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DISEÑO DE LAS ETAPAS DE HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN Y FERMENTACIÓN PARA PRODUCIR BIOETANOL BASADO EN LA RESPUESTA DINÁMICA DEL SISTEMA ANGEL DE JESÚS HERRERA ESCOBAR ROBERTO CARLOS MEERS DÍAZ UNIVERSIDAD DE CARTAGENA FACULTAD DE INGENIERÍA PROGRAMA DE INGENIERÍA QUÍMICA CARTAGENA DE INDIAS, D. T. Y C. 2013 DISEÑO DE LAS ETAPAS DE HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN Y FERMENTACIÓN PARA PRODUCIR BIOETANOL BASADO EN LA RESPUESTA DINÁMICA DEL SISTEMA Grupo de Investigación en Ingeniería Química ÁNGEL DE JESÚS HERRERA ESCOBAR ROBERTO CARLOS MEERS DÍAZ Proyecto de Grado presentado como requisito para optar al título de Ingeniero Químico Directora ISABEL CRISTINA PAZ ASTUDILLO, M. Sc, Ph. D. UNIVERSIDAD DE CARTAGENA FACULTAD DE INGENIERÍA PROGRAMA DE INGENIERÍA QUÍMICA CARTAGENA DE INDIAS, D. T. Y C. 2013 Nota de aceptación: _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________ _________________________________________ Firma del presidente del jurado _________________________________________ Firma del jurado _________________________________________ Firma del jurado Cartagena 09 /04 /13 DEDICATORIA A Dios, por permitirnos la realización de esta investigación, guiarnos en los momentos más difíciles y darnos la sabiduría para resolver cada uno de los problemas presentados en el transcurso de ésta. A nuestros padres y abuelos, que han sido el apoyo y motivación más grande que hemos tenido para el alcance de la meta que conlleva este trabajo final. A nuestros futuros hijos que verán reflejados en sus vidas los frutos de cada uno de los esfuerzos que se han hecho para abrirnos paso en este campo profesional. Ángel De Jesús Herrera Escobar Roberto Carlos Meers Díaz AGRADECIMIENTOS A Dios, quien nos orientó y fortaleció para vencer las dificultades presentadas en la parte de diseño, así como en la falta de herramientas informáticas inesperadas; por darnos la perseverancia día a día; por derramar muchas bendiciones en nuestras vidas, y por la oportunidad de terminar en el momento justo para la entrega. A la Universidad de Cartagena, por brindarnos la oportunidad de estudiar, ser un profesional, y llevar con orgullo el hecho de ser un egresado udeceista. Le agradecemos a nuestra tutora Isabel Paz, por su paciencia, dedicación, por ser nuestra guía para la realización de esta investigación, y sobre todo, por brindarnos su amistad de forma incondicional. A todos los docentes del programa de ingeniería química, quienes en el transcurrir de la carrera nos orientaron, nos brindaron sus conocimientos, exigieron, direccionaron y concientizaron con sus enseñanzas de tipo académico, personal y profesional, permitiéndonos el fortalecimiento en diferentes áreas de la ingeniería. CONTENIDO pág. INTRODUCCIÓN 1. OBJETIVOS .................................................................................................................. 1 1.1 OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 1 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................... 1 2. MARCO DE REFERENCIA .......................................................................................... 2 2.1 ANTECEDENTES ...................................................................................................... 2 2.2 ESTADO DEL ARTE ................................................................................................. 4 2.3 MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 05 2.3.1 Etapa de hidrólisis. .................................................................................................... 5 2.3.2 Etapa de fermentación ............................................................................................. 12 2.3.3. Modelamiento dinámico de reactores bioquímicos y enzimáticos ........................... 17 2.3.4. Bifurcaciones ......................................................................................................... 20 2.3.5. Fenómenos de estabilidad en biorreactores ............................................................. 22 3. METODOLOGÍA ........................................................................................................ 23 3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN ................................................................................... 23 3.2. FUENTES DE INFORMACIÓN.............................................................................. 23 3.2.1. Fuentes de información primaria. ........................................................................... 23 3.2.2 Fuentes de información secundaria. ......................................................................... 23 3.3. VARIABLES ........................................................................................................... 24 3.3.1. Operacionalización de las variables ........................................................................ 24 3.4 PROCEDIMIENTO .................................................................................................. 27 3.4.1. Modelamiento de la etapa de hidrólisis enzimática para producir bioetanol............. 27 3.4.2. Análisis de la respuesta dinámica del arranque de los procesos y el alcance de los estados estables para diferentes parámetros de operación. ........................................... 28 3.4.3. Selección de las condiciones de operación más adecuadas para alcanzar estados estables con alto rendimiento de producto de la etapa de hidrólisis. .................................. 29 3.4.4. Modelamiento de la etapa de fermentación para la producción de bioetanol. ........... 31 3.4.5. Análisis de la respuesta dinámica del arranque de los procesos y el alcance de los estados estables para diferentes parámetros de operación. ........................................... 31 3.4.6. Selección de las condiciones de operación más adecuadas para alcanzar estados estables con alto rendimiento de producto de la etapa de fermentación. ............................ 32 4. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS ..................................................... 34 4.1. MODELAMIENTO DE LA ETAPA DE HIDRÓLISIS ........................................... 34 4.1.1. Selección del modelo cinético ................................................................................ 34 4.1.2. Modelamiento del reactor continuo para la hidrólisis .............................................. 35 4.2. SIMULACIÓN DINÁMICA DE LA ETAPA DE HIDRÓLISIS .............................. 37 4.2.1. Selección preliminar del rango de alimentación de sustrato .................................... 37 4.2.2. Construcción y análisis de diagramas dinámicos de la etapa de hidrólisis (arranque y estabilización) ............................................................................................... 39 4.2.3. Construcción y análisis de diagramas de fase de la etapa de hidrólisis (arranque y estabilización) ............................................................................................................... 45 4.3. SELECCIÓN DE CONDICIONES DE OPERACIÓN ............................................. 48 4.3.1. Efecto de cada parámetro a seleccionar ................................................................... 48 4.3.2. Detección de fenómenos atípicos para el rendimiento del sistema ........................... 48 4.3.3. Selección de la velocidad de dilución ..................................................................... 52 4.3.4. Selección dela concentración de sustrato en la alimentación .................................. 54 4.4. MODELAMIENTO DE LA ETAPA DE FERMENTACIÓN EN UN CSTR ........... 56 4.4.1. Selección del modelo cinético ................................................................................ 56 4.4.2. Reajuste de parámetros dependientes de la temperatura .......................................... 57 4.4.3. Modelamiento del reactor continuo de tanque agitado ............................................ 60 4.5. SIMULACIÓN DINÁMICA DE LA ETAPA DE FERMENTACIÓN ..................... 61 4.5.1. Construcción y análisis de diagramas dinámicos de la etapa de fermentación (arranque y estabilización) ............................................................................................... 61 4.5.2. Construcción y análisis de diagramas de fase para la etapa de fermentación (arranque y estabilización) ............................................................................................... 66 4.6. SELECCIÓN DE CONDICIONES DE OPERACIÓN ............................................. 72 4.6.1. Efecto de cada parámetro a seleccionar ................................................................... 72 4.6.2. Selección de la temperatura de operación ............................................................... 73 4.6.3. Selección de la concentración de alimentación de sustrato para la operación........... 75 4.6.4. Selección de la velocidad de dilución para la operación .......................................... 77 4.7. DISEÑO OPERACIONAL ...................................................................................... 78 5. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 80 6. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 82 REFERENCIAS .............................................................................................................. 83 ANEXOS ......................................................................................................................... 88 LISTA DE TABLAS pág. Tabla 1. Parámetros reportados en función de la temperatura ........................................... 14 Tabla 2. Clasificación de estados estacionarios para un sistema bidimensional ................. 19 Tabla 3. Bifurcaciones de estado estacionario para sistemas de codimensión-1................. 21 Tabla 4. Parámetros de operación que afectan los sistemas bioquímicos. .......................... 22 Tabla 5. Variables de la simulación del proceso de hidrólisis. .......................................... 25 Tabla 6. Variables de la simulación del proceso de fermentación ..................................... 26 Tabla 7. Tiempo de estabilización para la glucosa. ........................................................... 43 Tabla 8. Tiempo de estabilización para la isomaltosa. ...................................................... 43 Tabla 9. Concentraciones de arranque, utilizando alimentación continua de biomasa. ...... 62 Tabla 10. Tiempos de estabilización con y sin alimentación fresca de biomasa................. 64 Tabla 11. Tiempos de estabilización del sustrato con y sin alimentación fresca de biomasa. ........................................................................................................... 64 Tabla 12. Tiempos de estabilización del producto con y sin alimentación fresca de biomasa. ........................................................................................................... 65 Tabla 13. Condiciones de operación para corridas dinámicas. .......................................... 71 Tabla 14. Comparación de condiciones de operación de la etapa de fermentación. ........... 77 Tabla 15. Parámetros de operación seleccionados para la etapa de hidrólisis. ................... 79 Tabla 16. Parámetros de operación seleccionados para la etapa de fermentación. ............. 79 LISTA DE FIGURAS pág. Figura 1. Representación gráfica de la metodología utilizada para la hidrólisis. ................ 30 Figura 2. Representación gráfica de la metodología utilizada para la fermentación. .......... 33 Figura 3. Representación gráfica de la etapa de hidrólisis. ................................................ 35 Figura 4. Análisis de la velocidad inicial neta de reacción para la producción de glucosa en función de la concentración de almidón licuado alimentado. ........... 38 Figura 5. Diagramas dinámicos con concentración de alimentación de almidón licuado 600 g/L y velocidad de dilución de 1.9 h -1 . ....................................................... 41 Figura 6. Diagramas de fase para la etapa de hidrólisis con concentración de sustrato de alimentación de 600 g/L, velocidad de dilución de 1.9 h -1 y diferentes condiciones de carga de sustrato y otras especies. ............................................ 46 Figura 7. Diagramas de fase para la etapa de hidrólisis, con concentración de sustrato de alimentación de 900 g/L y velocidad de dilución de 0.3 h -1 . ......................... 47 Figura 8. Diagrama de bifurcación 3D del rendimiento de la glucosa en función de los parámetros independientes: Concentración de sustrato alimentado y Velocidad de dilución. Para un rango de 10 g/L a 7000 g/L. ............................ 50 Figura 9. Panorámica en 2 dimensiones del diagrama de bifurcación 3D del Rendimiento de la glucosa en función de los parámetros independientes: Concentración de sustrato alimentado y Velocidad de dilución. Con un rango de alimentación de 60 g/L a 9000 g/L. ............................................................. 51 Figura 10. Diagrama de bifurcación 3D para la región de operación sin presencia de fenómenos atípicos: Concentración de sustrato alimentado = [60-1000] g/L. .... 53 Figura 11. Panorámica en 2 dimensiones del diagrama de bifurcación 3D para la región de operación sin presencia de fenómenos atípicos: Concentración de sustrato alimentado entre [80-1000] g/L. ....................................................................... 54 Figura 12. . Rendimiento de glucosa en función de la concentración de almidón alimentado con velocidad de dilución de 1.4 h -1 . .............................................. 55 Figura 13. Productividad de glucosa en función de la concentración másica de almidón alimentado 1.4 h -1 ............................................................................................ 55 Figura 14. Reajuste de la Velocidad específica de crecimiento máxima como parámetro cinético en función de la Temperatura. ............................................................. 57 Figura 15. Reajuste de la Concentración máxima de biomasa como parámetro cinético en función de la Temperatura. * ......................................................................... 58 Figura 16. Reajuste de la Concentración máxima de Producto como parámetro cinético en función de la Temperatura. .......................................................................... 58 Figura 17. Reajuste del Rendimiento de biomasa por sustrato consumido como parámetro cinético en función de la Temperatura. * ........................................... 59 Figura 18. Reajuste del rendimiento de producto respecto a la biomasa como parámetro cinético en función de la Temperatura. ............................................................. 59 Figura 19. Representación gráfica de la etapa de fermentación. ........................................ 60 Figura 20. Simulación dinámica para las concentraciones de biomasa, sustrato y producto con alimentación continúa de biomasa (2.5 kg/m 3 ) y sustrato (80 kg/m 3 ), velocidad de dilución 0.2 h -1 y temperatura de 34.6 . ......................... 63 Figura 21. Dinámica del arranque y estabilizacióndel sistema con D=0.2 h -1 , T=34.6 ºC, Csf =105 kg/m 3 , Cxf=2.5 kg/m 3 , Cpf=0 kg/m 3 , Cs0=140 kg/m 3 , Cx0=9.5 kg/m 3 y Cp0=0 kg/m 3 . ..................................................................................... 67 Figura 22. Diagramas de fase para el sistema con D=0.2 h -1 , T=34.6 ºC, Csf=105 kg/m 3 , Cxf =2.5 kg/m 3 , Cpf=0 kg/m 3 , Cs0=140 kg/m 3 , Cx0=9.5 kg/m 3 y Cp0=0 kg/m 3 ... 68 Figura 23. Diagramas de fase para el sistema con D=0.2 h-1 ,T=34.6 ºC, Csf =105 kg/m3, Cxf =2.5 kg/m3, Cpf=0_kg/m3 , Cs0=60,80,100,120 y 140 kg/m3, Cx0=9.5 kg/m3 y Cp0 =0 kg/m 3. ........................................................................ 69 Figura 24. Diagramas de fase para el sistema con D=0.13 h -1 , T=34.6 ºC, Csf=135 kg/m 3 , Cxf=4.5 kg/m 3 , Cpf=0, Cs0=60, 90 y 120 kg/m 3 , Cx0=2, 4, 8, 10 y 12 kg/m 3 y Cp0=0 kg/m 3 . ....................................................................................... 70 Figura 25. Diagramas de fase para el sistema con D=0.2 h-1, T=34.6 ºC, Csf=80 kg/m3, Cxf =2.5 kg/m3, Cpf=0_kg/m3 , Cs0=40, 80, 120, 160, 200 y 240 kg/m3, Cx0=3.2 kg/m3 y Cp0=0 kg/m3. ........................................................................ 71 Figura 26. Diagrama de bifurcación de Temperatura vs. Rendimiento, para diferentes Velocidades de dilución: D=0.15 h -1 (negro); D=0.25 h -1 (rojo); D=0.35 h -1 (azul). .............................................................................................................. 73 Figura 27. Diagrama de bifurcación de Temperatura vs. Rendimiento, para diferentes concentraciones de Sustrato alimentado, kg/m 3 : Csf=200 (negro), Csf=70 (rojo), Csf=45 (verde), Csf=30 (azul). ............................................................ 74 Figura 28. Diagrama de bifurcación para sistema de producción de etanol con Saccharomyces cerevisiae. Csf = 80 kg/m 3 (negro), Csf = 120 kg/m 3 (azul), Csf = 160 kg/m 3 (verde), Csf = 200 kg/m 3 (rojo). ............................................... 75 Figura 29. Diagrama de bifurcación para sistema de producción de etanol con Saccharomyces cerevisiae. Csf=80 kg/m 3 (negro), Csf=120 kg/m 3 (azul), Csf=160 kg/m 3 (verde) Csf=200 kg/m 3 (rojo). .................................................... 76 Figura 30. Representación gráfica de las etapas de hidrólisis y fermentación. ................... 78 LISTA DE ANEXOS pág. ANEXO A ...................................................................................................................... 89 ANEXO B ...................................................................................................................... 91 ANEXO C ....................................................................................................................... 93 ANEXO D ...................................................................................................................... 94 ANEXO E ....................................................................................................................... 95 ANEXO F ....................................................................................................................... 98 ANEXO G ...................................................................................................................... 99 ANEXO H .................................................................................................................... 