microscopios ME

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MICROSCOPIA 
DE LUZ
Dra Shirley Rojas
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES
Inventado en 1932 por el físico neerlandés Frits Zernike
Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas
Es un microscopio óptico modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad.
Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminación de tal manera que vaya en diferentes rutas a través de las distintas partes de una célula.
El resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad.
Con este método, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la célula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras.
MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA
Se basa en principios similares a los del microscopio de contraste de fases, pero tiene la ventaja de dar resultados cuantitativos e información adicional sobre las propiedades físicas de los componentes celulares.
Las variaciones de fase se pueden reflejar en cambios de color tan acentuados que una célula viva es susceptible de parecerse a una preparación coloreada.
Células de Sacharomyces cerevisiae por microscopía de interferencia
MICROSCOPIO DE NOMARSKI
La microscopía de Nomarsky o de contraste de interferencia diferencial (DIC) 
Se basa en el mismo principio que la microscopía de contraste de fases 
Pero utiliza un dispositivo distinto a los anillos intercambiadores de fase para aumentar las diferencias de los índices de refracción de las partes del objeto. 
Este microscopio utiliza unos prismas en los sistemas de lentes condensador y objetivo que producen imágenes con mayor detalle que el microscopio de contraste de fases y con aspecto ligeramente tridimensional.
 Protozoo unido a un alga verde filamentosa con bacterias en su superficie (160x), Nomarski diferencial de interferencia de contraste.
Frotis sanguíneo observado con interferencia diferencial según Nomarski. Se identifican eritrocitos y dos leucocitos
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Las sustancias fluorescentes son capaces de emitir una luz de mayor longitud de onda que la de la fuente de luz con que son iluminadas. 
Cuando se iluminan con luz uv (de longitud de onda corta, no visible) son capaces de devolver luz visible, intensamente brillante contra un fondo oscuro. 
Este microscopio lleva, una fuente de luz uv para iluminar la muestra y un condensador especial, de cuarzo, susceptible de ser atravesado por la luz uv.
La utilización de luz uv para iluminar la muestra hace que el límite de resolución de estos microscopios sea menor (y por tanto su poder de resolución, mayor) que el de los microscopios de campo claro. 
Algunos microorganismos son fluorescentes por sí mismos, como algunas bacterias fotosintéticas y algas, pero la mayoría no lo son. 
Pueden observarse en este microscopio si se tiñen con sustancias fluorescentes como:
la naranja de acridina,
la auramina 
la rodamina. 
Células epiteliales 
Célula del músculo cardiaco
La tinción de un microorganismo con anticuerpos específicos unidos a compuestos fluorescentes es de gran utilidad en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y una de las aplicaciones más importantes de esta microscopía
Staphylococcus aureus teñido con Naranja de Acridina
MICROSCOPIO CONFOCAL
Es básicamente un microscopio óptico que incluye como fuente de luz un láser y un sistema electrónico que ayuda a la captación de imágenes.
Gracias a ello se consigue por un lado un aumento en la resolución y por otro la obtención de imágenes de secciones ópticas extremadamente finas
Eliminando la interferencia que produce la luz que llega de los diferentes campos ópticos de todo el grosor de la muestra que se observa
Se consigue así que el enfoque se realice sobre un único plano (confocal). 
Por todo ello y a que las imágenes obtenidas son imágenes digitales, se pueden obtener aumentos insospechados para la microscopía óptica.
MICROSCOPIO DE POLARIZACIÓN
Es un MO al que se ha agregado dos filtros polarizadores de luz
Uno de ellos (filtro polarizador) se coloca debajo del condensador
El otro (filtro analizador) se coloca por encima de las lentes del objetivo, en el tubo del microscopio
Ambos filtros se colocan cruzados, con lo cual se suprime el paso de la luz directa
El campo del microscopio aparece homogéneamente oscuro, salvo ciertos componentes de la preparación que se pueden distinguir brillando sobre un fondo oscuro 
Si el material es isotrópico, la propagación de la luz polarizada ocurre en él con la misma velocidad.
Estas estructuras se caracterizan por tener el mismo índice de refracción en todas las direcciones
En un material anisotrópico la velocidad de propagación de la luz polarizada difiere según la dirección que se considere
Un material anisotrópico también se denomina birrefringente, por que presenta dos índices de refracción distintos, que corresponden a las diferentes velocidades de transmisión
Este tipo de microscopio se usa para poder identificar sustancias cristalinas (minerales) o fibrosas (como el citoesqueleto)
También se lo utiliza para el diagnóstico histopatológico, con el fin de detectar la presencia de lagunas sustancias anormales en los tejidos, como cristales de oxalato, ciertos cuerpos extraños o sustancia amiloide.
Citoesqueleto
células musculares estriadas
MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
Ultramicroscopio 
El microscopio de campo oscuro es un tipo de microscopio óptico en el que se ha modificado el sistema de iluminación de manera que la luz incide sobre la muestra sólo desde los lados. 
