PROYECTO MICROBIOMA TRABAJO FINAL

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CARACTERIZACIÓN DEL MICROBIOMA DE LA LECHE MATERNA EN MADRES 
CLINICAMENTE SANAS VS MADRES CON DIABETES GESTACIONAL, DE 
PEREIRA COLOMBIA. 
 
 
 
 
 
Carlos Andrés Castro Henao 
 
 
Revisión de Tesis 
 
 
Dra. Sandra Yolanda Valencia 
 
 
 
 
Universidad Libre Seccional Pereira 
Facultad de Ciencias de la Salud 
Programa Nutrición y Dietética 
2022 
2 
 
TABLA DE CONTENIDO 
 
1. RESUMEN...................................................................................................................... 3 
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ......................................................................... 4 
3. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................... 6 
4. OBJETIVO GENERAL .................................................................................................. 8 
5. MARCO TEÓRICO ....................................................................................................... 8 
6. METOLODOLOGÍA .................................................................................................... 14 
7. RESULTADOS ............................................................................................................ 17 
8. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 19 
9. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 22 
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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CARACTERIZACIÓN DEL MICROBIOMA DE LA LECHE MATERNA EN 
MADRES CLINICAMENTE SANAS VS MADRES CON DIABETES GESTACIONAL, 
DE PEREIRA COLOMBIA. 
 
1. RESUMEN 
Planteamiento del problema: La Leche Materna Humana (LMH) constituye el alimento 
ideal para los recién nacidos y lactantes, teniendo en cuenta que cuenta con componentes 
esenciales para proporcionar los nutrientes y requerimientos necesarios en esta población que es 
altamente vulnerable; pese a ello, la adherencia a la Lactancia Materna (LM) sigue estando por 
debajo de lo esperado, lo que genera preocupación en la comunidad científica. Justificación: La 
LMH además de ser un alimento con un gran aporte nutricional, se complementa con una carga 
microbiana. Hoy en día los estudios se han centrado en la caracterización de la microbiota de la 
LMH. La Diabetes Gestacional (DG) es considerada unas de las causas que impide a las madres 
lactar a sus hijos por temor a “contagiarlos”. Estudios previos demuestran que patologías como 
la Diabetes Mellitus (DM) provocan disbiosis en la microbioma intestinal. No obstante, la 
afectación a la microbiota de la LMH es poco conocida en pacientes con DG, por ello es 
importante ahondar en el tema con estudios como este. Metodología: Se reclutaron maternas 
entre 20 y 41 años de edad, clínicamente “Sanas” para el primer grupo y para el segundo grupo 
ser diagnosticadas con DG, en ambos casos el embarazo debió finalizarse a término, haber tenido 
al menos cuatro controles prenatales, con todos los exámenes realizados y procedentes del eje 
cafetero. Se recolectaron muestras de LMH, se almacenaron y se congelaron a -20ºC hasta 
procesarlas. Se extrajo ADN genómico de la leche y se hizo secuenciación del gen ribosomal 
16S, se fragmentó el ADN y fue enriquecido por PCR a 25 ciclos. El perfil taxonómico y el 
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análisis diferencial bacteriano presente en las muestras se calculó y visualizo con 
MicrobiomeAnalyst. Resultados: Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacterias son los filum 
predominantes para ambas muestras, sin diferencias altamente significativas de ningún filum 
entre las muestras. Sin embargo, géneros como Veillonella, Bacteroidetes no clasificados, 
Pseudomonas, Bacillales, están en Abundancia Relativa (AR) superior dentro de las muestras de 
LMH de Madres con Diabetes Gestacional (LMH-MDG), mientras que Serratia, Acinetobacter, 
Enterococcus y Staphylococcus se encontraron con AR mayor en muestras de Leche Materna 
Humana de Madres Clínicamente Sanas (LMH-MCS). Conclusión: Aunque estadísticamente no 
se encontró diferencia significa entre los filum de las muestras, a nivel de genero si se observa 
diferencias de AR entre las mismas, lo que podría generar deficiencias de algunos nutrientes en 
caso tal de que estos géneros colonicen el intestino del lactante. 
 
