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Biológicas / Saúde

Igor Souza

23/3/2020

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Control de calidad microbiológica

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Manual de Prácticas de
Microbiología Industrial
UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA

Práctica I
Bioseguridad
La bioseguridad es una doctrina de comportamiento encaminada a lograr actitudes y
conductas que disminuyen el riesgo del trabajador. Es un conjunto de medidas preventivas,
destinadas a mantener el control de factores de riesgo laboral, procedente de agentes biológicos,
físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o
producto final de los procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de trabajadores,
visitantes y medio ambiente. El conocimiento y la aplicación adecuada de normas de
bioseguridad así como la importancia de estas normas antes, durante y después de cada
práctica es un deber de cada estudiante en el laboratorio donde se esté desenvolviendo.

Todos los establecimientos laborales, incluyendo los laboratorios de análisis,
investigación y demás, necesitan tener una serie de normas para llevar un desempeño seguro y
garantizar resultados exitosos. Las normas generales son:
 El acceso al laboratorio estará limitado solo al personal autorizado.
 El personal que trabaje en el laboratorio debe cumplir a cabalidad las normas de
bioseguridad.
 Toda área debe estar marcada con la respectiva señal de riesgo biológico y su nivel de
contención.
 Al ingresar al laboratorio se debe tener en cuenta el debido porte de la bata manga larga,
abotonada y limpia, así mismo una vez se ingrese se debe colocar los abrigos libros y
demás objetos, en sitios adecuados para evitar un posible accidente y nunca sobre los
bancos o mesas.
 Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesión de laboratorio para
evitar la contaminación por corrientes de aire.
 Al inicio y término de una práctica se debe limpiar la superficie de trabajo con una
solución desinfectante.
 El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado, durante el trabajo o el término del
mismo.
 Se deben lavar las manos al inicio y al término de cada sesión de trabajo, secándolas
posteriormente con toallas de papel.
 Se deberán usar todos los implementos necesarios para la protección según el nivel de
riesgo biológico.
 Durante la práctica no se deben guardar ni consumir alimentos y bebidas.
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 Se debe colocar un calzado adecuado para las prácticas en el laboratorio, así como
mantener las uñas cortas, limpias y sin esmalte.
 Utilizar los equipos según las instrucciones o los procedimientos operativos
estandarizados.
 Realizar el trasporte de materiales o de muestras de manera tal que en caso de caídas no
se produzca salpicadura.
 Todo personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto con materiales
potencialmente infecciosos sin la debida protección.
 Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente el supervisor de
laboratorio.
 Utilizar máscaras faciales si existe el riesgo de salpicaduras o aerosoles.
 Apagar los instrumentos eléctricos antes de manipular las conexiones.

Figura 1.1. Algunos símbolos de bioseguridad presentes en el laboratorio y su significado.

1. Principios básicos de bioseguridad
El término contención se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales
infecciosos en el ambiente de laboratorio donde son manipulados o conservados. El objetivo de
la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios, de otras
personas y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.

1.1 Niveles de contención
El elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las
prácticas y técnicas microbiológicas de procesamiento de las muestras de laboratorio. Cuando
las prácticas de laboratorio no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o
un procedimiento de laboratorio en particular, es necesario aplicar medidas adicionales. Estas
medidas adicionales corresponden a los equipos de seguridad diseñados para la protección del
personal y las prácticas de manejo (barrera primaria), así como el diseño de instalación y
características de ingeniería adecuados (barrera secundaria).
1.2 Barreras primarias
Constituyen la primera línea de defensa cuando se manipulan materiales biológicos,
químicos o físicos. Se considera que las barreras de protección primaria son: equipos de
protección personal (guantes, mascarillas, mandiles); cabinas de seguridad biológica (con
barreras de aire, que permiten que éste fluya en una sola dirección y a una velocidad constante
originando el flujo de aire laminar o flujo con ausencia de turbulencias y con filtros, que
atrapan las partículas contenidas en el flujo de aire); normas de higiene personal;
inmunización (vacunación); desinfección (alcohol, compuestos fenólicos, hipocloritos) y
esterilización (calor húmedo, calor seco) de instrumentos y superficies. Principalmente se busca
la protección del personal presente en un ambiente frente a los agentes infecciosos o productos
químicos de riesgo. Seguridad.
1.3 Barreras secundarias
El diseño y construcción de un laboratorio se conoce como contención o barrera
secundaria, contribuye a la protección del personal del laboratorio así como el que se localiza
fuera del laboratorio y personas de la comunidad en general, frente a posibles escapes
accidentales de agentes infecciosos. Se incluye la localización del laboratorio fuera del área de
tránsito, acceso restringido al personal autorizado con puerta cerrada con llave ( nivel 2) o doble
puerta ( nivel 3), presencia de lavamanos, duchas de emergencia, mesas de trabajo resistentes al
calor moderado, ácidos y álcalis, áreas con la señal de riesgo biológico y su nivel de contención,
tratamiento de residuos o transporte en envases sellados, servicios auxiliares de gas, aire y
eléctrico de fácil acceso.

2. Clasificación de los agentes biológicos por grupo de riesgo
2.1 Agentes biológicos del grupo 1
Es poco probable que causen enfermedad en los humanos, no se les conoce factores de
virulencia y pueden tener susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Ejemplo:
Escherichia coli K12, Saccharomyces cerevisiae, microorganismos que se utilizan en la
elaboración de quesos, embutidos, entre otros.

2.2 Agentes biológicos del grupo 2
Pueden causar enfermedad en el hombre, es poco probable que se propaguen a la
colectividad y generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz. Algunos de estos agentes
pertenecen a la biota habitual del hombre, siendo capaces de originar una patología infecciosa
de gravedad moderada o limitada. Ejemplo: Staphylococcus epidermidis, Salmonella spp., entre
otros.
2.3 Agentes biológicos del grupo 3
Pueden causar una enfermedad grave en el hombre y presentan un serio peligro para los
trabajadores, con riesgo de que se propaguen a la colectividad; sin embargo, existe
generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Implican patología grave, de difícil y largo
tratamiento, pueden curar con secuelas y ocasionalmente producen la muerte. El mayor y más
frecuente peligro es la infección adquirida a través de aerosoles y por fluidos biológicos.
Ejemplo: Mycobacterium. tuberculosis, Brucella sp., Coxiella burneti, entre otros.
2.4 Agentes biológicos del grupo 4
Son aquéllos que causan una enfermedad grave en el hombre y suponen un serio
peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propaguen a la colectividad
y sin que exista generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Normalmente son
microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Ejemplo: virus Ebola, Hantavirus,
etc.

3. Niveles de bioseguridad para los laboratorios
Se consideran cuatro nivelesde contención o de seguridad biológica, que consisten en la
combinación, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biológica descritos:
técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y diseño arquitectónico de las instalaciones del
laboratorio. Cada combinación está específicamente dirigida al tipo de actividades que se
realizan, las vías de transmisión de los agentes infecciosos y la función o actividad el
laboratorio. De forma general, los cuatro niveles de bioseguridad definen la contención
necesaria para proteger al personal y al ambiente.

3.1 Nivel de bioseguridad 1
Es el nivel de seguridad requerido para trabajar con agentes biológicos del grupo de
riesgo 1. Es utilizado habitualmente en los laboratorios de prácticas de universidades o centros
de enseñanza donde se emplean microorganismos no patógenos.
3.2 Nivel de bioseguridad 2
Es el nivel obligado para trabajar con agentes del grupo de riesgo 2. Considera personal
especializado para el manejo de éstos microorganismos y corresponde a algunos laboratorios de
microbiología clínica y de control de calidad sanitaria (técnicos de laboratorio, especialistas en
microbiología).
3.3 Nivel de bioseguridad 3
Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biológicos del grupo de riesgo 3. El
material biológico sólo puede ser procesado por personal calificado y en una zona con
infraestructura apropiada para el nivel de contención 3, es decir, con aire acondicionado
independiente, sin recirculación de aire, con gradiente de presión, cabinas de bioseguridad, entre
otras características; correspondiendo a algunos laboratorios de microbiología clínica, de
producción de biológicos y de control de calidad sanitaria.
3.4 Nivel de bioseguridad 4
Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha de un agente biológico de
riesgo 4, especialmente patógeno infecto – contagioso, exótico o no, que produce alta
mortalidad y para el que no existe tratamiento o es poco fiable. Este nivel también puede
utilizarse para trabajar con animales de experimentación infectados por microorganismos del
grupo de riesgo 4.

