Aplica_Cultivos_Celulares_2007

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D o c u m e n t o d e A p l i c a c i ó n 
 
 C U L T I V O S C E L U L A R E S 
 
 
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Índice de materias: CULTIVOS CELULARES 
• Introducción a los cultivos celulares. 
 Conceptos actuales de cultivo celular. 
 Tipos de cultivos de tejidos. 
 Biología de la célula en cultivo. 
• El medio de cultivo. 
 El sustrato de cultivo. 
 La fase gaseosa. 
 Oxígeno. 
 Dióxido de carbono. 
 Propiedades físicas. 
 pH y capacidad tamponadora. 
 Osmolaridad 
 Temperatura 
 Viscosidad 
 Tensión superficial 
 Condiciones fisiológicas. 
• Las contaminaciones. 
 Contaminación bacteriana y por levaduras. 
 Contaminación por micoplasmas. 
 Contaminación por virus. 
• Técnicas de contaje celular. 
• Métodos de disgregación celular. 
 Mecánicos. 
 Químicos. 
 Enzimáticos. 
• El laboratorio de cultivo celular. 
 Cabinas de flujo laminar. 
 Incubadores. 
 Incubador de CO2. 
 Incubadores tipo "roller". 
 Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido. 
 Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido). 
 Equipo de esterilización. 
 Equipo de filtración. 
 Autoclave. 
 Mechero Bunsen 
 Otros instrumentos. 
 Centrífugas. 
 Contador electrónico de células ("cell counter"). 
 Equipo de purificación de agua. 
 Pipeteadores. 
• Productos 
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Introducción a los cultivos celulares. 
Introducción histórica 
El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX como una continuación de las técnicas de la 
embriología. Wilhem Roux mantuvo en el año 1885 células de embrión de pollo en solución salina durante unos días. El zoólogo 
americano R.G. Harrison es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animales, en 1907. 
Harrison fue el primer autor que empleó técnicas in vitro para el estudio de fenómenos in vivo, realizando cultivos de médula 
espinal embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableció que el axón se 
formaba por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusión de una cadena de células. El cultivo se realizaba en una 
gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cámara sellada. 
 
La primera limitación para el establecimiento de cultivos era lograr un medio nutritivo adecuado. Burrows (1910) empleó 
plasma de pollo para nutrir los explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio se reveló mucho mejor que los 
anteriormente probados, lo que le permitió observar el crecimiento del tejido nervioso, corazón y piel. 
Burrows y Carrel realizaron los primeros intentos de establecer cultivos de células de mamífero, y consiguieron mantener 
explantes obtenidos a partir de perros, gatos y conejos de indias, así como en el crecimiento de tumores sólidos. Demostraron 
que la vida del cultivo se puede prolongar mediante subcultivo. Los medios empleados fueron plasma suplementado con 
extractos de embrión. 
 
Roux y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para disociar las células de embriones de 
pollo, estableciendo el primer cultivo celular. Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los 
cultivos celulares es la aparición de múltiples contaminaciones, por lo que desarrollaron numerosos métodos de manipulación 
en condiciones de asepsia que aún hoy día se utilizan. 
 
En 1913 Carrel demostró la posibilidad de mantener en cultivo células extraídas de un animal, embrión de pollo, durante un 
periodo de tiempo superior al de la vida de éste. Mantuvo en cultivo células de pollo durante 34 años (Sharp, 1977). Gran parte 
del éxito en el mantenimiento de los cultivos se debió al desarrollo del denominado frasco de Carrel. 
 
Entre los años 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtención de cultivos y de mantenimiento de las 
condiciones estériles, pero sin grandes avances. A partir de los años 40, con el aislamiento de los primeros antibióticos, se 
desarrollaron numerosas aplicaciones de entre las que podemos destacar : 
• 1948 Earle y col. (Sanford, Earle y Likely, 1948) aislaron células de la línea celular L y mostraron que eran capaces de formar 
clones en el cultivo de tejidos. Demostraron que para que una célula llegue a dividirse necesita ser alimentada con los 
nutrientes correctos. 
• 1952. Gry y col. (Grey, Coffman y Kubicek, 1952) establecen la primera línea celular continua, las actualmente bien conocidas 
células HeLa. El medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo, extracto de embrión bovino y 
suero de cordón umbilical humano. 
• 1954 Rita Levi-montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones en 
tejidos en cultivo (Levi-Montalcini y Calissano, 1979). Este trabajo supuso el Premio Nóbel para Levi-Montalcini en 1986. 
• 1955 Eagle (Eagle, 1955) realiza la primera investigación sistemática de los requerimientos nutritivos de las células en cultivo. 
Describe que las necesidades del cultivo de soluciones corporales complejas (sueros,... ) pueden ser satisfechas por tan poco 
como el 1% de suero de caballo dializado en un medio definido de pequeñas moléculas (aminoácidos, azúcares, ...) 
• 1961 Hayflick y Moorhead usaron por primera vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de fibroblastos. 
Pudieron mantener estos cultivos durante unos 12 pases, pero no consiguieron establecer líneas estables. 
• 1965 Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener algunas células de mamífero en cultivo 
indefinidamente (Ham, 1965). 
• 1969 Augusti-Tocco y Sato establecen la primera línea celular estable de neuroblastoma aislando clones que establecían 
procesos nerviosos y que eran eléctricamente excitables (Augusti-Tocco y Sato, 1969). Se empiezan a establecer las primeras 
líneas celulares diferenciadas. 
1974 Albert Claude, George Palade y Christian de Duve recibían el Premio Nobel de Medicina por haber hecho posible la mirada 
cercana a ese mundo en miniatura que es la célula con sus estructuras subcelulares y organelos con las primeras fotos de una 
célula intacta obtenidas mediante un microscopio electrónico. 
• 1975 Kohler y Milstein establecen la primera línea celular hibrida productora de anticuerpos monoclonales (Koehler y Milstein, 
1975). El establecimiento de la tecnología de obtención de anticuerpos monoclonales les valió el Premio Nóbel. 
• 1976 Sato y col. publicaron sus trabajos en los que demuestran que las diferentes líneas celulares requieren mezclas distintas 
de hormonas y factores de crecimiento para crecer en medios libres de suero. (Sato y col., 1982). 
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Desde que Cultek se inició como empresa en 1976, los cultivos celulares han conocido una revolución tecnológica que pasa por 
la incorporación de las técnicas de ingenieria genética, el desarrollo de reactores para cultivos masivos, producción de vacunas 
virales, el cultivo en microcarriers, el desarrollo de nuevas superficies de cultivo en monocapa de alta adherencia, sustitutos de 
suero, robotización de las manipulaciones de cultivo, etc. 
En la actualidad, entre las areas de aplicación en las que el cultivo celular in vitro es una herramienta basica cabe destacar: 
- El Cancer que se puede considerar como una enfermedad del ciclo celular. Los defectos en el control del ciclo pueden 
conducir a una proliferación celular anormal o a alteraciones cromosómicas como las que se observan en las células cancerosas. 
Se están estudiando las relaciones entre la regulación del ciclo celular y el cáncer, así como el papel específico de dos tipos de 
genes, los oncogenes y los genes supresores de tumores, presentesen las células normales, y cuyas alteraciones pueden 
conducir precisamente a la aparición del cáncer. 
- La reproducción y diferenciación celular. Sus aplicaciones se refieren, de una parte, a la llamada “reproducción asistida” y al 
controvertido tema de la clonación y, de otra, a la Medicina Regenerativa en la que, a partir de celulas madre o troncales, se 
forman o reconstruyen tejidos que sustituyen a otros dañados por diversos procesos patológicos. 
- La medicina regenerativa, que pretende conseguir la regeneración, total o parcial, de los tejidos que han perdido masa 
celular, utilizando técnicas de trasplante celular para implantar células troncales o células madre. 
 
Conceptos actuales de cultivo celular. 
Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células 'in vitro', 
manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Dependiendo del grado de preservación de la 
estructura del tejido o del órgano de origen y de su duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos: de órganos, explantes, 
primarios o secundarios,... 
Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenómeno 
celular. 
• Actividad intracelular. Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como por ej. transcripción de DNA, 
síntesis de proteínas, metabolismo energético... 
• Flujo intracelular. Movimientos intracelulares de sustancias y señales asociadas a los diferentes procesos fisiológicos, como 
por ej. ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA: núcleo-citoplasma, 
movimiento de proteínas,... 
• Ecología celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su 
diferenciación..., como por ej. estudio de las necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la transformación celular 
(inducidas por virus o agentes químicos), cinética de la población celular,... 
• Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto o por adhesión, 
interacciones célula-célula. 
 