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
La Leche Materna Humana (LMH) constituye el alimento ideal, natural para los recién 
nacidos y lactantes. Son innumerables los beneficios de este acto fisiológico. La Organización 
Mundial de la Salud (OMS) recomienda el consumo de este alimento desde la primer hora de 
vida y continuar con la Lactancia Materna Exclusiva (LME) hasta los seis meses de edad, como 
alimento complementario, incluso con una nutrición adecuada hasta los dos años (1). 
Además de ser un alimento con un gran aporte nutricional, se complementa con una carga 
microbiana, la LMH contiene componentes que ayudan en el crecimiento y desarrollo del niño, 
fortalecimiento del sistema inmune, motor, neural y en toda la fisiología del bebé. 
5 
 
Los beneficios de la Lactancia Materna (LM) no es solo para el lactante, las madres también 
tienen ventajas, además de ser una forma natural, segura y económica de alimentación, la LM 
puede disminuir el riesgo de algunos tipos de cánceres (2). 
En Colombia los índices de LM son bajos (1), las mujeres en Colombia inician la nutrición de 
sus bebés desde el mismo instante del nacimiento, como acto natural por medio de la lactancia en 
un 96% (3), sin embargo, este porcentaje va disminuyendo considerablemente con los meses y 
solo un 43% de las madres alcanza los 6 meses de lactancia exclusiva. Es por ello que varios 
campos de la salud se dedican a fortalecer dicha práctica. (4). 
La falta de lactancia obedece en parte a las fuerzas culturales a las que las madres se ven 
enfrentadas en el cumplimiento de sus metas personales y tempranamente regresan a su vida 
laboral (7) y distintas causas de tipo psicosocial, sobrecarga de trabajo, ansiedad por falta de 
apoyo, problemas conyugales, madre soltera o adolescente, mitos y creencias, desinformación o 
información incorrecta, depresión materna, adicionando las experiencias previas de cada mujer y 
a su edad (1). 
No proporcionar este valioso alimento al lactante genera vulnerabilidad ante infecciones 
gastrointestinales, infecciones respiratorias, otitis, atopía, rinitis, alergias alimentarias, 
enfermedades cardiovasculares, obesidad, diabetes, algunos tipos de cáncer. Estudios demuestran 
que la LME y la Lactancia Materna Complementaria (LMC) genera un rol protector sobre la 
enfermedad celiaca y la enterocolitis necrosante (6). Estas enfermedades son menores en los 
lactantes que son amamantados durante los primeros seis meses de vida en forma exclusiva, que, 
entre los amamantados en forma parcial, o no amamantados, según diversos estudios (4). 
Una de las razones por las cuales las madres no alimentan, es por temor de transmitir 
sustancias afectantes en el caso de poseer alguna enfermedad. De los casos más comunes se 
6 
 
encuentra la diabetes pregestacional y gestacional que en Colombia y en el Mundo son 
enfermedades que más pueden afectar el binomio madre e hijo (8). 
Además de las ventajas en salud proporcionada por la LMH también hay beneficios a nivel 
económico, favoreciendo tanto a las familias, frente el alto costo de sucedáneos de la LM, como 
a las naciones en temas de rentabilidad en el sistema sanitario. Estudios presentes han 
demostrado que hay imposibilidad de replicar las condiciones naturales de un ecosistema en el 
laboratorio, tanto bioquímica como microbiológicamente, haciéndose improbable asemejar los 
componentes de la LMH por medio de técnicas tradicionales,lo que ha puesto límites a los 
conocimientos completos de los metabolitos y microbiomas (9). 
Actualmente existen tecnologías que permiten hacer una caracterización completa por medio 
de alta computación, de los componentes de esta matriz alimentaria (nutrigenómica), al ser de 
alto costo repercute en la existencia de pocos estudios reportados, pero sería un paso gigante para 
fortalecer y ampliar información, enriqueciendo a la comunidad científica en general, se 
convierte de igual forma en soporte sólido para seguir reforzando la importancia que existe el 
proporcionar este valioso alimento por las madres a sus descendientes (4). 
En este estudio de caracterización completa (metagenómica) del microbioma de la Leche 
Materna Humana en Madres Clínicamente Sanas (LMH-MCS) y Leche Materna Humana en 
Madres con Diabetes Gestacional (LMH-MDG), ofrece un apoyo científico para respaldar los 
esfuerzos del sistema de salud, ante la misma pujanza del gobierno para seguir apuntando a que 
la LMH sea el alimento prioritario del lactante y se logre mejorar la calidad de vida materno-
perinatal ante un avance preliminar a medicina de preventiva y de precisión (10). 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
7 
 
