasificaciones a través de pruebas
bioquímicas, genéticas y de biología molecular (Moore, 1996); la mayoría de
autores reconocen principalmente las divisiones Chytridiomycota,
Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota, (figura 2.1). Schüßler y
colaboradores (2001) definieron una nueva división taxonómica para el reino
fungi basados en análisis filogenéticos sobre secuencias del DNA del la
subunidad pequeña del ARN ribosomal (SSU rRNA) (figura 2.2). A esta
nueva división taxonómica pertenecen los hongos formadores de micorrizas
arbusculares, clasificados anteriormente en la división Zygomycota. Aun se
nombra la división Deuteromycota, que incluye a los hongos que no
presentan fase de reproducción sexual, sin embargo algunos autores
consideran que esta división no es una categoría taxonómica formal debido a
que los términos anamorfo o mitospórico se utilizan para referirse a hongos
cuya fase sexual es desconocida (Franco et al., 2005).

Figura 2.1 Diversidad reino fungi
Fuente: http://mail.fq.edu.uy/~microbio/MGral/T2005/hongos7.pdf

Figura 2.2 Diversidad reino fungi.
Fuente: Burns, 2006

La división Chitridiomycota es considerada como el grupo de los hongos
primitivos. La pared celular de estos hongos se constituye de quitina y ß-
glucano, son unicelulares o compuestos por un micelio rudimentario formado
por hifas no septadas. La reproducción sexual se da por gametos móviles
llamados zoosporas, o por la unión de una espora sin movimiento u oospora
y una zoospora; pueden vivir en materia orgánica viva o muerta (Franco,
2005; Moore, 1996). Los Zygomycota se reproducen sexualmente por la
fusión de gametangios y la posterior formación de una zigospora de pared
celular gruesa; sus hifas son cenociticas o no septadas y multinucleadas, la
clase de los zygomycetes son generalmente saprófitos y parasíticos de una
gran variedad de hospedadores; algunos pueden llegar a ser comensalistas
en los intestinos de artrópodos (Moore, 1996). Asi mismo, es posible
encontrar entre la clasificación taxonómica dos divisiones caracterizadas por
su capacidad de formar estructuras macroscópicas conocidas como
ascocarpos y basidiocarpos. En la división Ascomycota las cepas
compatibles se fusionan de diferentes formas, realizándose una union de
núcleos compatibles, las esporas sexuales o ascosporas, se producen en un
número de ocho o múltiplos de ocho, debido a una mitosis post-meiótica,
dentro de células especializadas en forma de saco llamados ascos. Los
cuerpos fructíferos de los ascomycetes presentan una gran diversidad de
formas, tales como apotecio, peritecio, cleistotecio y ascostroma (Moore,
1996).

Los hongos que pertenecen a la división Basidiomycota se caracterizan
porque las esporas sexuales (basidiosporas), tras haber sufrido la meiosis en
el interior del basidio, maduran en la parte externa de una estructura
microscópica llamada esterigma, que son proyecciones elongadas generadas
a partir del basidio, donde crecen en un número de cuatro basidiosporas
(figura 2.3). Las basidiosporas usualmente contienen un solo núcleo
6
haploide. Cuando la espora germina es el inicio del micelio haploide
monocariotico o micelio primario. Este puede ser en un principio no septado
pero más tarde se divide en un número de células uninucleadas. Siendo esta
una fase del ciclo de vida usualmente corta. Posterior a esto ocurre la
plasmogamia, de dos hifas monocariotas. Cuando la hifa monocariota se
fusiona, el núcleo de una hifa fluye dentro de la otra, siendo un intercambio
recíproco entre los núcleos, teniendo finalmente dos núcleos genéticos afines
y un estado dicarión (figura 2.4) (Moore, 1996).

Figura 2.3. Desarrollo de un basidio típico.
Fuente: http://ib.ufpel.edu.br/basidiomycota.pdf

Los basidios pueden estar formados por una célula (holobasidio) o por varias
células (fragmobasidio) y se localizan en el himenóforo; la expulsión de las
esporas puede hacerse de manera activa y en este caso las esporas se
denominan balistosporas, o en forma pasiva y entonces las esporas se
denominan estatismosporas (Franco et al., 2005). Hawksworth y
colaboradores (1995) reconocen tres clases dentro de la division
Basidiomycota, Basidiomycetes, Telyomycetes y Ustomycetes. La clase
Basidiomycetes se encuentra dividida en dos subclases,
Phragmobasidiomycetidae con cinco órdenes y Holobasidiomycetidae con 27
7
órdenes. Paralelo a esto se han propuesto otras clasificaciones. Gams y
colaboradores (1998) y Kirk y colaboradores (2001) reconocen tres clases
dentro de esta división: Basidiomycetes o Hymenomycetes,
Uredioniomycetes (las royas) y Ustilaginomycetes (los carbones) (citados por
Franco et al., 2005).

Figura 2.4 Ciclo de vida de la división Basidiomycota.
Fuente: http://www.educa.aragob.es/iescarin/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/
Seccion%205/5%20-%20Capitulo%2029.htm

La división Basidiomycota incluye macromicetos con gran variedad de
formas, texturas y colores, que los hacen muy llamativos. Entre las formas
que se pueden encontrar están la sombrilla, coral, clava, balón y repisa. Y
pueden tener una contextura carnosa, gelatinosa, leñosa o correosa.A esta
división pertenece la gran mayoría de setas o macrohongos, los cuales
constituyen uno de los tipos de organismos menos estudiados a nivel
bioquímico, pero sin embargo como lo reporta Brizuella 1998 y Suay y
8
colaboradores, en el 2000, son organismos que presentan gran variedad de
metabolitos.

2.1.2 Generalidades de las setas, hongos macromicetos

Al existir una alta variedad de organismos reconocidos como hongos es difícil
proveer una precisa descripción de ellos, pues al parecer estos son una
combinación de características diversas tales como la nutrición, la
composición de las paredes celulares y organización multicelular. Sin
embargo autores como Alexopoulos definen a los hongos como organismos
con núcleo que se reproducen por esporas, carecen de clorofila (por lo tanto
no son fotosintéticos), se reproducen sexual o asexualmente y tienen
estructuras somáticas filamentosas y ramificadas rodeadas por una pared
celular compuesta por celulosa, quitina o ambas. Una descripción más
profunda señala que son organismos heterotróficos (incapaces de usar el
dióxido de carbono como única fuente de carbono), e ingieren su alimento
por absorción. Su talo es variable, desde ameboide y unicelular, hasta tubular
rodeado por una pared celular. Puede ser único multicelular (septado) y
hallarse sobre o dentro del substrato. Su pared está hecha de un polisacárido
llamado quitina, pero también puede contener celulosa. No son organismos
móviles, pero en algunos casos sus esporas sí lo son; pueden ser haploides,
homocarióticos, heterocarióticos, dicarióticos o diploides (Herrera, 2001).
Algunos hongos tienen la capacidad de formar conglomerados de largas
hifas ramificados que se reúnen en cordones rizomorfos y cuerpos de
reproducción (ascomas, basidiomas) visibles y medibles en centímetros,
siendo las estructuras denominadas como setas. Son organismos saprobios
que absorben la materia orgánica muerta de los residuos donde crecen,
pueden ser parásitos de árboles, o vivir en simbiosis con plantas formando
ectomicorrizas (Carrillo, 2003).