4. Referencias bibliográficas
- Granados, E. & Villaverde C. (1977). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.
- Instituto Nacional de Salud. (2002). Manual de bioseguridad para los laboratorios.
Serie de Normas Tècnicas Nº 18 (2 º ed.). Perú
- Perú, Ministerio de Salud. (2001). Buenas Prácticas de Laboratorio. Seminario Taller,
Lambayeque, Perú.

Práctica II
Material y equipo de laboratorio

1. Introducción
Las tres fuentes del conocimiento son la observación, la experimentación y el razonamiento. La
experimentación exige menos esfuerzo mental pero más tiempo, es decir más presencia; por
consiguiente se necesita equilibrar la enseñanza con más horas de laboratorio para un buen
aprendizaje. Una buena enseñanza experimental debe fomentar la capacidad de distinguir entre
observar un fenómeno o una reacción, y el poder interpretarlo. La correcta observación le dará
el domino real sobre la materia. La capacidad de interpretación le proporcionará además la
preparación técnico-científica necesaria para ser un buen investigador.
Es de vital importancia el conocimiento y buen manejo del material y equipo de laboratorio,
sólo así se logrará obtener buenas lecturas lo que permitirá una buena interpretación de los
resultados.

2. Objetivos
2.1 Reconocer el material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiología.
2.2 Aprender a utilizar los equipos en el laboratorio de Microbiología.
2.3 Aprender a esterilizar el material en el laboratorio de Microbiología.

3. Procedimiento
3.1 Reconocimiento de material y equipo utilizados en el laboratorio de Microbiología
3.1.1 Tubos de ensayo
Existe una gran variedad de tubos, pero se prefieren los de vidrio neutro, paredes gruesas y
sin rebordes para facilitar el taponamiento. Para estudios bioquímicos se usan tubos de 13 X
100 mm. y para diluciones tubos de 16 X 150 mm y de 15 X 125 mm.
3.1.2 Placas de Petri
Están compuestas por dos cristalizadores, de los cuales el más grande hace de tapa. Se emplean
para el aislamiento y cultivo de microorganismos.
3.1.3 Tubos de Smith
Son utilizados para cuantificar el gas producido en los procesos de fermentación.
3.1.4 Campanas de Durham
Son tubos de vidrio huecos con uno de sus extremos cerrado y dilatado y permiten detectar la
producción de gas en los procesos de fermentación.

3.1.5 Pipetas serológicas o de medida
Presentan subdivisiones de su capacidad total y se calibran en mL a 20°C. Las marcas más
conocidas son PYREX, NORMAX y CORNING. Las pipetas NORMAX se usan para trabajos
de precisión, son contrastadas individualmente por la Oficina Nacional de Patrones en
Norteamérica y tienen las siglas NBS y el año de control. Por ejemplo, una pipeta NORMAX
serológica de 1 mL de capacidad tiene un error tolerable (ET) de 0,01 (1%), mientras que una
pipeta PIREX del mismo volumen tiene un ET de 0.02 (2%).
Las pipetas serológicas son terminales y con capacidad de 0,1 a 25 mL. Las de mayor uso son:
Pipetas de 10 mL 0,1 mL
Pipetas de 5 mL. 0,1 mL
Pipetas de 1 ml. 0,1 y 0,01 mL
Pipetas de 0.1 mL. 0,1 y 0,001 mL
Pipetas de Dhan de 0,125 0,0125 mL
Pipetas de Dhan de 0,250 0,0250 mL
Pipetas de Bang de 0,2 0,08 y 0,005 ml
Las pipetas graduadas pueden ser terminales, cuando el vaciado del líquido se realiza hasta la
punta de la pipeta y pipetas no terminales cuando el vaciado del líquido se realiza hasta la
última línea de graduación.
3.1.6 Pipetas Pasteur
Son confeccionadas de varillas de vidrio de diámetro de 4 X 20 mm. y de 30 ó 40 cm. de
longitud. La calidad del vidrio debe facilitar el reblandecimiento a la acción directa de la llama
del mechero, para conseguir un estiramiento a la capilaridad deseada. Se emplean para la toma
de pequeños inóculos de siembra.
Modo de emplear la pipeta Pasteur
- La pipeta se sujeta con el pulgar y el dedo medio. Se coloca la punta de la pipeta en el
líquido por medir, bastante profundo, para que se pueda aspirar el volumen necesario sin aire.
Con aspiración suave, se llena el líquido por encima de la marca de calibración. Se cierra la
pieza de la boca con el dedo índice.
- Se seca el exceso del líquido en el exterior de la pipeta con un paño o un papel limpio,
y colocando la punta de la pipeta contra el recipiente, se deja que el nivel del líquido baje hasta
la marca de calibración moviendo con suavidad el índice sobre la pieza de boca. El dedo no
debe retirarse.
- Ahora la pipeta se pasa al recipiente de recepción, colocando su punta contra la pared.
- Se levanta el dedo de la pieza de boca y se deja que la pipeta se vacíe durante el tiempo
necesario. No se debe soplar para hacer salir la última gota al emplear una pipeta volumétrica o
cualquier pipeta calibrada. Es importante que la pipeta se mantenga vertical para que el
vaciamiento sea correcto.
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3.1.7 Buretas
Son tubos largos de vidrio con una llave de descarga en uno de sus extremos o bien con un tubo
corto de jebe que termina en un pico de vidrio. Las más comunes son de 50 mL y están
graduadas al décimo de mL. Las buretas se emplean para descargar distintas cantidades de
líquidos o soluciones y se las usa mayormente en las titulaciones volumétricas.
Modo de usar la bureta
- La bureta limpia y vacía se mantiene en posición vertical mediante un soporte adecuado.
- Se enjuaga la bureta con el mismo líquido que se va a descargar.
- Se llena la bureta con el líquido hasta un poco más arriba de la graduación y se descarga
el líquido de modo que la parte inferior del menisco coincida con el comienzo de la graduación
y el pico de la bureta debe quedar completamente lleno de solución.
- Al efectuar las lecturas con la bureta, el ojodebe estar al nivel del menisco para evitar
errores.
- Después de su uso las pipetas se deben lavar con agua destilada y cubrir con un tubo de
ensayo corto, invertido para preservarlas del polvo, o también pueden colocarse en el soporte
con las puntas hacia arriba.
- Las llaves de vidrio de las buretas se lubrican con grasa, vaselina pura o mezclada con
cera y resina. La lubricación adecuada de la llave evita que se pegue o endurezca.
3.1.8 Matraces
Son recipientes volumétricos muy útiles en la preparación y almacenamiento de soluciones,
colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Su forma y tamaño son muy variables.
- Matraces cónicos (Erlenmeyers): Se utilizan para hervir soluciones cuando hay que
reducir a un mínimo la evaporación; son útiles para las titulaciones. En Microbiología sirven
para la preparación de medios de cultivo. Es necesario emplear una tela de asbesto o una tela de
alambre cuando se realiza el calentamiento evitando así el contacto directo entre el matraz y la
llama.
- Matraces de fondo redondo: Estos matraces soportan mejor el calor directo sobre el
mechero. Para calentar solventes orgánicos, o para manipulaciones muy prolongadas, es
preferible emplear matraces con cuello esmerilado que pueden recibir los condensadores
correspondientes y permiten un cierre mucho más hermético que los tapones de caucho o de
corcho.
- Matraces aforados o fiolas: Idénticos a los matraces erlenmeyer. Están calibrados a
medidas exactas mediante un aforo en la parte media del cuello del recipiente en el que se indica
la medida. Se emplean para la preparación de reactivos y de soluciones buffer.
- Matraces kitasato: Son matraces que además de la boca tienen una tabulación corta
lateral para hacer vacío. Se utilizan como complemento del equipo de filtración (esterilización
en frío).
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3.1.9 Espátulas de Drigalsky
Se confeccionan a partir de las pipetas Pasteur. La fracción recta y horizontal facilita la siembra
y aislamiento de bacterias por diseminación.
3.1.10 Probetas
Recipientes cilíndricos con base para la estabilidad. Pueden estar graduadas y tener capacidad
de 10 mL hasta 2 000 mL. Las más utilizadas son las de 100, 250, 500 y 1000 mL.
3.1.11 Beacker o vasos de precipitación
Recipientes cilíndricos y cortos, con una depresión en el margen de la boca. El vidrio debe ser
necesariamente resistente al calor. Existen desde 1 mL hasta 4 000 mL de capacidad.
3.1.12 Varillas de vidrio macizo
Fragmentos de 30 a 60 cm, que sirven para la confección de agitadores o baguetas. Las varillas
cortas de 20 cm pueden utilizarse como mangos para las asas de siembra.
3.1.13 Frascos reactivos
Frascos de vidrio de paredes gruesas, transparentes o de color ámbar. Son cilíndricos, tienen
cuello estrecho y tapones de cristal esmerilado (algunos con tapas especiales para facilitar su
vaciado y su tamaño varía de 25 mL a 1000 mL).En los frascos pequeños se pueden almacenar
HCl, H2SO4, CCl4, etc. En los frascos grandes se pueden almacenar reactivos desinfectantes u
otros reactivos.
3.1.14 Frascos goteros
Tienen una capacidad de 50 mL, pueden ser de vidrio claro o ámbar, y sus tapones son
ranurados para que su contenido salga gota a gota cuando se inclinan. Se pueden utilizar para
colorantes o para indicadores.
3.1.15 Picetas
Son botellas plásticas de color blanco con una especie de caño que al presionar el frasco permite
que el líquido salga con fuerza. Se utilizan para lavar láminas portaobjetos con tinciones.
3.1.16 Portaobjetos y cubreobjetos
Los portaobjetos son láminas de vidrio transparente de forma rectangular y de mínimo grosor.
Los cubreobjetos son finísimas laminillas de mucho menor tamaño que los portaobjetos y
pueden ser de forma rectangular, cuadrada o circular. Ambos son material indispensable para la
observación microscópica de las bacterias u otros organismos.
3.1.17 Jarra de Brewer
Denominada también campana de anaerobiosis, está constituida por una tapa de baquelita en
cuya parte inferior presenta una canastilla conteniendo granos de paladio. El cuerpo es un
cilindro de vidrio en cuyo interior se colocan los tubos o placas de Petri. La jarra es cerrada
herméticamente mediante una abrazadera de metal.

