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1 TP 4: BIOENERGÉTICA Y CINÉTICA ENZIMÁTICA - EJERCITACIÓN ADICIONAL 1. a) Realice los gráficos correspondientes a nivel energético vs coordenada de reacción para las reacciones: i: L����M ii: Y����Z, Para la confección de los mismos, tenga en cuenta que: GºL = 4.8 Kcal/mol, GºM=2.1 Kcal/mol, GºY= 5.6 Kcal/mol, GºZ= 4.4 Kcal/mol y que el estado activado para que se produzcan ambas reacciones se alcanza a una energía de 7,0 Kcal/mol. b) Calcule el ∆Gº y la Ea para ambas reacciones e indique ambos parámetros en el gráfico. c) ¿Que puede decir respcto a la espontaneidad de las reacciones en condiciones estándar? d) ¿Cuál de las reacciones ocurrirá a mayor velocidad? e) Si se agrega un catalizador enzimático específico tanto para la reacción i como para la ii, ¿Qué ocurrirá con el ∆Gº y con la Ea de cada reacción? Indíquelo en el gráfico. f) Si se desea acoplar la reacción A����B cuyo ∆Gº= 2 Kcal/mol ¿cuál de las dos reacciones anteriores sería la indicada para que tal reacción ocurra? Justifique. 2. La sacarosa puede ser clivada por dos mecanismos diferentes: I. Sacarosa + H2O � glucosa + fructosa ∆∆∆∆G °°°°’ = - 7 kcal/mol II. Sacarosa + Pi � glucosa -1-fosfato + fructosa a) Estime el ∆∆∆∆G°°°°’ de la reacción ii sabiendo que la reacción glucosa -1-P + H2O � glucosa + Pi tiene un ∆∆∆∆G°°°°’ = –5 Kcal/mol b) Si el objetivo del clivaje fuera obtener fructosa, ¿Cuál de los dos procesos (i- hidrólisis o ii-fosforólisis) es más ventajoso desde el punto de vista del ahorro energético? c) ¿Cuál de las dos reacciones cree Ud. que será más beneficiosa si fuera acoplada a un proceso endergónico? ¿Necesita información adicional para tener el 100% de certeza en su respuesta? 3. La Hidroxiacil-CoA deshidrogenasa es una enzima involucrada en uno de los pasos de la β-oxidación, la oxidación del 3-hidroxiacil-coA a 3-cetoacil-coA. Represente en forma general un gráfico de velocidad de reacción vs concentración de L-3-Hidroxiacil-CoA, indicando Km y Vmáx: ¿Cómo se modificarán los parámetros mencionados anteriormente si a) se aumenta la concentración de enzima? b) si se agrega un inhibidor competitivo? 2 c) si se agrega un inhibidor no competitivo específico de la enzima? Justifique y represéntelo gráficamente 4. La proteína “E” es una enzima obtenida de lisosomas de riñón de mono. La misma está constituida por una cadena polipeptídica de 120 aminoácidos a la cual se encuentra unido un decasacárido lineal constituido por restos alternantes de D-. glucosa y D- galactosa unidos entre sí a través de un enlace O-glicosídico α(1→4). a) i- Clasifique a la proteína E según: - forma: ……………………………. - composición: ……………….…………….…… ii- Esquematice la unión de D-glucosa y D-galactosa tal como se encuentran en el oligosacárido. iii- Respecto a su estructura secundaria indique: principal interacción que la estabiliza y grupos entre los que se establece dicha interacción. iv- Al desnaturalizar completamente la proteína E la misma pierde la/s estructura/s (PRIMARIA / SECUNDARIA / TERCIARIA / CUATERNARIA). (Tache lo que no corresponda). b) En los lisosomas, esta enzima (E) cataliza la reacción A+ → B siendo su pH y T óptimos igual a 5 y 37°C, respectivamente. La concentración de E en los lisosomas es 4 mM y, en las condiciones óptimas, los parámetros cinéticos que la caracterizan en estas organelas son: Km = 0,1 µM y Vmáx = 200 mM/min. Partiendo de una solución 2 mM de la proteína E, procede a realizar distintos experimentos: i- Toma alícuotas de 1 ml, las coloca en cuatro tubos (P, X, Y y Z) y ajusta la temperatura y el pH de cada uno de ellos a los valores indicados en la