TP ADN RESUELTO 2019

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Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Médicas
UNLP
Guías de actividades prácticas Segundo cuatrimestre 2019
Actividades 13-15
Actividad 13
METABOLISMO	DEL	ADN	(REPLICACION,	REPARACION	Y RECOMBINACION DEADN).
(A) OBJETIVOSGENERALES:
Vincular la estructura molecular de los ácidos nucleicos, con su perpetuación (replicación). Analizar sus mecanismos de reparación y recombinación.
(B) OBJETIVOSESPECÍFICOS:
(B.1) Sistematizar los conocimientos sobre estructura y propiedades del material genético.
(B.2) Explicar el proceso de replicación del material genético en eucariotas.
(B.3) Reconocer drogas que interfieren con los procesos de replicación resaltando su mecanismo de acción e importancia clínica.
(B.4) Estudiar los diferentes sistemas de reparación del ADN, vincularlos con la replicación.
(B.5) Conocer los mecanismos más importantes de recombinación del ADN. Discutir su importancia y vincular con estados fisiológicos y patológicos.
(B.6) Aplicar los conocimientos adquiridos a la resolución de situaciones problemáticas.
(C) CONOCIMIENTOS PREVIOSNECESARIOS:
Grupos funcionales de la química orgánica. Tipos de uniones químicas. Estructura de ADN forma B. Empaquetamiento del ADN. Apareamiento clásico de bases del tipo Watson y Crick. Conceptos básicos de replicación de ADN en procariotas
(D) TEMARIOGENERAL
(D.1) Proteínas MCM, su vinculación con el ciclo celular. Superenrollamiento del ADN. Topoisomerasas. Antibióticos inhibidores de topoisomerasas. Epigenética.
(D.2) Flujo de la información genética: Replicación del ADN, reglas fundamentales (semiconservatividad, bidireccionalidad, semidiscontinuidad). ADN polimerasas, mecanismo de polimerización. Fidelidad, corrección de errores. Etapas y mecanismo de la replicación; enzimas y factores proteicos que intervienen. Replicación de los extremos de cromosomas lineales (Telómeros). Antibióticos y drogas citostáticas que interfieren en la replicación. Transcriptasa reversa.
(D.3) Mecanismos de reparación del ADN.
Reparación por escisión de base. Reparación por escisión de nucleótido. Reparación por polimerasas especiales en respuesta a lesión propensa al error o graves daños en el ADN. Reparación directa, reparación de apareamientos incorrectos y reparación por recombinación. (D.4) Recombinación del ADN. Recombinación genética homóloga. Recombinación específica de sitio. Contexto fisiológico. Elementos genéticos móviles. Transposones.
(D.5) Mutaciones: naturaleza molecular (clasificación).
(E) FUENTES DEINFORMACIÓN:
· Clases teóricas y seminarios de laCátedra
· Lehninger. Principios de Bioquímica, Nelson,Cox, 5taEd.
· Bioquímica, L. Stryer, Berg, Tymoczko, 7maEd.
· Bioquímica Celular y Molecular, H. Lodish, Berk, Matsudaira, Kaiser, Krieger,Scott,
Zipursky, Darnell 7 ma Ed.
· Genética humana, Strachan y Read. 3ªEd.
(F) DESARROLLO DE LAACTIVIDAD:
Esta actividad tiene como objetivo resolver los problemas y generar debate de los temas a desarrollar, con el fin de reafirmar los conceptos teóricos y aclarar posibles dudas según las instrucciones del docente a cargo del grupo.
PROBLEMAS DE RESOLUCIÓN DOMICILIARIA:
1 ¿Cuál de las siguientes afirmaciones con respecto a la molécula doble-helicoidal de ADN forma B es correcta?
a) Todos los grupos hidroxilos de las pentosas están involucrados en las unionescovalentes.
b) Las bases nitrogenadas son perpendiculares al ejeprincipal.
c) Las dos cadenas son idénticas entresí.
d) Las dos cadenas que forman la doble hélice tienen una dirección paralela 5´ a3´.
e) Cada cadena hija es exactamente igual a lamadre.