3.1.18 Asas de siembra
Con mango de vidrio o de metal aislante del calor y un alambre o aguja de micrón resistente a
elevadas temperaturas. Se usan en la siembra y trasplante de bacterias y hongos.
3.1.19 Mangos de Kolle
Vástagos de metal con una cubierta aislante del calor y en el extremo proximal, una tuerca para
insertar el alambre de platino o micrón en el asa de siembra. Pueden ser reemplazados por
mangos de vidrio.
3.1.20 Alambres de platino en aro y en punta
Pueden ser acoplados a los mangos de Kolle.
3.1.21 Canastillas o cestos de metal
Las mejores son de aluminio. Favorecen el almacenamiento de tubos de prueba en medidas
conocidas, sin riesgo de roturas.
3.1.22 Gradillas
Permiten una mayor estabilidad a los tubos de ensayo, evitando accidentes.
3.1.23 Soportes universales
Con tenazas y aros de metal, para asegurar cuellos y bases de matraces, beackers, etc. Son de
metal de preferencia de fierro y son muy buenos soportes de recipientes sometidos al
calentamiento.
3.1.24 Trípodes
Son de metal, de preferencia de fierro. Muy buenos soportes de recipientes sometidos al
calentamiento. De variada altura y diámetro.
3.1.25 Rejilla o malla metálica
Malla de alambre galvanizado, resistente a la corrosión a elevadas temperaturas. Se coloca sobre
el trípode.
3.1.26 Mecheros
- Mechero de alcohol: Constituido de un recipiente de vidrio borosilicato y una tapa de
metal por donde se introduce la mecha.
- Mechero Bunsen: Funciona a gas. Es uno de los instrumentos más útiles en el
laboratorio. Fue inventado por el alemán Robert Bunsen en 1866. Existen diferentes tipos de
mecheros, algunos tienen regulación de gas y otros no. Los que se usan en laboratorio son
simples, no regulan el gas, y queman gas propano.
3.1.27 Autoclave
Consta de una caldera de acero o de cobre batido estañado interiormente, protegida por una
camisa metálica de cobre; quedando formado de paredes dobles. En su base está instalada la
fuente calórica (gas o electricidad). A una distancia del fondo del recipiente, está la placa
cribosa para apoyo del material y para la salida del vapor; en la parte superior se halla la tapa
que es pesada (de bronce fundido) en cuyo borde interno está adaptado un arandel de caucho
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para el cierre hermético del aparato. Los tornillos o bulones en el margen superior refuerzan el
cierre, evitándose el escape del vapor. Presenta además, un manómetro (que marca las libras de
presión), una válvula de seguridad, un termómetro y una llave o espita (para la salida del aire y
vapor al empezar a hervir el agua).
El vapor de agua se aplica en una cámara cerrada en la que existe un generador de vapor;
cuando éste se produce, desplaza el aire, que sale por un orificio que se cierra en el momento en
que ya sale vapor. Posteriormente se consigue la presión deseada, teniendo en cuenta que el
vapor a 1 atm. de presión corresponde a 121°C de temperatura. Esta temperatura, aplicada
durante 15 o 20 minutos, ó una temperatura de 134 °C durante 7 minutos destruye todas las
formas vegetativas y esporuladas.
El autoclave requiere de indicadores, que comprueben que en el interior del recipiente se han
dado las condiciones deseadas de temperatura y tiempo. Los indicadores de esterilización más
usados son productos químicos (que cambian de color según los niveles alcanzados) y esporas
de ciertas bacterias.
3.1.28 Horno Pasteur
Es un aparato muy utilizado en la esterilización por calor seco. Es cilíndrico, de metal, de triple
pared; la intermedia más corta que las otras dos, quedando formada por dos cajas paralelas
(concéntricas) quese comunican por la parte superior. La parte inferior del cilindro hace fondo.
Las paredes son metálicas y revestidas de planchas de asbesto al igual que la puerta. Por los
lados o al fondo, entre las paredes media y externa se halla un colector de mechero múltiple o
juego de resistencia (fuente calorífica).
3.1.29 Espectrofotómetro
Es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz transmitida y se utiliza mucho en
análisis bioquímicos. Las sustancias disueltas tienen determinados colores porque absorben
ciertas longitudes de onda de luz y dejan pasar otras. Ejemplo: La hemoglobina tiene color rojo
porque absorbe los colores complementarios del rojo, es decir las longitudes de onda más cortas
del azul y el verde.
3.1.30 Potenciómetro
Es un aparato utilizado para medir el pH de soluciones buffer, fluidos biológicos, medios de
cultivo, etc.
3.1.31 Contador de colonias
Lo más difícil en la determinación de una colonia es el conteo en las placas de Petri. El
contador de colonias soluciona este problema convirtiéndose en un auxiliar indispensable para
todo laboratorio microbiológico y además no ocasiona problemas con su mecanismo de conteo.

3.1.32 Refrigeradoras y congeladoras
Son incubadoras de temperaturas frías. Se requieren para almacenar medios de cultivo, sueros
y reactivos especiales. Las congeladoras se requieren para almacenamiento más prolongado de
sueros, enzimas, etc.
Deben localizarse lejos de los hornos de aire caliente, de radiadores de tuberías de agua caliente.
3.1.33 Estufas de cultivo
Sirven para realizar el proceso de incubación, que brinda una temperatura adecuada para que los
microorganismos permanezcan viables y se desarrollen. Existen dos métodos de incubación:
 Incubación por calor seco: Se realiza en incubadoras e incluso en hornos. Las
incubadoras y los hornos se basan en los mismos principios y la diferencia entre éstos radica en
la temperatura que puede obtenerse en su interior. Usualmente se denomina horno al aparato
que es capaz de soportar temperaturas de 100 °C ó más. El más conocido es el horno Pasteur.
 Incubación por calor húmedo (baño María): El llamado baño María presenta un
dispositivo enrollable que es sumergido en el agua y la calienta. La fuente de calor es por medio
de una corriente de convección, lo que permite que el agua se caliente en forma más uniforme.
3.1.34 Microscopio óptico
La Microbiología se ha podido desarrollar a partir de la aparición y progreso del microscopio.
Podemos encontrar un microscopio simple que no es más que una lente biconvexa, o un
microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con ello
mayor aumento.
Los microscopios se clasifican básicamente en dos grupos en función del tipo de luz utilizada y
amplificación: microscopio de luz óptica y microscopio electrónico. El microscopio mediante el
cual la amplificación de la imagen se obtiene por un sistema de lentes ópticas, corresponde a los
microscopios de luz. El microscopio mediante el cual la amplificación de la imagen se hace a
través de un haz de electrones en lugar de ondas luminosas corresponde al microscopio
electrónico.
Los diversos componentes del microscopio óptico pueden ser agrupados en cuatro sistemas:

a) Sistema de soporte: Pie, bastidor, revólver portaobjetivos, platina.
b) Sistema de aumento : Objetivos, oculares
c) Sistema de iluminación: Fuente luminosa, espejo, condensador, diafragma, filtros.
d) Sistema de ajuste: Tornillo macrométrico, tornillo micrométrico, condensador,
elevador del diafragma iris, reguladores de la platina mecánica, tornillos para centrar el
condensador.