tabla. Luego adiciona la cantidad necesaria de sustrato A+ para alcanzar en cada tubo la concentración referida en la tabla. Finalmente registra la velocidad inicial de producción de B (Vo). En la última fila, señale los valores de Vo que espera encontrar en las distintas condiciones (enciérrelos con un círculo). Tubo P X Y Z T °C 37°C 5°C 37°C 97°C pH 5 5 7 7 [A+] 0,1µM SATURANTE SATURANTE SATURANTE Vo (mM B/min) 50 / 100 / 200 30 / 100 / 200 40 / 100 / 200 20 / 40 / 100 ii- Incuba en presencia de (X- / Y+ / Z), un inhibidor competitivo de E1, observando que el Km de esta enzima será (MAYOR / IGUAL / MENOR) a 0,1 µM y su Vmáx será (IGUAL/ MENOR/ MAYOR) a 100 mM/min. (Tache lo que no corresponda) 5. En el citosol de la mayoría de las células de rata, Z- es sintetizado a partir de V+ a través de una vía metabólica constituida por 4 reacciones secuenciales. Los valores correspondientes a Ea y ∆G° de las reacciones no catalizadas se indican en la tabla: a) Sabiendo que la reacción Z- → V+ tiene un ∆G° = 45 kJ/mol ¿Cuál es el ∆G°W → X? V + W X Y Z - Ea (kJ/mol) 3 2 1 10 ∆∆∆∆G° (kJ/mol) -15 ---------- +0,01 -30 3 b) ¿Qué puede decir respecto a la espontaneidad de la reacción W → X? c) ¿Cuál de las reacciones condiciona la velocidad de producción de Z- en la vía sin catalizar? d) ¿Cuáles de estas reacciones son reversibles en condiciones celulares? e) ¿Cuál es el valor de Ea de la reacción Z- →Y? f) Si la vía metabólica tiene lugar en condiciones estándar ¿qué sucederá con el desorden del universo? g) EH es la enzima que cataliza la primera reacción de esta vía (V+ → W) en células de hígado y los parámetros cinéticos que la caracterizan son: Km = 0,4 mM y Vmáx = 300 mM/min. En las siguientes afirmaciones, tache lo que no corresponda: i- La reacción V+ → W catalizada por EH posee un ∆G° de (-17 / -13 / -15 / 15) kJ/mol y una Ea de (1 / 3 / 5) kJ/mol. ii- (Asp / His / Val / Ser / Cys / Lys / Glu) son dos aminoácidos que esperaría encontrar en la región del sitio activo de EH. iii- La isoenzima renal (ER), que es menos efectiva que EH en la catálisis tanto a bajas como a altas [V+], posee un Km (MAYOR / IGUAL / MENOR) y una Vmáx (MAYOR / IGUAL / MENOR) que EH. iv- EH es una proteína (GLOBULAR/ FIBROSA) donde encontramos (UN ÚNICO TIPO / DIVERSOS TIPOS) de estructura secundaria que puede estar estabilizada por (ENLACES PEPTÍDICOS / FUERZAS DE VAN DER WAALS / PUENTES DE HIDRÓGENO / PUENTES DISULFURO / INTERACCIONES HIDROFÓBICAS). h) El producto final de la vía (Z-) puede unirse a EH en un sitio distinto del sitio activo disminuyendo la afinidad de esta enzima por su sustrato sin inactivarla. Indique: - Nombre específico de la regulación ejercida por Z-: ……………………………… - ¿Qué valores de Km y Vmáx sería posible encontrar para EH en condiciones en las cuales se acumula Z-? Rta: Km = (0,6 / 0,4 / 0,2) mM y Vmáx (250 / 300 / 350) mM/min. (Tache lo que no corresponda). 6. La enzima E es una proteína plasmática constituida por una cadena polipeptídica alfa de 120 aminoácidos y otra beta de 130 aminoácidos a la cual se encuentra unido un oligosacárido ramificado constituido por 5 restos de D-glucosa unidas entre sí a través de enlaces O-glicosídicos β(1→2) presentando en las ramificaciones el mismo tipo de enlace encontrado en las ramificaciones del glucógeno. a) i- Clasifique a la proteína E según su forma y composición. ii- Esquematice la/s unión/es encontrada/s en el oligosacárido. b) En el torrente sanguíneo E cataliza la reacción A →B cuyos valores de ∆G y de estado activado para la transformación sin catalizar son: ∆G A →B = -3 Kcal/mol; Estado activado (A # )= 9 Kcal/mol. Sabiendo que GB = 1 Kcal/mol y que el estado