2017-QA-Espec_UV-VIS

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Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires 1
Quimica Analitica – 2do Cuatrimetres 2017
Dr. Fernando A. Iñón.
Espectroscopía UV-VIS
Absorción y fluorescencia
Química Analítica 
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Dr. Fernando A. Iñón
Temario 
l Teoría de la espectroscopia UV-VIS y 
luminiscencia 
l Instrumentación UV-VIs
l fuentes, elementos dispersivos, detectores, 
interferencias.
l Aplicaciones y consideraciones estructurales
l Luminiscencia: Fluorescencia
¿Qué debo saber explicar? 
l Cuáles son los fenómenos espectroscópicos
l Cuál es la relación entre potencia incidente y 
transmitida y de qué parámetros depende
l Cómo están conformados los instrumentos y 
cual es el rol de cada parte
l Cómo se llevan a cabo las medidas 
experimentales, qué interferencias pueden 
existir y cómo se calcula la composición de 
una muestra
c
l
e
H
l = longitud de onda n = frecuencia = c / l
c = velocidad de la luz (300000 km/s)
e = campo eléctrico H = campo magnético
Radiación electromagnética
¿Ondas o partículas de luz?
• A principios del siglo XX comienza nuevamente la polémica. 
Ninguna de las dos teorías puede explicar todos los fenómenos 
físicos.
Reflexión þ þ
Refracción þ þ
Interferencia þ ý
Difracción þ ý
Polarización þ ý
E. Fotoeléctrico ý þ
Efecto Fotoelectrico …
l De acuerdo con la teoría ondulatoria, la fuerza o amplitud de la 
luz se hallaba en proporción con su brillantez: 
la luz más brillante debería ser más que suficiente para crear el 
paso de electrones por el circuito. 
Sin embargo, extrañamente, no lo producía.
• Einstein concluyó que los 
electrones eran expelidos del 
metal por la incidencia de 
fotones. 
• Cada fotón individual 
acarreaba una cantidad de 
energía E, que se relacionaba 
con la frecuencia n de la luz.
- - -
-
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E = energía (J)
h = constante de Planck (6.63 x 10-34 J/s )
c = velocidad de la luz (3 x 1010 cm/s)
l = longitud de onda (cm)
n = c/ l = frecuencia (1/s)
n = 1/ l = N°de onda (cm-1)
E = hn = hc/l
Energía asociada a un fotón Interacción de la materia con 
radiación electromagnética
l Fenómenos espectroscópicos
Ø Absorción
Ø Emisión
Ø Fluorescencia
l La materia sufre cambios en su energía interna en función 
de sus niveles CUANTIZADOS electrónicos, vibracionales, 
rotacionales. La energía de la radiación electromagnética 
debe estar relacionada con la diferencia entre la energía de 
estos niveles energéticos internos.
l Dispersión (Scattering) 
Ø Elástica
Ø Inelástica
Emisión
Q hn
EMISIÓN
Absorción
Qhn
ABSORCIÓN
Luminiscencia (flourescencia, fosforescencia)
hn1
FLUORESCENCIA
hn2
Interacción luz-materia:
Espectroscopias
Q hn Qhn hn1
l Cambio de energía interna de la materia por 
interacción con radiación electromagnética
l Einterna @ Eelectrónica + Evibracional + Erotacional
EMISIÓN ABSORCIÓN FLUORESCENCIA
hn2
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Estado fundamental E0
Estado excitado E1
DE = E1 - E0 = hn
Nivel 
energético
eDE
Transiciones electrónicas
E
ne
rg
ía
 
 (e
V
)
DE = hn = hc/l
Energía de Transición
ENERGÍA
ESTADO
FUNDAMENTAL
ESTADOS EXCITADOS
Energía
TRANSICION VIBRACIONAL
TRANSICION
ROTACIONAL 
R
v1
v2
v0
5
4
3
2
1
0
TRANSICION 
ELECTRONICA
E1
E0
v0
v1
v2
Transiciones
17
• Los Orbitales Moleculares resultan de la 
Combinación Lineal de Orbitales Atómicos
• Dado que los orbitales son funciones de onda, se 
pueden combinar:
• constructivamente
(formando un OM ligante), 
• destructivamente
(formando un OM antiligante).
Teoría de Orbitales Moleculares
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Las funciones de onda de los átomos de hidrógeno A y B 
pueden interactuar en forma constructiva o destructiva.