Sistema de aumento
La amplificación de la imagen en un microscopio óptico se obtiene mediante dos sistemas de
lentes convergentes. Un primer sistema de lentes situados en el extremo inferior del tubo del
microscopio, justo por encima de la muestra que se halla sobre la platina, se denominan
objetivos y forman la imagen real del objeto que se está observando. El poder de aumento de
cada uno de ellos es indicado por un número grabado ejemplo: 40 indica un aumento del
objetivo de 40 veces.
El segundo sistema de lentes que se sitúa en el extremo superior del tubo del microscopio, está
más alejado de la muestra y más próximo al ojo humano. Son los oculares y se encargan de
ampliar la imagen real formada por el objetivo originando una imagen virtual que es la que
percibe el ojo humano. La amplificación del ocular suele venir indicada en la parte superior del
lente ocular o en la lateral.
Poder de aumento del microscopio
Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el del ocular. Por ejemplo si se emplea
un objetivo que tiene 45 de aumento y un ocular con 10 de aumento, el poder de aumento del
microscopio será de 450.
Poder de resolución del microscopio
Es la distancia entre dos estructuras de un espécimen en la cual todavía se pueden observar
como estructuras separadas en la imagen amplificada. La resolución se define como el espacio
de máxima aproximación entre dos puntos en el que aún se pueden observar con claridad como
dos entidades independientes y si se les acerca un poco más, ya no se distinguen, y se les ve
como un solo punto.
El poder de resolución está sujeto a la longitud de onda (λ) del espectro de luz visible y a la
propiedad de las lentes conocidas como la abertura numérica (AN). El límite del poder de
resolución de un microscopio es aproximadamente igual a 0.61 λ/AN que para un microscopio
óptico es alrededor de 200 nm. A menor longitud de onda de luz y mayor la AN de las lentes,
será mejor el poder de resolución del microscopio

Abertura numérica de un objetivo
Depende del índice de refracción (N) del medio que llena el espacio entre el espécimen y la
parte frontal del objetivo, y del ángulo (μ) de los rayos de luz mas oblicuos que pueden entrar al
objetivo. Usando una lente con mayor abertura numérica, se obtiene mayor poder de resolución.
AN = N x Sen μ/2
El aire tiene un índice de refracción de 1, que limita la resolución que se puede obtener, pero se
puede incrementar la abertura numérica colocando aceite de inmersión entre el especímen y el
objetivo, aumentando así el poder de resolución del microscopio.

Aceite de inmersión
Sobre el preparado que se va a observar se coloca una gotita de aceite de cedro y luego se
desciende el objetivo hasta tocar la gota, de tal manera que el medio entre el objetivo y el punto
objeto es el aceite. Este tiene un índice de refraccción de 1,5, lo que aumenta considerablemente
la abertura numérica. La observación de algas, hongos y protozoos se puede hacer con los
objetivos secos, en los que el aire ocupa el espacio entre el espécimen y el objetivo, pero para
observar las bacterias con suficiente detalle se requiere el uso de un objetivo de inmersión de
aceite.
Iluminación
La iluminación es esencial para aprovechar adecuadamente los aumentos y la resolución de un
microscopio. La luz procederá de la fuente de iluminación que se situará en la parte más baja del
microscopio. Dicha luz penetrará en el condensador y éste llegará al objetivo que lo amplificará,
así pues deberá llegar un cono de luz muy grande para que su amplificación sea mayor. Este
tamaño de cono de luz que llega al objetivo se podrá controlar con el diafragma situado
inmediatamente debajo del dispositivo condensador. Si, por ejemplo, el diafragma estuviera
completamente abierto, se perdería contraste y nitidez.
Si se utiliza el objetivo de inmersión, la distancia de trabajo es muy pequeña y, en estos casos,
hay que abrir más el diafragma para facilitar una mayor amplificación que aumente el máximo
poder de resolución.

3.2 Manejo de los equipos en el laboratorio de Microbiología
.3.2.1 Microscopio
- Obtener una muestra de sarro dentario conasa bacteriológica estéril.
- Homogenizar la muestra en solución salina fisiológica estéril (1 gota) sobre una lámina
porta – objetos.
- Cubrir el preparado con laminilla. Tiene Ud. un preparado en fresco para examen directo.
- Enfoque y observe al microscopio con objetivos de: 3,5 X, 10 X y 40X.
3.2.2 Horno Pasteur
- Colocar en el horno el material a esterilizar debidamente acondicionado.
- Cerrar la puerta y encender la fuente calorífica.
- Graduar la temperatura del horno a 180 °C y mantener el material por espacio de 2 horas.
Precauciones en el manejo
 No abrir la puerta del horno mientras la temperatura en su interior se mantenga elevada. Un
cambio brusco de la temperatura puede causar destrozos del material de vidrio.
 Cuidar de no elevar excesivamente la temperatura; de ésta manera se evitará la
carbonización del papel y tapones de algodón.
16

 No colocar materiales que pueden ser destruidos por la temperatura como delantales,
guantes de goma, etc.
3.2.3 Autoclave
- Depositar agua en la caldera hasta unos centímetros de la parrilla.
- Colocar el material a esterilizar en la canastilla.
- Cerrar la tapa y asegurar el cierre ajustando los tornillos o mariposas tomando de dos en
dos tornillos diagonalmente opuestos.
- Dejar abierta la espita.
- Encender la fuente de calor.
- Cerrar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo.
- Observar el manómetro y mantener la presión en 15 libras mediante el control de la
temperatura (121 °C) durante 15 a 20 minutos.
- Iniciar la cuenta del tiempo en el momento que se consigue la temperatura y la presión
deseada.
- Apagar el sistema de calefacción, después del tiempo de esterilización.
- Dejar enfriar hasta que el manómetro marque cero.
- Abrir la espita para que salga el exceso de vapor de agua.
- Aflojar los tornillos y levantar la tapa poniéndose detrás del aparato para evitar que los
vapores lleguen a la cara del operador.
Precauciones en el manejo:
 Para evitar la pérdida de material por ebullición se recomienda no llenar los recipientes.
 No colocar los materiales muy juntos. Es preferible dejar espacios libres para favorecer la
circulación del vapor.
 No bajar la presión abriendo la espita. Esta medida puede ocasionar pérdida de material
y ruptura de los recipientes de vidrio por el cambio brusco de la presión.
3.2.4 Estufa
- Colocar en la estufa el material a incubar: placas de Petri o tubos de ensayo con el
medio de cultivo inoculado.
- Cerrar la puerta y encender la fuente calorífica.
- Graduar la temperatura deseada y mantener el material en incubación durante 24, 48
horas o más tiempo si es requerido.
3.2.5 Baño María
- Colocar la cantidad de agua suficiente en la canastilla del equipo.
- Encender la fuente calorífica.
- Graduar la temperatura deseada.
- Colocar dentro del agua el material a calentar y mantenerlo durante el tiempo
deseado.
17

3.3 Esterilización del material de uso en el laboratorio de Microbiología
3..3.1 Placas de Petri
 Empaquetar las placas de Petri conteniendo material contaminado o de descarte y
esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
 Eliminar los restos de agar y lavar las placas de Petri con detergente, enjuagar y
dejar secar.
 Envolver con papel y asegurar con pabilo.
 Esterilizar en el horno a 180° C durante 2 horas.
3.3.2 Tubos de ensayo
 En una canastilla o un depósito que los sostenga depositar los tubos que contengan
material contaminado o de descarte.
 Esterilizar en el autoclave a l21 °C durante 20 minutos.
 Eliminar los restos de agar y lavar los tubos de ensayo con detergente, enjuagar y
dejar secar.
 Taponar los tubos con algodón no graso, de modo que el tapón ajuste perfectamente
y facilite su uso posterior.
 Envolver con papel. De preferencia formar grupos de seis tubos, envolver y
asegurar con pabilo.
 Esterilizar en el horno a 180° C durante 2 horas.
3.3.3 Matraces
 Esterilizar en autoclave los matraces que contienen medios de cultivo recién
preparados o cultivos de descarte.
 Eliminar los restos de agar, lavar con detergente, enjuagar y dejar secar.
 Colocar tapones de algodón no graso, de modo que el tapón ajuste perfectamente y
facilite su uso posterior.
 Esterilizar en el horno a 180° C durante 2 horas.
3.3.4 Pipetas
 Colocar un tapón de algodón ligeramente ajustado en el orificio superior de las
pipetas.
 Envolver con tiras de papel de 3 cm, de modo que cubran totalmente las pipetas.
 Esterilizar en el horno a 180 ºC durante 2 horas.