9
Es de importancia el reconocer las formas de nutrición y las condiciones
físicas que requieren los hongos para la formación de setas. En el
saprofitismo los hongos obtienen sus requerimientos nutricionales derestos
de materia vegetal o animal en descomposición. En los ambientes naturales
las fuentes básicas de carbono son elementos lignocelulósicos, provenientes
de las paredes celulares de las plantas, siendo estos insolubles en agua, por
esto, los hongos producen enzimas extracelulares, las cuales, son
excretadas de las hifas al ambiente que los rodea, donde convierten dichos
compuestos insolubles en solubles, es decir rompen las macromoléculas en
sustancias simples que pueden entrar a la célula por osmosis o mecanismos
de transporte especializados, llevándolos a través de la pared celular fúngica
y la membrana celular donde son metabolizados. (Moore, 1996). Por otro
lado muchos de estos hongos obtienen sus nutrientes de hospederos vivos,
en especial plantas; este parasitismo puede ser tan extenso que puede llegar
a afectar al hospedero. En último lugar, se conocen interacciones de hongos
con otros organismos como plantas y algas, en donde se dan relaciones de
simbiosis, mutualismo o comensalismo (micorrizas y líquenes) de las cuales,
el hongo saca provecho para satisfacer sus requerimientos nutricionales. Por
medio de estos métodos el hongo integra los requerimientos nutricionales de
macronutrientes como carbono, nitrógeno, azufre, fósforo, potasio, y de
micronutrientes como hierro, zinc, manganeso, cobre y molibdeno, además
de sintetizar vitaminas como la tiamina, biotina, ácido nicotínico, y ácido
pantoténico entre otras, las cuales juegan el papel esencial en el
metabolismo del organismo, como coenzimas (Miles, 1999 ).

En cuanto a las condiciones ambientales, algunos bosques generan
ambientes propicios para el desarrollo de las setas de tipo mesófilo, es decir,
con una temperatura óptima de crecimiento de 15ºC a 30ºC, sin embargo,
hay que tener en cuenta que esto varía según la especie, la fase de
crecimiento y los metabolitos a producir (Moore, 1996). Igualmente el
10
ambiente debe proporcionar una humedad alta ya que la mayoría de hongos,
requieren altos niveles de humedad, los cuales también pueden variar en
diferentes etapas de crecimiento; para la mayoría de setas, una humedad
relativa de 95 a 100 % en el ambiente permite un crecimiento máximo con
poca pérdida de contenido de humedad del sustrato debido a evaporación,
asimismo la luz tiene gran influencia sobre el desarrollo de los hongos, pero
esta es más evidente sobre aquellos que producen cuerpos fructíferos, pues
tiene que ver con el desarrollo de órganos productores de esporas (Moore.
1996). La luz podría impulsar el origen de primordios en algunas especies y
ser necesaria para el desarrollo de otras etapas de la evolución del órgano
productor de esporas. Los componentes gaseosos más importantes para las
setas son oxígeno y dióxido de carbono, pues el primero es utilizado en la
respiración aerobia descomponiendo carbohidratos; mientras que un
incremento leve en la concentración de CO2 (menor a 0.3 a 0.5%) estimula
formación de primordios. En último lugar, la concentración de iones de
hidrógeno o pH para el crecimiento vegetativo o de cuerpo fructífero, debe
ser alrededor de la neutralidad con una leve inclinación a la acidez (pH = 6.5
– 7.0). Sin embargo, las necesidades supletorias del hongo, como enzimas
extracelulares necesitan valores de pH diferentes para una mejor actividad
catalítica (Miles, 1999; Moore, 1996).

Generalmente un hongo macromiceto de la división Basidiomycota es como
una sombrilla extendida (píleo) sostenida por un pie (estípite) que a veces
tiene un anillo o restos de una membrana que unía al píleo con el pie. Otras
veces hay en la base una volva o restos de un velo que envolvía a todo el
basidioma joven. Hay hongos cuyos basidiomas se asemejan a un abanico,
otros son cilíndricos, esféricos o coralinos. En el basidioma cerrado el peridio
envuelve a la gleba fértil y se rompe cuando las esporas están maduras
(figura 2.5) (Carrillo, 2003).
11

Figura 2.5. Esquema de basidiomas
Fuente: Carrillo, 2003

En la mayoría de estos organismos el basidioma está compuesto
principalmente por el himenio, subhimenio y tejido estéril. El himenio está
constituído por basidios y tejido estéril, que puede cubrir la superficie externa
del basidioma o solo parte de ésta. El subhimenio es la capa de la cual crece
el himenio. En último lugar, el tejido estéril es aquel que pude separar el
himenio adyacente o puede comprender la mayor parte del basidioma y es
frecuentemente llamado trama (figura 2.6) (Moore, 1996).

Figura 2.6. Ubicación y conformación del basidioma
Fuente: http://fai.unne.edu.ar/biologia/fungi/image-hongo/agarico.jpg (modificado por
autores)
12
2.1.3 De la división Basidiomycota a la familia Tricholomataceae

Dentro del la división Basidiomycota es posible encontrar la clase
Basidiomycetes y a su vez en ésta, la subclase Holobasidiomycetidae donde
se encuentra el orden de los Agaricales, los cuales en el país revisten gran
interés desde el punto de vista alimentario, industrial y ecológico. Los hongos
pertenecientes a este orden son saprofitos de plantas, escombros de suelos,
madera o estiércol. Algunas especies son parásitos de plantas y otras se ven
involucradas en asociaciones simbióticas con plantas vasculares. Los
miembros de los Agaricales se han encontrado en diversos hábitats, tales
como pasturas, césped, cultivos, ciénagas, humus, bosques y flores. Son
además considerados como importantes descomponedores de las plantas.
Se conocen más de 5000 especies de este orden y el rasgo más
característico de este grupo es un carnosoy fresco basidioma de donde
fructifica un himenio que es expuesto al madurar (Moore, 1996).

