TP METABOLISMO DEL ARN Y REGULACION DE LA EXPRESION GENICA

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Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Médicas
UNLP
Guías de actividades prácticas Segundo cuatrimestre 2019
Actividad 14
Metabolismo del ARN y Regulación de la expresióngénica	
(A) OBJETIVOSGENERALES:
Conocer el proceso de transcripción por el cual se sintetizan los diferentes tipos de ARN, a partir de la información contenida en el ADN.
Interpretar los distintos mecanismos involucrados en la regulación de la expresión de distintos genes y aplicarlos a situaciones específicas como son la acción de algunas hormonas en eucariotas.
(B) OBJETIVOSESPECÍFICOS:
(B.1) Describir el proceso de transcripción en eucariotas.
(B.2) Explicar el procesamiento postranscripcional.
(B.3) Reconocer drogas que interfieren con la transcripción, resaltando su mecanismo de acción e importancia clínica.
(B.4) Describir los mecanismos básicos para el control de la expresión génica en eucariotas.
(B.5) Describir mecanismo de acción de hormonas tiroideas y esteroideas como ligandos de factores de transcripción, e insulina y glucagón como reguladores metabólicos inductores de la síntesisproteica.
(B.6) Aplicar los conocimientos adquiridos a la resolución de problemas.
(C) CONOCIMIENTOS PREVIOSNECESARIOS:
Temas tratados en el seminario de Síntesis de ADN.
(D) TEMARIOGENERAL
(D.1) Transcripción: síntesis de ARN dependiente de ADN. Iniciación, promotores, activadores y represores de la iniciación. ARN polimerasas en eucariotes. Elongación y terminación. Fidelidad de la transcripción. Antibióticos inhibidores de la ARN polimerasa. (D.2) ARNs mono y policistrónicos. Procesamiento del ARN. Multiplicidad de productos originados a partir de un mismo gen (splicing alternativo). Edición del ARN (apo B100 y apoB48). Enzimas ARN o ribozimas.
(D.3) Regulación de la expresión génica: Principios generales: expresión constitutiva y regulada; inducción y represión.
(D.4) Regulación en eucariotas: Regulación de la transcripción. Secuencias activadoras, factores de transcripción generales y específicos de gen. Remodelado de la cromatina: acetilación, submetilación e hipersensibilidad a ADNasas de las regiones transcripcionalmente activas de los cromosomas. Conformación de los complejos de iniciación de la transcripción, rol de los transactivadores y coactivadores.
(D.5) Hormonas que actúan regulando la expresión génica. Receptores de hormonas tiroideas y esteroideas, características y modo de acción. Insulina y glucagón: factores de transcripción asociados a su funcionamiento (SREBP, FOXO, CEBP, etc.). Receptores nucleares heterodiméricos: ligandos naturales y artificiales. Uso de ligandos de factores de transcripción como drogas. Controles postranscripcionales.
(E) FUENTES DEINFORMACIÓN:
· Seminarios de laCátedra
· Principios de Bioquímica, A. Lehninger, 5taEd.
· Bioquímica, L. Stryer, 6taEd.
· Bioquímica Celular y Molecular, H. Lodish, 7maEd.
· Fundamentos de Bioquímica, D. Voet, 3raEd.
· Biología Molecular del Gen, J. Watson, 5taEd.
· Bioquímica, Devlin, 4taEd.
(F) DESARROLLO DE LAACTIVIDAD:
Los Sres. Alumnos deberán concurrir a la actividad habiendo estudiado la totalidad de los ítems consignados en el rubro Conocimientos previos necesarios y en el Temario Analítico que se adjunta.
Durante el desarrollo de la clase el docente a cargo del grupo conducirá la discusión colectiva de las dificultades que surjan en la resolución de los problemas. En ningún caso y por ningún motivo se impartirán clases magistrales sobre cuestiones vinculadas al temario. Con este fin, los alumnos cuentan con las clases de seminarios.