2-¿Qué diferencia entre el ARN y el ADN ayuda a explicar la gran estabilidad del ADN? ¿Qué implicancias tiene esto para la función del ADN?
3- Mutaciones
a) Defina “mutación”. ¿Se trata de un cambiohereditario?
b) Efectúe una clasificación de las mutaciones sobre la base de las alteraciones producidas, su mecanismo, y las posiblesconsecuencias.
c) ¿Qué agentes mutagénicosconoce?
4- Es sabido que las ADN polimerasas sintetizan el ADN solamente en la dirección 5´ a 3´. En la horquilla de replicación ambas cadenas parentales son replicadas con la síntesis de una nueva cadena de ADN. ¿Cómo es posible que mientras una cadena es sintetizada en la dirección 5´ a 3´, la otra cadena aparece siendo sintetizada en la dirección 3´ a 5´? Esta aparente paradoja se explicapor:
a) Enzimas de reparación del ADN 3´ a5´.
b) Por una ADN polimerasa 3´ a5´.
c) Fragmentos de Okazaki.
d) Replicación e inmediato entrecruzamiento de la cadenaconductora
e) La carencia del “primer” ó cebador de ARN en una de lascadenas.
5. ¿Qué complejidad témporo-funcional presenta la replicación en eucariotas respecto de procariotas?
PROBLEMAS DE RESOLUCION EN CLASE:
1. Compare las estructuras de las formas A y Z del ADN y discuta sufuncionalidad
Forma A: Predomina en disoluciones relativamente pobres en agua, el ADN esta todavía estructurado en una doble hélice dextrógira pero la hélice es más gruesa y el número de pares por vuelta es de 11(10,5 B ADN) El plano de los pares de base tienen una inclinación de 20° con respecto al eje de la hélice. Los reactivos utilizados para promover la cristalización del ADN tienden a deshidratarlo y por eso muchos ADN cortos cristalizan en forma A, cabe destacar que esta forma A se encuentra solo en laboratorio.
La forma Z: interviene en la regulación de la expresión de algunos genes en la recombinación genética. Contiene una rotación levógira de la hélice, contiene 12 pares de base por vuelta, estructura delgada y alargada cadenas del adn adoptan un plegamiento en Zing-Zag y una inclinación de 7°. Se encuentra en células y generarmente se forma cuando hay un exceso de replicación 
2. Un organismo diploide con un genoma haploide de 45000 kb contiene un 21% de residuos de G. Calcule el número de residuos de A, C, G y T en el ADN de cada célula de esteorganismo.
21%G.........21%C
29%A……29%T 
 90.000 Total, 18,000 A-T 
26,100 C-G
3. Una muestra de ADN humano es sometida a un incremento de temperatura hasta que se observa un aumento en la densidad óptica debido a la disrupción de la doble hélice (fusión o desnaturalización). Una fracción menor tiene un comportamiento atípico, ya que requiere un aumento mucho mayor de temperatura para desnaturalizarse. Esta pequeña fracción de ADN debería contener:
a) > Nº de pares de bases Adenina/ Timina que la fracciónmayoritaria
b) = Nº de pares de bases Adenina/ Timina que la fracciónmayoritaria
c) < Nº de pares de bases Adenina/ Timina que la fracciónmayoritariaDebido a que los pares de base A-T tienen menor numero de puentes de hidrogeno (2) y C-G 3 puentes de hidrogeno.
Señale la opción correcta. Realice un esquema de DO, expresada como porcentaje de desnaturalización en función de la temperatura para ambos tipos de moléculas de ADN. Señale en ellos la temperatura de fusión ó Tm.
A) Menos C-G 
Más A-T 
B) menos A-T 
Mas C-G
D.O
Tm
Tm,
T° Tm: 50% del ADN desnaturalizado
4. Discuta el inicio de la replicación eneucariotas.
Explique el significado y funcionalidad de los términos: replicadores, complejos prerreplicativos, ORC, proteínas MCM.