4 Anexo

Figura 2.1 Equipos de uso en microbiología, a. Autoclave, b. Estufa c. Horno,
d. Espectrofotómetro

a b
c d
http://www.google.com.pe/imgres?imgurl=http://bifi.es/infrastructures/biochemistry/img/estufa_placas_cultivo.jpg&imgrefurl=http://bifi.es/infrastructures/biochemistry/index.php&usg=__Thffhcq9xHjOXArTOJZT3mUSmYI=&h=710&w=510&sz=49&hl=es&start=8&tbnid=AyfKQ2vKkAgzpM:&tbnh=140&tbnw=101&prev=/images?q=ESTUFA&hl=es&gbv=2&tbs=isch:1&itbs=1
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19

Figura 2.2 Equipos de uso en Microbiología, a. Potenciómetro, b. Refrigeradora, c.
Microscopio binocular, d. Contador de colonias, e. Microscopio monocular, f. Baño maría.

a b
c
d
f e
20

5. Referencias bibliográficas
- Granados, E. & Villaverde C. (1997). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.
- Mendo, M. (1999).Instrumentaciónde Laboratorio. Lima, Perú: Editorial Científica
Mundi E.I.R.L.
21

Práctica III
Observación de bacterias

1. Introducción
Leewenhoek realizó observaciones de microorganismos hacia fines del siglo XVII; hasta
entonces sólo se podía especular de la existencia de agentes infecciosos más pequeños que lo
que el ojo humano podía distinguir. Desde ese momento el microscopio óptico se ha
transformado en una herramienta muy importante en la determinación y clasificación
microbiana. Muchos agentes microbianos pueden ser identificados en forma confiable con sólo
unas pocas coloraciones y un microscopio básico. La coloración de Gram aún es el método
individual más eficiente y económico para el diagnóstico rápido y precoz de un tipo bacteriano.

2. Objetivos
a. Reconocer la morfología de las bacterias.
b. Adquirir destreza en la obtención de un frotis.
c. Describir las técnicas de coloración simple y compuesta.
d. Adquirir destreza en la tinción de Gram

3. Procedimiento
a. Obtención de un frotis
El frotis constituye la extensión y fijación de la muestra sobre una lámina portaobjetos limpia y
desengrasada.
 Extensión: Se coloca en el centro de una lámina portaobjetos una gota del cultivo
líquido. Si el cultivo fuera sólido, se coloca previamente una gota de solución salina o agua
destilada sobre la lámina portaobjetos y sobre ella se emulsiona una pequeña porción de una
colonia tomada con el asa de Kolle. En ambos casos se extiende la muestra formando una capa
delgada y uniforme procurando no llegar al borde o extremo de la lámina.
 Fijación: Tiene por objeto adherir el extendido al portaobjeto y evitar que sea
arrastrado durante el lavado. Se puede fijar el frotis por el calor suave del mechero.

Figura 3.1 Tecnica para la obtención de un frotis .a) flamear el ansa microbiologica. b) colocar
una gota de solucion salina esteril en una lámina portaobjetos c) tomar una colonia de la placa
de Petri. c), d) realizar una emulsión , luego extender la muestra sobre la lamina y fijar la
muestra al calor .

b. Coloración simple
Es aquella en la cual se usa un solo colorante. Ejemplo: azul de metileno, fucsina, safranina, etc.
Procedimiento:
 En una lámina portaobjetos realizar el frotis de la muestra.
 Agregar al frotis unas gotas de colorante azul de metileno y dejar actuar durante 3 a 5
minutos.
 Lavar el frotis a chorro de agua.
 Secar el frotis a temperatura ambiente o al calor suave del mechero.
 Observar al microscopio y esquematizar.

c. Coloración compuesta: Técnica de Gram
Coloración compuesta es aquella que utiliza más de un colorante. La más común es la tinción
de Gram, donde las bacterias se tiñen con cristal violeta de genciana, que al mezclarse con el
lugol forma un complejo que es retenido y no es eliminado por el alcohol acetona en las
bacterias Gram positivas, sucediendo lo contrario en las Gram negativas.
A c
b
D
23

Procedimiento:
 En una lámina portaobjetos limpia colocar una gota de cultivo o muestra y realizar el
frotis.
 Cubrir el frotis con violeta de genciana y dejar actuar durante 3 minutos.
 Lavar a chorro de agua, cubrir luego con lugol y dejar actuar durante 1 minuto.
 Lavar a chorro de agua y decolorar rápidamente con alcohol acetona.
 Lavar y cubrir el extendido con safranina y dejar actuar durante 30 a 60 segundos.
 Lavar a chorro de agua y secar a temperatura ambiente o al calor suave del mechero.
 Observar al microscopio utilizando objetivo de inmersión.
 Comparar y esquematizar.

Soluc. A
Soluc. B
4. Anexo

Reactivos para la tinción de Gram

A) Violeta de Genciana de Hucker
Violeta de Genciana ......................................................................... 2,0 g
Alcohol etílico ............................................................................... 20,0 mL
Oxalato de amonio ......................................................................... 0,8 g
Agua destilada ............................................................................... 80,0 mL

B) Solución de safranina
Safranina ...................................................................................... 0,25 g
Alcohol etílico .............................................................................. 10,0 mL
Agua destilada ............................................................................. 100,0 mL

C) Solución de lugol
Yodo .............................................................................................. 1,0 g
Yoduro de potasio ......................................................................... 2,0 g
Agua destilada.............................................................................. 300,0 mL

D) Alcohol acetona
Alcohol de 95° ............................................................................... 70,0 mL.
Acetona .......................................................................................... 30,0 mL

5. Referencias bibliográficas
- Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.
- Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos (10ª
ed.) Madrid, España: Parson Educación, S.A.

Práctica IV
Medios de cultivo

1. Introducción
Medio de cultivo es un sustrato que permite el desarrollo y multiplicación de los
microorganismos por un tiempo prudencial y a una temperatura adecuada. Todo medio de
cultivo debe contener una fuente de carbono y de nitrógeno, debe presentar un equilibrio ácido –
base (pH) y debe estar libre de microorganismos contaminantes (esterilizado en autoclave a 121
°C, 15 libras de presión, por 15 a 20 minutos.

1.1 Clases de medios de cultivo según su naturaleza
1.1.1 Naturales
a. Origen animal: Leche, huevos.
b. Origen vegetal: Papas.
1.1.2 Artificiales: Son aquellos que tienen una composición química conocida y constante
ejemplo Agar Tripticasa soya.

1.2 Clases de medios de cultivo según su utilidad
1.2.1 Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos.
Entre ellos están el caldo común, agar común, caldo nutritivo y agar nutritivo.

Caldo común (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 5,0
Agua destilada csp 1000 mL
pH 7,0

Agar común (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 5,0
Agar 15,0
Agua destilada csp 1000 mL
pH 7.0

Caldo nutritivo (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 5 ,0
Extracto de carne 3,0
Agua destilada csp 1000 mL
pH 7,0

Agar nutritivo (g/L)
Peptona 10,0
NaCl 5,0
Agar 15,0
Extracto de carne 3,0
Agua destilada csp 1000 mL
pH 7,0

1.2.2 Medios especiales
a. Medios mejorados o enriquecidos: Son aquellos a los que se les agrega fluidos orgánicos
como sangre, yema de huevo, suero, etc.
Agar sangre
Agar común fluidificado y enfriado a 45 °C 95 mL
Sangre citratada 5 mL

b. Medios selectivos o de aislamiento: Facilitan el desarrollo de un determinado grupo de
microorganismos e inhiben a otros acompañantes. Ejemplo: agar Chapman, agar azida de sodio.
Agar Chapman (g/L)
Peptona 10,0
Extracto de carne 1,0
NaCl 75,0
Manitol 10,0
Agar 15,0
Agua destilada csp 1000 mL
Rojo de fenol 2,5 ml (pH 6.8 amarillo, pH 8.4 rojo)
pH 7,4

c. Medios selectivos diferenciales: Son semejantes a los de aislamiento pero contienen un
sustrato definido y un indicador de pH. Permiten el desarrollo de un determinado grupo de
microorganismos y a la vez los diferencian según la utilización del sustrato. Ejemplo: Agar
Mac Conkey, Agar SS.

