Es probablemente el poder de la religión y del catolicismo lo que marca decisivamente este período histórico del Imperio. La convivencia pacífica de las tres culturas desaparece y ya en 1480 se crea el Tribunal del Santo Oficio de la Inquisición para investigar la sinceridad de las conversiones al cristianismo de algunos judíos y musulmanes que vivían en la península Ibérica. Con el fin de la Reconquista, la unidad del país buscada por los Reyes Católicos tenía un fuerte componente religioso. Por ello, se expulsó en 1492 a los judíos y en 1502 a los musulmanes que no hubieran querido convertirse al cristianismo. La tragedia humana de estas expulsiones tuvo profundos efectos económicos e intelectuales sobre el país, pero también dejó su marca en la constante sospecha sobre la sinceridad de las conversiones y en la obsesión por la “limpieza de sangre”. En ese ambiente de intolerancia religiosa, la propuesta de reforma de la iglesia planteada por Lutero en 1519 se entendió también como una herejía y como un ataque a la institución religiosa que los monjes españoles defendieron en el Concilio de Trento del que había de salir la Contrarreforma. Dado que el poder del rey estaba muy vinculado a la iglesia católica, de este enfrentamiento entre reformistas protestantes y contrarreformistas nacieron las justificaciones para muchas de las guerras que libraron los ejércitos españoles en Europa a lo largo del siglo XVI.