La replicación del ADN : semiconservadora, bidireccional y semidescontinua 
El inicio de la replicación esta dado por el complejo de reconocimieno ORC que para iniciar recluta con la proteína CDC6, MCM Y CDT1 formando un complejo prereplicativo. Durante la transición a la fase S del ciclo celular, aumentan los niveles de CDK que a su vez fosforilan CDC6 Y CDT1 de modo que pierden su afinidad por el complejo y el ADN , de esta forma la enzima helicasa deja de estar inhibida, abriendo la hebra del ADN para que inici la replicación que progresa su síntesis 5´3´ y es semidiscontinua siendo 3´ OH libre el punto de elongación del ADN creando una tensión que es relajada por acción de las topoisomerasas. Las cadenas separadas son estabilizadas por proeinas de unión al ADN. Los cebadores ( segmentos cortos de ARN, sintetizados por primasas) tienden a estra unidos antes de que la ADN polimerasa comiencela síntesis. Una vez sintetizado tofa la hebra, los cebadores de ARN son renovados y eliminados y reemplazados por ADN. Donde quedan muezcas son sellados por enzimas denominadas ADN ligasas. Cabe destacar que en la síntesis de ADN poseemos dos tipos de cadenas la resagada que necesita adicionar cebados cada una log determinada de nucleótidos esos fragmentos son denominados fragmentos de okazaki mientras que la cadena continua no necesita cebadores.
5. Telómeros
a) ¿Qué dificultad presenta la duplicación de los extremos lineales de los cromosomas humanos? ¿Cómo seresuelve?La dificultad que presenta es la perdida de información que se pierden en los extremos de los cromosomas humanos, debido a esto se agregan telomeros segregado por las telomerasas que ayudan a la protección del cromosoma 
b) Explique que son los telómeros. ¿Cuál es su característica distintiva y como es su estructura?Los telomeros son estructuras de ADN proteína que forman una cubierta protectora en los extremos de los cromosomas y permiten distinguir el final de los cromosomas de una ruptura en la doble hélice. Se caracterizan por presentar miles de repeticiones en tándem de una secuencia hexamerica de nucleótidos 5´-TTAGGG-3´ la hebra 3´ es mas larga y forma un ADN simple hebra en el extremo final se curva sobre su propio eje formando un gran bucle.
c) ¿Qué actividad cumple la enzimatelomerasa?Enzima transcriptasa reversa, retrotranscriptasa inserta los telomeros en los extremos inferiores de los cromosomas 
d) ¿Quérelaciónexisteentrelalongituddelostelómerosylasenescenciacelular?La senescencia es el procesp por el cual se pierden con el tiempo o con sucesivas divisiones la capacidad de volver a replicarse. La longitud del telomero marca la vida media de la celula, cuando el telomero se acorta demasiado la celula muere 
e) ¿Que células del organismo humano tienen actividad telomerasa? Discuta la actividad de la telomerasa en célulastumorales. Las células germinales, células madres, células tumurales, en estas últimos la actividad de la telomerasa es alta , son células que poseen telomeros largon, viven mas tiempo y causan mutaciones 
f) ¿Cómo se estabilizan los telómeros? ¿Qué papel cumple la proteínaPot1?Se estabilizan mediante puentes de hidrogeno, TRF1-TRF2 y Pot1 que estabilizan el bucle evitando asi que el extremo 3´ del bucle del telomero del cromosoma active mecanismos de replicación del ADN 
6. Mecanismos de acción de fármacos antivirales. Explique el mecanismo de acción del AZT (3´ azido - 2´,3´ dideoxi - timidina), una de las primeras drogas utilizadas para el tra- tamiento de la infección por elHIV.AZT es un antiretroviral, antiviral frente a retrovirus ( son virus que sintetizan ADN a partir de ARN9 inhiben la transcriptasa inversa bloqueando la formación del virus ADN proviral. La AZT compite estructuralmente con la timina.