Constructivamente:
Ψ(σ) = (1/√2 ) [φ(1sa) + φ(1sb) ]
Destructivamente
Ψ(σ*) = (1/√2 ) [φ(1sa) - φ(1sb) ]
Teoría de Orbitales Moleculares
20
Transiciones electrónicas en moléculas
anti-enlazantes
no-enlazante
enlazantes
E
N
E
R
G
ÍA
TransicionesNiveles de Energía
22
3x1012 3x1010 3x108 3x106 3x104 3x102
n (MHz)
10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1 l (m)
Vibraciones 
moleculares
Rotaciones moleculares
Electrones
internos Electrones
externos
Rayos X Ultravioleta
Vi
si
bl
e
Infrarrojo Microondas Radio
El espectro electromagnético
E0
E1
ATOMO
E0
E1
V0,2
V0,1
V0,0
V1,2
V1,1
V1,0
MOLECULA
LINEA
BANDA
Dl
Dl
l
I
l
I
~20-30nm
<0.01nm
DE = hc/l
Átomos y moléculas UV-VIS
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§ Parte de la luz emitida por la fuente IR es 
absorbida por la muestra
§ La porción transmitida es medida por el 
detector
MUESTRA
Fuente de 
radiación
Radiación 
transmitida
Principios de la espectroscopía
LUZ 
INCIDENTE
P0DE LA 
FUENTE 
DE LUZ
AL 
DETECTOR
LUZ 
TRANSMITIDA
P1
CELDA CON ANALITO
CAMINO OPTICO
Transmitancia T =
P1
P0
Espectrofotometría de absorción
P0 P1
Transmitancia T =
P1
P0
%Transmitancia T% = T x 100
0% = absorción total 
100% = transmisión total
Espectrofotometría de absorción Transmitancia y Paso Óptico
l La transmitancia 
depende del 
espesor de la 
muestra atravesada
l Incrementando al 
doble el paso 
óptico, la 
transmitancia se 
reduce a la mitad Ley de Lambert
I = I0 e –k b
Paso óptico
Tr
an
sm
it
an
ci
a
100%
I0
50%
I1
25%
I2
12.5%
I3
6.75%
I4
0
20
40
60
80
100
0 b 2b 3b 4b
b 
Transmitancia y Concentración
l La transmitancia 
depende de la 
concentración de la 
muestra
l Incrementando la 
concentración al 
doble, la 
transmitancia 
decrece a la mitad Ley de Beer
I = I0 e –k C
Concentración
Tr
an
sm
it
an
ci
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
100%
I0
50%
I1
c
100%
I0
12.5%
I3
3c
100%
I0
6.75%
I4
4c
0 c 2c 3c 4c
100%
I0
25%
I2
2c
Deducción Ley de Lambert-Beer
I0 I
dl
L
s
BdNKI
dI
=- n
n
Un haz de luz monocromática de intensidad I y
frecuencia n atraviesa una muestra de una
substancia B en solución de concentración CB,
que es capaz de absorber la radiación incidente
Proporción de radiación absorbida
Proporcional al número de
partículas de B
Probabilidad de que una partícula de
B absorba un fotón
dlcNdN BAB s=
Partículas en un diferencial de
longitud
dlcKN
I
dI
BAsn
n
=-
Coeficiente de 
absorción molar 
para la 
frecuencia n
òò =-
l
BA
I
I
dlcKN
I
dI
00
s
n
n n
n
lcKN
I
I
B
A
10ln
log 0 sn
n
=
)(neA
Área
Absorbancia para la 
frecuencia n
lcA B)(nen = Ley de Lambert-Beer
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lcA B)(nen =
mol·L-1
cm
L·mol-1·cm-1
La absorbancia es un parámetro adimensional en escala
logarítmica determinable experimentalmente mediante técnicas
espectrofotométricas
Unidades típicasn
)(ne
El coeficiente de absorción molar
varia según la frecuencia de la
radiación incidente
1n 2n
Las bandas de absorción en líquidos se suelen extender por un intervalo de
frecuencias n1 y n2.
ò=
2
1
)(
n
n
nne d
Coeficiente de absorción molar integrado
A
)( nmne
L·mol-1·cm-1s-1Unidades típicas
P0 P1
Transmitancia T =
P1
P0
Absorbancia A = -log T
A = µ (0%T) = absorción total
A = 0 (100%T) transmisión total
Espectrofotometría de absorción
% Transmitancia
Absorbancia
b
Al = el x b x C
el = absortividad molar (o coeficiente de absorción)
b = camino óptico (cm)
C = concentración de la especie absorbente
l Si incide luz monocromática
de frecuencia n se verifica que:
Absorcióny Ley de Lambert-Beer
P0 P1
CbA ´´= ll e
b
AC
´
=
l
l
e
C
Al
Absorción y Ley de Beer Análisis de mezclas multicomponentes
l LIMITACIONES DEL METODO
l Encontrar las longitudes de onda adecuadas
l Interferencias entre componentes del sistema 
(reacciones, variaciones de pH, etc.)
''
1 11 lll NNMM
aCaCA +=
''
2 22 lll NNMM
aCaCA +=
A una dada longitud de onda, la absorbancia medida dependerá de la 
concentración y la absortividad de todas las especies químicas. Si se considera 
absorbancia aditivita e independencia química para dos especies:
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Instrumentación
l Componentes del espectrofotómetro
l Fuentes de luz
l Elementos de selección de longitud de onda
l Tipos
l De filtros (de absorción y de interferencia)
l Monocromadores (de prisma y de red de difracción)
l Resolución
l Luz espuria
l Detectores
l Otros componentes
l Espectrofotómetros de doble haz
l Espectrofotómetros de dispositivo de fotodiodos 
Espectrofotómetro UV-VIS
Componentes
Fuentes de radiación
l CONDICIONES BASICAS : 
lSuficiente energía radiante en toda la 
región de longitudes de onda donde se 
utiliza.
l Intensidad constante durante el intervalo 
de tiempo de medición.
Lámpara de W-halógeno
l Rango: 330 a 2500 nm (VIS y NIR)
Ventanas de cuarzo
Excelente estabilidad
Lámpara de W-halógeno
l Ciclo regenerativo del halógeno
D2 + e- ð D2* ð D + D + hn
Lámpara de deuterio
l RANGO ESPECTRAL: 
l Espectro continuo 
l 160 a 370 nm (UV)
l Líneas espectrales 
l l = 486.0 y 656.1 nm (también 433.9 y 410.1 nm)
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Lámpara de deuterio
• La excitación del deuterio atómico produce un espectro de 
líneas, siendo las más importantes las 486.0 y 656.1nm
200 300 400 500 600 700 800 nm
Otras lámparas: Xenón
Las lámparas de flash de Xenón proveen alta energía con corto tiempo 
de calentamiento y larga vida útil. 