Agar Mac Conkey (g/L)
Peptona 17,0
Peptona proteosa 3,0
Lactosa 10,0
Salesbiliares 1,5
Cristal violeta 0,001
NaCl 5,0
Agar 15,0
Agua destilada csp 1000 mL
Rojo neutro 0,03 (pH 6.8 rojo, pH 8 incoloro)
pH 7,1

d. Medios diferenciales: Permiten poner de manifiesto alguna propiedad bioquímica de los
microorganismos. Tienen un sustrato definido y un indicador de pH. Ejemplo: Agar TSI, Agar
LIA.

Agar LIA (Agar lisina hierro) (g/L)
Peptona 5,0
Extracto de Levadura 3,0
Dextrosa 1,0
Lisina 10,0
Cítrato amónico férrico 0, 5
Tiosulfato de sodio 0, 04
Púrpura de bromocresol 0, 02
Agar 15 g
Agua 1 000 mL
pH 6,7

1.3 Clases de medios según su consistencia
1.3.1 Líquidos
1.3.2 Sólidos: Son aquellos que tienen un solidificante llamado agar que es un polisacárido
extraído de las algas marinas pardas y tiene la propiedad de licuarse a 80 – 100 °C y de
solidificarse a 40 °C. Así mismo, el agar no es degradado por las bacterias.
1.3.3 Semisólidos: Son aquellos que contienen entre 0,3 a 0,5 % de agar.

2. Objetivos
2.1 Diferenciar los medios de cultivo de mayor uso en el laboratorio de Microbiología.
2.2 Adquirir destreza en la preparación y esterilización de medios de cultivo.

3. Procedimiento
3.1 Preparación y esterilización de medios de cultivo
a. Pesar cada uno de los componentes del medio de cultivo, llevarlos hacia un matraz y
adicionar la cantidad de agua destilada requerida.
b. Disolver en Baño María.
c. Enfriar y ajustar el pH según convenga.
d. Colocar un tapón de algodón en el extremo superior del matraz, cubrirlo con papel y
asegurar con pabilo.
e. Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 libras de presión durante 15 minutos.

3.2 Metodología para servir medios de cultivo
a. Fluidificar los medios sólidos al calor, enfriar a 50 °C y frente a la llama del mechero servir
en placas de Petri, en tubos o en viales previamente esterilizados. Dejar solidificar. En el caso
de los tubos y viales, colocar sobre una superficie inclinada.
b. Servir los medios líquidos en tubos o en viales previamente esterilizados.

3.3 Control de esterilidad de los medios de cultivo servidos
a. Acondicionar los medios de cultivo servidos e incubar durante 24 horas a 30 °C.
b. Observar y descartar los medios que presenten desarrollo de algún microorganismo
(contaminante).

Figura 4.1 Metodología para preparar, esterilizar, servir y controlar medios de cultivo sólidos y
líquidos

4. Referencias bibliográficas
- Granados, E. y Villaverde C. (1998). Microbiología. España: Editorial Paraninfo.
- Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos (10ª
ed.) Madrid, España: Parson Educación, S.A.

Adicionar los ingredientes
en el matraz.
Agua destilada Llevar el medio a
autoclave
Llevar el medio de
cultivo a control de
esterilidad.
Servir los medios
a placas
Llevar a control de
esterilidad
Agua destilada Homogenizar
el medio de
cultivo
Servir el
medio de
cultivo
Los tubos son
colocados en una
gradia y son
taponados con
algodón
Los tubos son
llevados a
autoclave
Los tubos son
inclinados y llevados
a control de
esterilidad.
Adicionar los ingredientes
en el matraz.
30

Práctica V
Siembra y aislamiento de bacterias

1. Introducción
Sembrar es la acción de poner una bacteria en contacto con un medio adecuado o sustrato que
permita el desarrollo de colonias. Los objetivos de la siembra pueden ser para aislamiento y para
trasplante.
La siembra para aislamiento se realiza cuando se desea estudiar la muestra. Por lo común ésta
presenta una mezcla de bacterias por lo que es preciso separar (aislar) los microorganismos.
Generalmente se utiliza la técnica de agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría
simple. Cuando se desea contar el número de bacterias se utiliza la técnica de placa vertida. La
siembra para trasplante ocurre cuando el material motivo de estudio contiene una sola especie
microbiana (cepa). También se denomina “repique”. El objetivo es el mantenimiento del
microorganismo conocido cambiándolo a un nuevo medio de cultivo.
La siembra por trasplante puede ser:
 De un medio sólido a otro medio sólido
 De un medio sólido a un medio líquido
 De un medio líquido a otro medio líquido
 De un medio líquido a un medio sólido

2. Objetivos
- Realizar una siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría simple.
- Realizar una siembra por difusión en placa o placa vertida
- Obtener un cultivo puro de bacterias

3. Procedimiento
3.1 Siembra por agotamiento en superficie sólida o aislamiento en estría simple
Se realiza para obtener colonias individuales de bacterias a partir de una muestra biológica.
 Tomar una alícuota de la muestra (inóculo) y depositarla en uno de los extremos
superiores de la placa de Petri que contiene medio de cultivo agar nutritivo previamente servido
y controlado.
 Realizar movimientos en zig – zag (estrías) muy juntos en el primer tercio de la placa
para agotar el inóculo. Posteriormente realizar estrías muy separadas de un extremo a otro lado
de la placa no tomando nuevo inóculo ni levantando el asa hasta concluida la siembra en toda la
placa.
 Incubar a 37 ºC (o la temperatura requerida por la bacteria) durante 24 horas.
31

Figura 5.1 Siembra por la tecnica de agotamiento y estria.

3.2 Siembra por difusión en placa o placa vertida
Se utiliza para realizar el recuento total de bacterias de una muestra biológica.
 Depositar 0,1 mL (0,5 mL, 1 mL)) de la muestra sobre la superficie de una placa de
Petri estéril y vacía.
 Agregar 10 mL de agar nutritivo licuado y enfriado a 45 – 50 °C.
 Homogenizar por movimientos de rotación de la placa de Petri para la dispersión de
microorganismos en forma más o menos homogénea, hasta la solidificación.
 Incubar a 37 ºC durante 24 horas.
 Realizar el recuento de colonias.

3.3 Obtención de un cultivo puro de bacterias
a. Tratamiento de la muestra
Para estudiar las bacterias se necesita poder cultivarlas en condiciones de laboratorio y por lo
tanto inicialmente deben ser aisladas. Por ello, se debe disponer de muestras biológicas que
pueden ser de varios tipos:
a.1 Muestras que contienen abundante número y tipo de microorganismos en las que
previamente se deben realizar diluciones en solución salina fisiológica estéril. Ejemplo suelo.
a.2 Muestras que no contienen suficiente cantidad del microorganismo que se desea investigar,
por lo que previamente se deben enriquecer para incrementar el número del microorganismo
requerido y disminuir el de los contaminantes. Ejemplo leche.
a.3 Muestras que naturalmente no presentan bacterias (incluyendo el microorganismo
investigado y los contaminantes) y que se siembran sin ningún pre-tratamiento. Ejemplos
sangre,

b. Aislamiento primario
Una vez que la muestra ha recibido o no tratamiento se procede al aislamiento primario a través
de la siembra en placa de Petri mediante la técnica de estría en la superficie de medios
enriquecidos (agar sangre), medios selectivos (agar Chapman) o medios selectivos diferenciales
(agar Mac Conkey). Después de un periodo de incubación de 24 horas (puede variar en función
del microorganismo), se observarán las colonias de bacterias (masas constituidas por millones
de bacterias que se aprecian a simple vista y que han sido originadas a partir de una célula). Se
observará el tamaño y el aspecto de cada colonia que generalmente son constantes para cada
género y especie bacteriana, por lo que se les utiliza como característica diferencial. A
continuación se realizará una tinción de Gram para determinar la morfología y reacción tintorial
de las bacterias constituyentesde la colonia.

Figura 5.2 Aislamiento primario: observe las colonias bacterianas debidamente aisladas sobre
el medio de cultivo.

c. Aislamiento secundario
En caso que la morfología y reacción a la tinción de Gram de las células bacterianas coincidan
con el microorganismo que se desea investigar se realiza el aislamiento secundario a través de
una siembra para trasplante o transferencia de una pequeña porción de la colonia hacia un tubo
con medio de cultivo inclinado que permitirá el desarrollo bacteriano o cultivo puro bacteriano
(población de bacterias que procede de una célula) y que a su vez puede ser mantenido e
identificado merced a sus propiedades culturales y fisiológicas.

4. Referencias bibliográficas
- Perú, Ministerio de Salud (2001). Manual de análisis Microbiológico de alimentos.
Lima, Perú: Dirección General de Salud Ambiental
- Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos
(10ª ed.) Madrid, España: Pearson Educación, S.A.