Como ejemplo de áreas de investigación fuertemente dependientes de las técnicas de cultivo celular son: 
• Virología: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas antivirales,... 
• Investigación del Cáncer 
• Inmunología. Gracias especialmente a la introducción de las técnicas de fusión celular en la producción de anticuerpos 
monoclonales, así como en el análisis de la genética de la célula somática. 
• Ingeniería de proteínas. Por la producción de proteínas en líneas celulares: interferón, insulina, hormona de crecimiento,... 
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• Estudios de interacción y señalización celular, en la diferenciación y en el desarrollo. Comprende el estudio de los receptores y 
de las vías de translocación de la señal. 
• Aplicaciones diagnósticas. Por ejemplo en medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células crecidas a 
partir de muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad,... 
• Aplicaciones médicas: mantenimiento y producción de tejidos para transplante. 
• Aplicaciones industriales y agronómicas: producción por reproducción "in vitro" de clones de plantas de interés comercial,... 
Los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables, pero al mismo tiempo tienen unas desventajas que hay que 
tener en consideración. Como ventajas podemos citar: 
• Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio: físico-
químicos (pH, temperatura, presión osmótica, niveles de O2, CO2, tensión superficial...), y fisiológicos (hormonas, factores de 
crecimiento, densidad celular,...). Esto es cierto completamente sólo para algunas líneas celulares para las que se han 
definido los denominados medios definidos. Un medio definido es aquel en el que se conocen todos y cada uno de los 
componentes que lo forman, y la concentración exacta en que se encuentran. Establecer un medio definido supone conocer 
con precisión las necesidades nutritivas de las células en cuestión. Sin embargo en muchas líneas no se han llegado a 
establecer medios definidos. En estos casos se trata de medios que se suplementan con soluciones complejas (suero, 
extractos de embrión, etc...) en los que se encuentran factores hormonales y nutritivos imprescindibles para el 
mantenimiento del cultivo pero cuya naturaleza se desconoce. Estas soluciones complejas están sujetas a variación de lote a 
lote. 
• Caracterización y homogeneidad de la muestra. Las células en cultivo de una línea celular (cultivo primario propagado), o de 
una línea continua son homogéneas, con morfología y composición uniformes. Se pueden obtener con facilidad un número 
elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado 
al uso de animales de experimentación. 
• Economía. Suponen una economía en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al realizarse en volúmenes reducidos, y 
con un acceso directo de las células a la droga las concentraciones requeridas son mucho más bajas que en animal completo. 
Es diferente el coste de investigación de un nuevo fármaco para la empresa farmacéutica que está desarrollando moléculas si 
ha de sintetizar de cada una de las que ha de probar en cantidades del orden del gramo (para el estudio en animales) a que 
baste con pocos miligramos. 
• Motivaciones éticas. La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles de animales de 
experimentación. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo' pero es una alternativa válida en muchas 
situaciones. Incluso un cultivo celular primario permite realizar experimentos que suponen el sacrificio de uno o pocos 
animales, pero con ellos se pueden ensayar un número de condiciones experimentales que pueden suponer si el estudio se 
hace con animales de experimentación el sacrificio de decenas o cientos. 
En cuanto a las desventajas del cultivo celular: 
• Técnica sensible. El crecimiento de las células animales es mucho más lento que el de los contaminantes más habituales 
(hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas,...) y además dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de 
crecer en ausencia de una compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto supone la 
necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental 
requerido como del personal cualificado para su manipulación. 
• Cantidad y costo. El costo de producción de 1 gr de tejido en cultivo es más de 10 veces superior al obtenido en el animal. 
Asimismo existe una limitación de producción, que es del orden de 10 gr de células en un laboratorio normal, y que para ser 
superior a 100 gr requiere instalaciones de tipo industrial. 
• Inestabilidad. Muchas de las líneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la dotación cromosómica 
aneuploide. La población celular puede variar su composición si alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer con 
una tasa ligeramente superior, es decir podemos encontrar diferencias significativas en la línea celular de una generación a la 
siguiente. La única manera de evitarlo es emplear líneas estables que se resiembran a partir de un stock congelado cada 
determinado tiempo, o después de un determinado número de generaciones. 
• Validez del modelo “in vitro”. Cuando nos referimos a un cultivo celular nos estamos refiriendo exactamente a un disgregado 
celular de un tejido de origen y que se diferencia de éste en que: 
 se ha perdido la organización espacial tridimensional propia del tejido. 
 se han perdido lasinteracciones heterotípicas, entre los distintos tipos celulares, y entre las células y la matriz extracelular. 
Es de destacar que los avances más excitantes en la función celular proceden del reconocimiento de la importancia de las 
interacciones específicas de las células con otras células o con el sustrato. 
 carece de los componentes sistémicos de regulación, implicados en la regulación de la homeostasis 'in vivo', especialmente 
los sistemas nervioso y endocrino. 
Cuando se establece el cultivo, las células se desdiferencian, y entre otras cosas se hacen móviles e inician su proliferación. 
Esta desdiferenciación puede, en algunos casos ser revertida por procedimientos de diferenciación inducida por hormonas, 
confluencia, inductores químicos (ésteres de forbol,...) pero no está claro si el estado rediferenciado es equivalente al estado de 
diferenciación 'in vivo'. 
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Por todo lo anterior hemos de ser precavidos en cuanto a la validez de los resultados obtenidos “in vitro” respecto a lo que 
pueda observarse “in vivo”. Sin embargo actualmente se están realizando gran cantidad de estudios de validación de modelos 
“in vitro” dentro del desarrollo de los métodos alternativos a la experimentación animal, por ejemplo por ECVAM (European 
Center for Validation of Alternative Methods), ALTWEB (Colección de recursos para el desarrollo de métodos alternativos a la 
experimentación animal en web de la Universidad John Hopkins, USA), Invittox (Colección de protocolos “in vitro”), Invitroderm 
(Alternativas a los ensayos de irritación dérmica en animales), etc. 
Tipos de cultivos de tejidos. 
Se podría hablar de tres tipos de cultivos: 
• Cultivo de órganos. Implica que la arquitectura característica del tejido “in vivo” se mantiene al menos en parte. Para ello 
el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene 
su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es 
por ello una buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento, de 
producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. La imposibilidad de 
propagar obliga a partir en cada nuevo experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada heterogeneidad. 
• Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las células 
de la periferia del explante. 
• Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. La suspensión celular se 
puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su 
propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como característica 
negativa se pierde la heterogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en el 
cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento. 
 
En la actualidad los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la posibilidad de propagación, así como 
por las ventajas en la cuantificación, caracterización y repetitibilidad de las muestras. A fin de compensar la ausencia de 
interacciones heterotípicas se realizan desde hace unos años cultivos mixtos con importantes éxitos. 
Biología de la célula en cultivo. 
En el proceso de establecimiento de un cultivo celular se seleccionan las células que crecerán según numerosos criterios. Así 
solo formarán el cultivo aquellas células que sean por una parte capaces de superar el proceso de disgregación, y por otra 
capaces de adherirse al sustrato y proliferar en forma de monocapa o en suspensión. 
El crecimiento en monocapa significa que las células se adherirán al sustrato y en esa forma inician la proliferación. Muchas 
líneas celulares son anclaje dependientes, es decir no inician la proliferación hasta que se han adherido al sustrato. Este es el 
modo normal de proliferación de la mayor parte de las células, con excepción de las células hematopoyéticas maduras. El 
crecimiento en suspensión es propio de aquellas células capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato, 
independientes de anclaje, y es propio de las células hematopoyéticas, algunas líneas celulares transformadas y de células 
procedentes de tumores. Es de destacar que en todo tejido existe una fracción o tipo celular que es capaz de crecer en 
suspensión. A pesar de que su origen no está claro se cree que se trata de células cepa ("stem cells") indiferenciadas. 
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http://www.ei.jrc.it/report/ecvam.html
http://altweb.jhsph.edu/
http://embryo.ib.amwaw.edu.pl/invittox/
http://www.invitroderm.com/
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Cuando se mantiene el cultivo se establece una nueva selección: aumentan en número aquellas células que tienen una mayor 
tasa de crecimiento. En el momento en que se alcanza la confluencia las células, en general, detienen su crecimiento, aunque 
pueden existir tipos celulares, neoplásicos, que sigan duplicándose y que desplacen a los otros del cultivo. 
Así pues se ha de entender el cultivo como un ente dinámico en el que las proporciones relativas de los diferentes elementos 
que lo forman varían en el tiempo en función de la presión selectiva a la que estén sometidos. 
Una vez se alcanza la confluencia en el cultivo es cuando muchas líneas celulares expresan sus aspectos más característicos. Es 
en este estado cuando el parecido morfológico y fisiológico es mayor al modelo celular de origen. Es también el momento en el 
que se detiene el crecimiento y se hace necesario dividir, replaquear o propagar las células. 
Es una observación generalizada que después del tercer replaqueo el cultivo se estabiliza y homogeneiza: el tipo celular de 
mayor tasa de crecimiento ha ocupado completamente el cultivo desplazando a los otros tipos celulares. En general, si no se 
establecen condiciones selectivas las células del tejido conjuntivo, especialmente fibroblastos, serán las seleccionadas 
finalmente. Para evitar que las células más especializadas del cultivo se vean desplazadas de éste por los fibroblastos y otras 
células de rápido crecimiento se han establecido protocolos detallados de medios selectivos. 
 