Pueden medir tanto en el UV como en el Visible (190 - 1100 nm).
Típicamente disparan 80 flashes por segundo, con un sonido distintivo.
Selección de longitudes de onda
l El selector restringe el rango de longitudes 
de onda de la radiación que incide sobre el 
analito.
l Cuanto menor el rango, mayor adherencia a 
la Ley de Beer.
l Cada selector tiene un ancho de banda 
nominal efectivo.
El ancho de banda efectivo es el rango de 
longitudes de onda en el que la transmisión es 
mayor que la mitad del valor máximo.
ancho de banda efectivo = l2 – l1
Selección de longitudes de onda
l0
Resolución
l El ancho de banda instrumental es el intervalo de 
longitudes de onda que deja pasar el filtro/ 
dispositivo de monocromación
l El ancho espectral natural para una la molécula es 
el ancho de banda de absorción medido a la mitad 
de su altura
l0
Ancho de media banda
l
A
Resolución
l Capacidad de discernir diferentes longitudes 
de onda
el puede tener un efecto instrumental!!
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Resolución
l La resolución depende del ancho de banda
1nm 2nm
La Farmacopea Europea 
exige un cociente superior 
a 1.5 entre el pico a 269 
nm y el valle a 266 nm 
para una solución de 
tolueno en hexano. El 
cociente es 2.23 en el 
diagrama mostrado
Parámetro que exigen 
las Farmacopeas
Ancho de banda nominal: 1.5 nmAncho de banda 
nominal 0.5 nm
Espectros de vapor de benceno
Resolución
Efecto del ancho de ranura Luz espuria
l Es luz parásita de longitud de onda diferente a la de 
interés 
l Fuentes de luz espuria o parásita:
l Luz de órdenes superiores de la red de difracción
l Dispersión de luz por partículas de polvo o manchas en 
superficies ópticas
l Reflexión de luz por paredes del monocromador, lentes y 
montaje de componentes ópticos
l ¿Cómo afecta a las mediciones?
La transmitancia medida TM será mayor que la 
transmitancia teórica T
S
S
M PP
PPT
+
+
=
0
1
P1
PSPS
P0
Luz espuria
1089,0
01,1
11,0
01,01
01,01,0
0
1 ==
+
+
=
+
+
=
S
S
M PP
PPT
P1
PSPS
P0
Cuanto menor la transmitancia T , mayor el efecto
Ejemplo: equipo con luz espuria 1% a T=10%
963,01089,0log =-=MA
Luz espuria
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1
2
3
4
5
1 2 3 4 5
Absorbancia teórica
A
bs
or
ba
nc
ia
 m
ed
id
a
S = 0,1%
S = 0,01%
S = 0,001%
S = 0,0001%
S = 1%
Luz espuria
Ejemplo:
Para un espectrofotómetro con nivel 
de luz espuria del 0,05%
S=0.05%
Abs TEÓRICA Abs MEDIDA ERROR
1.0000 0.9980 0.19%
2.0000 1.9790 1.05%
3.0000 2.8241 5.86%
4.0000 3.2221 19.45%
Luz espuria
Luz espuria
l Cómo disminuir la luz espuria:
l Usando filtros de corte de órdenes superiores
l Usando doble monocromador
l Pintando las paredes y montajes del 
monocromador de negro mate
l Usando monocromadores herméticos (evita la 
corrosión de superficies ópticas y el ingreso de 
polvo atmosférico)
Selección de longitudes de onda
l Filtros 
l De Absorción
l De Interferencia
l Monocromadores
l Prismas
l Redes de difracción
l Utilización de fuentes LED
Filtros de absorción
vidrio
film metálico
capa dieléctrica
film metálico
vidrio
Filtros de interferencia
l Usan la interferencia óptica para obtener radiación 
de bajo ancho de banda.
l Consisten de un aislador dieléctrico (MgF2 o CaF2) 
entre dos películas metálicas semitransparentes.
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Filtros de interferencia
l Si bien tienen menor ancho de banda efectivo que los filtros 
de absorción y son útiles en un rango espectral más amplio, 
no permiten la libre selección de la longitud de onda ni la 
adquisición de espectros
Monocromadores
l Para mediciones fotométricas exactas, la luz 
incidente debe ser monocromática (el ancho 
espectral tan pequeño como sea posible) y la 
longitud de onda tiene que ser aquella de 
máxima absorción del analito.
l Para obtener un espectro de absorción, se 
mide la transmitancia o absorbancia en 
función de la longitud de onda.
Monocromadores
l Los monocromadores contienen diversos 
elementos ópticos:
l Ranuras de entrada y salida
l Elementos de reflexión y enfoque
l Lentes y/o espejos colimadores
l Elemento dispersor
l Prisma
l Red de difracción
Refracción a través del Prisma
• El índice de refracción (η) varía con la longitud de onda
Refracción a través del Prisma
• El comportamiento del prisma no es lineal, se 
encuentran más comprimidas las longitudes de 
onda altas
Red de difracción
l La mayoría de los monocromadores actuales 
usa una red de difracción reflectante.
l La red consiste en una superficie óptica 
plana pulida sobre la que se graban líneas 
paralelas igualmente espaciadas.