La OMS, el Colectivo Mundial para la Lactancia Materna y la Unicef, han publicado en 2017 
un nuevo informe, sobre la lactancia con resultados deprimentes, de 194 países evaluados en las 
prácticas de la LM. El 43% en Colombia y una media en el mundo del 40%, afirma que los niños 
menores de 6 meses reciben la LMHE (1). La OMS, recomienda la LM en los primeros 6 meses 
de vida del lactante de manera exclusiva y hasta los 2 años de edad de manera complementaria 
(3). 
La calidad de este alimento no solo radica en el componente nutricional que posee sino 
también en la carga microbiana, ayudando todos estos componentes con el desarrollo 
inmunológico, motor, neural y en general, en todo su crecimiento y desarrollo. La lactancia sigue 
al embarazo, interrumpirla perjudicaría al binomio madre e hijo (11). 
Por otro lado, existe preocupación en mujeres gestantes con diagnóstico de Diabetes 
Gestacional DG, quienes convencidas en un 47%, no ofrecerán LME, optando por brindar este 
alimento de manera mixta con otros líquidos, por no ser adecuadas según ellas, además del temor 
de contagiar a su bebé, como lo expone un estudio realizado en Venezuela (12). Estudios previos 
demuestran que patologías como la diabetes mellitus provocan disbiosis en la microbioma 
intestinal. No obstante, la afectación a la microbiota de la LMH es un poco desconocida en 
pacientes con diabetes gestacional (DG) (13). 
En 2016 se aprueba como política de estado para el desarrollo integral de la primera infancia 
la estrategia “De Cero a Siempre”, desde la cual se busca fortalecer la atención integral a la 
primera infancia, involucrando diferentes sectores que en conjunto trabajen para velar por los 
derechos de los niños desde el momento de su nacimiento, haciendo énfasis en los primeros 
años. “El programa cero a siempre se consolida como una de las formas más efectivas para 
8 
 
romper los círculos viciosos de la pobreza y de la violencia, y que contribuye a la construcción 
de paz y de una sociedad más equitativa y bien educada” (14). 
Partiendo de la importancia de la alimentación adecuada en los niños, se hace necesario 
ahondar en el microbioma de la LMH y plantear las diferencias identificadas entre Madres 
Clínicamente Sanas (MCS) y Madres con Diabetes Gestacional (MDG), aportando a la evidencia 
científica y contribuyendo a la promoción de la lactancia materna en el país como parte de la 
política dirigida a una sana nutrición en la primera infancia, como principal pauta de 
puericultura. 
A la fecha no se cuenta con estudios de tipo comparativo donde se evalúen la LMH-MCS y 
LMH-MDG, sin embargo, estudios similares han mostrado que en ambos casos se cuenta con 
una gran diversidad en el microbioma de la leche materna y las variaciones que ésta tiene durante 
la gestación (4). 
 
4. OBJETIVO GENERAL 
Comparar el microbioma de la leche materna de madres clínicamente sanas vs madres con 
diabetes gestacional, de Pereira Colombia. 
 
5. MARCO TEORICO 
La LMH es un fluido biológico complejo que además de ser una fuente de nutrientes 
indispensables para desarrollo temprano y crecimiento humano, contiene también su propio y 
único microbioma (15). La LMH suministra componentes que amparan el crecimiento y 
desarrollo infantil, y a su vez presenta distintos componentes inmunológicos fundamentales, con 
acciones antiinfecciosas y funciones críticas en la formación de inmunidad, pero además, incluye 
9 
 
bacterias comensales, beneficiosas y potencialmente probióticas, que pueden favorecer a la 
colonización intestinal infantil (16), de igual manera “componentes bioactivos, como las 
proteínas antimicrobianas lactoferrina y lisozima, y contiene una variedad de oligosacáridos que 
sirven como fuente de prebióticos” (17). 
a. Componentes nutricionales de la Leche Materna Humana (LMH) 
La LMH proporciona gran cantidad de nutrientes, entre ellos, micronutrientes como minerales 
(hierro, cobre, zinc, yodo y selenio), algunas vitaminas; la tiamina (Vitamina B-1), riboflavina 
(Vitamina B-2), niacina (Vitamina B-3), acido pantoténico (Vitamina B-5), piridoxina (Vitamina 
B-6), biotina (Vitamina B-7), folato (Vitamina B-9), cobalamina (Vitamina B-12) y colina, 
vitamina A en forma de retinol, ester de retinilo, y b-caroteno, Ácido ascórbico (Vitamina C), a-
tocoferol (Vitamina E), filoquinona (Vitamina K) (K-1) y menaquinona-4 (K-2) (18). La LMH 
también contiene hormonas, factores de crecimiento y otros componentes únicos y cruciales para 
que el lactante tenga un correcto desarrollo. 
La LMH no es ajena en composición de macronutrientes, como por ejemplo las proteínas, las 
cuales presenta más de 400 diferentes tipos que realizan funciones antimicrobianas, 
inmunomoduladores y de nutriente, y que podrían ser clasificadas en tres grupos principales: 
proteínas séricas, mucinas y caseínas (15). Respecto a los carbohidratos, la lactosa es el principal 
representante oscilando en concentraciones de alrededor de 60-70 g/L, contiene también 
oligosacáridos complejos compuestos de D-galactosa, D-glucosa, L-fucosa, N-
acetilglucosamina, N-acetilneuraminico que son el cuarto componente más abundante después 
del agua, los lípidos y la lactosa (18). La mayor fuente de energía que provee la LMH proviene 
de los lípidos, contribuyendo en 40-50% de la energía total, siendo triacilglicéridos en su gran 
10 
 