Evolución de una línea celular hipotética. Comportamiento a lo largo de las semanas. 
En el momento en que las células comienzan a dividirse en la placa su número se incrementa, hasta ocupar todo el espacio. En 
ese momento es necesario tomar algunas y resembrar en una nueva placa. En el caso de células en cultivo primario el factor de 
dilución de un pase al siguiente suele ser de 1/2 a 1/5 pero no superior. En el caso de líneas celulares establecidas la dilución 
puede ser tan elevada como 1/100 o 1/1000, siendo la habitual 1/10. El caso más extremo serían los procesos de clonaje en los 
que se siembran en pocillos (multiwell de 96 pocillos) 1 única célula. 
El crecimiento de las células en cultivo primario prosigue a lo largo de una serie de generaciones o pases característicos de cada 
tipo celular y condiciones de cultivo. Así los hepatocitos de adultos no se establecen más que como cultivo primario mientras 
que las células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9 pases, y los fibroblastos 
dérmicos humanos pueden superar los 20 pases. Sin embargo al final todas ellas entran en una fase de senescencia, con 
acumulación de numerosas anormalidades, perdida de funciones especializadas, etc... 
que conducen a la muerte del cultivo. 
Sólo ocasionalmente un cultivo primario se mantiene durante más generaciones de las 
esperadas. Es debido a la aparición en el cultivo de células inmortales. Estas células 
forman líneas estables o cultivos celularespermanentes. La razón de la inmortalización 
de estas células es en la mayor parte de los casos desconocida pero se incrementa la 
frecuencia de inmortalización mediante infecciones virales, tratamientos con mutágenos, 
etc... por lo que deben estar relacionadas con la pérdida, espontánea o inducida por el 
tratamiento, de las vías de control celular. Se hipotetiza que la capacidad de un cultivo 
celular primario para establecerse como línea estable está relacionado directamente con 
su variabilidad genética. Así líneas celulares que nunca se establecen como estables se 
mantienen euploides como es el caso de fibroblastos humanos (Hayflick y Moorhead, 
1961), fibroblastos de pollo (Hay y Strehler, 1967), y la glia humana (Pontén y 
Westermarck, 1980) mientras que otras líneas frecuentemente se convierten en 
aneuploides y se transforman en líneas celulares continuas con mayor frecuencia, como es el caso de las células epidérmicas 
(Green y col., 1979; Thomas J., 1979). 
Comparación del número de cromosomas por 
célula en una línea primaria glial y una línea 
estable de melanoma. 
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Existen diferencias muy importantes entre una línea celular continua y una línea primaria o un cultivo primario. En la tabla 
siguiente se recogen las propiedades diferenciales de las líneas finitas y continuas. 
 Finita Continua 
Ploidía Diploide / Euploide Heteroploide / Aneuploide 
Transformación Normal Transformada 
Tumorogenicidad No-tumorogénica Tumorogénica 
Dependencia de anclaje Si No 
Inhibición por contacto Si No 
Limitación de crecimiento por densidad Si No 
Mantenimiento Cíclico Posible mantenerlas 
quiescentes 
Requerimientos de suero Elevados Bajos 
Eficiencia de clonaje Baja Elevada 
Marcadores Pueden expresar 
marcadores específicos 
Cromosomales, 
enzimáticos... se pierden 
Funciones especializadas Se mantienen Se suelen perder 
Tasa de crecimiento Baja (24 a 96 h tiempo de 
replicación) 
Rápida (12 a 24 h) 
Rendimiento en cultivo Bajo (<106 células/mL; 
<105 células/cm2) 
Alto (>106 células/mL; 
>105 células/cm2) 
 
Algunas definiciones que son importantes son: 
• Cultivo primario. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano. Las células mantienen la viabilidad un periodo de 
tiempo limitado y no se reproducen en cultivo. En general en cultivo presentan una reducción en el número total de células 
vivas a lo largo del tiempo. Ejemplos: hepatocitos obtenidos de hígado adulto, neuronas, etc... 
• Línea primaria. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se mantiene un periodo de tiempo limitado pero con 
reproducción de las células en el cultivo. Ejemplos: fibroblastos dérmicos, queratinocitos, células endoteliales de aorta bovina 
(BAEC), células endoteliales de cordón umbilical (HUVEC), etc... 
• Línea celular continua. Cultivo que se establece a partir de un tejido u órgano, en muchos casos de un tumor, y que se 
mantiene en cultivo un tiempo ilimitado. Se trata de células “inmortales”. 
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El cultivo de las células no presenta las mismas dificultades independientemente del tipo de célula de que se trate. Hay grandes 
diferencias que se relacionan fundamentalmente con el grado de diferenciación del tipo celular. Así pues en general se puede 
establecer como norma que una línea celular será tanto más fácil de establecer o cultivar cuanto más indiferenciada sea, con 
las excepciones de las líneas tumorales de células diferenciadas. 
 
Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las células pierden algunas de sus propiedades 
diferenciadas, entre ellas la característica incapacidad de dividirse, y se convierten en células que mantienen tan solo algunas 
de las propiedades que las caracterizaban. Esta pérdida de propiedades puede ser debida a desdiferenciación o desadaptación. 
La primera implica una pérdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular ( por ejemplo un hepatocito en cultivo 
pierde sus enzimas característicos (arginasa, aminotransferasas,...) no puede almacenar glucógeno ni sintetizar las proteínas 
del suero...), mientras que la segunda implica que la característica especializada perdida no es irreversible sino consecuencia de 
la pérdida de la señal (por ejemplo externa, hormonal, nerviosa, ...) y que basta con recuperarla para que se reexprese (por 
ejemplo Michalopoulos y col. (Michalopoulos y Pitot, 1975; Sattler y col., 1978) han demostrado que los hepatocitos de rata 
pueden reexpresar tirosina aminotransferasa en presencia de ciertas hormonas (insulina e hidrocortisona) cuando crecen sobre 
una matriz de colágeno). 
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El medio de cultivo 
El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones 
orgánicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre soportes o 
recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estará formado por 
cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células, las condiciones físico-químicas y fisiológicas del 
medio, la naturaleza y composición de la fase gaseosa y las condiciones de incubación, especialmente la humedad y la 
temperatura. 
• El sustrato de cultivo. La mayor parte de las líneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte más o 
menos sólido. El crecimiento en suspensión está usualmente restringido a algunas líneas celulares especialmente de células 
hematopoyéticas y tumores ascíticos. Según si la línea celular precise o no unirse al sustrato para proliferar se dice que es 
dependiente (adhesión) o independiente (suspensión) de anclaje: 
 La mayor parte de las células que se mantienen en cultivo proceden de disgregación tisular o de tumores formados por 
células adheridas y mantienen esa característica: necesitan adherirse al sustrato para mantenerse. 
 Los cultivos en suspensión suelen coincidir con los de aquellas células que “in vivo” son circulantes, en general células 
sanguíneas. El gran interés que tiene el cultivo de células sanguíneas (linfocitos) ha extendido notablemente la 
caracterización de los cultivos en suspensión. El cultivo de células en suspensión tiene algunas ventajas: mayor facilidad de 
manipulación y pase de un cultivo al siguiente (replaqueo) pues no requieren separación del sustrato mediante por ej. 
tripsinización, posibilidad de cultivo en mayor escala pues sólo dependen de la accesibilidad del medio y de los gases pero 
no de la superficie del recipiente, etc... y algunas desventajas: son cultivos homogéneos en los que se pierden las 
interacciones (espaciales, de adhesión, etc...). 
Los tipos de sustrato más empleados en la actualidad son los siguientes: 
 Vidrio. Empleado usualmente como sustrato de cultivo tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y 
esterilización. Asimismo es especialmente útil para su posterior observación al microscopio por su calidad óptica. 
 Plástico desechable. Muy empleado en la actualidad como material desechable estéril por irradiación. El plástico más 
empleado es el poliestireno, de buena calidad óptica. Debido a que este plástico es hidrofóbico requiere un tratamiento 
mediante irradiación-gamma, químico, o mediante descargas eléctricas que produzca una superficie hidrofílica. El 
tratamiento es característico de los diferentes suministradores, y por ello los productos varían en calidad de uno a otro. 
Aunque para la mayor parte de los usos rutinarios no es necesario, es recomendable probar muestras de distintos orígenes 
y medir la eficacia de plaqueo y las tasas de crecimiento para maximizarlas especialmente en aquellas líneas celulares de 
crecimiento difícil. Otros plásticos que se emplean son polivinil-cloruro,policarbonato (PVC), politetrafluoretileno (teflón, 
PTFE), thermanox (TPX). 
 Actualmente es de gran interés, especialmente para el cultivo de células epiteliales polarizadas, el uso de membranas 
plásticas porosas. Un ejemplo de este tipo de cámara se representa en la figura. 
 