Nasi (1977) hizo descripciones principalmente macroscópicas de algunos
hongos que viven en la sabana de Bogotá; Pulido publicó en 1983 el trabajo
“Estudios de Agaricales Colombianos”. Los últimos muestreos realizados y
publicaciones pertenecen a Franco, Calle, (2005) Vasco y López (2000);
convirtiéndose este orden en uno de los más conocidos con
aproximadamente 270 especies reportadas (Franco et al., 2005). A partir de
estas publicaciones, se ha podido observar que dentro del orden de los
Agaricales, la familia Tricholomatacea es la más extensa de todas y se
encuentra presente en ambientes como los del altiplano cundiboyacense,
siendo los géneros más representativos, Collybia, Marasmiellus y Marasmius
(Pegler, 1983). En Colombia se han reportado aproximadamente 35 géneros
y 148 especies pertenecientes a la familia Tricholomataceae, lo cual la
convierte en una familia con facilidad para ser estudiada en diversos campos
de acción y ser reportada constantemente (Franco et al., 2005).
13

La familia Tricholomataceae está compuesta por especies de esporas
blancas y lamelas adjuntas. Los miembros de esta familia son encontrados
sobre muchos substratos y diferentes ambientes, tales como madera viva o
muerta, hojarasca en bosques de pino, roble y eucalipto. Miembros muy
conocidos de esta familia son Armillariella mellea (el champiñón de la miel),
Pleurotus ostreatus (el champiñón ostra) y Marasmius oreades, estas son
especies comestibles. Marasmius es pequeño (estípite 2.5 cm), de
contextura carnosa algo dura y con píleo delgado. Los basidiocarpos secos
pueden ser fácilmente reconstituidos en agua, una característica que no solo
está limitada a este género. Clitocybe dealbata y Clitocybe aurantiaca son
venenosas al igual que Omphalotus olearius, los basidiocarpos de este último
género tienen lamelas naranja y decurrentes. Ellos se producen típicamente
de forma cespitosa, normalmente en la base de los tocones de árboles, pero
también en el césped (Alexopoulos & Mims, 1979). Tricholoma forma
micorrizas, así como Nothofagus, que crece en la zona subtropical. Estos
generos tienen laminillas, esporas blancas y carecen de anillo (Carrillo,
2003). Con tal diversidad de hongos el presente estudio planea poder
identificar otros usos para estas setas en el campo biotecnológico, como es
la identificación de metabolitos activos con actividad antimicrobiana.

Para poder muestrear esta familia es necesario conocer sus rasgos
característicos. Píleo carnoso, membranoso o correoso. Superficie del píleo
celular o tricodermal. Himenio generalmente lamelar, poroide, intervenido,
liso, libre, anexo, adnado o decurrente. Esporada blanca o crema, raramente
rosada. Estípite central, excéntrico, lateral o ausente. Trama regular o
irregular, hifas con o sin fíbulas. Cistidios presentes o ausentes. Puede tener
anillo o no; pero no volva. Basidios generalmente no más de 5.5 veces mayor
que las esporas. Esporas lisas u ornamentadas y poro germinal ausente
(Pulido, 1983).
14

A continuación se describen hongos representativos de la familia
Tricholomataceae que han sido reportados en Colombia y muchos de estos
en el altiplano cundiboyacense, con las características más representativas
para la clasificación taxonómica de los mismos (tabla 2.1).

TABLA 2.1. Algunos géneros de hongos de la familia Tricholomataceae reportados en Colombia

**Especies reportados en el altiplano cundiboyacense.
* Especies reportados en Colombia.

HONGO PILEO ESTÍPITE CONTEXTO LAMELAS ANILLO HÁBITAT Y
HÁBITO
**Cystoderma amianthinum

Globoso en
estadíos jóvenes,
luego se aplana
(convexo).
Diámetro 1.5 a
4.5 cm.
Color amarillo o
anaranjado.
Cilíndrico, del
mismo color
que el sombrero
Carnoso Cercanas,
escotadas,
subdecurrente
s por un
estrecho
filamento.
Color blanco a
crema.

Delgado,
frágil.
Algunas
veces
unido al
límite del
píleo.
Suelo.
*Hydropus nigritus

Convexo aplano
con un umbo
pequeño;
superficie glabra
a finamente
fibrilosa, rugosa
en el centro, lisa
hacia el margen
(entero,
incursado a
recurvado).
Diámetro 0.5 a
2.7 cm.
Color amarillo
grisáceo
tornandose negro
Central a
ligeramente
excéntrico,
cilíndrico,
superficie
glabra,
fibriolosa a
pruinosa,
interior hueco.
Longitud 1 a 4
cm, diámetro
0.1 a 0.3 cm
cerca del ápice.
Color gris a gris
amarillento,
tornándose
Color amarillo
claro a gris
claro. Grosor
0.1 cm.
Olor y sabor
indistintivos.
Anexas muy
apretadas.
Ancho 0.2cm.
Color grisáceo
claro con tintes
amarillentos
cuando joven,
negras con la
edad.
Látex hialino,
abundante.
No
presenta
Gregario, sobre
madera en
descomoposici
ón.
16
HONGO PILEO ESTÍPITE CONTEXTO LAMELAS ANILLO HÁBITAT Y
HÁBITO
al manipularse o
con la edad;
negro al
manipularse o
con la edad;.
**Oudemansiella canarii

Presenta parches
afelpados por la
ruptura del velo
universal.
Color gris con
blanco o gris
claro. de forma
convexa
Delgado de
aproximadamen
te 0.3 mm y
concoloro con
el pileo
Carnos Subdistantes,
bordes
fimbriosos
Color blanco
perla.
Presente Madera en
descomposició
n

**Laccaria laccata

Convexo,
presenta una
depresion cental,
con margen
ondulada.
Diámetro 1.5 a
6cm.
Color blanco
cremoso, rojizo a
rosado o
anaranjado.

Base sólida y
fibrosa. A veces
está torcido,
enrollado, o
comprimido.
Presenta
micelio
aterciopelado
en la base.
Del mismo color
de píleo pero
mas oscuro,
rojo-cobrizo.
Del mismo
color del píleo
o más pálido.
Sabor suave.
Olor débil.
Delgadas,
distantes.
Color rosado
pálido o café-
rojizo.
Ausente Madera, suelo.

**Megacollybia platyphylla

Cóncavo cuando
joven,
tornándose
convexo a plano
con el tiempo.
Tiene estrías que
irradian desde el
centro.
Margen es
Puede ser duro
o suave pero de
apariencia
fibrosa.
Presenta
estrías en la
base
(rizomorfo).
Longitud 7.5 a
Color
blancuzco.
Sabor suave.
No presenta
olor
distinguible.
Unidas al pie,
o muy cerca
de este. Casi
distantes o
cercanas.
Color blanco.
Ausente Madera
(sapófito)
17
HONGO PILEO ESTÍPITE CONTEXTO LAMELAS ANILLO HÁBITAT Y
HÁBITO

ondulada.
Diámetro 3 a
12.5 cm.
Color café pálido.