100 RESUMEN En este trabajo fueron diseñadas las etapas de hidrólisis y fermentación para producir bioetanol a partir de almidón de yuca amarga, basándose en la respuesta dinámica del sistema, con el fin de obtener un proceso continuo estable y con alto rendimiento de producto. En el estudio, se implementaron modelos cinéticos complejos de estructura matemática no lineal que permitieron verificar fenómenos de inestabilidad que propiciaron bajo rendimiento de producto. Se simuló el arranque de cada etapa en un biorreactor de tanque agitado continuo (CSTBR) utilizando códigos programados en Matlab. Los resultados permitieron determinar el efecto de la velocidad de dilución, y la concentración de alimentación de sustrato sobre la estabilidad de ambas etapas, así como el efecto de la temperatura sobre la estabilidad del proceso de fermentación. Mediante el análisis de la información, se establecieron valores para los parámetros de operación estudiados y para las concentraciones de arranque, que permitieron alcanzar y mantener estados estables de alta productividad y rendimiento en cada uno de los procesos. Se obtuvo un diseño integral al incluir un análisis coherente de la respuesta dinámica del sistema para cada una de las etapas. Este diseño aporta a la solución de problemas que se presentan actualmente en las plantas industriales de producción de alcohol carburante, relacionados a caídas de rendimiento inesperadas que se atribuyen a la inestabilidad del sistema. Palabras claves: Hidrólisis, fermentación, amiloglucosidasa, estabilidad, Saccharomyces cerevisiae. http://es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae ABSTRACT The hydrolysis and fermentation stages for producing bioethanol from bitter yucca starch were designed based on the dynamic response of the system with the purpose of obtaining a stable process with high product yield. During the study, complex kinetic models with nonlinear mathematical structure were used with the purpose of verifying un-stability phenomena leading to low product yield. The starting up of each stage in a continuous stirred tank bioreactor (CSTBR) was simulated by means of own codes programmed in Matlab. The results allowed determining the effect of the dilution rate, and feed substrate concentration on the stability of both stages. Likewise, the effect of temperature on the stability of the fermentation process was established too. From analysis of the information, values for the studied operation parameters and for the starting up concentrations, that allow reaching and maintaining stable steady states with high productivity and yield for each process, were defined. An integral design was obtained through the analysis of dynamic response of the system for each process. The design obtained for the starch hydrolysis and glucose fermentation stages contributes to the solution of problems related to unexpected falls of the yield, attributed to system’s stability, during the industrial fuel ethanol production. Keywords: Hydrolysis, fermentation, amyloglucosidase, stability, Saccharomyces cerevisiae. http://es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae INTRODUCCIÓN Según el Programa de Uso Racional y Eficiente de Energía y Fuentes no Convencionales (PROURE), Colombia presentó, entre los años 1999 y 2008, un incremento anual promedio de 1,2% en la demanda energética. Con una proyección de 2,6%, del 2008 al 2020, el Estado debe garantizar la disponibilidad de recursos para suplir tal demanda (PROURE, 2010). En efecto, con la inminente disminución de recursos fósiles, el gobierno nacional ha impulsado un marco normativo de incentivos tributarios y financieros para fomentar la producción y el consumo de combustibles de origen biomásico a partir de la Ley 693 del 2005 (FedeBiocombustibles, 2012), con lo cual en Colombia la producción actual de etanol es de 1’275.000 L/día (FedeBiocombustibles, 2012) y se espera que llegue a 3’798.163 L/día para el 2020 (BIRD, 2008), mostrando una tendencia de aumento en la demanda de alcohol carburante para oxigenación de la gasolina. En Colombia, la demanda de bioetanol como combustible ha sido satisfecha, en gran parte, por la caña de azúcar. Según la Asociación de Cultivadores de Caña de Azúcar de Colombia (Asocaña, 2012), la caña procesada en Colombia presenta, para el 2009, 2010 y2011, niveles de 23`588.646, 20.272.594 y 22`727.758 TM (equivalente a volumen de azúcar crudo) y una producción de alcohol carburante de 326, 291, y 336 millones de l/año, con una concentración de 98% de bioetanol. El uso extensivo de esta materia prima se debe al alto rendimiento que tiene para producción de bioetanol frente a otros cultivos (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2012). Sin embargo, al tener en cuenta el inminente aumento esperado de la demanda de bioetanol, el uso de cultivos alimenticios tales como el de la caña de azúcar en Colombia implica un riesgo para la seguridad alimentaria; lo cual va en contra vía al desarrollo territorial sostenible propuesto por las políticas del Gobierno Nacional (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2006). Un problema claro con la implementación de nuevas tecnologías es garantizar una producción acorde con la oferta de materias primas disponibles en la región. Es así como el Gobierno Nacional ha impulsado un plan de diversificación energética para la producción de biocombustibles en todo el país (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2006). Una materia prima alternativa para la producción de bioetanol es la biomasa lignocelulósica proveniente de residuos con alto contenido de celulosa pero su tecnología es muy insipiente aún. Otra alternativa es la materia prima de origen amiláceo. De hecho, en Estados Unidos el alcohol se procesa a partir de maíz por su alto contenido de almidón (Copelo, 2007). Sin embargo, en Colombia es un alimento de primera generación y, por lo tanto, no es una opción viable, haciendo necesario buscar otra alternativa que no atenten contra la seguridad alimentaria. Teniendo en cuenta que la producción de bioetanol se concentra en el interior del país, se presenta una oportunidad para el departamento de Bolívar, que no es gran productor de caña (Biblioteca Virtual del Banco de la República, 2005), de implementar nuevas plantas productoras de bioetanol a partir de otras materias primas con alta producción en la región; al mismo tiempo incentivando el mercado agrícola, tan azotado por conflictos armados, y favorecer el auge de la economía bolivarense, siendo uno de los departamentos donde se cultivan mayores cantidades de yuca amarga en el país (Secretarías de Agricultura Departamentales - UMATA, 2006-2007). Por ser un tubérculo que solo se utiliza para la alimentación de los cerdos, se convierte en un problema por las grandes cantidades que quedan fuera de esta forma de aprovechamiento, abriéndose así una puerta para otras aplicaciones. Además, ha sido la materia prima seleccionada para esta investigación por el alto contenido de almidón de este material, el fácil procesamiento del mismo y la adaptabilidad de su cultivo en terrenos áridos (Alarcón & Dufour, 1998). Por otro lado, investigaciones previas referentes a los procesos de producción de etanol mediante fermentación, han desarrollado la hipótesis que en las actuales plantas instaladas productoras de bioetanol, incluso cuando las condiciones y parámetros físicos se mantienen constantes, se presentan caídas inesperadas en el rendimiento de las etapas que involucran el bioproceso, las cuales propician una consecuente reducción de su productividad, problemas de operación, paradas de planta, pérdidas de materia prima y pérdidas económicas. Estas investigaciones destacaron que esto se debe a la presencia de fenómenos de inestabilidad típicos de sistemas altamente no lineales, los cuales no se han tenido en cuenta durante el diseño de los procesos fermentativos (Paz, 2010). La implementación adecuada de tecnologías eficientes de producción de alcohol carburante en la región depende, directamente, de dar solución a los problemas de estabilidad en los procesos que existen actualmente y, por ende, se necesita realizar un diseño de las etapas de hidrólisis y fermentación que permitan alcanzar y mantener estados estables con alto rendimiento (Paz, 2010). Entonces, un análisis coherente del comportamiento dinámico de las cinéticas de hidrólisis del almidón y fermentación de los azúcares, proporcionará los parámetros pertinentes de diseño y las condiciones adecuadas de operación para estos bioprocesos con altas cantidades producidas (Paz & Cardona, 2009). Además, proveerá una base para la implementación adecuada de tales etapas en nuevos complejos de producción de bioetanol en la región. Con el fin de contribuir al continuo mejoramiento de los procesos de producción de bioetanol en el país y de aportar un mayor entendimiento sobre el diseño integral de sus etapas, en este trabajo se desarrolló mediante simulación un análisis coherente de la respuesta dinámica del sistema en la hidrólisis y la fermentación, basado en cinéticas relativamente complejas que permiten verificar fenómenos de inestabilidad. Por consiguiente, al aplicar este análisis, se proporcionaron los parámetros y condiciones operacionales para el diseño integral de las etapas de hidrólisis del almidón y fermentación de los azúcares en el proceso de producción de bioetanol, teniendo en cuenta el comportamiento dinámico de las mismas, para realizar un control simultáneo de las operaciones, que garanticen el alcance y mantenimiento de estados estables de alto rendimiento (Paz & Cardona, 2009). 