 
 
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 Microsoportes ("microcarriers"). Se trata de soportes plásticos (poliestireno), de sephadex o poliacrilamida en forma de 
pequeñas bolas ("beads") a las que se unen las células dependientes de anclaje. Estas bolas con las células adheridas se 
mantienen en suspensión. 
 Otros sustratos artificiales. Se han desarrollado técnicas para crecer células de glia en sustratos metálicos, de paladio 
(Westermark, 1978) o en discos de acero (Birnie y Simmons, 1967). 
 Superficies tratadas. La adherencia y crecimiento de las células en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha 
sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido a la presencia de colágeno o fibronectina liberada por las 
células, o bien sobre superficies recubiertas de proteínas de matriz extracelular (fibronectina, colágeno, vitronectina, 
Matrigel, etc...). Así, se pueden tratar los recipientes de cultivo con fibronectina (1 ng/mL) añadido al medio, o con 
colágeno. El tratamiento con colágeno desnaturalizado aumenta la adhesión de muchos tipos celulares, y especialmente de 
las células epiteliales. 
Muchos resultados parecen indicar que el tratamiento de las superficies con compuestos biológicamente activos pueden 
inducir alteraciones específicas de la adhesión o el comportamiento celular. Se han descrito métodos para la reconstitución 
de membranas basales con la finalidad de optimizar las condiciones de diferenciación celular (Reid y Rojkind, 1979). Estos 
resultados refuerzan la noción cada vez más extendida de que las interacciones célula-matriz extracelular son 
determinantes en la regulación de la proliferación y la diferenciación. 
Otros tratamientos que se han usado han sido: gelatina (músculo), poli-D-lisina (algunos teratomas de ratón). 
 "Feeder layers". Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus características 
diferenciadas precisan de suplementos específicos. Una manera de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer 
sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares. Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento 
(normalmente por irradiación X o gamma). Este efecto podría ser debido a dos posibilidades: suplementación del medio, o 
modificación del sustrato. Una de las monocapas más empleadas son los fibroblastos de ratón 3T3 irradiados. 
 Matrices tridimensionales. Son sustratos en los que las células penetran, estableciendo una distribución tridimensional: 
geles de colágeno (Douglas y col., 1980), esponja de celulosa sola (Leighton y col., 1951), o recubierta de colágeno 
(Leighton y col., 1968), o "gelfoam". En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una manera 
análoga a como lo hacen en el tejido de origen: células epiteliales de mama se organizan en disposición tubular, mientras 
que las células del carcinoma de mama lo hacen de una forma mucho más desordenada (Yang y col., 1981). 
 Sustratos no adherentes. Son sustratos que no permiten la adhesión celular, por ejemplo agar, agarosa, o methocel 
(metilcelulosa de alta viscosidad). Son de utilidad en situaciones en las que no conviene que exista dispersión de las células 
derivadas de una originaria, por ejemplo en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus. 
 Interfases líquido-gel o líquido-líquido. Se han observado en algunas situaciones proliferación celular y adhesión a las 
interfases líquido-líquido o líquido-gel, a pesar de que se desconocen exactamente los mecanismos (Rosenberg, 1965). 
 Haces microcapilares permeables (“hollow fiber”). Son cámaras de crecimiento de células formadas por un recipiente 
cilíndrico en el que se siembra, y en el interior del cual hay un haz de capilares plásticos permeables adecuados para que 
las células se adhieran. Los capilares se encuentran conectados a un circuito de recambio del medio. Este dispositivo ofrece 
una gran superficie de crecimiento apta para el crecimiento celular, y un eficaz sistema de recambio del medio. 
 
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Tal como se ha descrito previamente, el material más utilizado como sustrato es el plástico desechable, en forma de 
diferentes tipos de recipientes. Los más comunes son: 
 placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaños: 3,5, 6,0 y 10 cm de diámetro son las más empleadas cuando se 
trata de crecer las células para usar directamente en experimentos. No es recomendable, por su escasa estanqueidad, 
emplearlas para el mantenimiento de líneas. 
 
 multiplacas. Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96 pocillos. 
 
 frascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaños, son recomendables para el mantenimiento 
de las líneas y la producción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión. 
 
 
 
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 "roller bottles". Se trata de tubos, con una cara plana sobre la que se fija el cultivo, y que se incuban en los incubadores 
dotados de "roller". Existen variantes con una gran superficie de adhesión (espirales de plástico...) y que se destinan a la 
producción de gran número de células. 
 