12.5 cm. Grosor
1 a 2 cm.
*Clitocybe illudens

De forma plana
en la mayoria de
ocaciones de
Diámetro 10
a16cm. Color
anaranjado u
amarillo azfran
El estipite
puede tener de
7 a 13 cm de
altura
carnoso Color naranja.
Suddistantes
Ausente Se encuentra
en grupos de
más de 15
hongos,
usualmente en
la base de
robles, o
tocones de
árboles, o en la
raíz.
18
HONGO PILEO ESTÍPITE CONTEXTO LAMELAS ANILLO HÁBITAT Y
HÁBITO
*Clitocybe gibba

Al principio
convexo, para
embudarse
posteriormente.
Diámetro hasta
8cm.
Color ocre rojizo
a ocre claro,
incluso crema o
blanquecino.
Cilíndrico,fino,
con su parte
inferior
recubierta por
una fina pelusa.
Color
blanquecino,
del mismo tono
que el píleo.
poco carnoso Finas y
apretadas, y
decurrentes.
Color blanco.
Ausente Fructifica tanto
en caducifolios
como en
coníferas, en
todo tipo de
sustratos.
Generalmente
se encuentra
sobre
acúmulos de
hojarasca y en
bordes de
caminos, pero
también
directamente
sobre suelos
sin hojarasca o
entre musgos.
*Cantharellus lutescens Bordes
recortados,
delgados y
enrollados hacia
abajo.
Diámetro 2 a 6
cm.
Color marrón
grisáceo sobre
fondos amarillo-
naranja, más
oscuro en el
centro.
Liso,
comprimido,
hueco, surcado
longitudinalmen
te.
Color amarillo a
naranja.
Delgado.
Color
amarillento.
Olor fuerte y
muy agradable,
de sabor dulce.
Carece de
láminas, casi
lisa,
ligeramente
venosa.
Color amarillo
a naranja.
Ausente Se halla en
pinares (Pinusnigra y Pinus
sylvestris), en
terrenos
calcáreos,
siempre
camuflados por
el musgo o la
hierba.
Habitualmente
formando
setales de
buen número
de ejemplares.
19
HONGO PILEO ESTÍPITE CONTEXTO LAMELAS ANILLO HÁBITAT Y
HÁBITO
*Lactarius badiosanguineus

Superficie lisa,
casi húmeda,
brillante y su
látex no es
picante, convexo
a aplanado, pero
con el centro
hundido, donde
tiene un
mamelón que, a
veces, es apenas
perceptible.
Color rojo a
castaño o rojo-
púrpura.
Regularmente
cilíndrico,
atenuado hacia
la base y liso.
Color análogo
al del píleo.
La carne es
blancuzca pero
un poco rojizo-
marrón hacia
las superficies.
No tiene olores
ni sabores
particulares.
Segrega un
látex blanco, no
picante o
ligeramente
picante
después de un
tiempo de
haberla
probado.
Apretadas,
decurrentes al
pie, en
ocasiones
ahorquilladas.
Coloración
amarillo a
rosado.
Ausente Crece en los
bosques de
coníferas con
particular
preferencia por
el abeto rojo.
Se presenta en
grandes
formaciones y
puede
encontrarse
sobre suelos
herbosos.
*Campanella alba

Foto no disponible

Subreniforme o
convexo,
superficie glabra,
pustulosa a
subreticulada.
Margen entero a
ligeramente
ondulado.
Diámetro 0.2 a
2cm.
Color blanco, a
veces grisáceo
con la edad,
crema cuando
seco.

Información no
disponible
Delgado. Color
blanco.
Sin olor. Sabor
no reportado
Rectas o
flexibles,
distantes, se
anastomosan
formando un
himenio
alveolado-
poroide (2 a 7
lamelas)
Color blanco.
Informació
no
disponible
Madera en
descomposició
n.
Solitario o
gregario.
20
HONGO PILEO ESTÍPITE CONTEXTO LAMELAS ANILLO HÁBITAT Y
HÁBITO
*Collybia aurea Convexo,
depreso a
subumbilicado en
el centro,
superficie
subvíscida,
glabra a
finamente
fibrilosa,
higrófana.
Margen entero.
Diámetro 0.5 a
3cm.
Color amarillo
mostaza, a veces
con tonos rojizos.
Cerca del ápice,
central,
cilíndrico,
superficie lisa,
glabra a
finamente
fibrilosa,
concolora con
la superficie del
píleo,
Longitud 2 a
6cm. Diámetro
0.2 a 0.6cm.
carnoso apretadas Ausente Gregario, sobre
Madera.
*Collybia neotropica 1-13 cm. de
diámetro,
convexo,
campanulado a
ambulado,
crema, café muy
claro a café
cuando joven,
canela en el
centro y mas
claro a crema
hacia el margen
con la edad,
surcado-estriado;
margen
ligeramente
recurvado
5-9 cm. de
longitud, 0.1-0.6
cm. de diámetro
cerca del ápice,
central,
cilíndrico a casi
plano,
superficie
finamente
fibrilosa a
velutinosa,
crema o
amarillosa
cerca del ápice
concoloro con
la superficie del
píleo hacia la
base, interior
hueco.
Adnadas,
cercanas,
margen entero
a finamente
fimbriado.
Ancho 0.3cm.
Color crema o
concoloras con
el píleo.
Cercanas de
colores café o
beich
Ausentes Solitario o
agrupado sobre
troncos en
descomposició
n.
21
HONGO PILEO ESTÍPITE CONTEXTO LAMELAS ANILLO HÁBITAT Y
HÁBITO
*Clitocybe cyathiformis

Forma de
embudo cuando
esta maduro.
Diámetro mayor
de 7cm.
Color café
oscuro, concoloro
con el estípite.
Información no
disponible
carnoso Café claro o
grisáceo
oscuro.
Cercans o
apretadas
ausente Crece sobre
humus o
madera en
descomposició
n.

Fuente: Información tomada de fuentes electrónicas y Franco et al. (2000).
http://www.idsetas.com/cystoderma.amianthinum.htm
http://www.nybg.org/bsci/res/hall/nigrita.html
http://www.viarural.com.ar/viarural.com.ar/guia-de-hongos/oudemansiella-canarii/default.htm
http://grzyby.strefa.pl/Laccaria_laccata.html
http://www.valdorba.org/micovaldorba2/setas/Clitocybe_gibba_clitocibe_embudado.html
http://darnis.inbio.ac.cr/ubisen/FMPro?-DB=UBIPUB.fp3&-lay=WebAll&-error=norec.html&-Format=detail.html&-Op=eq&id=6997&-
Find
22
2.1.4 Aplicaciones de los metabolitos secundarios de macromicetos

Los hongos basidiomicetos son un grupo de organismos ubicuos ya que se
encuentran distribuidos en una gran cantidad de regiones a nivel mundial, lo
que ha facilitado su uso por parte del hombre a través de la historia. Con el
transcurso de los años, además de su uso como alimento se ha evidenciado
la relación entre el consumo de setas con la salud, hechos que condujeron a
definirlos como “alimentos funcionales”. Este término lo ha definido la
Academia de Ciencias de Estados Unidos en 1994, como “aquellos alimentos
que abarquen productos potencialmente saludables, incluyendo cualquier
alimento modificado o ingredientes de alimentos, que puedan proveer un
beneficio para la salud mas allá de los nutrientes que contiene” (citado por
Smith et al., 2002). Actualmente diversas investigaciones han confirmado su
eficacia medicinal, y han permitido revelar moléculas bioactivas a partir de
estos hongos, por esto el término “hongos medicinales” ha venido ganando
reconocimiento a nivel mundial (Smith et al., 2002).