1 1. OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GENERAL Diseñar las etapas de hidrólisis y fermentación para producir bioetanol a partir de la yuca amarga, basado en el análisis de la respuesta dinámica del sistema. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Modelar los procesos continuos de hidrólisis enzimática del almidón y la fermentación de los azúcares para producir bioetanol, a partir de balances de masa y expresiones cinéticas, con el fin de reproducir el comportamiento dinámico del sistema. 2. Analizar la respuesta dinámica del arranque de los procesos, para evaluar el efecto de diferentes parámetros de operación sobre el alcance de estados estables, mediante simulación dinámica. 3. Seleccionar las condiciones de operación más adecuadas que permitan alcanzar estados estables con alto rendimiento de producto en las etapas estudiadas, basado en el análisis del comportamiento del sistema. 2 2. MARCO DE REFERENCIA 2.1 ANTECEDENTES El análisis dinámico de las etapas de hidrólisis de almidón y la fermentación de azúcares amerita un modelamiento pertinente basado en expresiones cinéticas que permitan describir el comportamiento del sistema, teniendo en cuenta factores que intervienen en el alcance de altos rendimientos de producto para cada una de las etapas. En la literatura se encuentran múltiples modelos cinéticos que describen la hidrólisis del almidón. Uno de estos modelos describe la cinética de la hidrólisis de almidón soluble con glucoamilasa como una modificación de la ecuación de Michaelis- Menten que tiene en cuenta algunos factores que afectan la velocidad de reacción (inhibición por productos, desnaturalización de la enzima, cambios del pH y de la fuerza iónica, reversibilidad de la reacción, etc.). Pero este modelo presenta una desventaja respecto a las conversiones pues no es aplicable a conversiones mayores al 40%, lo que se convierte en una limitante para el estudio de cinéticas que estén relacionadas con conversiones superiores (González, et al., 1990). En 1997, Zanin y Moraes plantearon un modelo cinético para la hidrólisis, en el cual usaron un modelo multisustrato para enzimas inmovilizadas teniendo en cuenta la formación de productos intermedios, la reversibilidad de algunas reacciones, la inhibición por sustrato, producto y la formación de isomaltosa. Obtuvieron los parámetros cinéticos mediante pruebas de velocidad inicial de sacarificación con enzima inmovilizada y para diferentes concentraciones de almidón licuado; siendo este modelo válido para reactores de lecho fijoy fluidizado, además, muestra que la inhibición por producto es 7 veces más alta en reactores de lecho fijo que en los de lecho fluidizado (Zanin & Moraes, 1997). Modelos cinéticos para la fermentación de azúcares han sido ampliamente estudiados. En el año 2001, Atala y compañía, desarrollaron y validaron un modelo considerando los efectos de temperatura e inhibición de sustrato, producto y biomasa, en el cual los 3 parámetros cinéticos son descritos como función de la temperatura. Este modelo fue desarrollado a partir del estudio de las cinéticas de fermentación bajo condiciones de alto estrés para el microrganismo permitiendo determinar los efectos de inhibición; y se extiende al uso industrial pues también consideró un proceso continuo y utilizó como sustrato azúcar recuperada (Atala, et al., 2001). Respecto al cultivo de la yuca, el Programa de Apoyo a la Modernización Tecnológica del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR) ha estado aplicando desde la década pasada una política coherente con la política actual del gobierno (PND), junto con el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y el Consorcio Latinoamericano y del Caribe de Apoyo a la Investigación y Desarrollo de la Yuca (CLAYUCA), liderando el trabajo en este área. Esta política agropecuaria de mediano y largo plazo busca impulsar el mejoramiento tecnológico, el crédito y el financiamiento, la comercialización y la formación de capital social en la producción agrícola, mediante la aplicación de estrategias que se apoyan en la capitalización y la organización de los productores (Ospina & Ceballos, 2002). El Gobierno Nacional ha promovido el desarrollo de los biocombustibles mediante un marco legal comprendido por la Ley 693 de 2001, que describe el uso de alcoholes carburantes en Colombia. Luego, aparece la ley 939 de 2004 como estímulo de la producción y comercialización de biocombustibles para el uso de motores diesel. Aparece en el 2002 una contextualización de los biocombustibles en el mercado, con la Ley 788 del mismo año (Reforma Tributaria, Artículo 31), la cual exoneraba de pago de iva al alcohol carburante, y, en el artículo 88, se decretaba la exoneración de pago de sobretasa al uso de alcohol carburante (CONPES, 2008). Mediante el Decreto 383 de 2007 se establecen estímulos a la implementación de zonas francas para proyectos agroindustriales en materia de biocombustibles, y, en la última reforma tributaria, estímulos a la inversión de hasta un 40 %. La Resolución 447 de 2003, modificada por la resolución 1565 de 2004 en la cual establecen los requisitos técnicos y ambientales de los combustibles oxigenados. 4 Apareciendo la Resolución 18 0222 de 2006 de Ministerio de minas, por la cual se establece el precio del alcohol carburante. 2.2 ESTADO DEL ARTE Según el Programa de Uso Racional y Eficiente de Energía y Fuentes no Convencionales (PROURE) - en Colombia se presentó, entre el año 1999 y el 2008, un incremento anual promedio de 1,2 % en la demanda energética. Con una proyección esperada de incremento anual medio de 2,6 %, del 2008 al 2020, debe garantizarse, por parte del Estado, la disponibilidad de recursos para suplir tal demanda. Siendo un hecho la inminente disminución de recursos fósiles disponibles, el gobierno nacional ha impulsado un marco normativo y una política de incentivos tributarios y financieros para fomentar la producción y el consumo de combustibles de origen biomásico estableciendo el uso de mezclas estándar de combustibles fósiles y biocombustibles en el país. El porcentaje reglamentado para el etanol es de 10% ± 0.5% en volumen, a partir del 1° de enero de 2010 (PROURE, 2010). Cumpliendo con lo dispuesto en la Ley 693 de 2001, el país empezó a implementar esta iniciativa para la creación de plantas de producción de alcohol carburante en la región suroccidental, donde el 28 de octubre de 2005, se inauguró la primera planta productora de alcohol carburante. En el 2006, se inaugura la primera planta de obtención de bioetanol a partir de yuca amarga en el departamento de Meta. Este complejo agroindustrial tomó el nombre de Cantaclaro y pretende, en el año 2012, doblar su producción actual (GPC, 2012). Por otra parte, estudios anteriores han demostrado que algunas plantas ya instaladas, que producen bioetanol a partir de jugo de caña y melaza, presentan problemas inesperados de inestabilidad del sistema durante la etapa de arranque y de operación que conllevan a paradas de producción y, por consiguiente, a pérdidas económicas significativas. Dicho estudio estableció que el problema de inestabilidad se debe a que durante el diseño de la 5 etapa de fermentación no se tiene en cuenta la respuesta dinámica del biosistema, y permitió resaltar la importancia de los estudios de estabilidad en tales sistemas de producción (Paz & Cardona, 2011). La evaluación del comportamiento dinámico y la estabilidad de un sistema de fermentación continua busca mostrar que, mediante el análisis anterior, se pueden definir las regiones de interés operativo para la producción de etanol, teniendo en cuenta la caracterización de puntos fijo, puntos de bifurcación y planos de fase para los modelos de crecimiento microbiano de Haldane y Monod (Trejos, Fontalvo, & Gómez, 2009). Es pertinente tener en cuenta que, actualmente, el diseño de la mayoría de las fermentaciones se lleva a cabo mediante pruebas de ensayo y error, en las que no se tienen en cuenta todos los fenómenos de estabilidad que caracterizan el sistema; conllevando esto a que el proceso no siempre opere dentro de una región estable y se obtengan desviaciones en las variables de salida. Como resultado del estudio se estableció una alternativa para el diseño de estos procesos, que tiene en cuenta el análisis de la estabilidad del sistema, lo cual permite la selección de los parámetros de operación con base en la respuesta dinámica del sistema (Paz, 2010). 2.3 MARCO TEÓRICO 2.3.1 Etapa de hidrólisis. La hidrólisis consiste en la doble descomposición de la molécula de agua ( y ) con otro compuesto, en la cual sus átomos forman otra especie química. Por la naturaleza disolvente del agua, también puede efectuarse la hidrólisis mediante adición de un ácido o una enzima. Reacción de hidrólisis: Ec. (1) 6 Con el objetivo de producir azúcares fermentables (de menor peso molecular) por acción de microorganismos o digestión ácido, se somete a hidrólisis almidón. Esta reacción consiste en un desdoblamiento del almidón, propiciado, por exceso de agua o por una pequeña cantidad de enzima o ácido (AGRONET, 2006). 