Incubador tipo “roller” “Roller bottles” 
• La fase gaseosa. Los componentes más significativos de la fase gaseosa son el oxígeno y el dióxido de carbono: 
 Oxígeno. Las necesidades de oxígeno para la mayor parte de los cultivos celulares es cubierta con la tensión atmosférica, 
aunque existen cultivos, especialmente los cultivos de órganos que requieren una tensión de oxígeno superior (del 95%) 
posiblemente debido a la geometría del órgano y a las dificultades de difusión del gas en su interior. Se ha propuesto 
(McKeehan y col., 1976) que los requerimientos de selenio en el medio podrían ser debidos a su papel en la detoxificación 
de radicales de oxígeno, especialmente en los medios sin proteínas séricas. 
 Dióxido de carbono. El dióxido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO2 
disuelto, el pH y la cantidad de iones HCO3-. Las reacciones que tienen lugar en el medio son: 
 [1] −+ +⎯⎯←
⎯⎯→⎯
⎯⎯←
⎯⎯→⎯+ 33222 HCOHCOHCOOH
 [2] −+ +⎯⎯←
⎯⎯→⎯
33 HCONaNaHCO
El incremento de la concentración de ión bicarbonato desplaza la ecuación [1] hacia la izquierda, de modo que el pH se 
establezca en 7,4. Se puede emplear asimismo otra base, por ejemplo NaOH, siendo la ecuación: 
 [3] OHHCONaOHNaHCOCOHNaOH 232332 ++⎯⎯←
⎯⎯→⎯+⎯⎯←
⎯⎯→⎯+ −+
De modo que para establecer un pH determinado se debe tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato sódico 
y la tensión de CO2. Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO2 para alcanzar el pH 
correcto. Sin embargo, se emplean otras sustancias tamponadoras en la formulación de muchos medios en la actualidad, lo 
que permite una estabilidad superior del pH en el medio, así como una mayor capacidad tamponadora (los denominados 
Good's buffers: HEPES, Tricina,.. (Good et al., 1966)). Aunque aparentemente podría ser posible prescindir del bicarbonato 
en la formulación del medio, esto se ha revelado falso, debido probablemente a que la ausencia de bicarbonato sódico 
desplazaría la ecuación [1] hacia la derecha, de modo que tendería a desaparecer el CO2 disuelto y eventualmente el ión 
bicarbonato, ambos aparentemente necesarios para el crecimiento celular (Itagaki y Kimura, 1974). 
Una alternativa es la suplementación del medio con piruvato. Esto permite a muchos tipos celulares incrementar su 
producción de CO2 endógeno, haciéndolasindependientes de la aportación de CO2 exógeno. 
En resumen, los cultivos crecidos a baja densidad en un recipiente abierto precisan una atmósfera de CO2, cuya 
concentración esté en equilibrio con el bicarbonato sódico en el medio. A concentraciones celulares muy reducidas (por ej. 
durante el clonaje) es necesario añadir CO2 en la fase gaseosa de los frascos cerrados. Cuando la concentración celular es 
más elevada puede no ser necesario añadir CO2 a frascos cerrados, pero si en frascos abiertos. En los casos en los que la 
densidad celular sea elevada, con mucha producción de ácido es recomendable, por la elevada producción de CO2 
endógeno, mantener abierto el recipiente de modo que se pueda eliminar el exceso. En estos casos es especialmente 
recomendable suplementar el medio con HEPES para asegurar un correcto control del pH del medio. 
• Propiedades físicas. Las características del medio son: pH, osmolaridad, temperatura, viscosidad y tensión superficial. 
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 pH y capacidad tamponadora. El pH óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7,4 aunque existen 
pequeñas variaciones: algunas líneas normales de fibroblasto crecen mejor entre pH 7,4 y 7,7 y células transformadas lo 
hacen en el margen de pH de 7,0 a 7,4 (Eagle, 1973), células epidérmicas pueden ser mantenidas a pH 5,5 (Eisinger y col., 
1979). 
El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a pH 7,4, naranja a pH 7,0, amarillo a pH 
6,5, azul-rojo a pH 7,6 y púrpura a pH 7,8. El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios bruscos 
de pH. La solución tamponadora más empleada sigue siendo el tampón bicarbonato, que equilibra el CO2 atmosférico, a 
pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a: su bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el 
cultivo. HEPES es la solución tamponadora de elección por su elevada capacidad tamponadora en el rango 7,2 a 7,6, y se 
emplea en concentraciones de 10 a 20 mM. Cuando se usa conjuntamente con CO2 externo, debe estar a concentración 
doble del bicarbonato para un tamponamiento adecuado (ver figura 3.3). 
 Osmolaridad. Muchas células en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo bien en el 
rango de 260 a 320 mOsm/kg, con pequeñas variaciones dependiendo de la especie considerada. Es recomendable emplear 
medios ligeramente hipotónicos para compensar la evaporación durante el periodo de incubación, especialmente en 
incubadores sin control de la humedad ambiente. 
La osmolaridad se controla mediante la determinación del punto de congelación o la elevación de la presión de vapor. Hay 
que tener en cuenta que la adición de HEPES, de drogas disueltas en ácidos fuertes y la neutralización posterior pueden 
afectar fuertemente a la osmolaridad del medio. 
 Temperatura. La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, de ahí la importancia de un 
buen control de ésta en la incubación. Influye asimismo en el pH del medio, por lo que se recomienda o bien ajustar el pH 
del medio 0,2 unidades por debajo del óptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, 
dejar equilibrar en la estufa y después ajustar el pH, antes de añadirlo al cultivo. 
 Viscosidad. La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia 
sobre el crecimiento. Sí es importante para evitar el daño celular en la agitación del cultivo (menor daño a más viscosidad) 
y en la tripsinización. Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero, añadiendo al medio 
carboximetil-celulosa o polivinilpirrolidona (Birch y Pitch, 1971). 
 Tensión superficial. La tensión superficial se ha de mantener baja, y en general sólo se ve alterada por la aparición de 
espumas en los cultivos en suspensión donde se burbujea CO2. En estos casos es recomendable emplear un agente 
antiespumante de silicona pues en éstos casos se produce un aumento de la desnaturalización de proteínas y se incrementa 
el riesgo de contaminación si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo. 
• Condiciones fisiológicas. Hacen referencia a la composición del medio. Ya se indicó que la principal dificultad para el 
establecimiento de las líneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al 
medio "natural" como extractos embrionarios, hidrolizados de proteína o sueros. Un primer grupo de medios tales como el 
medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, 1955, 1959) y el más complejo 199 de Morgan y col. (Morgan y col., 1950) o CMRL 1066 
de Parker y col. (1950) eran medios definidos pero que precisaban de un suplemento de suero entre el 5 y el 20%. 
A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios más complejos como NCTC 109 
(Evans y col, 1956), 135 (Evans y Bryant, 1965), MB572/1 (Waymouth, 1959), Ham F10 y F12 (Ham, 1963, 1965), serie de 
los MCDB (Ham y McKeehan, 1978) y los medios de Sato suplementados con hormonas (Barnes y Sato, 1980). 
La aproximación recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12, 
suplementado con elevada concentración de suero (20%) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero 
hasta poderla reducir o suprimir. Después de años de investigación en la composición de los medios la elección de éstos sigue 
siendo empírica. 
Los principales medios empleados y sus aplicaciones son: 
 Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con sólo los aminoácidos esenciales. Se necesita siempre la suplementación 
con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratón y células HeLa. 
 Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso más corriente, contiene más aminoácidos y en mayor 
concentración que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adición de suero (10%). 
 RPMI 1640. Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión. Tiene un amplio 
rango de aplicaciones con suplementos adecuados. 
 Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentración de aminoácidos y vitaminas que el 
BME. Se usa para la selección de hibridomas suplementado con HAT o HT. 
 Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina 
bovina, transferrina, selenito, et... Es muy útil para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. También sirve para otros 
tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones. 
 McCoy 5A. Medio diseñado para el crecimiento para el crecimiento de líneas celulares diploides tanto de rata como 
humanas. 
 Medio L-15 de Leibovitz. Utilizado para el cultivo de virus. 
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usualmente
neutro
ácido
básico
ácido
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 Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de líneas celulares humanas, debe ser suplementado con proteínas y hormonas. 
Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es útil para el cultivo de células amnióticas. 
 Medio F-12 de Ham. Útil para el crecimiento de líneas celulares son suplementos proteínicos. Combinado con IMDM es un 
medio que se usa como libre de suero. 
 Medio 199. Muy usado para el cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías. 
Todo medio de cultivo está formado por los siguientes elementos: 
 Soluciones salinas equilibradas (BSS). Una solución salina equilibrada es una mezcla de sales inorgánicas, incluyendo 
usualmente bicarbonato sódico, y suplementada con glucosa. Se usan para diluir medios más completos, como medio de 
disección o lavado, o para incubaciones cortas que requieren un medio isotónico no completo nutricionalmente. Su elección 
dependerá de: 
 la tensión de CO2. La concentración de bicarbonato deberá permitir el equilibrio apH 7,54 a 36,5ºC. Así BSS-Eagle es 
más usada para 5% CO2 y BSS-Hank (HBSS) es usado a la tensión atmosférica normal. 
 su uso en la disgregación de tejidos o monocapas. En ese caso deberán carecer de Ca2+ y Mg2+. Son recomendables los 
medios de Moscona, CMF, o PBS de Dulbeco o Vogt (PBSA). 
 su uso para el cultivo en suspensión o de células en monocapa. Es recomendable el uso de MEM(S), variante de MEM 
sin Ca2+ que reduce la agregación celular y la adherencia. 
Debido a su escasa capacidad tamponadora se recomienda suplementarlo con HEPES para pH en el rango 7,2 a 7,8 y 
Tricina en el rango 7,4 a 8,0. 
 Aminoácidos. Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales. Asimismo se suplementa con otros 
aminoácidos, pues los requerimientos pueden variar de una célula a otra. Un suplemento común es el de glutamina, a 2 
mM final, aunque hay algunas líneas celulares pueden usar el glutamato. La glutamina es inestable en el medio, y se 
recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100×) que se mantiene congelado, no más de 1 semana antes de 
añadir el medio al cultivo (conservando a 4ºC). 
 Vitaminas. El medio MEM sólo suplementa con vitaminas del grupo B, siendo los demás grupos aportado por el suplemento 
de suero. En medios más definidos se suplementan todas las vitaminas. La limitación de vitaminas se manifiesta en la 
supervivencia de las células y en la reducción de la tasa de crecimiento más que en la densidad celular. 
 Glucosa. Es la fuente de energía en muchos medios. Metabolizada preferentemente vía glucólisis hacia piruvato que puede 
ser convertido en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs, y genera CO2. La acumulación de ácido láctico en el 
medio propio de células embrionarias y transformadas parece indicar un funcionamiento diferente del ciclo de Krebs en 
estas células respecto al modelo in vivo. En estos casos la mayor parte del CO2 parece proceder de un uso de la 
glutamina/glutamato. 
 Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular. Dependiendo del medio, éste incluye en su formulación nucleósidos, 
intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato, lípidos,... La adición de piruvato en el medio permite al cultivo incrementar su 
producción endógena de CO2 haciéndole independiente de la aportación exógena de éste. El medio de Leibovitz L15 
contiene una concentración superior de piruvato y no contiene bicarbonato sódico, y no requiere aporte de CO2 en la fase 
gas. 
 Hormonas y factores de crecimiento (suero). En los medios no definidos suele aportarlos el suero. Los tipos de suero 
empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de caballo ("horse 
serum", HS) y suero humano ("human serum", HuS). El más usado es el suero de ternera, mientras que el suero bovino 
fetal es usado en líneas más exigentes, y el suero humano en líneas humanas. La utilización de suero es problemática pues: 
 a pesar de que la composición del suero es conocida, existen gran cantidad de componentes presentes en cantidades 
variables en éste que pueden influir notablemente en el cultivo (hormonas, factores de crecimiento...) 
 el suero varía de lote a lote, y cada uno se puede emplear como máximo 1 año, probablemente deteriorándose a lo 
largo de ese tiempo, a pesar del almacenamiento a baja temperatura. 
 cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de controles tediosos y costosos. 
 si se cultivan varios tipos celulares cada uno puede requerir un lote diferente, lo que complica el almacenamiento e 
incrementa los costes. 
 crea una dependencia importante de un suministro que no siempre puede mantenerse con la periodicidad y calidad 
requerida. 
 si se han de purificar productos del medio de cultivo la presencia de los componentes del suero dificulta notablemente 
estos procesos. 
 el suero está contaminado con desgraciadamente demasiada frecuencia por virus y micoplasmas, lo que representa un 
grave peligro para el cultivo. 
 algunos factores séricos como el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) estimula la proliferación de fibroblastos, lo 
que puede ser un problema en el establecimiento de cultivos primarios especializados. 
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PBS
é uma solução salina
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En conjunto supone un gran inconveniente para la estandarización de protocolos experimentales y de producción. Por ello 
se realizan importantes esfuerzos para la definición de medios definidos para el crecimiento celular. Esto, además de la 
reproducibilidad buscada, permite establecer medios selectivos en los que crezca el tipo celular deseado. Tienen como 
desventaja la gran cantidad de esfuerzo necesario para su definición, así como que en muchos casos el crecimiento de las 
células en estos medios es menor, las líneas finitas permanecen viables menos generaciones, así como el hecho probable 
de que la adaptación del cultivo al medio libre de suero supone un tipo de selección per se. 
Para conseguir reemplazar el suero completamente de un medio será necesario reemplazar: 
 los factores de adhesión como la fibronectina. Células crecidas en medios libres de suero requieren el suplemento de 
fibronectina (25-50 μg/mL) o laminina (1-5 μg/mL) en el medio, o bien el tratamiento de las placas con poli-lisina (1 
mg/mL) antes de la siembra. 
 inhibidores de proteasas. Después de la tripsinización de un cultivo el exceso de actividad tríptica se inhibe por la 
adición de suero al medio. En ausencia de éste deben usarse inhibidores de proteasas como el inhibidor de tripsina de 
soja. 
 hormonas. El complemento hormonal dependerá especialmente del tipo celular, tales como hormona de crecimiento, 
T3, hidrocortisona, dexametasona, FSH, ... 
 factores de crecimiento peptídico. En la actualidad se han identificado algunos polipéptidos de actividad mitogénica: 
FGF ("Fibroblast Growth Factor"), EGF ("Epidermal Growth Factor"), PDGF ("Platelet Derived Growth Factor") y MSA, y 
con un rango amplio de actividad. Asimismo se han aislado otros factores con mayor especificidad de acción. 
 nutrientes: Fe, Cu, Se, y otros minerales, a pesar de que los fundamentos de su función son desconocidos en muchos 
casos. 
 proteínas y poliaminas. La inclusión de albúmina bovina añade indefinición al medio, por ello se recomienda el uso de 
BSA libre de ácidos grasos (usualmente a 1-10 mg/mL). Transferrina (10 ng/mL) se requiere como portador de Fe, y se 
cree que puede tener actividad mitogénica. Putrescina se usa a alrededor de 100 nM. 
A fin de reemplazar el suero se han desarrollado una serie de sustitutos comerciales como son SerXtend (NEN), Ventrex 
(Ventrex Lab Ltd.), Nu-serum (Collaborative Res.), ... 
 Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos). A fin de evitar el crecimiento de 
contaminantes en el cultivo se suele suplementar éste con sustancias antibióticas de diferente espectro de acción. La 
adición de antibióticos ha de ser estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo. 
Es importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o más antibióticos. Las mezclas de uso más común son: 
 Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 μg/mL). Combinación anti-microbiana. 
 Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 μg/mL) / Fungizona. Combinación anti-microbiana y anti-fúngica. 
 Gentamicina (50 μg/mL). Anti-microbiana, conviene ir alternándola con la penicilina-estreptomicina. 
 Anfotericina-B (2,5 μg/mL). Antifúngico y antilevaduras. Se han observado algunos efectos secundarios sobre el 
crecimiento de células de médula ósea humana en cultivo. 
 