El uso de hongos y plantas para efectos medicinales ha sido una tradición
milenaria, este hecho deja claro que la naturaleza provee un enorme
potencial para el descubrimiento de nuevas moléculas que son sintetizadas
por estos organismos en las fases tardías de su crecimiento, y que aun
cuando no sean indispensables para el desarrollo del organismo, son
producidas por cada especie para contribuir a la supervivencia de la misma,
es decir metabolitos secundarios. Estos pueden tener diversos tipos de
actividad como agentes antimicrobianos, antifúngicos, antivirales y
citostáticos, hasta enzimas reguladores de crecimiento y aromas (tabla 2.2)
(Brizuela, 1998).

Investigaciones acerca de plantas con efectos medicinales, permitieron
evidenciar que los metabolitos secundarios producidos por algunos
organismos, sirven como mecanismo de defensa contra plagas y
23
enfermedades, descartando así la teoría que dictaba que estas sustancias
eran productos de desecho sin una función específica aparente (Verpoorte,
1998). Es por esto que los esfuerzos de investigación con fines de
descubrimiento y desarrollo de nuevos productos farmacéuticos, se han
enfocado sobre metabolitos secundarios producidos por algunos organismos
tales como hongos. Aun cuando la mayoría de metodologías para la
investigación de estos metabolitos se han desarrollado en plantas, por medio
del presente trabajo se pretende implementar una de estas metodologías
para setas.

Tabla 2.2. Productos bioactivos de origen microbiano de naturaleza no antibiótica.
Fuente: Berdey (1989)
24
Los trabajos tomando como modelo de investigación plantas del género
Ageratina de diferentes especies, han permitido evidenciar la acción
antimicrobiana de metabolitos secundarios tales como falvonas metoxiladas,
diterpenos y cumarinas, responsables de actividad antifúngica contra los
hongos fitopatógenos Cladosporium cucumeruim y Fusarium oxysporum,
además del dermatofito Trichophyton mentagrophytes (Flores, 1992; Robles,
1992; Barberan, 1998; Gonzáles & León, 2000). Las rutas metabólicas
generales seguidas para la síntesis de los metabolitos secundarios por
hongos y plantas se presentan en la figura 2.7.

Figura 2.7. Rutas metabólicas de síntesis de algunos metabolitos secundarios producidos
por hongos y plantas.
Fuente: http://www.ugr.es/~quiored/pnatu/secundario.htm

Investigaciones sobre basidiomicetos han revelado que existen al menos 270
especies de hongos que poseen propiedades terapéuticas (Smith et al.,
25
2002), ya que algunos de los metabolitos secundarios que sintetizan
presentan fuerte capacidad inmunomoduladora y anticancerígeno; debido a
la presencia de algunos tipos de polisacáridos dentro de los cuales se
encuentran β-D-glucanos, con cadenas de heterosacáridos compuestas por
xilosa, manosa, galactosa o ácido urónico; o complejos de β-D-glucanos
unidos a proteínas. Estos polímeros interactúan con el sistema inmune para
regular aspectos específicos de la respuesta inmune delhospedador, y de
esta forma ocasionar efectos terapéuticos (Piqueras, 2004). Además, los
metabolitos secundarios producidos por hongos podrían servir como
mecanismo de protección contra la degradación del organismo causada por
parásitos o predadores cuando un daño físico en el cuerpo fructífero ocurre
(Stadler & Sterner, 1997) asimismo, se han reportado gran cantidad de
basidiomicetos con actividad antimicrobiana y antiviral, entre los cuales
figuran diversos géneros de la familia Tricholomataceae tales como
Pleurotus, Marasmius, y Clitocybe, en donde dicha actividad es generada por
diversos tipos de compuestos tales como sesquiterpenos, diterpenoides,
acetilenos, glicolípidos, policetonas, nucleocidos y sales de diazonio,
extraídos o producidos por dichos hongos (tabla 2.3) (Brizuela, 1998). Por
otro lado, existen setas de esta familia, como Oudemasiella mucida que
produce peptidos, los cuales afectan la cadena respiratoria mitocondrial,
observándose de esta manera un efecto antimicótico contra levaduras y
dermatofitos (Mesa et al., 2004).

La creciente demanda de productos farmacéuticos de origen natural ha
obligado a intensificar la investigación en cuanto al descubrimiento y
desarrollo de nuevas alternativas para el tratamiento de diversas
enfermedades presentes en humanos, animales y plantas. En este sentido,
Colombia presenta una ventaja competitiva, pues como se mencionó con
anterioridad, la biodiversidad que existe en este país representa una
26
oportunidad para llevar a cabo adelantos investigativos que conlleven al
fortalecimiento de la industria farmacéutica y biotecnológica.

Tabla 2.3. Compuestos producidos por basidiomicetos con antividad antimicrobiana.
Fuente: Berdey (1989)

2.2 HONGOS CAUSANTES DE MICOSIS: Dermatofitos y Fusarium sp.

2.2.1 Micosis en animales

La mayoría de los casos clínicos en pequeños animales se deben a
Microsporum canis, Microsporum gypseum y Trichophyton mentagrophytes.
M. canis (huésped primario del gato) y T. mentagrophytes son dermatofitos
zoofílicos, mientras que M. gypseum es geofílico. Las especies antropofílicas
(por ejemplo, T. rubrum) pueden infectar de forma ocasional a los perros y
gatos. Se considera, de acuerdo a estudios llevados a cabo en EEUU, que el
70% de las infecciones en los perros serían atribuibles a M. canis, el 20% a
M. gypseum y el 10% a T. mentagrophytes. La proporción de cultivos
27
positivos con relación al número de muestras examinadas en casos de
dermatofitosis oscila entre el 8% y 20%, siendo Microsporum canis el
dermatofito más comúnmente aislado, sin embargo también aislar
Microsporum gypseum y Trichophytion mentagrophytes (Cabañes, 2000).
Estos datos facilitan la indagación y el aislamiento de este tipo de hongos,
para usar estas cepas como referencia y poder estandarizar métodos y
pruebas de tipo antifungico.