activado del complejo Enzima- Sustrato (ER # ) es de 5 Kcal/mol. Construya el gráfico de G versus coordenada de reacción y señale en el mismo GA y Ea A →B e indique con línea de puntos cómo se modificará el gráfico por la presencia de la enzima E. c) En el plasma humano la [E] = 1mM y, cuando las condiciones son óptimas (pH: 7 y 37°C), los parámetros cinéticos que caracterizan a esta enzima son: Km = 5 µM y Vmáx = 200 mM/min. 4 i- En las condiciones óptimas ¿Cuál será la velocidad de producciónde B cuando: [A] sea de 5 µM y la [E] sea 3mM? ii- A 5°C, la Vmáx será (MENOR / IGUAL) que 200 mM/min porque al disminuir la temperatura (LA ENZIMA SE DESNATURALIZA / NO SE DESNATURALIZA / DISMINUYE LA ENERGÍA CINÉTICA DE LOS REACTIVOS / LA ENERGÍA DE ACTIVACIÓN NO CAMBIA). (Tache lo que no corresponda). iii- ¿Cuál de los siguientes valores corresponde al valor del Km de esta enzima en presencia de un inhibidor competitivo? Rta: (0,1 µM / 5 µM / 0,1 mM) (Tache lo que no corresponda). 7. En la figura de la derecha, hemos esquematizado una vía metabólica ramificada presente en citosol de hepatocitos de rata. A través de esta vía, se generan dos productos finales diferentes: C y D. Las enzimas E1, E2 y E3 son las encargadas de catalizar las reacciones de esta ruta como muestra el esquema. a) Sabiendo que: - En condiciones basales E1 posee un Km = 0,01mM y una Vmáx = 200 mM/min - La energía de activación (Ea) correspondiente a la reacción A- �B no catalizada es 3 Kcal/mol. - E2 tiene mayor afinidad por B que E3 y la Vmáx de E3 es el doble de la alcanzada con E2 - G°A-= 5 Kcal/mol; G°B = 6 Kcal/mol; G°C = 1 Kcal/mol; G°D = 2 Kcal/mol - GA-= 7Kcal/mol; GB= 5Kcal/mol; GC= 2Kcal/mol; GD= 4Kcal/mol i- Cuando se duplique la concentración de E1 en respuesta a estímulos externos los valores de sus parámetros cinéticos serán: Km = (0,005 / 0,01 / 0,02) mM y Vmáx = (100 / 200 / 400) mM/min. (Tache lo que no corresponda) ii- En presencia de (X- / Y+ / Z), un inhibidor competitivo de E1, el Km de esta enzima será (MAYOR / IGUAL / MENOR) a 0,01 mM y su Vmáx será (MAYOR / IGUAL / MENOR) a 200 mM/min. (Tache lo que no corresponda) iii- A bajas concentraciones de B, el producto final que se generará a mayor velocidad será (C / D) y cuando las concentraciones de B sean altas será (C / D). (Tache lo que no corresponda) iv- La Keq para la reacción B � D es (MAYOR / IGUAL / MENOR) a 1. (Tache lo que no corresponda) v- En los hepatocitos de rata: la reacción A- � B es (ESPONTÁNEA / NO ESPONTÁNEA) y la energía de activación de la reacción catalizada es (MAYOR / IGUAL / MENOR) a 3 Kcal/mol (Tache lo que no corresponda) vi En los hepatocitos de rata, la velocidad de la reacción B�A- será es (MAYOR / IGUAL / MENOR) que la de A- � B dado que la Ea de B�A- será (MAYOR / IGUAL / MENOR) a la Ea de A- � B. (Tache lo que no corresponda) vii- Para la reacción global A- �C el ∆GA- � C es igual a ( -4 / -5 / +4 / +5 ) Kcal/mol. (Tache lo que no corresponda) b) La enzima E1 es una proteína (GLOBULAR / FIBROSA) que posee una única cadena polipeptídica. Su estructura primaria se halla estabilizada por (ENLACES PEPTÍDICOS / FUERZAS DE VAN DER WAALS / PUENTES DE HIDRÓGENO / PUENTES DISULFURO / INTERACCIONES HIDROFÓBICAS), las 2 principales fuerzas que estabilizan a su estructura secundaria son (ENLACES PEPTÍDICOS / A - B C D E1 E3 E2 5 FUERZAS DE VAN DER WAALS / PUENTES DE HIDRÓGENO / PUENTES DISULFURO / INTERACCIONES HIDROFÓBICAS) mientras que la estructura terciaria puede estar estabilizada por (ENLACES PEPTÍDICOS / FUERZAS DE VAN DER WAALS / PUENTES DE HIDRÓGENO / PUENTES DISULFURO / INTERACCIONES HIDROFÓBICAS). (Tache lo que no corresponda)