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Las contaminaciones. 
Uno de los problemas más frecuentes en el cultivo de tejidos en general es el de las contaminaciones. Las células eucariotas en 
cultivo crecen lentamente, con tiempos de duplicación superiores en muchos casos a las 24 h. Sin embargo, tanto las bacteriascomo las levaduras tienen una tasa de crecimiento superior. Si se da el caso de una contaminación por estos organismos 
pueden provocar la muerte del cultivo en poco tiempo. Para evitarlo se utilizan una serie de técnicas de trabajo que suponen la 
máxima asepsia, así como la esterilización del material y el trabajo en ambientes estériles (cabina de flujo laminar). Asimismo 
se utilizan cócteles de sustancias antimicrobianas y antifúngicas en el medio aunque en multitud de ocasiones no es posible 
usarlas o bien no son suficientes para prevenir la aparición de microorganismos. 
Los tipos de contaminaciones más frecuentes son por bacterias, por hongos y levaduras, por micoplasmas y por virus: 
• Contaminación bacteriana y por levaduras. Los medios de cultivo proporcionan un medio ideal para el crecimiento de 
los contaminantes microbianos, y los procedimientos habituales de manipulación (abertura de recipientes, pipeteado,...) son 
susceptibles de provocar contaminación por bacterias. Los antibióticos, añadidos en los cultivos a corto plazo de forma 
habitual no son recomendables en los cultivos a largo plazo. Para evitar las contaminaciones por bacterias es necesario 
extremar las condiciones de esterilidad y realizar una serie de controles sobre las soluciones y recipientes a usar. Así es 
recomendable comprobar el estado de contaminación de cualquier tipo celular antes de introducirlo en las salas donde se 
trabaja con otros tipos celulares... 
Los controles de esterilidad están diseñados para detectar no aquellos contaminantes de crecimiento rápido y que producen 
cambios notables en el medio de cultivo pues estos se detectan fácilmente incubando alícuotas de medio en la estufa durante 
24 o 48 h, sino aquellos otros de crecimiento lento y que no se producen cambios apreciables en el cultivo. No existe un test 
único capaz de detectar todos los contaminantes. 
La fuente más frecuente de contaminación es la atmósfera. Las precauciones a tomar serán: 
 trabajo en ambiente estéril, en una cabina de flujo laminar o en el área de influencia de un mechero bunsen. 
 usar pipeteadores automáticos y pipetas automáticas. Si no se dispone de estos nunca pipetear directamente con la boca 
sino mediante un tubo de goma y intercalando algodón en la boca de la pipeta. 
 mantener los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible. 
 todas las botellas de medio y de soluciones atemperadas en un baño deben secarse cuidadosamente antes de usarlas. 
 ante cualquier duda limpiar con alcohol 70% o flamear el material que pueda estar contaminado si no es reemplazable, o 
reemplazarlo si es posible. 
 si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Si se han de tomar muestras para su análisis conviene hacerlo 
en ambiente estéril y después limpiar cuidadosamente el área de trabajo y conectar la iluminación UV. 
De todas formas no es fácil reducir a una lista las precauciones a tomar y la única forma de aprender es practicar bajo 
supervisión. 
• Contaminación por micoplasmas. Los micoplasmas son células procariotas pequeñas (0,3 a 0,5 μm de diámetro) que 
pueden formar pequeñas colonias similares a las que forma el agente productor de la pleuroneumonía bovina (de ahí su 
nombre de "pleuropneumonia-like organisms", PPLO). No poseen pared celular y por ello sólo son capaces de crecer en 
ciertos medios. Existen varios grupos serológicos de micoplasmas de dos géneros (Mycoplasma y Acholeplasma). Los 
contaminantes responsables de las infecciones de los cultivos celulares proceden mayoritariamente de 4 especies: M.orale 
(humano), M.hyorhinis (cerdo), M.arginini (bovino) y A.laidlawii (bovino y también de roedores). 
Los cultivos primarios suelen estar libres de micoplasmas, pero muchas de las líneas celulares continuas están infectadas. La 
contaminación suele proceder de suero animal contaminado con A.laidlawii y M.arginini o de la tripsina de cerdo contaminada 
con M.hyorhinis. A pesar de que M.hominis, M.pharyngis y M.salivarum se pueden aislar de la boca y la garganta humana, la 
mayor fuente de contaminación procede del uso de cultivos contaminados. Se citan datos de que alrededor del 50 al 95% de 
las células utilizadas actualmente están contaminadas con micoplasmas. 
Dado que la contaminación con micoplasmas no es tan evidente como la contaminación por bacterias o levaduras es 
importante por una parte tener en cuenta el posible efecto de los micoplasmas sobre el cultivo, y realizar controles periódicos 
de su presencia. 
Los efectos dependen de la especie implicada. Así las especies M.gallisepticum y M.mycoides son patógenos pero son poco 
frecuentes. Otras especies no producen la muerte celular pero retardan el crecimiento celular. Así por ejemplo M.hominis 
parece retardar el crecimiento del cultivo pues consume toda la arginina presente debido a su elevada actividad arginina 
deaminasa, mientras que A.laidlawii destruye rápidamente los desoxirribonucleótidos, y en un cultivo infectado es realmente 
difícil realizar medidas de incorporación de timidina tritiada pues ésta es rápidamente convertida a timina. 
Los requerimientos de los micoplasmas son complejos y sólo crecen en medios donde hay células en crecimiento. Parece que 
requieren los productos de degradación de ADN celular, pues los nucleósidos son factores de crecimiento esencial para los 
micoplasmas. 
Una observación cuidadosa de las células en cultivo puede dar un primer aviso de la presencia de micoplasmas: aparición de 
gránulos oscuros en el citoplasma. A continuación se detallan algunas de las técnicas usadas en la actualidad para la 
detección de los micoplasmas: 
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 Tinción con orceína (Fogh y Fogh, 1968). 
 sembrar las células sobre cubreobjetos de modo que no hayan alcanzado la confluencia en 24 h. 
 sumergir el cubreobjetos en una placa de Petri con 3 mL de citrato sódico 0,6% y añadir lentamente 1 mL de agua. 
Dejar 10 min y añadir lentamente 4 mL de fijador de Carnoy (1:3 acético:etanol). Sacar todo el líquido y reemplazar por 
2 mL de fijador de Carnoy. 
 dejar fijar durante 10 min. Dejar secar. 
 teñir 10 min con orceína, y lavar 3 veces con etanol absoluto. 
 montar en DPX, observar con el microscopio de contraste de fase. Las células contaminadas muestran los micoplasmas 
preferentemente en el borde celular y en los espacios intracelulares. 
 Autoradiografía de cultivos incubados con timidina tritiada. Un cultivo contaminado muestra señal autoradiográfica fuera del 
núcleo por efecto de la degradación de la timidina a timina propia de muchos micoplasmas. 
 Tinción fluorescente con Hoechst 33258, 33217 o DAPI. Esta técnica detecta el DNA de los micoplasmas pues el colorante 
(Hoechst 33258 o 33532, o el DAPI) se une específicamente al DNA. Se emplea la misma técnica de tinción que para la 
tinción nuclear. 
 