2.3.1.1 Tipos de hidrólisis. Existen reportados en la literatura dos tipos de hidrólisis según el catalizador que se utilice. Hidrólisis ácida: El almidón es tratado con un ácido que permite el rompimiento de las cadenas cortas de dextrina. La concentración del ácido, el pH, la temperatura y el tiempo de hidrólisis son los parámetros de los cuales depende el grado de degradación. Por consiguiente, las reducciones del peso molecular y de la viscosidad son inversamente proporcionales al poder de reducción que aumenta por acción del ácido. Siendo el ácido nítrico y el ácido clorhídrico, los más utilizados en este tipo de hidrólisis, la clase de ácido es un factor determinante en el tiempo de sacarificación, al igual que la concentración, la temperatura, la presión y la relación másica con respecto al almidón. Generalmente, mientras se lleva a cabo la hidrólisis debe mantenerse un pH de 1.5, para lo cual deben agregarse las cantidades adecuadas de ácido que permitan mantenerlo en este valor (AGRONET, 2006). Hidrólisis Enzimática: Este proceso consiste en la utilización de enzimas como catalizadores para romper las moléculas de almidón, obteniéndose productos semejantesa los de la hidrolisis ácida. El tipo de enzima más utilizada en este proceso son las amilasas, siendo las más conocidas la α-amilasa y la β-amilasa, las primeras desdoblan el almidón en glucosa y maltosa; se caracteriza por la facilidad de fragmentación de los almidones en dextrinas reductoras, que no dan color en el yodo, y la segunda, convierte la totalidad del almidón en glucosa (AGRONET, 2006). Al utilizar amilasas, es preciso mantener un proceso de cocción que favorezca la dispersión y la aceleración del rompimiento de las cadenas de almidón. Las amilasas actúan sobre el almidón dependiendo del origen de este, puesto que la composición del mismo cambia 7 según su origen, es decir, el almidón consta de amilopectina y amilosa, con porcentajes de mezcla en un intervalo de 75 a 80 de amilopectina. Además, la amilosa se compone de unidades de glucosa enlazadas (tipo α-1,4 glicosídico) en cadenas longitudinales que pueden contener aproximadamente de 70 a 100 unidades de glucosa. Todo esto depende del origen del almidón (AGRONET, 2006). Existen dos fases dentro del proceso de Hidrólisis enzimática. Primero, la licuefacción y segundo, la sacarificación. La licuefacción se lleva a cabo en presencia de alfa-amilasa o beta-amilasa, mientras que la sacarificación, que es la conversión de almidón a glucosa, en presencia de glucoamilasa o pollulanasa (AGRONET, 2006). Mediante las diastasas de la malta o por las diastasas de los hongos se lleva a cabo la conversión del almidón a azúcares susceptibles de fermentación. Esta transformación se da a través de productos intermedios no fermentables. La cantidad de maltosa producida depende de la concentración en el mosto, la duración de la acción de las diastasas y de la temperatura (AGRONET, 2006). Al comparar los dos tipos de hidrólisis se encuentra la gran ventaja de la hidrólisis enzimática sobre la ácida. Esto se debe, primordialmente, a que las enzimas son específicas para un tipo de enlace (selectividad), por lo cual, no es usual la aparición de productos de degradación; caso contrario sucede con la hidrólisis ácida, en la cual, el poco control y la selectividad pobre ocasionan la aparición de productos de degradación, inclusive tóxicos. Otra ventaja son los rangos moderados de condiciones como temperatura y pH en las que transcurre la hidrólisis enzimática (pH=4-8; T=40-60°C). Además, no se presentan sustancias extrañas añadidas como en el caso de la hidrólisis acida para la neutralización (presencia de sales) (Guadix, et al., 2009). 2.3.1.2 Cinética de la etapa de hidrólisis. El modelo más simple y básico, para el estudio de las cinéticas de reacción enzimática, supone la ocurrencia de una reacción reversible entre una enzima (E) y un sustrato (S) para dar como producto un complejo enzima-sustrato (ES); y luego, dar lugar a una reacción 8 irreversible donde se obtiene un producto P y la enzima (E), haciendo así que la enzima vuelva a su estado original (regeneración) (Orrego, Cetina, & Hernández, 2009). Ec. ( 2 ) Se asume que la velocidad de esta reacción es proporcional a la concentración del complejo enzima-sustrato (ES), así: Ec. ( 3 ) El parámetro de Michaelis-Menten, denominado también la constante de Michaelis , relaciona la velocidad a la que se forma el complejo con las velocidades de liberación de producto , de la enzima y de sustrato . Ec. ( 4 ) Con el fin de tener en cuenta la concentración total de enzima en el sistema (enzima– sustrato y enzima libre) y normalizar la expresión de la velocidad de reacción se deduce que: Ec. ( 5 ) Ec. ( 6 ) Al introducir el parámetro , que representa la máxima velocidad de reacción posible, queda la Ec. ( 7) conocida como la ecuación de Michaelis Menten. Ec. ( 7 ) A este modelo se le han hecho varias modificaciones, con el fin de predecir el efecto inhibitorio del sustrato y producto sobre la enzima, por lo cual, este tipo de modelos con modificaciones son los más apropiados para analizar la respuesta dinámica del sistema. Tales modificaciones se han introducido con nuevos parámetros que permiten una 9 descripción más acertada del comportamiento evidenciado experimentalmente. Por ejemplo, González y compañía, realizaron un ajuste, que permitió una visualización más objetiva de cómo se lleva a cabo este proceso a nivel real, para conversiones menores a 40% (González, et al., 1990). Otro de los modelos planteados en los últimos años fue desarrollado por Zanin y compañía. La estructura de este modelo muestra la complejidad de las cinéticas involucradas en la hidrólisis del almidón utilizando como enzima la amiloglucosidasa. Realizaron el modelamiento cinético de la etapa mediante la descripción de la ocurrencia de reacciones múltiples, teniendo en cuenta: la presencia de oligosacáridos susceptibles y resistentes en el almidón, la de productos intermedios que se dan en reacciones secundarias, y los efectos de la inhibición por producto y sustrato (Zanin & Moraes, 1997). El modelo se basa en las siguientes consideraciones y la nomenclatura respectiva está disponible en los ANEXOS A, B y C: 1. El sustrato tiene un grado de polimerización promedio que está dado por los oligosacáridos que lo componen, productos de un pretratamiento del almidón con α- amilasa (se asume que el grado de tales oligosacáridos es mayor que 3). Según reportes en la literatura, el grado de polimerización es , basado en la descripción de Reilly para la acción de la α-amilasa ( ). 2. Estos oligosacáridos son considerados como Oligosusceptibles (aproximadamente el 77% de las moléculas), los cuales son más hidrolizables pues poseen enlaces α-1,4; y Oligoresistentes , que son menos hidrolizables, poseen enlaces α-1,6 y constituyen el 23% de las moléculas. 3. La sacarificación se da mediante múltiples reacciones simultáneas que son divididas en tres tipos: a. Reacciones de hidrólisis de los oligosacáridos con descritos anteriormente: 10 b. La hidrólisis de Maltotriosa es reversible: c. La hidrólisis de Maltosa es reversible: 4. Puede ocurrir la reacción de condensación de Glucosa . Esta reacción es reversible: 5. Existe una inhibición de producto , para el caso glucosa en las reacciones en que interviene como producto, excepto la de condensación. 6. Existe una inhibición de sustrato por los oligosacáridos con , pero no para la maltotriosa y la maltosa. 7. Todos los sustratos compiten por el sitio activo de la amiloglucosidasa. 8. Durante la sacarificación, el agua está en exceso, por lo tanto, su concentración se asume constante. 9. A 45 °C, pH 4.5 y cantidad de enzima inmovilizada por volumen de reacción (E) de 749.85 g/L, la estabilidad de la amiloglucosidasa es alta, por lo tanto, se considera la desactivación térmica de la enzima despreciable (Zanin & Moraes, 1997). La estructura del modelo cinético se basa en la interacción entre oligosusceptibles ( , oligoresistentes , maltotriosa , maltosa e isomaltosa , mediante las siguientes velocidades de reacción [Ec. ( 8) - Ec. ( 15)] (Zanin & Moraes, 1997): Velocidad de Hidrólisis de Oligosusceptibles, : [ ( ) ] Ec. ( 8) Velocidad de Hidrólisis de Oligoresistente, : [ ( )] Ec. ( 9) 11 Velocidad de Hidrolisis Maltotriosa : ( ) [ ( ) ] Ec. ( 10) En equilibrio: Ec. ( 11) Velocidad de Hidrolisis Maltosa : ( ) [ ( ) ] Ec. ( 12) En equilibrio: Ec. ( 13) Velocidad de formación (reacción de condensación) de Isomaltosa, : ( ) Ec. ( 14) En equilibrio: Ec. ( 15) Teniendo en cuenta el efecto de reacciones múltiples se deducen los términos de velocidad neta de reacción, para cada componente, así (Zanin & Moraes, 1997): Velocidad neta de Oligosusceptibles , : Ec. ( 16) Velocidad neta de Oligoresistentes , : Ec. ( 17) Velocidad neta de Maltotriosa , : Ec. ( 18) Velocidad neta de Maltosa , : Ec. ( 19) 12 Velocidad neta de Isomaltosa , : Ec. ( 20) Velocidad neta de Glucosa , : Ec. ( 21) 2.3.2 Etapa de fermentación La fermentación se lleva a cabo cuando una sustancia orgánica de origen vegetal libre de nitrógeno sufre un conjunto de reacciones químicas por medio de algún microrganismo (bacterias, bacilos, levaduras, mohos), donde por lo general, se produce un desprendimiento gaseoso y se da una producción de energía, que es adquirida por los microrganismos, la cual cuando se oxida el compuesto disminuye (AGRONET, 2006). La fermentación de la glucosa y materiales azucarados mediante la acción de microorganismos tiene como objetivo la producción de etanol. Los microorganismos más utilizados para la producción de etanol a partir de glucosa son la levadura Saccaromyces cerevisiae y la bacteria Zymomonas mobilis. 