mayoría, el resto consiste en diacilgliceridos, monoacilgliceridos, ácidos grasos libres, 
fosfolípidos y colesterol (4). 
b. Microbioma leche materna humana 
Se han identificado en el ser humano varias microbiotas en distintos sitios del cuerpo quienes 
están colonizados por grupos diferentes de bacterias y la LMH no es la excepción. 
Se define el término ‘microbioma’ como el “número total de microorganismos y su material 
genético”, y ‘microbiota’ como la “población microbiana presente en los diferentes ecosistemas 
en el cuerpo” (19). 
Antes del año 2003, la LMH se consideraba un alimento estéril y libre de microorganismos, 
sin embargo, esto cambia cuando Martin, et al. en el año 2003 describieron la presencia de 
bacterias comensales y probióticas en la LMH, estudiadas mediante técnicas dependientes del 
cultivo donde encontraron bacterias de predominio ácido láctico, lactobacillus gasseri y 
lactobacillus fermentum (20). Posteriormente, y mediante la utilización de técnicas basadas en 
ADN independientes del cultivo, incluida la desnaturalización, electroforesis en gel en gradiente, 
electroforesis en gel en gradiente de temperatura y secuenciación de próxima generación (NGS), 
fue posible la detección de géneros bacterianos adicionales. Estos incluyen los anaerobios 
obligados, particularmente Bifidobacterium spp., Bacteroides spp.,y miembros de la clase 
Clostridia (21). 
En el primer estudio NGS de muestras de LMH, la diversidad de comunidades bacterianas se 
determinó manejando pirosecuenciación de 454 para apuntar al gen 16S rRNA y se halló que 
Streptococcus, Staphylococcus, Serratia y Corynebacterium fueron los géneros más abundantes 
(19), como también se observaron géneros no cultivables como Blautia, Clostridium, Dorea, 
Eubacterium y Ruminococcus (22). 
11 
 
El bacterioma “nuclear” se podría definir como el número presente de especies bacterianas de 
manera natural en un nicho ecológico especifico cuya modificación puede perturbar 
denegadamente la función y estructura de otros componentes del ecosistema (23). Hoy en día y a 
pesar que los resultados presentados hasta la fecha no decretan un bacterioma nuclear consistente 
en la LMH, en base a diversos estudios se ha estimado que dicho bacterioma nuclear puede estar 
compuesto por bacterias principalmente pertenecientes a los géneros Staphylococcus, 
Streptococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Lactobacillus y Propionibacterium (24). 
c. Origen del microbioma de la leche materna 
Distintos estudios dejan como resultado propuestas planteadas sobre los posibles supuestos 
que tratan de evidenciar la presencia de bacterias en la leche materna. Actualmente se ha hablado 
de 2 hipótesis: La primera hipótesis consistía en que la microbiota encontrada en la LMH 
provenía de la contaminación de la piel entre la glándula mamaria con la cavidad oral del 
neonato, desplazando bacterias desde la boca del neonato hacia la glándula mamaria y a la leche 
materna entre los conductos mamarios durante la succión, proceso llamado flujo retrógrado (20). 
Además, se estimaba que la microbiota de la LMH fuese obtenida de igual forma por el 
“trasplante natural de bacterias” como era conocido el momento por el cual el neonato pasaba 
por el canal del parto (19). Esta hipótesis pierde fuerza al presentar argumentos en contra a esta 
teoría, uno de ellos lanzado por Jeurink et al. sugieren que, aunque aquellos lactobacilos 
vaginales hacen contacto con el niño en el momento del parto, no colonizan con éxito el intestino 
neonatal (25). Por otro lado, propionibacterium, no fue encontrado como uno de los géneros más 
abundantes en la LMH, mientras que si se obtenía ampliamente en piel sebácea. El bacterioma 
encontrado en LMH usando Illumina MiSeq® era distinto de la piel areolar tanto en diversidad 
12 
 