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Red de difracción
El problema es que en un mismo ángulo coexisten distintas 
longitudes de onda (distintos órdenes de la red):
600 nm (n=1) = 300 nm (n=2) = … = nλ = cte.
n=0
n=1
n=2
slit
Resolución en monocromadores 
basados en redes de difracción
l La resolución depende de:
l La densidad de líneas (N, mm-1)
l El diámetro de la ranura de entrada y salida.
l R se incrementa al:
l incrementar N, pero a expensas del rango espectral 
y la intensidad de luz
l Al disminuir el ancho de las ranuras, pero a 
expensas de la intensidad de luz
Red de difracción
En monocromadores convencionales (UV de mesada) se utiliza n=1. 
Los órdenes superiores se eliminan mediante filtros de corte.
Rueda de filtros
Montaje Czerny-Turner
Ranuras (slits)
l La ranura de entrada de un monocromadores la fuente de la energía radiante. 
l La imagen de la ranura de entrada se enfoca 
en el elemento dispersor y luego en el plano 
focal de salida.
l La ranura de salida puede ser ajustada de 
modo de limitar el rango de longitudes de 
onda que pasa a través de la misma.
l Al costo de reducir la potencia de la luz de salida
Ancho de ranura
l Algunos monocromadores tienen ranuras 
variables.
l Al disminuir el ancho de ranura aumenta la 
resolución.
l Pero al mismo tiempo la potencia radiante 
disminuye en una relación cuadrática, 
aumentando la relación S/R. 
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Cómo seleccionar el ancho de banda instrumental
l0
l
A MUY ANCHO:desviaciones a la ley de Beer
MUY ANGOSTO:
Poca luz, disminuye S/R
Optimo: 
ancho instrumental = 1/10 del ancho de media banda
Resolución Detectores fotosensibles
l Deben tener
lRespuesta lineal
lSensibilidad suficiente en el rango 
espectral de interés 
Cuando un fotón alcanza el cátodo fotosensible, se 
libera un electrón que es acelerado hacia el ánodo. 
Se mide la corriente.
Efecto fotoeléctrico
Los electrones liberados en el fotocátodo son acelerados hacia 
los dínodos, arrancando más electrones. Cada dínodo está a un 
potencial más positivo que el anterior, produciéndose un efecto 
de multiplicación de electrones y aumentando la sensibilidad.
Tubo Fotomultiplicador (PMT)
Tubo Fotomultiplicador (PMT) Tubo Fotomultiplicador (PMT)
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a) Sin tensión aplicada
b) Con polarización directa entre los 
electrodos
c) Con polarización inversa (negativa)
d) Generación de corriente resultante del 
impacto de un fotón en el área de despoblación
Longitud de onda (nm)
Fo
to
se
ns
ib
ilid
ad
 (A
/W
)
Longitud de onda (nm)
Fo
to
se
ns
ib
ilid
ad
 (A
/W
)
87
Instrumentos de doble haz Instrumentos de doble haz
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Instrumentos de doble haz
DAD
Ranura
Red PC
D2
W-I
Muestra
Dispositivo de fotodiodos
92
Comparación de espectrofotómetros
Convencional Array de diodos
Comparación de espectrofotómetros
RCOMPARTIMENTO DE MUESTRAS
RDEGRADACION DE MUESTRAS
RMEDICION SIMULTANEA A VARIAS l
RVELOCIDAD (adquisición de espectros)
RDERIVA
RLUZ ESPURIA
RRESOLUCION
REXACTITUD FOTOMETRICA
RREPETIBILIDAD ESPECTRAL
REXACTITUD ESPECTRAL
DADCONVENCIONAL
RCOMPARTIMENTO DE MUESTRAS
RDEGRADACION DE MUESTRAS
RMEDICION SIMULTANEA A VARIAS l
RVELOCIDAD (adquisición de espectros)
RDERIVA
RLUZ ESPURIA
RRESOLUCION
REXACTITUD FOTOMETRICA
RREPETIBILIDAD ESPECTRAL
REXACTITUD ESPECTRAL
DADCONVENCIONAL
Celdas de muestra
l Cuarzo o sílice fundida
l UV – Visible - NIR
l Vidrio grado óptico (350 - 2000 nm)
l Visible - NIR
l Plástico
l Visible
Materiales Celdas
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Celdas de muestra Celdas cilíndricas
Microceldas Celdas de flujo
Definiciones
• Cromóforo
• Cualquier grupo de átomos que absorben luz sin 
importar si se produce “color” o no
• Auxocromo
• Grupo que extiende la conjugación de un 
cromóforo compartiendo electrones no enlazantes
X
Chromophore Auxochromecromóforo auxocromo
Definiciones
Efecto hipocrómico
Disminución de la intensidad de absorción
εê
λè Corrimiento batocrómico
Desplazamiento de la absorción hacia mayores long. de onda
çλ Corrimiento hipsocrómico
Desplazamiento de la absorción hacia menores long. de onda
εé Efecto hipercrómico
Incremento de la intensidad de absorción
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Electrónicas Transiciones en 
moléculas Orgánicas Orbirales s y s* 
104
Orbitales p y p* Transiciones electrónicas:p ® p*
La transiciones p ® p* involucran 
orbitales que tienen un solapamiento 
significativo, y la probabilidad es cercana 
a 1.0 ya que son de “simetría permitida”.