2.3.1.1 Cinética de la etapa de fermentación Múltiples modelos matemáticos han sido propuestos, con el fin de reproducir mediante simulación el crecimiento microbiano que se da en los procesos fermentativos. Uno de los más sencillos y, por lo tanto, más utilizado, es el planteado por Monod; su simplicidad se deriva del número reducido de parámetros de ajuste en su expresión matemática, sin embargo, debe decirse que tal estructura posee un principio bioquímico (Fogler, 2008). Ec. ( 22) Donde, Velocidad de reacción específica de crecimiento máxima, s -1 . Constante de Monod, g/cm 3 . Concentración de sustrato, g/cm 3 . Concentracione de célula, g/cm 3 . 13 Otro modelo planteado en los últimos años en el cual se consideró el efecto de la temperatura sobre la cinética de la reacción es el de Andrade. Se llevaron a cabo experimentos en batch a temperaturas desde 30 hasta 38°C y el microorganismo utilizado fue Saccharomyces cerevisiae. El objetivo fue evaluar la dificultad en la actualización de los parámetros cinéticos cuando hay cambios en las condiciones de fermentación en el que la reestimación es una tarea que consume tiempo, además tuvo en cuenta el efecto de la inhibición por sustrato (Andrade, 2007). La estructura del modelo cinético se basa en la interacción bioquímica entre las siguientes especies: biomasa (X), sustrato (S) y producto (P), y se describe mediante las siguientes velocidades de reacción (Atala, et al., 2001): Velocidad para Crecimiento de Células: ( ) ( ) ( ) Ec. ( 23 ) Velocidad para Producto: Ec. ( 24 ) Velocidad para Sustrato: Ec. ( 25 ) Definidas las constantes como: La nomenclatura y algunas especificaciones del modelo pueden encontrarse en los ANEXOS F y H. Ahora bien, según este modelo cinético, las expresiones de las velocidades netas de reacción para cada componente interviniente (biomasa, sustrato y producto) se expresan (Andrade, 2007): 14 Velocidad neta de reacción de la biomasa (X), : Ec. ( 26) Velocidad neta de reacción de sustrato (S), : Ec. ( 27) Velocidad neta de reacción de producto (P), : Ec. ( 28) El modelo cinético propuesto por Andrade y compañía presenta expresiones que representan el efecto de la temperatura sobre algunos parámetros importantes del proceso fermentativo, válido para el intervalo de temperatura 30 a 38 ºC (Andrade, 2007). Parámetros dependientes de la temperatura Ec. ( 29 ) Ec. ( 30 ) Ec. ( 31 ) Ec. ( 32 ) Ec. ( 33 ) Para estos parámetros cinéticos en la Tabla 1 se reportan los valores de las constantes de ajuste (Andrade, 2007). Tabla 1. Parámetros reportados en función de la temperatura Parámetros A B C D Fuente: Andrade R. 2007. Estimation of temperature dependent parameters of a batch alcoholic fermentation process, Applied Biochemistry and Biotechnology. pág 758. 15 2.3.2.2 Estabilidad de sistemas continuos para la producción de etanol Empíricamente, se ha demostrado que en la operación de biorreactores de tanque agitado continuos, se exhiben fenómenos característicos de sistemas no lineales, como son la multiplicidad de estados estacionarios para un conjunto de parámetros determinados, oscilaciones de algunas variables del proceso y bifurcaciones. En la mayoría de los procesos estos fenómenos no lineales disminuyen la productividad del proceso (Paz, 2010). Bajo la premisa de predecir el comportamiento de los sistemas microbianos en el tiempo se han propuesto varios tipos de modelos que describen el crecimiento celular. Pueden clasificarse tales modelos en: no estructurados, estructurados, no segregados y segregados. Ahora bien, al tener en cuenta los efectos de inhibición que afectan a los microorganismos por altas concentraciones de sustrato y producto, se han modificado las cinéticas de crecimiento; de tal forma que se han encontrado expresiones de tipo lineal, exponencial, parabólico e hiperbólico (Lenbury, et al., 1999). Sistemas microbianos en los procesos de fermentación para producción de alcohol mediante Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis son sistemas específicos, a través de los cuales se ha llevado a cabo el análisis del comportamiento dinámico de los sistemas microbianos experimental y teóricamente. Los parámetros de proceso que han sido mayor fuente de estudio son la velocidad de dilución, la concentración del sustrato en la alimentación, el pH y la temperatura. También, se ha estimado el comportamiento dinámico de sistemas con configuraciones de operación específicas como biorreactores con aireación, con alimentación lateral de biomasa y producto, con reciclo de células, con consumo de sustratos sustituibles, con extracción con solvente y extracción con membranas del producto inhibitorio y de biorreactores biofilm en los que se consideran efectos difusivos (Paz, 2010). Zymomonas mobilis y Saccharomyces cerevisiae son unos de los microorganismos más estudiados para producir etanol a escala industrial. Los cultivos de microorganismos en biorreactores continuos de tanque agitado, al ser convertidos de procesos de pequeña escala a procesos de gran escala, presentan cambios en su estabilidad, que dificultan el16 control del proceso y afectan la productividad; estos comportamientos se deben a las características de los fenómenos no lineales presentes en el proceso (Paz, 2010). La bacteria Zymomonas mobilis en cultivos continuos, muestra multiplicidad de estados estacionarios y oscilación de diferentes variables de proceso (concentraciones de sustrato, biomasa, productos, y viabilidad de las células, entre otras) para valores específicos de la concentración de sustrato en la alimentación y de la velocidad de dilución. Hay casos en que estos comportamientos causan que la concentración de biomasa y la viabilidad de las células decrezca más de un 50% o puede que el proceso tenga una productividad demasiado baja. Por ejemplo, en fermentaciones continuas alimentadas con elevadas concentraciones de sustrato (entre y ) se observan grandes variaciones en las concentraciones de biomasa y producto debido al fenómeno oscilatorio. En el momento que este fenómeno es controlado, la productividad promedio del proceso llega a los . Sin embargo, cuando el fenómeno no es regulado, se da una caída en la productividad del proceso a (Paz, 2010). En el caso específico de los cultivos de Zymomonas mobilis, análisis dinámicos han demostrado que el sistema presenta diferentes regiones de estabilidad con multiplicidad de estados estacionarios y/u oscilaciones; por ejemplo, en algunos casos, las oscilaciones presentan al final una bifurcación de período infinito, siendo estos los más sencillos; aunque, aumentando la complejidad, se encontraron casos en los cuales la rama periódica bifurca en caos totalmente desarrollado. Todo esto dentro de los rangos respectivos para velocidad de dilución y concentraciones de sustrato en la alimentación de y . Además, durante la oscilación se presenta una concentración promedio de etanol mayor a la que se obtiene en el estado estacionario alrededor del cual oscila; esto último solo para algunos casos (Garhyan & Elnashaie, 2004) La multiplicidad de estados estacionarios y el comportamiento oscilatorio son fenómenos que también se presentan en cultivos continuos de saccharomyces cerevisiae. Cuando en la alimentación se tienen bajas concentraciones de sustrato, se mantiene un estado estacionario; mientras que en el caso contrario, al tener concentraciones altas de glucosa en 17 la alimentación, para un amplio rango de velocidades de dilución, aparecen múltiples estados estacionarios (Lei, Rotboll, & Jorgensen, 2001) Very High Gravity (VHG) es una tecnología para la producción de etanol que consiste en utilizar medios que contienen más del 25% (p/v) de azúcar, con el fin de alcanzar concentraciones de etanol mayores al 15% (p/v). Es característico de esta tecnología que se presenten cuasi estados estacionarios, y oscilación de las variables de proceso (Bai, 2007). Generalmente, los datos obtenidos de las fermentaciones a nivel de laboratorio no arrojan datos de múltiples estados estacionarios; esto se debe a las bajas concentraciones de glucosa en la alimentación, caso contrario a las altas concentraciones de sustrato que se tratan a escala industrial. Por lo tanto, la multiplicidad de estados estacionarios y oscilaciones tienen mayor importancia en procesos industriales a gran escala (Paz, 2010). 