Esta actividad tiene como objetivo resolver los problemas y generar debate de los temas a desarrollar, con el fin de reafirmar los conceptos teóricos y aclarar posibles dudas según las instrucciones del docente a cargo del grupo.
PROBLEMAS DE RESOLUCIÓN DOMICILIARIA:
A. Metabolismo del ARN
1.- Compare las ADN y las ARN polimerasas respecto de la estructura completa, los sustratos, los mecanismos de acción, la tasa de error y la especificidad del molde.
2.- Analice las diferencias en el proceso de iniciación de la transcripción entre células eucariotas y procariotas. En este contexto defina: promotor, secuencias consenso, activador y represor. Compare las distintas ARN polimerasas de eucariotas con la ARN polimerasa deprocariotas.
4.- ¿Cómo está compuesto el complejo de transcripción basal de eucariotas? Mencione brevemente las funciones de los diversos TFII. Describa la estructura y función del dominio carboxilo-terminal (CTD) de la ARN polimerasa II.
5.- Explique cómo se procesan los ARNr, ARNt y ARNm en eucariotas. ¿Cómo está constituido el spliceosoma?
B. Conceptos generales de regulación de la transcripción génica
6.- Defina genes constitutivos y genes regulables. Mencione ejemplos.
7.- ¿En qué se diferencian un factor de transcripción específico de uno basal o general?
8.- Defina brevemente los siguientes términos (indique si se tratan de proteínas o secuencias de ADN):
a) intensificador o potenciador (enhancer), b) aislante (insulator), c) silenciador, d) elemento de respuesta (RE), e) Proteína de unión a elemento de respuesta (REBP), f) trans activador, g) mediador, h) co-activador, i)co-represor.
9.- Explique la importancia de los sistemas remodeladores de nucleosomas y de la acetilación de histonas para el control de la expresión de genes eucarióticos.
PROBLEMAS DE RESOLUCION EN CLASE:
A- Metabolismo del ARN
1.- Dadas las siguientes secuencias:
a) 5´-AUGGUGGAACUAGCAAGUAGAG-3´hebra de ARN
b) 5´-ATGGTGGAACTAGCAAGTAGAG-3´Hebra no molde
c) 5´-CTCTACTTGCTAGTTCCACCAT-3´Hebra molde ( 3´5´)
d) 5´-TACCACCTTGATCGTTCATCTC-3´
Indique cuál de las secuencias corresponde a ADN codificante, ADN molde y ARN. Recordar que las secuencias se indican siempre en el sentido 5´ → 3´.
2.- Las talasemias son un grupo heterogéneo de anemias hereditarias con una tasa de portadores del 7 % en todo el mundo. En la talasemia β+ hay una reducción parcial de la síntesis de la cadena β. Dos mutaciones puntuales dentro de la secuencia TATA (A→G o A→C) del gen de la globina generan un fenotipo β+.
a) Explique brevemente cómo podría relacionar la presencia de las mutaciones con el desarrollo de estaenfermedad. La mutacion causa una falla a nivel de la transcripción de la globina, es decir si la caja TATA esta afectada, posee menor afinidad y por lo tanto la síntesis es menor haciendo que la disminuya la hemoglobina porque baja la síntesis de la cadena de globina 
Por otro lado en la talasemia β0 no hay síntesis de β globina por la presencia de mutaciones homocigotas en las secuencias de corte y empalme en los límites intrón/exón. En algunos individuos, un AT reemplaza a un GT en el gen en el extremo 5´.
b) Explique cómo se ve afectado el mecanismo de corte yempalme.No permite la unión de U1 ya que posee una secuencia especifica complementaria a GU, el limite interno y externo esta concentrado para que el esplicing funcione pero en este caso no se forma el espliceosoma ya 	que al no unirse U1, no se unen los siguientes.