Con el condensador de campo oscuro no entra luz directa en el objetivo, y por lo tanto el objeto aparece brillante, a causa de la dispersión de la luz, sobre un fondo oscuro
Este depende de controlar la iluminación del espécimen para que la luz central que normalmente pasa a través y alrededor del espécimen se bloquee. 
En lugar de iluminar la muestra con un cono de luz completo (como en microscopia de campo claro) el condensador forma un cono hueco con luz que pasa alrededor del cono en lugar de pasar a través de este.
Esta forma de iluminación permite que solamente los rayos de luz oblicuos peguen en el espécimen la platina del microscopio y se forme la imagen con rayos de luz dispersados por la muestras y capturados por el objetivo. 
La microscopia de campo oscuro crea contraste en especimenes transparentes sin tinción como células vivas. 
 
Cuando no hay muestra en la platina del microscopio la observación es completamente oscura.
Configuración esquemática del principio de iluminación de campo oscuro (luz transmitida). 
El filtro opaco es de forma circular y forma un cono de luz vacío que incide sobre el espécimen en forma oblicua y los rayos refractados, difractados y reflejados por el espécimen penetran en el sistema óptico del microscopio para formar la imagen.
APLICACIONES:
Es ideal para revelar contornos, bordes, fronteras y gradientes de índice de refracción pero no brinda mucha información sobre la estructura interna. 
Los objetos ideales incluyen células vivas sin tinción
Observación de células móviles, como el Treponema pallidum, la cual con la microscopía óptica ordinaria es muy difícil de visualizar.
Estudio de procesos fisiológicos como mitosis y migración celular. 
Espiroquetas 
de Treponema
pallidum
Células epiteliales
Espermatozoides
Micrografías de la superficie de una hoja que muestran diferencias de contraste entre los diversos tipos de iluminación. 
En la parte inferior se aprecia el tipo de filtro empleado, en campo claro (derecha) el haz de luz pasa sin interrupción. 
En campo oscuro, aún muchos detalles más pequeños son visibles. 
En iluminación oblicua se obtiene contraste con relieve. En campo claro el contraste es limitado.
Microscopia electrónica
Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos.
Los microscopios electrónicos permiten alcanzar ampliaciones hasta 5100 veces más potentes que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles".
Un microscopio electrónico, funciona con un haz de electrones generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya que los electrones son absorbidos por el aire).
Un rayo de electrones atraviesa la muestra (debidamente deshidratada y en algunos casos recubierta de una fina capa metálica para resaltar su textura) 
y la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. 
Los microscopios electrónicos producen imágenes sin ninguna clase de información de color, puesto que este es una propiedad de la luz y no hay una forma posible de reproducir este fenómeno mediante los electrones
Sin embargo, es posible colorear las imágenes posteriormente, aplicando técnicas de retoque digital a través del ordenador.
EXISTEN DOS TIPOS PRINCIPALES DE ME
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISIÓN
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION (MET)
Un MET dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. 
Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen y deja su impresión en una pantalla fluorescente.
Las áreas de la muestra que son más transparentes aparecen de color brillante, y las que son más opacas aparecen oscuras.
El tubo del microscopio debe estar sometido al vacío.
Las muestras a observar deben ser extremadamente finas, por lo que se cortan con ultramicrotomos.
No pueden utilizar lentes de vidrio (opacas a los electrones), que son sustituidas por electroimanes.
Los portaobjetos de vidrio son sustituidos por rejillas metálicas de unos 2mm.
Poder de resolución: 0,2nm. 1000 veces más que el m.óptico.
1.000.000x aumentos
micrótomo
Espermatozoides
vovinos
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO (SEM)
Es un microscopio que tiene una gran profundidad de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra.
Produce imágenes de alta resolución, que significa que características espacialmente cercanas en la muestra pueden ser examinadas a una alta magnificación.
La preparación de las muestras es relativamente fácil pues la mayoría de SEMs sólo requieren que estas sean conductoras.
Piojo humano 
(Pediculos humanus)
 con un huevo
En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón.
Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV
Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio.
Inventado en 1981 por Ernst Ruska, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer.
No es necesario cortar la muestra en capas, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos.
El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto.
Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisión.
Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparición de electrones secundarios. 
Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen. 
Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión. 
Cuanto mayor sea el número de electrones contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla.
A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor.
Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o más.
Aunque permite una menor capacidad de aumento que el microscopio electrónico de transmisión, permite apreciar con mayor facilidad texturas y objetos en tres dimensiones que hayan sido pulverizados metálicamente antes de su observación.
Por esta razón solamente pueden ser observados organismos muertos, y no se puede ir más allá de la textura externa que se quiera ver.
Los microscopios electrónicos sólo pueden ofrecer imágenes en blanco y negro puesto que no utilizan la luz.
Ácaro de la harina
 (Acarus siro)
Gracias 
por su 
atención