como en composición (26). Jeurink P V, et al. los lactobacilos vaginales no coinciden con los 
lactobacilos de la LMH (27). 
La segunda hipótesis postula que las bacterias propias de la microbiota intestinal se unen a las 
células dendríticas o macrófagos en el intestino materno, acceden al epitelio intestinal sin 
cambiar la estructura de la barrera epitelial, transportando estos microorganismos desde las 
placas de Peyer a los ganglios linfáticos mesentéricos (28); de allí, acceden a otros tejidos del 
sistema linfoide asociado a mucosas, entre las que sobresalen, la respiratoria y la genitourinaria, 
y las glándulas salivales y lacrimales, incluyendo la misma glándula mamaria. Conocida 
entonces como 'migración activa', se plantea una ruta entero-mamaria endógena, considerando 
que, las bacterias del intestino materno son capaces de colonizar las glándulas mamarias y, 
posteriormente, al momento de amantar al neonato, serian entregadas a ellos por medio de la 
lactancia (20), otorgando beneficios múltiples, contribuyendo a la maduración y fortalecimiento 
del sistema inmunológico, previniendo enfermedades infecciosas. Esta teoría actualmente deja 
entre dicho como pueden las bacterias burlar el escudo protector del huésped sano y no ser 
fagocitadas (21). 
d. Alteraciones en el bacterioma de la leche materna humana 
La importancia del microbioma asociado a la LMH radica en que es una fuente viable de 
bacterias comensales capaces de colonizar el intestino del lactante y contribuir de manera 
importante en el desarrollo inmunitario intestinal del neonato (29). Diversos estudios han 
reportado que el modo de parto puede influir en la composición del microbioma en la LMH, 
cuando el alumbramiento ocurre por cesárea pueden decrecer especies de los géneros 
Bifidobacterium y Lactobacillus, comparados con muestras provenientes de madres que 
alumbraron vaginalmente (37). Otro factor determinante en la composición del bacterioma de 
13 
 
LMH es el peso de la madre, madres con sobrepeso u obesidad presentan menor diversidad 
bacteriana y altas concentraciones de Staphylococcus en comparación con madres en normopeso 
(4). El estado de salud de la madre también puede influir en la alteración de este bacterioma, se 
ha evidenciado una diversidad bacteriana más alta al igual que una abundancia de lactobacillus 
en madres con virus de inmunodeficiencia humana, en comparación con la madres sanas (20); la 
etapa de lactación es otro factor que puede influir en la composición de la microbiota presente en 
la LMH, esto debido a las diferencias de composición, principalmente de lípidos que existen 
entre el calostro, la leche de transición y la leche madura. Por último, la alimentación en las 
distintas localizaciones geográficas se suma a los posibles factores de alteraciones a la estructura 
bacteriana (30). 
e. Diabetes gestacional 
El embarazo a manera fisiológica genera estrés en las células beta pancreáticas, lo que podría 
terminar en una resistencia a la insulina DG. La DG según La Asociación Americana de Diabetes 
(ADA) la clasifica como: diabetes diagnosticada por primera vez en el segundo o tercer trimestre 
de embarazo, y que no es clara la existencia de diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2 (31). Es definida 
como la intolerancia a los hidratos de carbono de intensidad variable, de comienzo durante la 
gestación después de las 24 semanas cuando la célula beta pancreática es incapaz de compensar 
la resistencia a la insulina (32). Los siguientes parámetros son los utilizados para realizar un 
diagnóstico de DG: glicemia en ayunas mayor de 126 mg/dl, una HbA1c mayor del 6,5% y una 
glicemia plasmática mayor de 200 mg/dl, si presenta uno de estos parámetros, ya sea glucemia 
en ayunas o HbA1c, es indicativo de DG (33); pero, si solo el único parámetro es la glucemia 
plástica, se debe confirmar con glucemia en ayunas o HbA1c. toda paciente en estado de 
gestación se le debe suministrar una carga 75gr de glucosa en ayunas entre la semana 24 – 28 del 
14 
 
embarazo, si uno o más valores de la curva de tolerancia a la glucosa son iguales o mayores, 
hacen el diagnostico de diabetes gestacional: glucosa en ayunas: 92 mg/dL, 1 hora glucosa en 
plasma: 180 mg/dL, 2 horas glucosa en plasma 153 mg/dL (34). 
En la actualidad, en Colombia estiman una prevalencia entre 10,3% y 15%. Un 5 % hace 
referencia a diabéticas tipo II, 7,5% a diabéticas tipo 1 que quedan en embarazo, y el 87,5% 
restante son efectivas diabetes del embarazo (35). En México se dice que afecta en un 14% de 
todos los embarazos (36). 
 