7. Mecanismos de reparación deADN
Las células de vertebrados y de las plantas generalmente metilan las citosinas en ADN para formar 5-metilcitosina (aproximadamente el 5% de las citosinas están metiladas). En estas mismas células, un sistema especializado de reparación reconoce desapareamientos G–T y los repara a pares de bases G-C. ¿Por qué motivo este sistema de reparación puede ser ventajoso para las células?La metilación del ADN , en la citosina para formar 5- metilcitosina hace que se distinga la nase análogo de ARN. La susticion mas común y universal en el ADN es uracilo por timina, al estar metilada el sistema de repacion cuando reconoce desapareamientos G-T y la repara G-C obteniendo una base únicamente de ADN y no G-U, teniendo a su vez que gastar ,as energía y otros métodos de reparación.
8. Reparación de ADN en pacientes con XerodermaPigmentoso.
Descripto originalmente por Kaposi en 1863, el Xeroderma Pigmentoso es una rara genodermatosis transmitida de forma autosómica recesiva. Se caracteriza por una temprana e intensa sensibilidad tegumentaria a la radiación lumínico-solar, cursando con quemaduras solares frecuentes, sequedad, discromías y cambios poiquilodérmicos con el desarrollo de neoplasias durante los primeros años de la niñez, constituyendo un trastorno progresivo, desfigurante y letal. El Dr. Cleaver (1968) estableció el origen molecular al demostrar numerosos defectos en la reparación del ADN (reparación por escisión de nucleótidos principalmente) en cultivos de fibroblastos irradiados con luz ultravioleta. Hasta ahora se han descripto 7 genes asociados al desarrollo de esta enfermedad con lo cual se las clasifica de la A a la G.
Discuta el siguiente caso clínico:
a)- Los padres de un niño de 2 años –Juan- acuden a la guardia porque su hijo presenta lesiones eruptivas en el rostro. El médico de guardia al analizar las lesiones nota que no son típicas, por lo tanto cree conveniente que sean revisadas por un médico especialista en dermatología. Este último concluye que las lesiones se presentan en zonas del cuerpo que están expuestas con mayor frecuencia a la luz solar y que una de estas lesiones estaba sobre-elevada.
El especialista consulta al departamento de bioquímica y resuelven realizar una biopsia para generar un cultivo de fibroblastos con el cual se realizará un Ensayo de Electroforesis de células individuales o “Ensayo Cometa”. Este ensayo consiste en someter los núcleos celulares a una electroforesis y luego teñir el ADN para analizar su integridad.
Electrodo (-)
Ensayo cometa para evaluar la integridad del ADN. Electroforesis de ADN genómico. Control representa una muestra sin alteraciones del ADN. 50, 100 y 500 uM son distintas concentraciones de la muestra problema.
Electrodo (+)
i-Analice y discuta los resultados de la electroforesis.Este ensayo consiste en someter los núcleos celulares a una electroforesis y luego teñir el ADN para analizar su integridad.
se puede observar que de negativo al positivo se movilizan las proteínas esto se debe a que los grupos fosfatos estabilizan las hebras de ADN, El adn de la muestra se encuentra desenrollado ya que el ADN posee cargas (-) y las histonas que lo envuelven carga (+) y el proceso tiende a incorporarse o movilizarse hacia el electrodo +.Los rayos ultravioletas generan mutuaciones con dimeros de timina 
iii- ¿Puede concluir que el paciente sufre de Xeroderma Pigmentoso?NO ¿Qué otro ensayo propondría para confirmar de que enfermedad se trata? Estudiar los genes involucrados en la enfermedad
iiii-¿Qué cuidados recomendaría a los pacientes que padecen estados patológicos asociados al mal funcionamiento del sistema de reparación del ADN?Evitar la luz UV
9. ¿Qué papel cumplen las alquiltransferasas en la reparación delADN?
Las aquiltransferasas catalizan la transferencia del alquilo de una base nitrogenada de ella misma ya sea metil o etil a una cisteína del centro activo de la enzima, esta forma modificada actua como activadorea de los sistemas de reparación celular
10. Mecanismos de recombinación génica.
Qué mecanismos de recombinación genética conoce. Describa cada mecanismo brevemente e indique cuales son las funciones de la recombinación genética.