Transiciones p ® p* 
Unión triple
Compuestos orgánicos con grupos -C≡C- o -C≡N, o metales 
de transición complejados con ligandos C≡N- o C=O, 
usualmente tienen orbitales p* de baja energía.
Transiciones electrónicas:
n ® p*
Los orbitales n no solapan bien con el 
orbital p*, con lo cual la probabilidad de 
excitación es baja. El e de una transición 
n®p* es unas 103 veces más pequeño 
que los e de una transición p®p* ya que 
son de “simetría prohibida”. 
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Absorción de cromóforos
Cromóforo Ejemplo Excitación lmax, nm e Solvente
C=C Etheno p __> p* 171 15,000 Hexano
CºC 1-Hexino p __> p* 180 10,000 Hexano
C=O Etanal
n __> p*
p __> p*
290
180
15
10,000
Hexano
Hexano
N=O Nitrometano
n __> p*
p __> p*
275
200
17
5,000
etanol
Etanol
C-X X=Br
X=I
Metilbromuro
Metil Ioduro
n __> s*
n __> s*
205
255
200
360
Hexano
Hexano
Cromóforos Orgánicos
Cromófero Transición ` log(e)
Nitrile (-C≡N) h to p* 160 <1.0
Alkyne (-C≡C-) p to p* 170 3.0
Alkene (-C=C-) p to p* 175 3.0
Alcohol (ROH) h to s* 180 2.5
Ether (ROR) h to s* 180 3.5
Ketone (-C(R)=O)
p to p* 180 3.0
h to p* 280 1.5
Aldehyde (–C(H)=O)
p to p* 190 2.0
h to p* 290 1.0
Amine (-NR2) h to s* 190 3.5
Acid (-COOH) h to p* 205 1.5
Ester (-COOR) h to p* 205 1.5
Amide (-C(=O)NH2) h to p* 210 1.5
Thiol (-SH) h to s* 210 3.0
Nitro (-NO2) h to p* 271 <1.0
Azo (-N=N-) h to p* 340 <1.0
Clasificación de bandas
lmax, nm e, M-1 cm-1 log10e Asignación
244 12,600 4.1 p ® p* K
280 1,600 3.2 p ® p* B
317 60 1.8 n ® p* R
B (por benzoico)
E (por etilénico)
R (por tipo radical)
K (por conjugación – del término alemán “konjugierte”)
C
O
CH3
acetophenone
Transiciones en alquenos
p ® p*
Transiciones en dienos
p ® p* Espectro UV-Vis del isopreno
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Espectros UV-Vis de dienos Transiciones p ® p* de polienos
La conjugación baja la energía de 
transición p ® p*
CH2=CH2 165 nm CH2=CH-CH=CH2 217 nm
p*
p
Harwood and Claridge, p. 15
Dienos conjugados
Alqueno lmax (nm) e log10(e)
CH2=CH2 165 10,000 4.0
CH3CH2CH=CH-CH2CH3
(trans)
184 10,000 4.0
CH2=CH-CH=CH2 217 20,000 4.3
CH3-CH=CH-CH=CH2
(trans)
224 23,000 4.4
CH2=CH-CH=CH-CH=CH2
(trans)
263 53,000 4.7
CH3(-CH=CH-)5CH3 (trans) 341 126,000 5.1
Field, Sternhell & Kalman, p. 10
Espectro de polienos y 
compuestos poliaromáticos Colorantes Orgánicos
lmax = 602 nm
lmax = 495 nm
lmax = 478 nm
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Bandas UV-Vis de compuestos 
carbonílicos comunes
Compuesto Estructura lmax (nm) e log10(e)
Acetaldehído 293 12 1.1
Acetona 279 15 1.2
Butenal 207
328
12,000
20
4.1
1.3
4-metilpent-3-
en-4-ona
238
312
12,000
40
4.1
1.6
Ciclohex-2-en-
1-ona
225 7,950 3.9
Benzoquinona 247
292, 363
12,600
1000, 250
4.1
3.0, 2.4
C
CH3
OH3C
C
CH3
OC
C
CH3
H3C
H
O
OO
C
H
OH3C
C
CH3
OC
H2C
H 220.0 240.0 260.0 280.0 300.0
Longitud de onda (nm)
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
Ab
so
rb
an
ci
a Etinilestradiol (26 mg/L)Gestodeno (5.4 mg/L)
Levonorgestrel (7.2 mg/L)
HO
CH3
OH
C CH
ETINILESTRADIOL (ETE)
CH2
OH
C CH
CH3
O
LEVONORGESTREL (LEV)
CH2
OH
C CH
CH3
O
GESTODENO (GTD)
-Los espectros presentan máximos de absorción anchos y poca estructura
fina.
-Excepción: iones de la serie de los lantánidos y actínidos. Los e- (4f
y 5f) responsables de la absorción están apantallados de influencias
externas por e- situados en orbitales de nºcuánticos elevados.
Consecuencia: bandas de absorción estrechas y están relativamente poco
afectadas por la naturaleza de las especies asociadas a ese ión y por el
disolvente.
- Iones y complejos de las 2 primeras series de transición: son
coloreados al menos en alguno de sus estados de oxidación. La
absorción de radiación visible se debe a transiciones de e- entre
suborbitales d completos y vacíos que difieren en energía a causa de los
ligandos unidos a los iones metálicos. La diferencia de energía entre
orbitales d depende del estado de oxidación del elemento, su posición
en la Tabla periódica y la clase de ligando unido a ese ión.