6. METODOLOGÍA 
a. Obtención de muestras 
Se reclutaron maternas con los siguientes criterios de inclusión: edad entre 20 y 41 años, de 
acuerdo a su historia clínica debían estar “Sanas” para el primer grupo y para el segundo grupo 
ser diagnosticadas con diabetes gestacional, en ambos casos el embarazo debió finalizarse a 
término, haber tenido al menos cuatro controles prenatales, con todos los exámenes realizados y 
procedentes del eje cafetero. 
Como criterios de exclusión se tuvieron en cuenta: poseer enfermedades metabólicas 
identificadas tales como obesidad, desnutrición, hipotiroidismo, hipertensión, enfermedades 
infectocontagiosas (Sífilis, Toxoplasmosis, Rubeola, hepatitis B y VIH), gestante valorada como 
de alto riesgo, complicaciones del parto o puerperio y malformaciones craneoencefálicas en el 
neonato que comprometan la lactancia. 
Luego de la explicación e invitacióna participar en la investigación, con previa firma de 
consentimiento informado, se obtuvieron muestras entre los 10 y 30 días, (período en adecuado 
para la microbiota intestinal después del parto) (37), de un total de 10 maternas, 5 de ellas con 
15 
 
DG y 5 sanas quienes serian el grupo control, en pares con sus neonatos, atendidas en la clínica 
Comfamiliar de Risaralda, Colombia. Las muestras fueron recolectadas en conchas de leche 
estériles, directamente del seno sin esterilizar con el fin de ser lo más natural a la lactancia del 
neonato. Se hizo un pull de la leche materna y se almacenaron en tubos de 15 ml autoclavados y 
se congelaron a -20ºC hasta procesarlas. Los datos se obtuvieron mediante encuesta y contando 
con la aprobación del comité de bioética de la institución. 
Las muestras fueron comparadas con la metagenómica de la materia fecal del neonato (Las 
cuales fueron tomadas en pañal desechable al revés) y de las maternas (frasco estéril), además 
con la materia fecal de bebés alimentados bajo fórmula a saber, se tomaron 5 muestras fecales de 
madres lactantes y 5 muestras fecales de los niños lactantes y 5 de los no lactantes en frascos 
estériles. Las muestras se congelaron en un periodo máximo de 30 minutos después de tomadas, 
y se almacenaron a -20°C hasta su procesamiento. 
b. Purificación de ácidos nucleicos 
El ADN genómico de las muestras de leche fue extraído de 1 mL a través de la eliminación de 
la grasa de las muestras por centrifugación y posteriormente al lavado de los pellets obtenidos 
con buffer PBS y lisozima/mutanolisina se utilizó el kit comercial DNeasy Blood and Tissue 
(Qiagen). El ADN de muestras fecales fue purificado a partir de 25 mg de materia fecal 
siguiendo las especificaciones del kit comercial mencionado anteriormente. La calidad del ADN 
estuvo verificada por espectrofotometría utilizando un equipo NanoDrop y previamente a la 
secuenciación se validó por Bioanalyzer. 
c. Procedimiento de secuenciación 
La librería pair-ended de secuenciación del gen ribosomal 16S se construyó de acuerdo a las 
especificaciones de la Illumina Multiplexing Guide (Illumina), de acuerdo a este procedimiento, 
16 
 
el ADN fue fragmentado, reparado en los extremos, marcado con A’s y ligado a los adaptadores 
37F (CTCCTACGGGAGGCAGCAG) y CD (CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC). El ADN 
fue enriquecido por PCR a 25 ciclos. Las librerías obtenidas fueron secuenciadas a través de la 
plataforma Illumina MySeq para producir un tamaño de rad de 300 pb en dirección forward y 
reverse (2x300) asegurando por lo menos 100,000 reads por muestra. La secuenciación se llevó a 
cabo en Laboratorio de Servicios Genómicos del Laboratorio Nacional de Genómica para la 
Biodiversidad (LANGEBIO) en Irapuato, México. 
d. Análisis bioinformáticos 
La calidad de los reads de secuenciación obtenidos se verifico utilizando FastQC. Los reads 
obtenidos se ensamblaron y su calidad fue verificada descartando secuencias de baja calidad. Las 
unidades taxonómicas operacionales (OTU’s) encontradas fueron identificadas por homología 
(97% de identidad) en un enfoque closedreference utilizando la base de datos SSUR Silva v. 132 
en la plataforma informática MOTHUR. Adicionalmente se removieron todas las secuencias 
identificadas como quiméricas y no bacterianas utilizando el algoritmo vsearch en MOTHUR 
local y en Galaxy Project Portal. El perfil taxonómico y el análisis diferencial bacteriano 
presente en las muestras se calculó y visualizo con MicrobiomeAnalyst 
(www.microbiomeanalyst.ca). La diversidad alfa de las muestras o diversidad dentro de cada 
muestra se calculó utilizando los algoritmos Chao1 y Simpson, mientras que la diversidad entre 
muestras (diversidad beta), se calculó a través del método de distancia Bay-Curtis y 
filogenéticamente. Se identifico el microbioma nuclear o constante entre todas las muestras de 
leche y fecales. El análisis diferencial de OTU’s y géneros bacterianos identificados entre las 
muestras analizadas se llevó a cabo a través de comparaciones estadísticas t-test/ANOVA y 
Mann-Whitney con el estatus DG como variable. 
17 
 
