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Bioluminiscencia en Biotecnología de Plantas: Las 
Bananas resplandecen de luz!
E. Santos, S. Remy, E. Thiry, S. Windelinckx,
R. Swennen and L. Sági
ACORBAT 2008, 10-14 noviembre
Guayaquil-Ecuador
Laboratory of Tropical 
Crop Improvement
KATHOLIEKE 
UNIVERSITEIT 
LEUVEN
17 April 2008
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Contenido
I. Bananos genéticamente modificados
II. Expresión de los genes
III. Genes reporteros
IV. El gen reportero de la luciferasa en biotecnología 
aplicada al banano
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de 
banano
VI. Conclusiones y perspectivas
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Plantas modificadas genéticamente
I. Bananos genéticamente modificados
• Mejoramiento convencional es un proceso largo y 
tedioso especialmente en banano y plátanos. Consiste 
en la polinización cruzada de una planta con una 
especie relacionada. Por tanto, el “pool” de genes está
limitado a especies compatibles para cruzamiento.
• Bananos del subgrupo Cavendish no se pueden 
mejorar convencionalmente debido a esterilidad.
• Transformación genética de plantas permite la 
integración de genes útiles de diferentes organismos a 
las plantas.
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Plantas modificadas genéticamente
I. Bananos genéticamente modificados
• Transformación genética en plantas puede ser 
definido como la inserción estable de genes en el 
genoma y su expresión en la planta transgénica (o 
cisgénica).
• Plantas cisgénicas. La introducción de genes en una 
planta, con sus promotores originales, de una planta 
compatible de cruzamiento o de la misma planta 
(Schouten and Jacobsen, 2006) .
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Genómica en Banano
I. Bananos genéticamente modificados
Genoma: 500-600 Mbp; 11 chromosomes; ploidia: 2x, 
3x, 4x; grupos genómicos (AAA, AAB, ABB …) 
Herramientas moleculares: Sistemas de 
transformación genética, Secuencia de datos 
‘limitada’ (EST, BAC, SAGE libraries), análisis 
proteómico, marcadores moleculares, …
“Revolución verde” a la “revolución de los genes”
(transformación genética)
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Expresión de genes
Gen
mRNA
Proteína
TATA-box
Sitio de Inicio 
de la 
Transcripción 
(TSS)- 30 
DNA
Promotor
+ 1 
II. Expresión de los genes
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Genes reporteros
• Mediciones de la expresión de 
genes se realizan generalmente 
a través de ensayos específicos 
del mRNA, sin embargo 
requiere esfuerzo substancial.
• Genes reporteros proveen 
información análoga más 
eficientemente. 
• Puede ser detectado mediante 
un ensayo visual y simple.
• Es usado para confirmar 
transformación genética 
temporal o estable.
Gen reportero
mRNA
Proteína 
reportera
Promotor
DNA
II. Expresión de los genes
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Genes reporteros
III. Genes reporteros
• Importantes para la prueba de la actividad de 
promotores.
• Genes reporteros más usados en biotecnología 
de plantas:
– β-glucuronidase (GUS)
– Proteína Fluorescente Verde (GFP)
– Luciferasa (LUC)
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Sistema del gen reportero Luciferasa
LUC
luciferin + ATP + O2 oxyluciferin + AMP + PPi + 
CO2 + light (562 nm) 
luc
Sistema de cámara CCD 
digital ultrasensible
- Tiempo real
- Sensibilidad
luc+
IV. El gen reportero de la luciferasa
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Uso de promotores en bananos modificados 
genéticamente
Virus CaMV35S (derivados), ScBV, TaBV,
BSV, BBTV
Banano: actina, EFE, ACO1, ACC 
Emu, (ocs)3mas
Arroz: actina
Maíz: ubiquitina
Arabidopsis: ubiquitina, tubulina
Promotores
heterólogos
Plant
Recombinante
Promotores
nativos
Clases de promotores: Constitutivos, regulados de acuerdo al desarrollo de 
la planta, tejido específico, inducibles (estrés biotico/abiotico) 
Funcionabilidad/estabilidad, mayor aceptación por el público
Bacteria nos
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Aislamiento de promotores
Trampeo de promotores
“Promoter tagging”
• Eficiencia en transformación genética
• Cantidad de tejido/RNA
• Alto nivel de expresión de genes
Basados en técnicas 
de mRNA 
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Aislamiento de promotores en banano
• Objetivo. Identificar y caracterizar 
promotores de banano para su uso en el 
desarrollo de bananos genéticamente 
modificados.
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Trampeo de promotores a través de 
transformación con Agrobacterium
T-DNA tagging vector
Agrobacterium transformation
DNA genómico
Promotor gen
LBRB
Gene selectivoGen reportero
RB LB
Región 5’ Región 3’
mRNA
Proteína 
reportera
Ensayos en 
diferentes
condiciones
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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400-600/Petri Dish
5,600-8,400/image
Meses después de 
infección con 
Agrobacterium
Fase
1 2 3 4 5 6 7 8 ...