2.3.3. Modelamiento dinámico de reactores bioquímicos y enzimáticos Los reactores pueden modelarse con un sistema de ecuaciones diferenciales, bajo la asunción de mezcla perfecta dentro del tanque, solo sí ocurren variaciones con el tiempo. Entonces, se puede describir el comportamiento del sistema con un conjunto de ecuaciones diferenciales de primer orden, que se puede representar de la siguiente forma: Ec. ( 34 ) donde: Dependiendo el grado de linealidad de la Ec. ( 34), se observarán diferentes comportamientos del sistema, como la multiplicidad de estados estacionarios, periodicidad, caos y bifurcaciones (Paz, 2010). De la teoría, se tiene que el balance para un componente A en estado no estacionario en un reactor continuo de tanque agitado (CSTR) se expresa de la siguiente forma (Fogler, 2008): Ec. ( 35) 18 A partir de esto, se tiene el modelo matemático del CSTR, con algunas asunciones importantes, como: y , entonces, Ec. ( 36) ( ) Ec. ( 37) Con un flujo de alimentación, igual al de salida. ( ) Ec. ( 38) Por definición, se tiene que ; por lo tanto, el balance para cualquier especie A en un CSTR en estado no estacionario, queda así: ( ) Ec. ( 39) 2.3.3.1. Estados estacionarios Los estados estacionarios se obtienen al igualar las derivadas del modelo que describe al sistema a cero; generalmente, un sistema presenta varios estados estacionarios porque está conformado por n ecuaciones no lineales para un grupo de parámetros p. El carácter de estado estacionario se calcula mediante la linealización de las ecuaciones diferenciales en este estado y calculando los valores de en la matriz jacobiana resultante de la Ec. ( 34). [ ] Ec. (40) con : matriz jacobiana ; : estado estacionario de la variable . Para sistemas bidimensionales, la estabilidad de estados estacionarios está definida en base a la Tabla 2. Para sistemas de orden superior donde se tienen más de dos valores propios involucrados, la estabilidad está definida por criterios similares (Kuznetsov, 2004). 19 Tabla 2. Clasificación de estados estacionarios para un sistema bidimensional Valores propios Signo de la parte real Clasificación Descripción Retrato de fase Ambos son reales, Ambos negativos Ambos positivos Signos opuestos Nodo estable Nodo inestable Silla Las trayectorias se dirigen hacia el punto de equilibrio. Las trayectorias se dirigen hacia fuera del punto de equilibrio. Siempre es inestable. Complejos conjugados con parte real diferente de cero Ambos negativos Ambos positivos Foco: Las trayectorias cercanas al punto de equilibrio parecen una espiral Foco estable Foco inestable Las trayectorias van hacia el punto de equilibrio. Las trayectorias van hacia fuera del punto de equilibrio. : Parte real del valor propio; Parte imaginaria del valor propio Fuente: Paz Astudillo, I. C (2010), Diseño Integral de Biorreactores Continuos de Tanque Agitado Aplicados a Procesos de Fermentación, Universidad Nacional sede Manizales, pag. 35 20 Fuera de los casos presentados en la Tabla 2 se encuentra otro caso: en los complejos conjugados cuando son estos los valores propios, es decir, la parte real de los complejos conjugados es cero; por lo tanto, queda, . En estos casos se presenta un estado periódico del sistema, también llamado “ciclo límite”, para el cual, los multiplicadores de Floquet determinan el carácter. Ahora bien, estos ciclos pueden clasificarse en nodos, focos o sillas, según la naturaleza y magnitud de los multiplicadores antes mencionados (Pavlo, 1999). Para estos ciclos, al incrementarse el tiempo: se presenta un ciclo estable, si todas las trayectorias que comienzan cerca del ciclo limite tienden a él, o se presenta uno inestable cuando todas las trayectorias que comienzan cerca del ciclo divergen fuera de este (Paz, 2010). 2.3.4. Bifurcaciones Las bifurcaciones son los cambios de cualidades presentadas por un sistema y se caracterizamatemáticamente por la variación en los valores propios en consecuencia de la variación de un parámetro del sistema, un ejemplo es el cambio de un estado estacionario desde un punto de equilibrio a una oscilación. Un punto de bifurcación es cuando la primera derivada de una ecuación diferencial es igual a cero. Ec. ( 41 ) Ec. ( 42 ) En la Tabla 3 se encuentran algunas bifurcaciones en estado estacionario elemental de cuando varía un parámetro en el sistema (Paz, 2010). 21 Tabla 3. Bifurcaciones de estado estacionario para sistemas de codimensión-1. Comportamiento valores propios Bifurcación Descripción Diagrama de bifurcación Un valor propio real cruza el eje imaginario. Silla – nodo (limit point) Transcrítica Dos estados estacionarios difiriendo en el signo de uno de sus valores propios colisiona y desaparece. Dos estados estacionarios difiriendo en el signo de uno de sus valores propios colisionan y cambian su carácter. Un par de valores propios conjugados cruza el eje imaginario. (En sistemas de orden superior, el carácter del resto de los valores propios de los estados estacionarios no cambia). Hopf supercrítica Hopf subcrítica En un sistema de dos dimensiones, un foco estable se convierte en un foco inestable y nace un ciclo límite estable a su alrededor. En un sistema de dos dimensiones, un foco inestable se convierte en un foco estable y nace un ciclo límite inestable a su alrededor. Un punto fijo cambia su estabilidad y nacen dos nuevos puntos fijos. Pitchfork supercrítica Una única solución real (y estable) cambia a tres soluciones reales, dos de las soluciones son estables y una es inestable. Pitchfork supercrítica Una única solución real inestable cambia a dos soluciones inestables y una estable. Fuente: Paz Astudillo, I. C (2010), Diseño Integral de Biorreactores Continuos de Tanque Agitado Aplicados a Procesos de Fermentación, Universidad Nacional sede Manizales, pag. 38. Inestable Estable Inestable Inestable Estable Estable Estacionario estable Periódico estable Estacionario inestable Estacionario estable Periódico inestable Estacionario inestable Inestable Estable Estable Estable Inestable Estable Inestable Inestable 22 2.3.5. Fenómenos de estabilidad en biorreactores 2.3.5.1. Estabilidad en sistemas continuos Los parámetros que determinan el estado de un reactor bioquímico son los físicos, químicos, bioquímicos y biológico, los cuales están descritos en la Tabla 4 los cuales afectan directamente la actividad celular. Los sistemas bioquímicos pueden tener variaciones en su estabilidad dependiendo al medio que se exponen, debido a que son afectados directamente por este. Por lo tanto, los sistemas que presentan procesos bioquímicos presentan comportamientos atípicos en las variables de salida (Paz, 2010). Tabla 4. Parámetros de operación que afectan los sistemas bioquímicos. Parámetros Función Físicos Volumen del caldo, potencia de agitación, velocidad de transferencia de calor, velocidad de alimentación del líquido, velocidad de dilución, etc. Describen el funcionamiento mecánico del equipo. Químicos Concentraciones de sustrato, productos, dióxido de carbono, oxígeno, y nutrientes, conductividad, pH, etc. Definen el ambiente químico dentro del reactor. Bioquímicos Contenido de aminoácidos, ATP/ADP, carbohidratos, enzimas, NAD/NADH, ácidos nucleicos, proteínas, vitaminas, etc. Indican el estado metabólico de la célula durante su crecimiento. Biológicos Distribución de edad y tamaño, grado de agregación, contaminación, y degeneración, tiempo de duplicación, inestabilidad genética, morfología, mutaciones, cantidad de células viables, etc. Caracterizan el reactor en términos del comportamiento de la población celular. Fuente: Paz Astudillo, I. C (2010), Diseño Integral de Biorreactores Continuos de Tanque Agitado Aplicados a Procesos de Fermentación, Universidad Nacional sede Manizales, pag. 11. 23 3. METODOLOGÍA 3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN A continuación se describe la metodología que permitió el cumplimiento de los objetivos del presente trabajo. Esta investigación es cuantitativa de tipo descriptiva debido a que mediante el análisis de las etapas diseñadas permitió determinar algunas características como la estabilidad, regiones de alto rendimiento y productividad. El método de estudio utilizado es el de modelación pues se hace uso de modelos científicos pertinentes para reproducir el fenómeno. 3.2. FUENTES DE INFORMACIÓN 3.2.1. Fuentes de información primaria. Los datos obtenidos mediante la simulación dinámica de las etapas de hidrólisis y fermentación componen la información primaria de esta investigación. En las corridas de simulación se obtuvieron gráficas y tablas de datos con los valores de las concentraciones de salida de los productos con respecto al tiempo, para cada una de las etapas, y, al mismo tiempo, para diferentes rangos de operación de las mismas, según las condiciones de alimentación, velocidad de dilución y temperatura. 3.2.2 Fuentes de información secundaria. Las fases de esta investigación estuvieron asistidas por la búsqueda bibliográfica permanente en revistas indexadas, bases de datos, libros y fuentes secundarias como organizaciones, dependencias del gobierno, instituciones, entre otras. 24 3.3. VARIABLES En este trabajo se analizó el efecto de parámetros de operación sobre el comportamiento dinámico del proceso en las etapas de hidrólisis y fermentación para la producción de alcohol carburante. 3.3.1. Operacionalización de las variables Para cada una de las etapas a diseñar se describen las variables dependientes, independientes e intervinientes en la fase de simulación, como lo muestran las Tablas 5 y 6. 