7. RESULTADOS 
 
Figura 1. Abundancia relativa de filos en las muestras analizadas presentadas por condición 
de salud. GDM: diabetes gestacional. 
En GDM se encontraron muestras compuestas por 189 OTU’s de 47 géneros bacterianos que 
fueron identificados. En la (figura 1) se evidencia una identificación marcada de tres filum 
correspondientes a Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacterias. El contraste entre el grupo de 
LMH de madre con GDM y LMH madres grupo control es leve, no se encontraron diferencias 
significativas en la Abundancia Relativa (AR) de ningún filum entre las muestras. 
18 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Gráfico de barras de AR a nivel de género. DBMilk1-5: DG LMH, BMilk1-5: 
control de la leche materna. 
A nivel de género (figura 2), Veillonella, Bacteroidetes no clasificados, Pseudomonas, 
Bacillales, están AR superior dentro de las muestras de DMG, mientras que Serratia, 
Acinetobacter, Enterococcus y Staphylococcus se encontraron con AR mayor en muestras 
control. Paenibacillus se encontró en AR alta en las muestras analizadas. 
19 
 
No se encontró una diversidad alfa significativa entre las muestras de control y DMG. Sin 
embargo, se observó un índice de diversidad alfa ligeramente más alto en las muestras de control 
a nivel de género. No se registró diversidad beta significativa entre los grupos analizados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Gráfico de análisis discriminante lineal que muestra la abundancia de géneros 
significantes diferenciales entre la DMG y grupo control. 
 
8. DISCUSIÓN 
Los hallazgos en este estudio demuestran que existe diferencia en el microbioma de la LMH 
de madres sanas vs LMH de madres con DG. Antes del año 2013 se consideraba la LMH como 
un producto estéril, sin embargo en diversos estudios se ha demostrado a través del tiempo que 
existe una diversidad significativa de microorganismos presentes en este alimento (20)(21), y 
este estudio no fue la excepción. 
20 
 
Se encontró lecturas de Paenibacillus spp. presente en alta AR en las muestras analizadas. 
Este grampositivo en forma de bastón, anaeróbico facultativo no tiene muchos estudios previos. 
Se han reportado hasta la fecha solo dos especies P. faecis y P. phocaensis, aisladas del intestino 
humano (13). Por ahora, Las especies de Paenibacillus spp en humanos no se han asociado con 
enfermedad (38). 
En este estudio se exponen 3 filums predominantes en la LMH de ambos grupos estudiados: 
Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria como los más abundantes, lo que coincide con los 
hallazgos reportados por LeMay-Nedjelski, et al. en su estudio publicado en julio de 2020, donde 
identificaron Proteobacteria y Firmicutes como los filos más abundantes, seguidos de 
Actinobacteria, Bacteroidetes y Fusobacteria (17), sin embargo en el presente estudio se observó 
mayor presencia de Proteobacteria en el grupo control LHM y mayor cantidad de Firmicutes en 
LMH de madre con DG, sin que este dato sea estadísticamente significativo en los resultados. 
Hubo una AR superior en el grupo de LMH-MDG de Bacteroidetes no clasificados. Esta 
familia de bacilos Gram (-), anaeróbicos, no formadores de esporas, que contempla géneros 
como Bacteroides y que hacen presencia altamente en las heces fecales y la cavidad bucal, son 
abundantes en el intestino e importantes en el metabolismo de polisacáridos complejos que 
arriban intactos al colon para descomponerlos en las unidades más simples (39). De igual manera 
este género hace parte de los microrganismos de la flora intestinal con capacidad de generar 
menaquinona (vitamina K2), una forma natural de obtener Vitamina K a partir de la respiración 
anaeróbica de estos comensales en el intestino humano (40). La vitamina K como nutriente 
esencial es necesariopara la coagulación de la sangre, la salud ósea, transporta electrones a la 
membrana citoplasmática, generando funciones antioxidantes con la finalidad de proteger las 
membranas celulares de la oxidación lipídica, durante la respiración procariota, perteneciendo 
21 
 