Ecológicamente, los dermatofitos están clasificados en tres grupos.
Antropofílicos, en donde el hospedero es humano; zoofílicos, en donde el
hospedero es animal; y por último geofílicos, cuando cumplen su ciclo de
vida o parte de este, en el suelo (Kane, 1997). Las dermatofitosis causadas
por dermatofitos son también conocidas como tiñas, y son susceptibles a
estas mamíferos, aves e incluso reptiles. En el contexto planteado, se dirige
la atención a los bovinos y caninos, especialmente a los terneros y
cachorros, pues gracias a trabajos de investigación hechos sobre este tipo de
enfermedades, se sabe que existe una relación entre la incidencia y
expresión de la enfermedad con la edad. Se cree que este fenómeno se
debe a que con la edad, el aumento del grosor de la piel, disminuye la
receptividad del hongo en el hospedero (Gonzáles, 1990).

Morfológicamente, los dermatofitos están clasificados en tres géneros.
Trichophyton se caracteriza por formar macroconidias multicelulares de
pared lisa, y pueden existir microconias; Microsporum, forma macroconidias
de pared rugosa, y pueden haber microconidias (figura 2.8); y
Epidermophyton, por producir solo macroconidias de pared lisa y delgada
(Wagner & Sohnle, 1995; Kane, 1997).
28

Figura 2.8. Macroconidias de Microsporum sp.
Fuente: http://www.mycology.adelaide.edu.au/gallery/photos/Microsporum1.gif

La inusual capacidad de utilizar la queratina como sustrato que presentan los
dermatofitos, y su amplia distribución ecológica, los ha convertido en un
grupo de especial importancia clínica, aunque se sabe que factores
ambientales como la temperatura, humedad, presencia o ausencia de dióxido
de carbono y disponibilidad de nutrientes influencia el desarrollo de estos
organismos. La patogénesis inicia cuando la colonización ha ocurrido, luego
de la transmisión directa o indirecta a partir de otros animales infectados o a
partir del suelo. El desarrollo de la lesión sigue una serie de estados que
incluye un periodo de incubación durante un lapso de tiempo entre tres y
cuatro meses, en la cual la hifa crece en el estrato córneo de la piel. El
crecimiento es seguido por un agrandamiento característico de la colonia de
forma radial. Un periodo refractario sigue cuando la hifa desaparece y no se
presentan nuevas lesiones, sin embargo, un gran número de artroconidias
son formadas en este periodo, iniciando un periodo conocido como recesión,
en el cual el sitio infectado regresa a su estado original. La intensidad de la
lesión está influenciada por el estado inmune del hospedador y del hábitat del
dermatofito (Gonzáles, 1990; Bofill, 1996).

Paralelo a los dermatofitos, existe otro grupo capaz de causar micosis
conocido como hialohifomicosis. El agente etiológico en los tejidos está
identificado por hifas septadas y sin pigmento en la pared micelial, siendo
Fusarium sp., uno de los géneros más reportados de este grupo (Montiel,
29
2004). Aun cuando no tiene una frecuencia tan alta como los dermatofitos, es
el género que mayor se reporta como causante de onicomicosis. Además de
esto debe tratarse con extremo cuidado por que en muchos casos la
infección puede llegar a colonizar ojos o volverse sistémica en el peor de los
casos, sin embargo el 75% de ocasiones este género se ve relacionado, con
una enfermedad localizada en piel y uñas
(http://www.accionecologica.org/index.php?option=com_content&task=view&i
d=89&Itemid=7670.)

El género Fusarium actúa como parásito facultativo por su capacidad
queratinofílica y queratinolítica, lo que le permite colonizar tejidos de
humanos y animales principalmente, y de esta forma convertirse en agentes
patógenos causando micosis similares a las de los dermatofitos (Imai, 1991;
Tosti et al., 2000). La principal característica para la diferenciación de
Fusarium son los conidios, los cuales pueden ser macroconidios curvados,
hialinos, pluriseptados, con una célula apical más o menos puntiaguda y una
célula basal en forma de pie que constituye la base para la identificación; y
microconidios producidos en el micelio aéreo, comúnmente unicelulares,
elipsoidales, fusiformes, claviformes, piriformes o subglobosos, similares en
ancho a los macroconidios, con una base redondeada o truncada, por lo
general formando cabezuelas mucosas o cadenas basípetalas. No siempre
se producen los dos tipos de propágulos (Moore, 1996; Alexopoulos et al.,
1996; Agrios, 1997).

2.2.2 Tratamiento de hongos dermatofitos y Fusarium sp., causantes de
micosis

El tratamiento de la dermatofitosis y dermatomicosis ha incrementado el
desarrollo de nuevos agentes antifúngicos, ya sean de aplicación tópica o de
administración oral. El enfoque inicial para el tratamiento sobre casos de este
30
tipo de enfermedad es el empleo de cremas o polvos que contienen agentes
antifúngicos específicos incluyendo tolnaftato, clorofenesina, undecilenato,
ciclopiroxolamina y naftalina o un imidazol tal como clotrimazol, miconazol oketoconazol (Wagner & Sohnle, 1995).

Paralelo a estos agentes se encuentra la anfotericina B. Este fármaco
pertenece al grupo de antimicóticos que actúan sobre la pared celular del
hongo. La anfotericina B es un macrólido heptaénico que contiene 7
ligaduras solubles conjugadas en la posición trans y es 3-amino-6,6-
dideoximanosa (micosamina) unida al anillo principal por un enlace
glucosídico (figura 2.9).

Figura 2.9. Estructura de la anfotericina B

El comportamiento anfotérico del cual ha tomado su nombre, depende de la
presencia de un grupo carboxilo en el anillo principal y otro amino primario en
el de micosamina; uno y otro grupo confieren hidrosolubilidad en extremos de
pH. El mecanismo de acción de la anfotericina B depende cuando menos en
parte de su unión a la fracción esterol y en particular, al ergosterol que está
en la membrana de hongos sensibles. Por su interacción con los esteroides
de las membranas en los microorganismos, los polienos forman poros o
conductos. El resultado es un incremento en la permeabilidad de la
membrana que permite la salida de diversas moléculas pequeñas. Esto
31
causa la muerte del agente infeccioso. Debido a su mecanismo de acción
(http://med.javeriana.edu.co/fisiologia/fw/c781.htm), lo cual lo clasifica como
un antimicótico de amplio espectro quizás sea un antifungico que a dosis
adecuadas presenta algún tipo de actividad contra dermatofitos y Fusarium
sp. por lo cual sea un control adecuado para medir actividad biológica.