3.- Las ADN polimerasas son capaces de editar y corregir errores, mientras que la capacidad de edición de las ARN polimerasas es limitada. Esta actividad correctora de pruebas ocurre de la siguiente manera: cuando se incorpora un ribonucleótido incorrecto se forman enlaces de hidrógeno que no son del tipo fuerte de Watson y Crick, ésto facilita el retroceso para colocar el nucleótido anterior al que se acaba de agregar próximo al catión divalente del centro activo de la ARN polimerasa. Esto permite activar la hidrólisis del dinucleótido que contiene el ribonucleótido incorrecto. Sin embargo la tasa final de errores es de 1 nucleótido cada 104 o 105, mucho mayor que la de las ADN polimerasas que es de 1 nucleótido cada 109 0 1010, luego de los mecanismos de revisión durante la síntesis y reparación postreplicación.
Cuando ocurre un error de una base tanto en la replicación como en la transcripción, el error puede trasladarse a un error en la síntesis proteica. Explique por qué es menosgrave una mayor tasa de error en las ARN polimerasas que en las ADNpolimerasas. La ARN polimerasa es muy progresiva: una vez que incia la transcripción rara vez se detiene antes de llegar a la señal de terminación. Comete pocos errores pero son mas que los del adn polimerasa, por lo que resulta menos fiable. Pero dado que el arn no transporta información de una generación a la siguiente es evidente que no se necesita un mecanismo de gran fidelidad. 
Otro aspecto importante es su degradación de nucleótidos tanto del arn pol como adn pol, ya que la fidelidad de la polimerización del ARN es mucho mas baja que la del ADN. Esto es permisible puesto que las moléculas aberrantes del ARN pueden simplemente reciclarse y se pueden hacer nuevas moléculas correctamente hechas.
4.- ¿Qué antibiótico utilizado con frecuencia, inhibe la ARN polimerasa bacteriana pero sin afectar la polimerasa de mamíferos? Explique el mecanismo de acción. Dentro de los acntibioticos mas conocidos tenemos la rifampicina es un derivado semisintetico de un antibiótico natural (rifamicina b) producido por la bacteria sreptomyces mediterranei. Su mecanismo de acción : inhibe la síntesis de ARN en las bacterias uniéndose a la subunidad beta de los ARN polimerasas bacterianos, lo que impide el desalojo del promotor en la transcripción. Se une a la subunidad Beta de la ADN pol ARN dep impidiendo que esta enzima no se una al ADN.
5.- Francisco acude a la consulta médica porque no se sentía bien. Había comenzado con diarrea y cólicos hacía dos días. El médico lo interroga acerca de los últimos alimentos que ingirió. Lo que le llamó la atención es que Francisco había salido a caminar por el bosque y había recolectado algunos hongos en el camino que después se los agregó a una salsa. Busco rápidamente en internet y le mostro fotos de distintos tipos de hongos. Francisco reconoció el que habíaconsumido.
a) ¿Conoce de la existencia de hongos que son potencialmente tóxicos? (ver foto), ¿cuál puede ser la causa delmalestar?Si, la alfa amantina , células del intestino están afectadas lo que causa el malestar de la diarrea y los colicos
b) Describa el mecanismo de acción del tóxico que afectó a Francisco.El mecanismo de acción de la alfa amantina inhibe principalmente a la ARN Pol 2 uniendose fuertemente a la enzima ( bloque la fase de elongación) a concetraciones elevadas inhibe también a la ARN pol 3 
c) ¿Cuáles son los órganos más afectados? Células del intestino, hígado, riñon¿Qué análisis clínicos le mandaría a pedir a Francisco?KPTT, Medir el amonio en orina y sangre, tiempo de coagulación de sangría ¿Qué espera encontrar?Al afectar el hígado, la síntesis de amonio se va a ver afectada, y la cogulacion también 
Para evaluar el grado de intoxicación de Francisco se realizó una biopsia de hígado. Se extrajeron los núcleos de las células hepáticas y mediante una cromatografía de intercambio iónico se separaron las diferentes ARN polimerasas y se midió la actividad a cada una de las fracciones. Se comparó la actividad ARN polimerasa (sombreado celeste) de las polimerasas de Francisco la con la actividad de una muestra de un individuo sano (línea roja). El estudio arrojó los siguientesdatos.
d) Identifique que fracción corresponde a la ARN pol II.Justifique.La fracción correspondiente a la ARN pol 2 es la fracción del medio
e) ¿Qué podría decir acerca del grado de intoxicación deFrancisco?es elevada 
6.- ¿Por qué la actinomicina-D puede utilizarse en el tratamiento del cáncer?