Práctica VI
IDENTIFICACION DE BACTERIAS

1. Introducción
Una vez obtenido un cultivo puro de una bacteria se debe realizar la identificación del
género y en el mejor de los casos de la especie. Las pruebas de identificación comienzan con el
estudio morfológico de la colonia, estudio morfológico de las células, motilidad, prueba de
catalasa, citocromo oxidasa, prueba de oxidación fermentación, metabolismo de carbohidratos,
metabolismo de compuestos nitrogenados, y muchas otras pruebas según la bacteria que va a ser
identificada.

2. Objetivos
2.1 Caracterizar morfológicamente las colonias bacterianas.
2.2 Caracterizar morfológicamente las células bacterianas.
2.3 Realizar e interpretar la prueba de catalasa.
2.4 Realizar e interpretar la prueba de oxidación-fermentación
2.5 Realizar e interpretar pruebas para investigar el metabolismo de los carbohidratos y
compuestos nitrogenados

3. Procedimiento

3.1 Estudio morfológico de las colonias bacterianas
Determinar el tamaño, forma, borde, elevación, consistencia, aspecto y color de la colonia
bacteriana.
a) Tamaño: Pequeño, mediano, grande y muy grande o extendida en forma de velo,
invadiendo toda la superficie del medio.
b) Forma: Puntiforme, circular, rizoide, filamentosa, irregular, fusiforme.
c) Bordes: Enteros, ondulados, filamentosos, rizoides, lobulados, espiculados.
d) Elevación: Plana, convexa, umbilicada, acuminada, plano-convexa, papilada.
e) Aspecto: Pulverulenta, granulosa, acuosa, brillante, transparente.
f) Color: Pigmentada, no pigmentada.

Forma Elevación

Figura 6.1 Distintas formas, bordes y elevación de colonias bacterianas.

3.2 Prueba de catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios
facultativos excluyendo a los estreptococos.
Técnica del porta objetos: En una lámina portaobjetos depositar una colonia bacteriana
procedente de un cultivo joven y añadir dos gotas de agua oxigenada de 30 volúmenes.
Interpretación: La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rápida
con desprendimiento de burbujas. La enzima catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en
agua y oxigeno molecular.
2 H202 = 2 H20 + 02

Figura 6.1 Reacción positiva en la prueba de la catalasa.

Tabla 6.1 Prueba de catalasa en algunas bacterias Gram positivas

Morfología
Reacción
Catalasa Gram
Cocos
Staphylacoccus
Micrococcus
Streptococcus
Enterococcus
+
+
-
-
+
+
+
+
Bacilos
esporulados
Bacillus
Clostridium
+
-
+
+
Bacilos no
esporulados
Listeria
Corynebacterium
Erysipelotrix
+
+
-
+
+
+

3.3 Estudio morfológico de las células bacterianas
Realizar un frotis de una pequeña porción de la colonia y una tinción de Gram para determinar
la morfología celular y reacción a la tinción de Gram de las células bacterianas.

3.4 Prueba de oxidación fermentación
Determina el tipo de metabolismo, oxidativo o fermentativo, que utilizan las bacterias al
desarrollar sobre un hidrato de carbono. En la vía oxidativa, el aceptor final de electrones es
el oxígeno, por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca acidez. Es la vía
fermentativa, el aceptor final de electrones es un compuesto orgánico procedente de la
misma vía, por consiguiente el proceso es anaerobio y se origina mucha acidez.
La acidez se detecta por la presencia de un indicador de pH. Las bacterias oxidativas
producen ácido en la zona de contacto con el aire pero no en profundidad, las bacterias
fermentativas producen mucho ácido en todo el tubo.
Técnica: Sembrar por picadura en dos tubos con medio Hugh-Leifson (0/F). Cubrir uno de
los tubos con vaselina o aceite de parafina estéril. Incubar a 37 ª C por 24 horas, aunque a
veces es necesario una incubación de hasta 14 días.
Interpretación: Si la vía es oxidativa, sólo el tubo que no tiene vaselina vira ligeramente en
la parte superior al amarillo y más tarde se extenderá por todo el tubo, pero nunca con
producción de gas. Si la vía es fermentativa, se observará un viraje intenso al amarillo que
se inicia en la parte inferior de los dos tubos con o sin producción de gas.
Utilización: Se usa para diferenciar Staphylococcus O (+) F (+) de Micrococcus O (+) F (-).

3.5 Metabolismo de carbohidratos
Investigar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa (agar TSI), formación de acidez
(medio RMVP), utilización del citrato como fuente de carbono y energía (medio citrato de
Simmons) e hidrólisis del almidón (agar almidón).

3.6 Metabolismo de compuestos nitrogenados
Investigar la descarboxilación de la lisina (agar LIA) y formación de indol (caldo peptonado)

AGAR TSI
(Agar triple azúcar de hierro) – (color del medio: anaranjado-rojizo)

1. Composición
Extracto de carne 3,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Peptona 15 g
Peptona proteasa 5,0 g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1,0 g
Sulfato ferroso (FeSO4) 0.2 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Tiosulfato de sodio (Na2S2O3) 0,3 g
Agar 15 g
Rojo de fenol 0.024 (indicador:6.8 amarillo;7,4 rojo)
Agua csp 1 litro
pH 7,4

2. Fundamento
Este medio se utiliza para la identificación de enterobacterias según su capacidad para
metabolizar o no los carbohidratos, con o sin formación de sulfuro de hidrógeno (H2S) y gas.
Cuando el microorganismo metaboliza los carbohidratos produce acidez que hace virar el
indicador rojo de fenol a un color amarillo. La fermentación de la glucosa se lee al fondo del
tubo (amarillo), la fermentación de la sacarosa en la parte intermedia del tubo (amarillo) y la
fermentación de la lactosa se lee en la parte superior del tubo (amarillo).
Cuando el microorganismo no metaboliza los carbohidratos, utiliza las proteínas que
alcalinizan el medio por la formación de aminas y el indicador rojo de fenol vira a un color rojo
acentuado, debido a que la pequeña cantidad de glucosa (0.1%) se consume rápidamente en la
superficie y luego se realcaliniza por el ataque de la peptona (lactosa negativo).
En la producción de sulfuro de hidrógeno, el microorganismo reduce el tiosulfato de sodio
hasta hidrógeno sulfurado (o sulfuro de hidrógeno) y éste se une al fierro (del FeSO4) formando
un compuesto negro: sulfuro de fierro. Se observa entonces un precipitado negro en cualquier
parte del tubo, especialmente en el fondo.
En la formación de CO2 e H2 durante la fermentación de los carbohidratos:el agar se
rompe o se forman cavidades con aire en el medio de cultivo.
39

A/A
amarillo todo el tubo

Gas (+)
H2S (-)
glucosa (+)
lactosa (+)
sacarosa (+)

3. Técnica
 Sembrar por puntura y estría en la superficie de un tubo conteniendo medio TSI.
 Incubar a 37 °C durante 24 horas.
 Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

A B C
K/A
amarillo en el fondo del tubo
y rojo en la parte superior

Gas (-)
H2S (-)
glucosa (+)
lactosa (-)
sacarosa (-)
negro
amarillo amarillo
amarillo rojo
amarillo
rojo
K/A
amarillo en el fondo del tubo
y rojo en la parte superior

Gas (-)
H2S (+)
glucosa (+)
lactosa (-)
sacarosa (-)
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Medio MRVP
(Rojo de Metilo – Voges Proskauer)

1. Composición (g/L)
Polipeptona 7,0
Glucosa 5,0
Fosfato dipotásico 5,0
Agua csp 1000 mL
Indicador rojo de metilo pH 4,5 = Rojo
pH 6,3 = Amarillo
pH 6,9

2. Fundamento
Este medio permite realizar la prueba del Rojo de Metilo y de Voges Proskauer. La prueba
de rojo de metilo detecta la formación de ácidos (láctico, acético, fórmico) por fermentación
ácido mixto de la glucosa. Dado que son muchas las especies de enterobacterias que pueden
producir cantidades suficientes de ácidos detectables con el indicador rojo de metilo durante las
fases iniciales de la incubación, sólo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos
que pueden mantener el pH bajo después de una incubación prolongada de 48 horas.
3. Técnica
 Inocular un tubo conteniendo caldo MRVP.
 Incubar a 37 ° C durante 48 horas.
 Adicionar cinco gotas del reactivo rojo de metilo y mezclar.
4. Lectura
El desarrollo de un color rojo estable indica que la producción de ácido es suficiente como
para bajar el pH a menos de 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden
producir cantidades menores de ácido es posible el desarrollo de un color naranja intermedio
entre el amarillo y el rojo. Ésta es una prueba negativa al igual que cuando el tubo se torna
amarillo.