2.3 METODOLOGÍAS PARA LA EVALUACIÓN DE METABOLITOS
BIOACTIVOS

Cuando se desea trabajar con metabolitos secundarios, es recomendable
ejecutar pruebas químicas preliminares que detecten cualitativa o
cuantitativamente la presencia o ausencia del compuesto o compuestos de
interés; esto se hace con el fin de ahorrar tiempo y dinero destinados al
desarrollo de la investigación, pues permiten dar preferencia a las muestras
con mayor provecho. Los métodos mediante los cuales se pueden llevar a
cabo las pruebas preliminares, pueden ser histológicos, químicos,
fisicoquímicos y biológicos. Particularmente, en micología, los análisis
histológicos realizados sobre las muestras a evaluar comprenden la adición
de reactivos que evidencian diferentes compuestos presentes en los tejidos
de estos, lo que facilita su identificación sistemática (Dominguez ,1973).

Domínguez en 1973 reportó que los flavonoides y compuestos afines son
pigmentos que poseen un esqueleto carbonado C6-C3-C6. Este tipo de
compuestos contribuyen a generar color. Los flavonoides presentan todos los
matices de solubilidad, desde los totalmente solubles en agua hasta los
insolubles en ella pero solubles en éter etílico, pasando por los solubles en
etanol. Como se mencionó con anterioridad, este tipo de compuesto presenta
actividad antimicrobiana contra algunas especies bacterianas (Flores, 1992),
y contra Cladosporium cucmerium, un hongo patógeno vegetal (Barberan,
1998).
32

Las lactonas son compuestos cíclicos que poseen al menos un anillo que
tiene involucrado un grupo carbonilo y un oxígeno, y las sesquiterpelactonas
poseen un esqueleto fundamental con átomos de 15 carbonos, que
teóricamente deriva de la unión de tres fragmentos de isopreno (2-
metilbutadieno-1,3) cabeza, cola y algunos productos de transposición y
parte del esqueleto es una anillo de metilbutenolido. (Domínguez, 1973)

Las cumarinas son compuestos derivados de la lactona y del acido o-
hidroxinamico, usualmente llamado cumarina. Estas sustancias son
fluorescentes y comunmente fotosensibles. Además, pueden existir
cumarinas con cadenas de isopreno, de las cuales se ha reportado su
actividad citotóxica y antimicrobiana (Devienne, 2002)

Según Domínguez (1973), los esteroles son alcoholes sólidos de cadenas de
27 - 29 átomos de carbono, reportados en animales, algas vegetales y
hongos. Cuando los grupos metilos se insertan en el C- 4 como en el lofenol,
o en el C-14 se les denomina metilesteroles (Lindequist, et all, 2005).

Las saponinas son un grupo de glucósidos que se disuelven en agua y
disminuyen la tensión superficial de ésta, por lo tanto al sacudir sus
soluciones se forma una espuma abundante y relativamente estable. Por
hidrólisis de las saponinas se obtienen carbohidratos y una aglicona, llamada
generalmente sapogenina, la cual puede tener un esqueleto esteroildal. Este
tipo de sustancias son muy polares y pueden ser extraídas con agua o
alcoholes de bajo peso molecular (Catedra, 2001).

Las quinonas son diacetonas insaturadas, que por reducción se convierten
en polifenoles. Contribuyen a la pigmentación, en fenómenos respiratorios
actúan como transportadores de electrones, por lo cual se les encuentra en
33
todos los seres vivos, algunas como la muscafurina son muy comunes en
hongos como Amanita muscaria (Brizuela 1998).

A través del conocimiento de estas estructuras, es posible diferenciar cada
una de las fracciones obtenidas de los cuerpos fructíferos, y de esta manera,
tener una aproximación del tipo de estructura encargada de causar el efecto
antimicrobiano o antitumoral, contra los hongos patógenos causantes de las
micosis en caninos y bovinos.

Por otra parte, los extractos crudos usualmente contienen una mezcla
compleja de sustancias. Estas mezclas pueden intervenir en el
sobrelapamiento o sinergismo de los efectos biológicos de las sustancias
presentes en estas, especialmente en los sistemas funcionales de ensayo.
De esta manera la actividad de algunos componentes biológicos presentes
en el extracto crudo, de manera individual, puede ser escondida como
resultado de la combinación de todos los componentes presentes en la
muestra (Schmid, 1999). Con el fin de evitar tales consecuencias se aplican
técnicas que pueden fraccionar compuestos presentes en un extracto crudo
por medio de fases sólidas o fases líquidas, separando los compuestos de
acuerdo a características comunes, fraccionando el extracto en grupos más
afines.

Además, es posible caracterizar los compuestos presentes en un extracto por
otro tipo de técnica, tal como la cromatografía de capa delgada, en la cual,
los componentes de la mezcla problema son separados por diferencias de
polaridades vehiculizados por solventes puros, así los componentes
mezclados migran a diferentes índices determinando el desarrollo del
cromatograma. Cuando la fase móvil se encuentra a una distancia apropiada,
la fase estacionaria es removida del tanque, y la fase móvil es rápidamente
secada y las bandas correspondientes a metabolitos son detectadas por la
34
aplicación de un reactivo de visualización apropiado. Las diferentes
migraciones son el resultado de varios estados de afinidad, entre la fase
estacionaria y la fase móvil, y de diferentes masas moleculares de los
metabolitos presentes en la muestra. Diferentes mecanismos de separación
son involucrados, las fuerzas predominantes dependen de la naturaleza
exacta de las dos fases y de los solutos. Las interacciones involucradas en la
retención determinante de la cromatografía y la selectividad incluyen enlaces
de hidrógeno, parejas de electrones de donadores y aceptores, entre iones, o
iones con dipolos e interaciones de van der Waals (Sherma, 1996). Al tener
un conocimiento previo sobre los solventes en los cuales los metabolitos de
interés son solubles, esta técnica puede ser ventajosa, para su identificación
en una muestra, y así ser aprovechada para la posterior evaluación de
metabolitos con posible actividad biológica.

La técnica directa de bioautografía sobre cromatogramas de capa delgada,
es un método para detectar sustancias fungitóxicas. Consiste en inocular e
incubar la cepa que se desea inhibir, sobre el cromatograma a partir del
extracto obtenido, con el fin de observar zonas de inhibiciónclaras sobre el
cromatograma, indicando la presencia de sustancias antimicrobianas en la
muestra (Howans, 1970). Muchos métodos bioautobiográficos han sido
introducidos con el objetivo de separar sustancias antimicrobianas. Esta
técnica presenta dentro de sus ventajas el ser altamente sensible y la
posibilidad de guardar y documentar los resultados. Sin embargo, cuando se
estudian compuestos fungitóxicos, se tiene el inconveniente que estas
sustancias pueden ser convertidas en otras sustancias sin la intervención de
enzimas, ya sea por oxidación o hidrólisis (Howans, 1970). La técnica
comúnmente se realiza para microorganismos no filamentosos, añadiendo
medio sólido sobre el cromatograma; sin embargo, se ha encontrado que al
asperjar conidios de un hongo suspendidos en una solución conteniendo
sacarosa y sales minerales sobre los cromatogramas de capa delgada,
35
además de ser más sencillo, se obtienen resultados más confiables en
comparación con el procedimiento tradicional (Colorado et al, 2007).