La recombiancion genética: es el reordenamiento de la información genética dentro y entre las moléculas de ADN 
Funciones de los sistemas de recombinación genética;
· Participan en sistemas de reparación del ADN especializados 
· Regulan la expresión de ciertos genes
· Contribuyen a la segregación correcta de cromosomas durante la división celular en los eucariotas
· Mantienen la diversidad genética
· Participan en el reordenamiento genético programado durante el desarrollo enbrionario.
Tipos de recombinación :
A) Recombinacion genética homologa: consiste en el intercambio genético entre dos moléculas de ADN que comparten una región extensa de secuencia casi idéntica .( Crossing over, reparación de horquillas bloqueadas por recombinación )
B) Recombinacion especifico de un sitio: los intercambios tienen lugar en una secuencia de ADN particular
C) Trasposicion de ADN.
11. El mecanismo de recombinación genética homóloga es clave para mejorar la diversidadgenética de una población. ¿Por qué es estoasí?
La recombinación genética homologa , crossing over entre cromatides no hermanas contribuye a que los caracteres hereditarios paternos y maternos se recombinen en los gametos en virtud de estos inetercambios todos los gametos resultaran distintos entre si, aumentando la variabilidad genética prácticamente infinitiva de los individuos a los que den origen 
12. Recombinacion genética y origen de la diversidad de inmunoglobulinas Las inmunoglobulinas son heterodímeros, constituidos por dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas. Tanto las cadenas livianas como las pesadas tienen regiones variables, en su secuencia de aminoácidos, con 3 secuencias cortas hipervariables próximas a su región N terminal y regiones constantes (zonas con muy baja variación de secuencia). Los vertebrados son capaces de producir miles de millones de anticuerpos diferentes. Esto implicaría que cada molécula diferente de cadenas L y H fuera codificada por genes diferentes. Por ejemplo se necesitarían mil genes diferentes de las cadenas L y H para codificar un millón de Ig diferentes, sin embargo el genoma humano contiene muchísimos menos genes para las Ig. Recordar que el genoma humano solo contiene 29.000genes
a) ¿Qué explicación científica puede justificar esta aparentediscordancia?Splicing alternativo
b) Discuta la recombinación somática de segmentos génicos para producir un gen funcional de inmunoglobulinas La recombinación somatica es un mecanismo que solo ocurre en el momento temprano del desarrollo de los linfocitos B. Los genes que codifican para la región V y U que se encuentran separados en todas las células se reordenan para juntarse en el caso de los linfocitos B Cuando estos genes se juntan reciben el nombre de Segmentos génicos. Los segmentos génicos pueden combinarse entre si llegando a generar aproximadamente 3.400.000 regiones V distintas. Esta gran variedad de combinaciones recibe el nombre de diversidad combinatorial
13. ¿Qué son los transposones? ¿Por qué constituyen posibles fuentes de generación de mutaciones en losorganismos?Son segmentos de ADN presentes en casi todas las celulas que se mueven o “saltan” de un lugar a otro del cromosoma el sitio dador u otro del mismo o diferente cromosoma del sitio receptor el movimiento puede producirse con duplicación del elemento o sin esta. 
Estas consecuencias pueden traer mutación (depende donde se encuentren los trasnposones que donde salten afecten el desarrollo de un gen )
· Pueden insertarse dentro de genes, con la supresión completa de la función génica
· Pueden insertarse dentro de secuencias reguladoras de un origen donde su presencia conduce a la aparición de cambios en la forma en el que el gen se expresa
14. Explique qué efectos produce la metilación de las bases en elADN.
La metilación del ADN es importante:
1) Mantiene el silenciamiento génico en el desarrollo normal 
2) Impronta genómica
3) Inactivación del cromosoma x
4) Supresión del gen 
5) Carcinogénesis
6) Estabilidad del cromosoma 
G) EVALUACIÓN:
Se realizará una evaluación oral continua por parte del docente a cargo de la comisión ó el jefe de trabajos prácticos.