 
Cultivo negativo a micoplasmas (ATCC) Cultivo positivo a micoplasmas (ATCC) 
 
 Test de crecimiento para micoplasmas. El efecto letal de la contaminación por micoplasmas sobre el cultivo puede 
acentuarse mediante la adición al medio de 6-metilpurina desoxirribonucleósido (6-MPDR). Todos los micoplasmas 
presentan gran actividad del enzima adenosina fosforilasa, capaz de convertir 6-MPDR (no tóxico) en 6-metil purina y 6 
metil-purina ribonucleósido, ambos tóxicos para las células de mamífero (McGarrity y Carson, 1982). 
Existen sistemas de cultivo de micoplasmas de gran sensibilidad que permiten detectar la presencia de pequeñas 
cantidades de contaminante. Es el caso del Método directo de cultivo que propone ATCC en su servicio de detección de 
micoplasmas. Este cultivo sin embargo tiene como gran limitación los 28 días que precisa. 
 
 Sonda DNA para micoplasma. Es una sonda de DNA tritiada capaz de reconocer el RNA ribosomal de micoplasma en 
cultivos celulares. Es muy sensible, pero aún cuesta 10 veces más que el ensayo de Hoechst. Supone obtener un lisado 
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celular al que se añade la sonda de DNA, se hibrida a 72ºC durante 1 h, se precipita y se lava el híbrido DNA/RNA y se 
cuenta la cantidad de radiactividad retenida. 
 Detección de micoplasmas mediante PCR. Se han propuesto diversos métodos para la detección de micoplasmas mediante 
PCR, y se han comercializado kits, como el producido 
por la ATCC que permite detectar 5 especies de 
micoplasmas responsables del 95% de las 
contaminaciones. En el laboratorio se emplea un 
método de detección mediante PCR que se basa en el 
descrito por Wong-Lee y Lovett (1998). Empleando una 
sola pareja de cebadores correspondientes al RNA 16s 
de 8 especies de micoplasma (M.hyorhinis, M.arginini, 
M.pneumoniae, M.fermentans, M.orale, M.pirum, 
Acholeplasma laidlawii y Spiroplasma mirum). 
Protocolo: 
 Secuencias de los cebadores: 
 Mico1: GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG 
 Mico2 : CGG ATA ACG CTT GCG AC TAT G 
 Concentración de trabajo de los cebadores 10 
pmol/μL 
 Condiciones de PCR: 95ºC 1 min, (95ºC 1 min, 
55ºC 1 min, 72ºC 1,30 min) 35 ciclos, 4ºC 
mantenido 
 Tamaño esperado 0,5 kb 
 
Para la eliminación de los micoplasmas, en general se recomienda, si el cultivo es reemplazable, eliminarlo, esterilizar todo y 
volver a empezar. Sólo cuando el cultivo es irreemplazable o importante se recomienda proceder a su eliminación en el 
cultivo. Para ello hay varias posibilidades: 
 Tratamientos antibióticos. Se ha descrito que la kanamicina (0,1 mg/mL) previene el crecimiento del micoplasma (Fogh y 
Hacker, 1960), así como la tylocina (6,0 μg/mL). Asimismo son efectivos contra micoplasmas las quinolonas, como 
ciprofloxacina (Schmitt y col., 1988), y MRA. Las quinolonas inhiben la DNA girasa procariota. 
 Tratamientos con sueros inmunes. El tratamiento del cultivo con sueros anti-micoplasmas se ha revelado como efectivo, 
pero costoso. 
 Pase por un animal. En el caso de cultivos de líneas tumorales se ha revelado como especialmente útil la inoculación a un 
animal de experimentación y la recuperación posterior. El sistema inmune del animal limpia el cultivo de micoplasmas. 
• Contaminación por virus. La contaminación viral es un problema grave pues su prevención y eliminación es realmente 
difícil. Desde que se descubrió que el suero bovino podía ser una fuente importante de contaminación por diferentes virus 
(herpesvirus y virus parainfluenza-3) los sueros son controlados rutinariamente, aunque la validez de estos ensayos es 
limitada. Por ello la única alternativa es el uso de medios libres de suero. 
Los virus pueden tener un efecto citopático marcado, pero los más peligrosos son aquellos que crecen a baja tasa o en unas 
pocas células tan sólo. Así, en células de individuos con linfoma de Burkitt, producido por EBV (Epstein-Barr virus), no 
muestran señales de EBV en cultivo hasta varios pases, cuando solo unas pocas células muestran inmunofluorecencia positiva 
(Henle y Henle, 1966). La manera más eficaz de detectar la infección por virus es infectar un animal sensible y seguir la 
aparición de efectos citopáticos. 
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Técnicas de contaje celular 
Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. 
Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son 
viables. 
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje 
celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la cámara de Neubauer, hasta equipos automáticos de contaje celular 
como el "Cell Coulter". 
El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una 
partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio. Una pequeña abertura entre los 
electrodos es la zona sensible a través de la que pasan las partículas que se encuentran en suspensión. Cuando una partícula 
atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje. La 
altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula. Controlando la cantidad de la suspensión que circula a través 
del orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas. Es posible contar y medir varios miles de partículas por 
segundo, independientemente de su forma, color y densidad. 
 