Absorción por compuestos inorgánicos Metales de transición
l Los iones de Cu(II) no complejados aparecen blancos o incoloros 
porque la transición entre el orbital ocupado más alto y el desocupado 
más bajo es de alta energía, y la longitud de onda muy baja para ser 
observada. 
Ión en campo ligando esférico Ión en campo ligando octahédrico
Desdoblamiento de energía de orbitales d en Cu(H2O)62+
• En los iones de Cu(II) hidratado los niveles energéticos de los orbitales 
3d se desdoblan, siendo posibles las transiciones por absorción de luz 
visible. El Cu(II) hidratado aparece azul porque la absorción ocurre en 
el extremo rojo del espectro.
Metales de transición
• El grado de desdoblamiento depende del ligando: 
• si reemplazamos el agua por amoníaco aumenta el ∆E y 
el color del complejo se hace azul-violeta dado que la 
absorción ocurre en la mitad del espectro visible. 
• Notar que también hay un efecto hipercrómico 
(aumenta ε). 
Espectro UV-VIS de Cu(H2O)62+
Espectro de Cu(NH3)4 (H2O)22+
Efecto de los ligandos sobre los máximos de 
absorción asociados a transiciones d->d
Orden creciente de aumento de este desdoblamiento
I- < Br- < Cl- < F- < OH- < C2O42- = H2O <SCN- < NH3 < etilendiamina < o-fenantrolina < NO2- < CN-
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- Complejo de transferencia de carga: consta de un grupo
dador de e- unido a un aceptor de e-.
- Cuando uno de estos compuestos absorbe radiación, se transfiere
un e- del dador a un orbital localizado preferente en el aceptor.
- El estado excitado es un producto de un proceso de oxidación
/reducción.
- Complejos inorgánicos y orgánicos.
-Se caracteriza por tener absortividades molares mayores de las
habituales (eMax > 1000), circunstancia que conduce a una gran
sensibilidad.
Absorción por transferencia de carga Absorción por transferencia de carga
• Absorción más importante en 
muchos complejos inorgánicos
• Transferencia de un electrón 
desde el orbital dador hasta el 
aceptor
Solventes
l Alta pureza 
l Deben disolver completamente la muestra
l Compatibles con los materiales de las celdas
l Transparentes en la región espectral de 
interés
l No deben ser usados cerca o por debajo de 
la longitud de onda de corte (l a la cual la 
absorbancia del solvente se aproxima a 1)
Elección del Solvente
l Transparente en la zona de absorción 
l Longitud de onda de corte (cut-off)
l Toxicidad
Efecto del solvente
Espectro UV de 4-metil-3-penten-2-ona 
(óxido de mesitilo) en hexano y en etanol
en HEXANO en ETANOL z 
• En la mayoría de las 
transiciones π→π* los estados 
excitados presentan mayor 
separación de cargas y por lo 
tanto son más polares que sus 
estados fundamentales. 
• Si se usa un solvente polar la 
interacción dipolo–dipolo 
reduce la energía del estado 
excitado más que la del 
fundamental, por lo que la 
absorción en un solvente polar 
como etanol será a mayor λ
(menor E, menor ν) que en un 
solvente no polar como hexano.
Efecto del solvente
Espectro UV de propanona en hexano y en agua
en HEXANO en AGUA 
• El efecto inverso se observa si el 
estado excitado reduce el grado de 
uniones por puente hidrógeno. 
• Aquí las transiciones son n→π* y 
el desplazamiento de λ se debe 
al menor grado en que el 
solvente se puede unir por 
puentes H al estado excitado.
• En particular, los grupos carbonilo 
tienden a interaccionar con el 
solvente por puente H. 
• Al cambiar como solvente de 
hexano a agua el λmáx en el 
espectro de la propanona se 
corre de 280 a 257 nm
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Efecto del solvente
Efecto del solvente en el máximo de 
absorción de propanona
Solvente λmax ε @ λmax
Hexano 280 14.8
Triclorometano 277 17.0
Etanol 271 15.2
Agua 257 17.4
Mediciones típicas con UV-Vis
l Técnicas colorimétricas: técnicas analíticas 
características por lograr especificidad a 
través de reacciones que producen la 
generación o desaparición de color
l Ampliamente utilizadas para la determinación 
de:
l Cationes 
l Aniones
l Algunos compuestos orgánicos: fenoles, 
pesticidas
APLICACIONES
CARACTERÍSTICAS DE LOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
- Amplia aplicabilidad.
- Elevada sensibilidad: los límites detección 10-4 a 10-5 M.
- Selectividad de moderada a alta.
- Buena exactitud: errores de concentración 1-5% o incluso menores.
- Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotométricas.
- Se prestan a una fácil automatización.
CAMPO DE APLICACIÓN
- Especies absorbentes: compuestos orgánicos que contengan grupos
cromóforos y especies inorgánicas como son los metales de transición.
- Especies no absorbentes: los analitos reaccionan con un reactivo
para producir un compuesto absorbente.
APLICACIONES MEDIOAMBIENTALES
ANALIZADORES DE FLUJO CONTINUO NO SEGMENTADO
Ø CON INYECCION : 
üANALISIS POR INYECCION 
EN FLUJO (FIA)
§ Son una consecuencia de los
métodos de flujo segmentado sin las
burbujas de aire.