entre los principales productores de menaquinona los miembros de los géneros Bacteroides, 
Enterobacterias, Serratia (13), los 2 últimos géneros pertenecientes al filum Proteobacteria, se 
encontraron presentes en este estudio en una AR mayor en el grupo de LMH de control; de esta 
manera se podría decir que las madres con DG al amamantar a los niños tendrían una 
disminución en la suplementación de menaquinona hacia ellos, por lo menos durante los primero 
meses de vida. 
Se observó que Enterococcus y Staphylococcus estuvieron presentes en AR superior en el 
grupo control, el estudio publicado en 2016 por Hassan et al. han demostrado que las fracciones 
citoplasmáticas de Enterococcus faecalis y Staphylococcus hominis muertas por el calor en un 
estudio in vitro poseen actividad antitumoral contra una línea celular de cáncer de mama. (20). 
El presente estudio demuestra también la presencia de Pseudomona con mayor predominio en 
el grupo de mujeres con diabetes gestacional, a pesar de que la Pseudomona se considera 
causante de varias infecciones como las neumonías asociadas al cuidado de la salud e infecciones 
urinarias, es considerada la quinta causa de infecciones a nivel mundial, ocupando el segundo 
lugar como causa de neumonía nosocomial, el tercer lugar en causas de infecciones urinarias, el 
cuarto puesto en infecciones de sitio quirúrgico y es la séptima causa de sepsis a nivel mundial, 
según describe Paz Zarza et al. (41); llama la atención que no se comporta como patógeno, 
probablemente por la presencia de proteínas como la lactoferrina, componente fundamental en la 
inmunología de la LMH, la cual es descrita por García- López desde 2011 con acción 
bacteriostática y antimicrobiana al actuar en la membrana celular, secuestrar el hierro y bloquear 
el metabolismo de hidratos de carbono de S. aureus, Vibrio cholerae, E. coli, Pseudomonas (18). 
Es probable que la presencia de Pseudomona particularmente significativa en la LMH de las 
mujeres con diabetes gestacional se deba a la inmunosupresión que posee la mujer por su 
22 
 
patología de base (41), sin embargo, es necesario realizar otros estudios relacionados con el 
tema, pues actualmente no se encuentra evidencia que soporte esta teoría . 
 
9. CONCLUSIONES 
Tal como se describe desde el 2013, se demuestra una vez más, que la leche materna no es un 
alimento estéril, y por el contrario se evidencia la presencia de múltiples microorganismos que 
son considerados como causantes de infecciones en su mayoría, pero, no actúan de la misma 
manera al estar presentes en la LMH, por lo que sigue siendo importante considerar la LM de 
manera exclusiva como un valioso alimento brindado al lactante, incluso si la madre no es 
clínicamente sana, pues como se demuestra en este estudio, no existen diferencias significativas 
entre los filum presentes en ambas muestras analizadas. Sin embargo, bioquímicamente si puede 
traer consecuencias para el lactante y la madre, por disminución de síntesis de vitaminas K o 
menor protección ante posibles líneas de cáncer que puedan afectar el seno de la madre. 
Es de resaltar que, aunque se evidenció un número mayor de géneros patógenos de bacterias 
en la LM de las MDG, se hace necesario evaluar la microbiota de los niños que reciben la misma 
y poder así evidenciar el impacto y el alcance que puede tener en los menores el recibir LMH de 
madres que presenten esta patología. Así mismo, es importante revisar los resultados de la 
evaluación de la microbiota materna, para asociar los hallazgos con los resultados evidenciados 
en este estudio, apoyar o refutar la importancia de la vía entero-mamaria y poder tener 
conclusiones más amplias que aporten a la evidencia respecto al tema, pues en la revisión 
realizada para este estudio, se encontró que es poca a la fecha. 
 
23 
 
Se sugiere continuar estudios similares en otros grupos poblacionales, teniendo en cuenta que 
la ubicación geográfica, la dieta y otras patologías, de una u otra manera influyen en la 
microbiota tanto de la madre, la leche materna y sus hijos, buscando determinar el bacterioma de 
la LMH y seguir aportando a un tema que es tan amplio como relevante. 
 
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