Colonias
celulares
Cultivo
Análisis
Vitroplantas
Inducción de 
embrión
Trampeo de promotores en banano
Inducción para
regeneración
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Deteción de luciferasa en banano
Colonias celulares Vitroplantas
LUC
Live
~42,000
346
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Detección de luciferasa en banano
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
17
26°C
8°C
26°C
Detección de luciferasa en condiciones de 
baja temperatura en tiempo real
Baja 
actividad
LUC 
Alta 
actividad
LUC
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Análisis de la actividad de LUC durante 
regeneración
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Actividad de promotores
Expresión 
específica en 
raíz
Expresión 
constitutiva
Live LUC
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Expresión 
específica en el 
pseudotallo
Actividad de promotores
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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TAIL-PCR para el aislamiento de 
secuencias en la región 5’
200
1500
1000
600
bp
200
2 3
1500
1000
M
600
bp2 3
AD2-1 AD2
2 3 2 3
AD2-1
1500
1000
800
400
M bp
AD2
M2 3
AD2
SP2
RB
pe35S-neo-T35Sluc+-Tnos
LBpETKUL2
SP1
AD
SP3
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Southern blot
Contr. 17 85 123 34 49 82 102 156 1C 5C
ET2-lines
Promedio: 3.6
kb MM
21.2
5.2
3.5
2.0
Min.# copias T-DNA: 5 3 3 1 4 4 4 5
Sonda luc+
probe
pETKUL2
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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1 T-DNA
2 T-DNAs
3 T-DNAs
….
Críptico
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Cuál es la secuencia con actividad 
promotora?
RB
pe35S-neo-T35Sluc+-Tnos
LB
Producto amplificado
Transcripción
Cap
Poly A mRNA
RT-PCR
Síntesis
de cDNA
cDNA
RT-PCR
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Análisis de la fusión transcripcional, RT-PCR
Pseudostem
Cormo
Live LUC
Pseudotallo
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Clonación de promotores en el vector pCAMBIA 1391Z
Banano
Son los promotores identificados activos?
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Validación de promotores identificados
Inducción de 
embriones
+ + -+++
+++
pLS25
Ubi
Colonia 
celular
+ + -
+
-
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Actividad de promotores
Colonia 
celular
Inducción
embriones
Vitro 
planta
Hoja
Pseudotallo
Raíz
pES1 pES2 pLS25
17-1
(1.74 kb)
17-1
(1.35 kb)
Ubi
Non 
transformed
85-1 
(0.60 kb)+
V. Caracterización y aislamiento de promotores y genes de banano
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Agrobacterium-mediated transformation of banana ECS High-through put
Early in vitro development stage and low temperature
Late in vitro development stage and low temperature
Luciferase 
screening
Molecular
characterization
Southern blot analysis Isolation of T-DNA
flanking sequences
in silico analysis of banana sequences
Transcriptional
fusion analysis RT-PCR
Cloning of candidate
promoter sequences
Back-transformation and 
promoter activity analysis
Back-
transformation
Physicallinkage
Low-through put
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• Un sistema para la identificación de promotores en 
banano ha sido desarrollado.
• El trampeo de promotores a través del T-DNA es 
confiable y reproducible en la caracterización y 
aislamiento de nuevos promotores en banano.
Conclusiones
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Perspectivas
• Confirmación de expresión en diferentes 
estadíos de desarrollo de la planta y cultivares 
de banano (y plátano).
• Utilización en generación de plantas de banano 
genéticamente modificados (bananos 
cisgénicos).
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Agradecimientos
• VLIR-ESPOL
• Centro de Investigaciones Biotecnológicas del 
Ecuador (CIBE) -ESPOL
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Laboratory of Tropical Crop Improvement
KU Leuven
	Bioluminiscencia en Biotecnología de Plantas: Las Bananas resplandecen de luz! 
	Contenido
	Plantas modificadas genéticamente
	Plantas modificadas genéticamente
	Genómica en Banano
	Expresión de genes
	Genes reporteros
	Genes reporteros
	Sistema del gen reportero Luciferasa
	Uso de promotores en bananos modificados genéticamente
	Aislamiento de promotores
	Aislamiento de promotores en banano
	Trampeo de promotores a través de transformación con Agrobacterium
	Deteción de luciferasa en banano
	Detección de luciferasa en condiciones de baja temperatura en tiempo real
	Actividad de promotores
	Actividad de promotores
	TAIL-PCR para el aislamiento de secuencias en la región 5’
	Southern blot
	Cuál es la secuencia con actividad promotora? 
	Conclusiones
	Perspectivas
	Agradecimientos
	Laboratory of Tropical Crop Improvement�KU Leuven