§ En la figura a se muestra un
sistema FIA para la determinación
colorimétrica de calcio en suero,
leche y agua potable.
§ El buffer y el reactivo se mezclan
en un serpentín antes de la inyección
de la muestra.
§ En la figura b se muestran los
fiagramas para tres muestras por
triplicado y cuatro patrones por
duplicado.
ü FLUJO NO SEGMENTADO
§ Las muestras se inyectan en el flujo. En la detección no se alcanza ni el equilibrio 
físico ni el equilibrio químico. 
§ Se distinguen dos modalidades: 
Ø CON INYECCION : 
a)Análisis por inyección en flujo (FIA ) 
b) Análisis por inyección en flujo segmentado, interrumpido y almacenado 
(SF/USA)
Ø SIN INYECCION: 
Análisis en flujo completamente continuo
Ley de Beer: Desviaciones
l Instrumentales
l Ancho de banda espectral grande
l Efecto de la Exactitud y precisión
l Químicas
l Cambios en equilibrios químicos o físicos
l Degradación de reactivos
l Inespecificidad del reactivo o del medio de 
reacción
l Reales
l Cambios en el índice de refracción de la muestra
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Longitud de Onda
l Exactitud y Reproducibilidad
Interferencias
l Dispersión de la 
Luz
Interferencias
l Espectrales
l En ciertos casos se puede corregir
Interferencias
l La ley de Lambert-Beer relaciona la concentración con el logaritmo de la 
transmitancia interna de la solución:
l toda otra pérdida de potencia es una interferencia.
Interferencias
Factor Causa Información Proceso*
(1) concentración Auto-asociación Constante de equilibrio de asociación nA ↔An (n ≥2)
(2) pH Equilibrio acido/base
Constante de equilibrio de 
protonación A+H3O
+ ↔AH++H2O
(3) tiempo Reacción química (incluyendo solvólisis) Velocidad de reacción A → B
(4) potencia 
(radiante) Reacción fotoquímica Velocidad de reacción
hν
A → B
Fotocromismo Constante de equilibrio y velocidad de reacción
hν
A ↔ B
(5) presencia del 
componente B Formación de complejos Constante de equilibrio A + B ↔AB
(6) temperatura Termocromismo Constante de equilibrio A ↔B
(7) solvente Interacciones soluto-solvente Tipo de transición
*A y B especies absorbentes
Métodos analíticos
l Análisis cualitativo
l comparaciónespectral
l Análisis cuantitativo: 
l Técnicas de medición (definición de respuesta analítica)
l Corrección de fondo espectral
l Espectroscopia de absorción de diferencias
l Espectroscopia de doble longitud de onda
l Espectroscopia de derivadas
l Ajuste (matching) de absorbancia
l Técnicas de cuantificación (correlación respuesta analítica y 
concentración)
l Calibración externa
l Agregado patrón
l Análisis de mezclas multi-componentes
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Métodos Cuantitativos
l Disminuye la relación S/N.
l Permite determinar el pico de absorción aunque exista 
superposición de bandas.
l Destaca bandas de absorción débiles parcialmente ocultas 
en bandas anchas
l Destaca bandas agudas en fondos espectrales anchos
CbA ××= ll e l
e
l
l
d
dCb
d
dA
××=
• Técnicas de medición
• Espectroscopia de derivadas
– Estrictamente se calculan en función del número de onda 
(en función de λ son levemente diferentes)
Métodos Cuantitativos
l Técnicas de medición
l Espectroscopia de derivadas
l Limitaciones
l Bandas de absorción muy parecidas
l d2el/dl2 debe ser grande (bandas de absorción estrechas)
Métodos Cuantitativos
l Soluciones patrón con concentración conocida 
del analito (especie a determinar)
l Matriz similar a la de la muestra
l Intervalo de concentraciones de interés
l Blanco de solvente
l Seleccionar la banda de absorción a la cual se 
realizarán las mediciones de absorbancia
Calibración externa
Métodos Cuantitativos
Calibración externa
CbA ××= ll e
Conc. Abs
0.000 0.000
0.200 0.171
0.400 0.341
0.600 0.512
?)0( +×= CmAl
C
Al
0 0.2 0.4 0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Ax
Cx
Métodos Cuantitativos
l Para sistemas con matriz compleja, difícil de reproducir 
en los patrones
l Debe verificarse la relación lineal entre A y C
l Se añade a la muestra una pequeña cantidad de 
solución de analito, de concentración conocida (patrón)
l Se mide la muestra y la muestra que contiene una 
concentración agregada “a” de analito
Método del Agregado Patrón
Métodos Cuantitativos
Método del Agregado Patrón
C
Al
-2a -a 0 a 2a 3a 
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
Cx
Muestra tipo 
Matriz ideal Muestra tipo
Matriz real
Matriz ideal
Matriz real
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Incertidumbre en las medidas Incertidumbre en las medidas
l La absorbancia de la muestra 
debe estar entre 0.1 y 1
l Mínimo error relativo:
l en detector limitado por ruido 
térmico (fototubo-fotodiodo) 0.43
l en detector limitado por ruido de 
disparo (fotomultiplicador) 0.86
Espectrofotometria con fibras opticas
l Son fibras finas de materiales como el vidrio, silice fundido o
plástico. Su diámetro oscila entre 0,05µm y 0,6cm.
l La trasmisión de la luz se produce por reflexión interna, para
que sea total se recubre la fibra con material de índice de
refracción menor que el de la fibra.
l También existen los sensores de fibra óptica (optrodos). Esto
permite instrumentos para la medida in-situ.
l Se arman arreglos experimentales donde una fuente de
radiación se trasmite través de una fibra óptica, al final se
encuentra un reactivo que va a reaccionar con el analito en
cuestión, esta reacción va a provocar una variación de la
radiación incidente, que se va a recoger a través de otra fibra
óptica hasta el detector.