36
3. JUSTIFICACION

Los hongos dermatofitos y Fusarium, son agentes causales de
dermatofitosis, onicomicosis o keratitis en animales, patologías que se
presentan como áreas anulares de alopecia que se expanden
periféricamente, escamas, costras y en ocasiones foliculitis y pústulas. Sin
embargo, es posible que la adaptación entre el hongo y el hospedero sea
buena lo que genera portadores asintomáticos con la capacidad de transmitir
la micosis. Esto ha generando una disminución en la calidad de vida de
dichas especies, y en algunos casos perjudica al hombre y su industria,
debido a que las enfermedades micóticas son de carácter zoonótico, afectan
de manera intensa a organismos inmunosuprimidos o débiles, provocan
pérdidas en animales de producción y en ocasiones pueden afectar a
especies protegidas. El tratamiento tradicional de estas enfermedad es es
por medio de antifúngicos tales como polienos, azoles, alilaminas.
lipopéptidos y pirimidinas, las cuales tienen reacciones adversas y
nefrotoxicidad, debido a su carácter hepatotóxico, por lo que no son bien
toleradas; además de un alto costo y el prolongado tiempo de tratamiento (lo
que las encarece aún más). Autores como Allevato et al. (2007) y Méndez et
al. (2007) reportaron resistencias de cepas de Fusarium y dermatofitos a
determinados de estos antifúngicos. Por lo que cualquier investigación
encaminada a obtener sustancias menos costosas, pero igualmente o mas
efectivas que las ya existentes, constituiría un gran aporte en este campo. En
este orden de ideas, se busca como tratamiento alternativo la obtención de
sustancias naturales, que pueden tener menor costo en la producción y a su
vez efecto fungicida o fungistático. Aun cuando los organismos más
estudiados en este campo son actinomycetes, en los últimos años diversos
autores como Brizuela (1998) han reportado gran variedad de metabolitos
activos con efecto antimicrobiano, sin embargo dichos reportes no se han
dado en el país, solamente revisiones generadas por Mesa (2004). Del
37
mismo modo, se reportan efectos inmunomoduladores y anticancerígenos en
hongos de la división Basidiomycota. Relacionado a esto, autores como
Pulido 1983 y Franco en el 2000 describieron diversidad de hongos
macromicetos, en el altiplano cundiboyacense, dentro de los cuales una gran
mayoría lo ocupa la familia Tricholomataceae.

Basados en estos hechos, el objetivo del presente trabajo fue recolectar
hongos de la familia Tricholomataceae, identificar que tipo de moléculas
bioactivas pueden tener y evaluar la presencia de estos metabolitos con
actividad antifúngica frente a hongos causantes de dermatomicosis en
animales, tales como Trichophyton sp., Microsporum sp. y Fusarium sp. Se
espera que la metodología propuesta sea comúnmente usada para el estudio
de metabolitos en hongos macromicetos, y no se restrinja únicamente a
estudios botánicos, con la finalidad de poder explotar este tipo organismos a
nivel biotecnológico, como una opción alterna a su beneficio tradicional,
manera de comestibles; y que los hongos macromicetos empiecen a jugar un
rol tan importante como el de las plantas, por ejemplo del campo de
etnomicología.

38
4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Realizar una búsqueda de hongos agaricales, pertenecientes a la familia
Tricholomataceae, en Cundinamarca, posibles productores de metabolitos
con actividad antifúngica frente hongos aislados de micosis en caninos y
bovinos.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

� Recolectar hongos pertenecientes a la familia Tricholomataceae en el
departamento de Cundinamarca e identificarlos taxonómicamente
mediante caracteres morfológicos, microscópicos y macroscópicos.

� Elaborar extractos etanólicos y fracciones de diferente polaridad a
partir de los cuerpos fructíferos de los agaricales colectados e
identificados.

� Caracterizar químicamente los extractos, a nivel de grupos
funcionales, por medio de pruebas químicas preliminares y
cromatografía en capa delgada.

� Evaluar in vitro la actividad antifúngica de los extractos, por medio de
técnicas en placa y bioautografía, frente a Microsporum sp.,
Trichophyton sp. y Fusarium sp., agentes causales de micosis en
animales.

39
5. METODOLOGIA

En la figura No 5.1 se presenta un diagrama de flujo general de la
metodología a seguir para el desarrollo de la investigación.

Colección de cuerpos macromicetos con características
compatibles con individuos de la familia Tricholomataceae
500g de cuerpo
fructífero
Conservación (2 individuos para
colección tipo)
Identificación taxonómica Extracto etanólico
Pruebas
macroquímicas
Macroscopía y
microscopía
Identificación de
individuos por
seguimiento claves
taxonómicas
Fraccionamiento de
extracto etanólico
Caracterización
Caracterización
química
Actividad biológica
Pruebas
químicas
preliminares
TLC
Actividad
antifúngica contra
dermatofitos y
Fusarium sp.
Resultados: Perfil metabolitos
Perfil susceptibilidad dermatofitos y
Fusarium sp.
Entrega de resultados y
documentos finales
40
5.1 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DE LA FAMILIA
Tricholomataceae EN CUNDINAMARCA

Se realizaron muestreos en zonas de bosques de Zipaquirá, Chía, Mosquera,
Madrid, Subachoque, Chocontá, Sisga, Neusa, Suesca, Cogua, cerros
nororientales Bogotanos; y los parques naturales Chicaque, Mataredondo y
estación termal los volcanes. Los criterios tomados en cuenta en el momento
de realizar el muestreo, además de presentar características típicas de la
familia Tricholomataceae, fueron colectar una biomasa de 500g en peso
fresco de por lo menos tres especies. En el momento de la colecta se
registraron características contempladas en el formato correspondiente al
anexo 11.1 que comprende caracterización morfológica, macroscópica y
caracterización del sitio de muestreo; adicionalmente, se llevó registro
fotográfico de los sitios de muestreo y de los individuos colectados. Los
cuerpos fructíferos colectados en campo fueron sometidos a identificación
taxonómica mediante la determinación de características microscópicas y
pruebas macroquímicas con reactivos tales como, hidróxido de potasio
acuoso al 10%, azul de lactofenol, rojo de fenol y reactivo de Mezler.

5.2 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE CUERPOS
FRUCTÍFEROS

500g de cuerpos fructíferos, previamente lavados, fueron sometidos a
desecación durante 3 días a temperatura ambiente para posteriormente ser
macerados en licuadora (Oster cycle-bend 10) durante 2 minutos en etanol
96% (v/v). El material macerado se llevó a agitación a 4ºC en condiciones de
oscuridad en dos ciclos de 48 horas, filtrando y resuspendiendo la biomasa