Es hidrofobica y se ubica entre las dos bases impidiendo que las bases se separen , además la actinomicina no es especifica , su mecanismo de acción es inhibir la elongación de las cadenas de ARN por la ARN pol tancto en bacterias como eucariotas al inhibir la elongación en cel intactas asi como extractos células resulta útil para identificar procesos celulare que dependen de la síntesis de ARN 
B) Conceptos generales de regulación de la expresión génica eneucariotas
7.- De los siguientes procesos:
a) transcripción b) modificaciones postranscripcionales c) degradación delARNm
d) traducción e) modificaciones postraduccionales f) degradación proteica
¿Cuál/es de ellos puede/n ser controlados para regular la actividad de una proteína en una célula eucariótica?TODAS
Desde el punto de vista de la economía celular ¿En qué nivel sería más eficiente el control?En la trasncripcion 
8.- Teniendo en cuenta las diferencias entre factores de transcripción basales y específicos,
¿Cuáles de ellos serán más probablemente utilizados por un virus que utiliza la maquinaria de una célula eucariota para la expresión de sus proteínas? Justifique. Factores basales porque el virus posee secuencias de virus, posee secuencias promotoras concetradas, no son especificas.
9.- Indique cuál/es de los siguientes mecanismos es/son normalmente utilizado/s por una proteína activadora de la transcripción en células eucarióticas:
a) directa fosforilación y activación de la ARN polimerasaII NO, no es directa, 2H la fosforila y la inhibe, acorta la formación del complejo
b) reclutamiento de sistemas remodeladores denucleosomas SI TF2E
c) reclutamiento de histona acetiltransferasasSI 
d) reclutamiento de factores de transcripción generales y ARN polimerasaIISI TF2F
10.- Describa los mecanismos mediante los cuales la insulina y el glucagón regulan la expresión de genes relacionados al metabolismo de glúcidos y lípidos.( TEMA DEL PARCIAL ANTERIOR, Explicar los mecanismos a largo plazo y a corto plazo de la insulina y glucagón) 
11.- En una condición conocida como feminización testicular, los pacientes producen andrógenos pero las células blanco no responden a estas hormonas esteroideas.
a) Esquematice la vía de transducción de señales de estas hormonas y nombre los dominios presentes en estasproteínas.
b) ¿Por qué puede estar fallando la respuesta de la célulablanco? Se puede estar presentando una histona desacetilaza que desacetila y no permite la transcripción 
c) ¿Qué manifestación clínica puedenpresentar?Caracteres femeninos, por que las hormonas encargadas de los caracteres físicos masculinos no son asimilados por la célula blanco 
C) Mecanismos de controlpostranscripcionales
12.- Mientras se investigaba la función de un gen humano que codifica el receptor de un factor de crecimiento específico, se encontró que dos tipos de proteínas son sintetizadas a partir de este gen. La proteína más grande que contiene un dominio que atraviesa la membrana, funciona reconociendo los factores de crecimiento en la superficie celular, estimulando un camino de señalización específico hacia el interior. En contraste, una proteína relacionada más pequeña, es secretada desde la célula y funciona uniendo un factor de crecimiento circulante en la sangre. Explique cuáles de los siguientes mecanismos puede tener la célula para sintetizar estas proteínas diferentes a partir del mismo gen:
a) Edición de ARNm, b) Splicing alternativo, c) Utilización de sitios alternativos de inicio de la transcripción, d) Utilización de sitios alternativos de inicio de la traducción,e) Utilización de sitios alternativos de terminación de la transcripción, f) Utilización de sitios alternativos de terminación de la traducción, g) Utilización de sitios alternativos de clivaje y poliadenilación de los ARNm,h) Degradación parcial de los ARNm, i) Cambios en el marco de lectura de la traducción
13.- De los términos entre paréntesis, tache aquellos que no correspondan de manera que las siguientes frases seancorrectas:
a) En eucariotas superiores, (el silenciamiento/la activación) postranscripcional de algunos genes puede ser mediada por pequeñas moléculas de (ADN/ARN). Estas se unen al (ARNm/ribosoma) inhibiendo su (procesamiento/traducción) o favoreciendo su degradación.