8.7.- APLICACIONES
VALORACIONES FOTOMÉTRICAS Y ESPECTROFOTOMÉTRICAS
Ø Las medidas espectrofotométricas son útiles para localizar
puntos de equivalencia en valoraciones siempre que uno o más
de los reactivos o productos absorban la radiación.
Ø Curva fotométrica: representación de la absorbancia
(corregida por la variación de volumen) en función del volumen
de valorante.
Accesorio Stopped Flow Mediciones Stopped-Flow
Reducción de Cr(VI) por H2O2 medio ácido
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Mediciones Stopped-Flow
Reacción de ferricianuro con ácido ascórbico
Es un proceso de fotoluminiscencia en
que las moléculas se excitan por
absorción de radiación electromágnética.
La especie excitada posteriormente se
relaja hasta el estado fundamental, con
la liberación de su exceso de energía en
forma de fotones
Fluorescencia molecular
ABSORCIÓN
CI
F
CS
CE
l1 l2 l3 l4
P
S2
S0
E
N
E
R
G
í
A
S1
T1
RV
DIAGRAMA DE ENERGÍA (Jablonski)
solvente
estructura
temperatura
LUMINISCENCIA 
EN SOLUCIÓN
concentración
tipo de transición
apagadores 
químicos
pH
Factores que influyen en la señal 
fluorescente
tipos de transición
estructura
p* p p* n
Compuestos aromáticos, 
estructuras con dobles enlaces 
conjugados, anillos aromáticos 
fusionados. Rigidez. Sustituyentes
bifenilo
C
H2
fluoreno
Factores que influyen en la señal 
fluorescente
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Rigidez estructural
F
Cl
Br
I
FLUORESCENCIA
RELATIVA
100%
7%
0.2%
<0.05%
Efecto de átomo pesado interno
F
l
EXCITACIÓN EMISIÓN
Corrimiento de 
Stokes
Espectro de exitación/emisión 
IF = f IA = 
= f (Io – IT) = 
= f Io (1– IT/Io) = 
= f Io (1 – e-2.303ebC) =
IF = f Io (1 – e-kbC) 
f = No fotones emitidos/No fotones absorbidos
f = IF/IA
Análisis cuantitativo
IF = f Io (1– 1 + kbC) = fIo kbC IF = KC
Recordando que:
x x2 x3
1! 2! 3!
si x es muy pequeño: e-x = 1-x
+- -1e-x =
K
IF = f Io (1 – e-kbC) 
Análisis cuantitativo
F
C
IF = KC
IF vs C (a bajas concentraciones de analito)
Análisis cuantitativo
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monocromador
monocromador
M
fotomultiplicador 
de muestrafotomultiplicador 
de referencia amplificador
dispositivo de lectura
atenuador 
del haz
fuente
Espectrofluorímetro
1) Obtención del espectro de absorbancia para 
determinar la longitud de onda de absorción
F
l
EXCITACIÓN EMISIÓN
2) Fijar el monocromador de excitación a esta l y 
obtener el espectro de emisión
3) Fijar el monocromador de emisión a la l
seleccionada en el punto 2 y obtener el espectro 
de excitación.
Obtención de espectros de excitación 
y emisión
F
C
Término lineal
Lineal+cuadrático
Lineal+cuadrático+cúbico
Si kbC es grande (absorbancia > 0.02)
IF = f Io [kbc – (kbc)
2
2
(kbc)3
6
...-+ ]
IF = f Io (1 – e-kbC) 
Causas de desvío de la linealidad
Producido por el propio analito (alta concentración)
- Variación de potencia de luz incidente en el trayecto
- Autoapatallamiento
- Autoabsorción
Afecta la linealidad de la curva de calibrado y el 
perfil de los espectros de excitación y/o emisión
Producido por otra sustancia
- Sustancia que absorbe en la región de l de 
excitación o emisión del analito
Filtro interno
Excitación
Detección de 
la emisión
Alta concentración: la 
emisión disminuye en el 
trayecto de la luz incidente
Detección de la 
emisión
Baja concentración:
emisión uniforme
Filtro interno
Excitación
ppm
F
100 200 300
F
ppm0 2 4 6 8 10
Linealidad
Término cúbico o 
mayor
Filtro interno
Curva de calibración de sulfato de 
quinina
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375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LONGITUD DE ONDA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
IN
TE
N
SI
D
A
D
 (n
m
)
100 ppb
200 ppb
300 ppb
400 ppb
500 ppb
TONICA
lex = 350, lem = 450 nm
[Quinina] 
(ppb)
Fluorescencia
100 1.19
200 2.38
300 3.49
400 4.53
500 5.93
tónica 3.77
0 100 200 300 400 500 600
CONCENTRACION (ppb)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.57.0
FL
U
O
RE
SC
EN
CI
A
Ajuste linear, y=b*x + a
Y = 0.01163 * X + 0.0150002
Coeficiente de la determinación r^2 = 0.9977