25 Tabla 5. Variables de la simulación del proceso de hidrólisis. Tipo de Variables Variable Definición Unidades Dependientes Concentración de salida de glucosa Cantidad de glucosa por litro de solución mol/L Concentración de salida de Maltotriosa Cantidad de Maltotriosa por litro de solución mol/L Concentración de salida de Maltosa Cantidad de Maltosa por litro de solución mol/L Concentración de salida de Isomaltosa Productividad Rendimiento Cantidad de Isomaltosa por litro de solución Velocidad con que se genera el producto Relación de cantidad de glucosa producida por cantidad de almidón consumido mol/L kg/m 3 h kg/kg Independientes Concentración de oligosacáridos susceptibles en la alimentación Cantidad de oligosacáridos susceptibles por litro de solución mol/L Concentración de oligosacáridos resistentes en la alimentación Cantidad de oligosacáridos resistentes por litro de solución mol/L Velocidad de dilución Relación entre el caudal de alimentación y el volumen de reacción 1/h Constantes Temperatura Contenido de la energía interna de las moléculas pH Masa de enzima inmovilizada Grado de acidez o alcalinidad de solución Cantidad de enzima inmovilizada por volumen de líquido intersticial Adimensional /L Fuente: Elaborada en esta investigación. 26 Tabla 6. Variables de la simulación del proceso de fermentación Tipo de Variables Variable Definición Unidades Dependientes Concentración de salida de Etanol Cantidad de Etanol por litro de solución mol/L Concentración de salida de Biomasa Cantidad de Biomasa por litro de solución g/L Concentración de salida de Glucosa Productividad Rendimiento Cantidad de Glucosa por litro de solución Velocidad con que se genera elproducto Relación de cantidad de glucosa producida por cantidad de almidón consumido mol/L kg/m 3 h kg/kg Independientes Concentración de glucosa en la alimentación Cantidad de glucosa por litro de solución en la línea de alimentación mol/L Concentración de glucosa de carga Cantidad de glucosa por litro de solución en la carga inicial al reactor mol/L Temperatura Contenido de la energía interna de las moléculas Velocidad de dilución Relación entre el caudal de alimentación y el volumen de reacción 1/h Concentración de biomasa en la carga Cantidad de biomasa por litro de solución en la cargan inicial g/L Constantes pH Grado de acidez o alcalinidad de solución Adimensional Fuente: Elaborada en esta investigación. 27 3.4 PROCEDIMIENTO El procedimiento llevado a cabo en este trabajo se basó en la búsqueda de información, interpretación, modelamiento y simulación de las etapas de hidrólisis enzimática y fermentación en el proceso de producción de bioetanol a partir de almidón. El procedimiento general de esta metodología es descrito a continuación para cada una de las etapas. 3.4.1. Modelamiento de la etapa de hidrólisis enzimática para producir bioetanol. ● Se realizó la revisión bibliográfica de modelos cinéticos que describieran la velocidad a la que evoluciona el sistema reaccionante de la hidrólisis del almidón de yuca. Luego, se seleccionó un modelo cinético que permitiera simular el comportamiento de la etapa teniendo en cuenta fenómenos que son importantes en el escalamiento del proceso. El criterio de selección se basó en que tal modelo cinético precisara características propias de la hidrólisis enzimática como la existencia de efectos inhibitorios de sustrato y producto, y un mecanismo de reacción que representara la complejidad de esta etapa, aspectos que se consideran pertinentes para el estudio dinámico del sistema. ● Seleccionado el modelo cinético apropiado, se plantearon los balances de masa de cada componente para un reactor continuo de tanque agitado (CSTR) en estado no estacionario, utilizando las expresiones cinéticas reportadas en tal modelo. Las especies intervinientes en esta etapa fueron: el almidón como alimento y los azúcares como productos. A partir de estos balances, se obtuvo un sistema de ecuaciones diferenciales (modelo matemático de la etapa) que permitió establecer cuáles eran las variables independientes (variables de operación y arranque), las variables dependientes y las constantes del modelo matemático (Fogler, 2008). 28 3.4.2. Análisis de la respuesta dinámica del arranque de los procesos y el alcance de los estados estables para diferentes parámetros de operación. Se construyó el perfil de velocidad neta inicial de la glucosa en función de la concentración de almidón licuado alimentado, mediante códigos programados en Matlab, basado en la cinética del modelo seleccionado, con el fin de establecer un rango preliminar de concentraciones de sustrato alimentado que garantizara altas velocidades iniciales de producción de glucosa en las corridas de simulación dinámica (Liu, 2013). Posteriormente, se elaboró un algoritmo mediante códigos programados en Matlab para la resolución de las ecuaciones diferenciales del modelo matemático de la etapa de hidrólisis; este modelo permitió obtener, en cada corrida de simulación dinámica, los valores de las concentraciones de cada una de las especies en el arranque y la estabilización del sistema, establecidas las condiciones de operación y arranque. La simulación permitió la construcción de dos tipos de diagramas para el análisis dinámico del sistema: Diagramas dinámicos: Estos diagramas se trazaron a partir de las concentraciones de cada una de las especies en función del tiempo, para verificar la reversibilidad e irreversibilidad mostradas en el mecanismo de reacción en el sistema, y analizar el efecto de la variación de diferentes condiciones utilizadas en el arranque sobre la estabilización del sistema (Loaiza, 2006). Diagramas de fase: Estos diagramas se construyeron relacionando las concentraciones de salida de dos especies, para un mismo tiempo, durante el arranque hasta la estabilización del sistema, en una sola gráfica. En otras palabras, muestran la evolución simultánea de la concentración de salida de dos especies químicas. Debe tenerse en cuenta que estos diagramas se construyeron para condiciones de operación constantes, y variaciones en las condiciones de arranque. Este tipo de diagramas permitieron establecer las características de las trayectorias que se presentan desde el arranque hasta el alcance de la estabilidad en el sistema, 29 de esta forma, facilitaron la corroboración de estados estables y las condiciones iniciales para alcanzarlos (Loaiza, 2006). 3.4.3. Selección de las condiciones de operación más adecuadas para alcanzar estados estables con alto rendimiento de producto de la etapa de hidrólisis. ● Se analizó el efecto de cada uno de los parámetros de operación sobre el sistema para determinar la metodología a llevar a cabo en el diseño operacional de la etapa. A partir de esta información se desarrollaron diagramas de bifurcación que muestran el efecto de las variables independientes sobre el rendimiento y la productividad de las etapas. Diagramas de bifurcación: Es la representación gráfica de los estados estables e inestables del sistema para un parámetro de operación, manteniendo los otros constantes; es decir, son líneas compuestas por todos los puntos representativos del equilibrio (estados estables e inestables) para cada valor del parámetro de bifurcación. Este tipo de diagramas pueden ser trazados como diagramas de 2 dimensiones (estado estacionario de una variable dependiente vs. un parámetro de operación) y de 3 dimensiones (estado estacionario de una variable dependiente vs. dos parámetros de bifurcación (Gustafson, 2006). ● Con base en esto, se seleccionaron las condiciones más adecuadas para alcanzar estados estables de operación con alto rendimiento de producto en la etapa de hidrólisis. A continuación se muestra una representación gráfica (Figura 1) de la metodología utilizada para el cumplimiento de cada uno de los objetivos en el diseño de la etapa de hidrólisis: 30 Figura 1. Representación gráfica de la metodología utilizada para la hidrólisis. Fuente: Elaborada en esta investigación. 31 3.4.4. Modelamiento de la etapa de fermentación para la producción de bioetanol. ● Se realizó la revisión bibliográfica de modelos cinéticos que describieran la velocidad a la que evoluciona el sistema reaccionante de la fermentación de la glucosa. Luego, se seleccionó un modelo cinético que permitiera simular el comportamiento de la etapa teniendo en cuenta fenómenos que son importantes en el escalamiento del proceso (inhibición por sustrato). El criterio de selección se basó en que tal modelo cinético fuera complejo, permitiera el diseño operacional variando diferentes parámetros, además mostrara los efectos de la temperatura sobre en la cinética (Lenbury, Neamvong, Amornsamankul, & Puttapiban, 1999). ● Mediante la simulación se verificaron los perfiles de ajuste de los parámetros cinéticos dependientes de la temperatura con base en el artículo seleccionado. Luego, se realizó un reajuste de aquellos parámetros que presentaron desviación con los puntos experimentales reportados por el autor (Andrade, 2007). ● Seleccionado el modelo cinético apropiado, se plantearon los balances de masa de cada componente para un CSTR en estado no estacionario, utilizando las expresiones cinéticas reportadas en tal modelo. Las especies intervinientes en esta etapa fueron: la glucosa como alimento y el bioetanol como productos. A partir de estos balances, se obtuvo un sistema de ecuaciones diferenciales