b) Las apolipoproteínas B100 y B48 son producidas a partir del mismo gen en hepatocitos y enterocitos, respectivamente. Esto se debe a (la edición/el splicing alternativo) de un (codón/intrón) que depende de la (desaminación/metilación) de una (citosina/adenina) específicay aparición de un codón (stop/deinicio)
14.- Regulación del corte y empalme alternativo y su relación con el desarrollo de cáncer
La mayor parte de la información necesaria para decidir qué secciones de un pre-ARNm van a ser incluidas en un ARNm está presente en la misma secuencia delpre-ARNm.
a) ¿Cómo se regula el corte y empalme alternativo? ¿Qué proteínas están involucradas en estaregulación?Se regula mediante una codificación dentro de la secuencia de los exones las proteínas involucradas son las SF2
La proteína Fas (también conocida como CD95) es un receptor de superficie celular que se une al ligando Fas (FasL) expresado en células T citotóxicas, puede iniciar una cascada que conduce a la muerte celular.
Además de producir el ARNm de longitud completa, el pre-ARNm de Fas se puede cortar y empalmar alternativamente para producir una isoforma (FasΔE6) soluble en la que se omite el exón 6 (E6), suprimiendo el dominio transmembrana, siendo por lo tanto capaz de inhibir la muerte celular mediada por Fas.
b) Grafique a partir de esta secuencia parcial del pre-ARN el ARN correspondiente aFAS y aFASdeltaE6
GRAFICO: 
c) Explique por qué la isoforma FasΔE6 no conduce a la muertecelular. Al faltarle el exón 6 atraviesa la membrana celular, y no se une al receptor
Los pacientes con large granular lymphocyte leukemia (leucemia granular de linfocitos) presentan un aumento de la isoforma ΔE6 en los ARNm de Fas en células mononucleares en comparación con individuossanos.
d) Relacione el corte y empalme alternativo de Fas con el desarrollo de estaenfermedad
Como posee esa isoforma que no posee el exón 6 falla el mecanismo de muerte celular por Fas, las células siguen repricandose y se establece la enfermedad del cáncer 
Varias RBP (RNA binding proteins) están implicadas en la promoción de la producción del ARNm de Fas de longitud completa. Una de ellas (TIA-1) se une a secuencias ricas en U hacia el extremo 3´ a partir del exón E6 aumentando el reclutamiento de U1 snRNP y promoviendo su inclusión en el ARNm.
e) ¿Qué función cumple esta partícularibonucleoproteica? Asegura que mas Fas se traduzcan y maduren completos sin faltarles el exón 6, el propósito es que lo hacen para que sean funcionales 
La activación del receptor Fas influye en el corte y empalme de su propio pre-mRNA a través de la activación de la Fas quinasa (FAST K). FAST K puede fosforilar TIA-1 potenciando su capacidad para activar la inclusión de E6 aumentando su capacidad para reclutar U1 snRNPs al pre-mRNA.
Charles J. David, and JamesL. Manley
Genes Dev. 2010; 24: 2343-
f)	2364
Discuta	los	mecanismos	que	pueden	estar
alterados y que llevan a una disminución de Fas y a un aumento desproporcionado de FasΔE6.