MEDIO CITRATO DE SIMMONS

1. Composición (g/L)
Fosfato amónico 1,0
Citrato sódico 2,0
Cloruro sódico 5,0
Fosfato bipotásico 1,0
Indicador azul de bromotimol 0,08
pH 6 = amarillo, pH  7.6 = azul
Sulfato magnésico 0.20
Agar 15
Agua csp 1000 mL
pH 6.9
2. Fundamento
Este medio permite investigar si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
fuente de carbono y energía. En caso positivo el citrato es oxidado y se forman carbonatos y
bicarbonatos (C02 se junta con el sodio). Simultáneamente los microorganismos utilizan el
fosfato amónico como fuente de nitrógeno y liberan amoníaco. La presencia de carbonatos,
bicarbonatos y amoníaco alcaliniza el medio y el indicador azul de bromotimol vira al azul.
3. Técnica
 Sembrar por el método de estría un tubo conteniendo agar citrato inclinado.
 Incubar a 37 ° C durante 24 horas.
 Observarel cambio de coloración del medio de cultivo y/o el crecimiento de la bacteria.
4. Lectura
En caso positivo se observará el medio de cultivo de color azul. Algunas veces la bacteria
utiliza el citrato pero no produce alcalinidad suficiente como para hacer virar el indicador,
observándose crecimiento de la bacteria pero no cambio del color del medio de cultivo. Se
recomienda incubar 24 horas adicionales. En caso negativo no se observará crecimiento de la
bacteria y el medio permanecerá de color verde.

MEDIO AGAR ALMIDÓN

1. Composición (g/L)
Agar nutritivo 100 mL
Almidón 1.0

2. Fundamento
El almidón es un polímero complejo que reacciona con el lugol (yodo) formando un
complejo de color azul. Cuando las bacterias hidrolizan el almidón a moléculas más simples
como la maltosa y glucosa, éstas ya no reaccionan con el lugol y no se forma una coloración
azul.

3. Técnica
 Sembrar por el método de estría un tubo conteniendo agar almidón inclinado.
 Incubar a 37 ° C durante 24 horas.
 Adicionar dos gotas de lugol.
 Observar la presencia o no de una coloración azul.

4. Lectura
En una hidrólisis positiva del almidón, después de adicionar el lugol no se observará coloración
alguna. Por el contrario, en una hidrólisis negativa después de adicionar el lugol se observará
una coloración azul.

AGAR LIA
(Agar Lisina Hierro)

1. Composición (g/L)
Peptona 5,0
Extracto de levadura 3,0
Dextrosa 1,0
Lisina 10,0
Cítrato amónico férrico 0, 5
Tiosulfato de sodio 0,04
Púrpura de bromocresol 0,02
Agar 15,0
Agua 1 litro
pH 6.7

2. Fundamento
Este medio permite evidenciar la descarboxilación de la lisina y la formación de ácido
sulfhidrico (H2S).
 Para que se lleve a cabo la descarboxilación tiene que existir acidez (pH inferior a 6,0)
por lo que es necesario que el microorganismo primero fermente la glucosa (solo debe
utilizarse este medio para fermentadores de la glucosa). Posteriormente la lisina es
descarboxilada hasta la amina cadaverina que produce un viraje del indicador hacia el color
violeta (K / K).
 La producción de H2S se evidencia por la coloración negra debido al sulfuro de fierro
formado.
 Algunos microorganismos no descarboxilan la lisina pero si la desaniman hasta un
cetoácido el cual da un color anaranjado en presencia de las sales férricas y un color rojizo bajo
la influencia del oxígeno en la parte inclinada superficial del medio de cultivo (R / A).
 Los microorganismos que no descarboxilan la lisina pero fermentan la glucosa
producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo (A / A).

3. Técnica
 Sembrar por puntura y estría en superficie en un tubo conteniendo medio LIA
 Incubar a 37 °C durante 24 horas.
 Realizar la lectura correspondiente.

4. Lectura

K / K R / A K / A A / A

LIA (+)

Rojo
LIA (-)
Violeta
Amarillo
Negro
Violeta
Amarillo
Amarillo

MEDIO CALDO PEPTONADO
1. Composición (g/L)
Peptona 10,0
Na Cl 3,0
H2O csp 1000
pH 7,0
Reactivo de Kovac : Alcohol amílico o isoamílico puro 150
p – dimetilaminobenzaldehido 10
HCl concentrado 50
2. Fundamento
Este medio permite investigar la presencia de indol como producto de la hidrólisis del
aminoacido triptófano presente en la peptona. Los microorganismos que producen la enzima
triptofanasa hidrolizan y desaniman el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y
amoniaco. El indol forma un complejo de color rojo cuando reacciona con el grupo aldehido
del p – dimetilaminobenzaldehido (Reactivo de Kovac)
3. Técnica
 Inocular el caldo peptonado con el microorganismo en estudio.
 Incubar a 37 °C durante 24 horas.
 Agregar por la pared del tubo cinco gotas del reactivo Kovac.
4. Lectura
Observar la formación de un anillo coloreado en la zona de reacción (color rojo) = Indol (+)

Tabla 6.2. Reacción a ciertas pruebas bioquímicas claves para la diferenciación de bacterias
entéricas

Géneros

H2S

Indol

Rojo de
metilo
Lisina
descarb.

Citrato
Gas (glucosa)
Lactosa
Escherichia - + + d - + +
Enterobacter - - + + + + +
Shigella - +/- + - - - -
Salmonella + - + + +/- + -
Klebsiella - - - + + + +
Citrobacter +/- - + - + + d
Proteus +/- +/- + - D +/- -

4. Referencias bibliográficas
- Carreño, C. (2010). Manual de Prácticas de Microbiología Industrial. Lambayeque,
Perú.
- MERCK (2005). Curso Taller de Actualización teórico-prácrtico. Técnicas Microbiológicas de
Análisis de Aguas y Alimentos. Piura, Perú.
- Perú, Ministerio de Salud (2001). Manual de análisis Microbiológico de alimentos.
Lima, Perú: Dirección General de Salud Ambiental
- Doyle, M., Beuchat, L. & Montville T. (1997). Microbiología de los alimentos.
Fundamentos y Fronteras. España: Editorial Acribia, S.A.
- Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos
(10ª ed.) Madrid, España: Pearson Educación, S.A.

PRÁCTICA VII

RECONOCIMIENTO DE LAS ETAPAS DE UN PROCESO
DE FERMENTACIÓN INDUSTRIAL

Un proceso de fermentación típico es aquel que se lleva a cabo en un recipiente llamado
fermentador o biorreactor, en el que determinados sustratos que componen el medio de cultivo
son transformados por acción microbiana en metabolitos y biomasa (producto). En el esquema
general de un proceso de fermentación existen cuatro etapas diferenciadas: propagación de
cultivos, fermentación, operaciones y procesos de separación y purificación de los productos
(recuperación de producto) y tratamiento de los residuos.

1. Propagación de cultivos
La propagación de cultivos se realiza en laboratorio y comienza con un tubo de ensayo que
contiene un cultivo reciente de un microorganismo o un tubo liofilizado o congelado, donde se
conserva el microorganismo de interés obtenido comercialmente. En ambos casos el proceso,
comprende aislamiento, selección, mantenimiento y mejoramiento de los microorganismos de
interés industrial.

Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a
partir de fuentes naturales o de una colección de cultivos .La fuente de todos los
microorganismos industriales es el ambiente natural (suelo, agua), animales y plantas enfermas,
alimentos de fermentaciones naturales (vino, pan, queso) y materiales en descomposición. A
nivel industrial, en general, cada firma posee su propia colección de organismos, muchos de los
cuales han sido mejorados a través de técnicas clásicas de mutación o de ingeniería genética En
el mundo existe un gran número de colecciones depositarias de cultivos como American Type
Culture Collection (ATCC), USA y la Colecciòn Española de cultivos tipo (CECT) las cuales
mantienen bacterias, levaduras, algas, actinomycetos, mohos, protozoos, virus y líneas celulares.

Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica utilizada,
siendo las alternativas: a) aislamiento directo b) enriquecimiento de la muestra con o sin
pretratamiento. Una vez efectuado el aislamiento de los microorganismos se procede al
“screening” primario que es una selección cualitativa para detectar si el microorganismo
produce o no un compuesto. Por ejemplo, seleccionar microorganismos productores de ácidos
orgánicos, enzimas, antibióticos por la presencia de halos transparentes o de zonas de

inhibición de crecimiento, respetivamente. Se prosigue con el “screening" secundario, que