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de 
contaje celular, por ej. la cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se 
coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que determinan un volumen conocido (x 
microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad 
de partículas en la suspensión de origen. 
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo 
claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el 
centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una 
cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 × 3 mm, con una 
separación entre dos líneas consecutivas de 0,25 mm. Así pues el área sombreada y 
marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos 
está hundida 0,1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un 
cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0,1 milímetro, y el volumen 
comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0,1 milímetro cúbico, es 
decir 0,1 microlitro. 
Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células entre 
las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será: 
Concentración en la suspensión (células/mL) = 
4
x
000.10 ⋅ 
 
En la imagen se puede observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una 
cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0,25 milímetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio 
invertido de contraste de fases. 
 
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Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen se puede observar 
una cámara de Neubauer doble: 
 
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul 
tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana. Así pues las células 
que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar células blancas, por exclusión, a 
células viables es un error pues por este método se sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión, determinando 
como inviables sólo aquellas con la membrana rota. En la imagen se han representado células vivas como puntos blancos y 
células muertas (teñidas con azul tripán) como puntos azules. Corresponde a una de las áreas de contaje de la cámara de 
Neubauer (1 mm2). 
 
Existen otros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio. 
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Métodos de disgregación de células en placa 
La disociación tisular y el subcultivo celular representan dos aplicaciones en las que es necesario separar las células entre sí y 
de un sustrato manteniendo la viabilidad celular. Para conseguirlo es necesario romper la malla de proteínas que forman la 
matriz extracelular que las mantiene unidas mediante procesos que separen las moléculas proteicas de la matriz extracelular 
(por ej. secuestrandolos iones calcio que permiten la unión), o bien rompiendo proteolíticamente (mediante la acción de 
proteasas) las mismas proteínas. 
Generalmente los métodos empleados se pueden clasificar en tres categorías: 
• Mecánicos (por ejemplo cortar, picar, cribar, rascar, etc...). En cultivos celulares se emplean con frecuencia los métodos de 
rascado (“scrapping”) de la placa para arrancar las células adheridas. 
 
• Químicos. Generalmente se trata de la adición de soluciones en las que no hay iones divalentes o bien de agentes quelantes 
de estos iones. En cualquier caso se reduce la concentración de los iones que estabilizan las uniones de las proteínas de la 
matriz extracelular y de éstas con los receptores celulares. 
• Enzimáticos. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de proteasas activas (colagenasa, dispasa, tripsina, 
elastasa, papaína, pronasa, hialuronidasa, etc...) 
Sin embargo en la práctica se suelen emplear técnicas que combinan dos o tres métodos. La elección de uno u otro 
procedimiento dependerá fundamentalmente de la naturaleza y cantidad de tejido o cultivo disponible y del uso previsto de las 
células obtenidas. A continuación se muestra una clasificación de métodos de disgregación celular clasificados según una 
severidad creciente: 
• Agitación (sacudidas a la placa). Se separan las células que están en mitosis y las adheridas 
ligeramente. 
• Tripsina (0,01-0,5%) en PBS, 5 a 15 min, 37ºC. La mayoría de las líneas celulares. 
• Prelavado con PBS, Tripsina 0,25% en PBS, 37ºC. Algunas líneas celulares que se adhieren fuertemente, y 
muchas líneas celulares a pases bajos. 
• Prelavado con EDTA 1mM, Tripsina 0,25 % en PBS, 37ºC. Algunas células en pases bajos fuertemente adheridas. 
• Dos lavados con EDTA 1mM, dejando en EDTA 1 mM, 1 
mL/5 cm2 
Células epiteliales, aunque algunas pueden ser sensibles a 
EDTA 
• Prelavado con EDTA, Tripsina 0,25% con EDTA Células fuertemente adheridas, especialmente epiteliales y 
algunas tumorales. Hay que tener presente la posible 
toxicidad del EDTA. 
• Prelavado con EDTA 1mM, Tripsina 0,25% y colagenasa 200 
U/mL en PBS o EDTA/PBS 
Cultivos gruesos formados por múltiples capas de células, 
especialmente en cultivos productores de colágeno. 
• Rascar (“scrapping”) Todos los cultivos, aunque puede producir daño mecánico y 
usualmente no produce una buena suspensión celular. 
• Añadir dispasa (0,1-1 mg/mL) o pronasa (0,1-1 mg/mL) al 
medio hasta que las células desadhieran. 
Suspenderá la mayor parte de las células, pero requiere la 
centrifugación de la suspensión para eliminar el enzima no 
inactivado por el suero. Puede ser dañino para algunas 
células. 
 
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El laboratorio de cultivo celular. 
La característica principal que define al laboratorio de cultivo celular es el mantenimiento de la asepsia. La tasa de crecimiento 
de las células en cultivo es muy inferior al de los contaminantes habituales: hongos, levaduras, bacterias y micoplasmas, y por 
ello para el mantenimiento del cultivo será vital evitar la aparición en éste de cualquier microorganismo indeseado. 
El área de trabajo para realizar cultivos debe instalarse en una parte del laboratorio tranquila, alejada de las vías de paso y a 
ser posible dedicada exclusivamente al cultivo de células. La solución ideal es disponer de una habitación aislada. 
Las aparición de cabinas de flujo laminar redujo las necesidades de aislamiento del área de trabajo pero aún así es 
recomendable mantener un gradiente de esterilidad, desde el medio exterior o laboratorio general al interior de las cabinas de 
flujo donde se manipularán los cultivos y del incubador donde se mantendrán. 
Las necesidades de asepsia dependen del tipo de material que se va a procesar en el laboratorio. Esto define dos tipos de 
contención y de área de trabajo diferentes: 
• el laboratorio de cultivo de tejidos general, para la manipulación de cultivos no patógenos se instalará preferentemente en 
una sala aislada y a la cual se le suministrará aire filtrado (normalmente mediante un equipo de filtración y regulador de la 
temperatura). Esto produce un aumento de presión atmosférica en el interior del laboratorio (típicamente entre 15 y 20 mm 
de Hg) que impide la entrada de aire no filtrado al área limpia. 
• el laboratorio de cultivo con patógenos supone un nivel de contención superior. A fin de evitar la salida accidental de éstos 
agentes se filtra el aire que sale de la sala, generando un déficit de presión en el interior de ésta. El aire sale siempre estéril. 
En el laboratorio de cultivo celular propiamente dicho se encuentran los siguientes tipos de instrumentos: 
• Las cabinas de flujo laminar. Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles 
contaminantes (bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante un dispositivo mecánico 
que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en 
la pared frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del 99.999% retiene las partículas por debajo de un cierto calibre 
que es en general de 0,2μm. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas partículas 
contaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del 
aire, como por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de 
intensas corrientes de convección. 
Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se diseñan con diferentes propósitos: 
 Protección personal: protección del personal de los posibles agentes dañinos del interior de la cabina. 
 Protección del producto, experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes exteriores 
o de la contaminación cruzada con otros productos o cultivos situados en la misma cabina. 
 Protección medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos o agentes contaminantes. 
Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena protección del producto, pero no son adecuadas 
para el trabajo con materiales peligrosos o con algún tipo de riesgo pues el operador queda completamente expuesto. En las 
cabinas de flujo vertical, más sofisticadas, se segura una buena protección del producto, y, dependiendo de su diseño se 
puede asegurar una protección total del operador. Son por ello más adecuadas para el trabajo con agentes peligrosos. 
 
 
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Cabina de flujo laminar horizontal Cabina de flujo laminar vertical 
Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos factores en el diseño de la cabina se trata de cabinas 
de clase I, II o III. 
 Cabina de clase I. Se trata de una unidad de contención parcial adecuada para la manipulación de agentes de bajo riesgo, 
donde existe una necesidad de protección del operario y del medio pero no del producto. Este es el tipo de cabinas 
normalmente denominadas "de gases", y no son de uso común en el laboratorio de cultivo de tejidos. 
 Cabina de clase II. Este tipo de cabinas protegen el producto, al personal y al medio ambiente. En general las cabinas de 
clase II se describen como un equipo de protección con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar 
estable en el interior, con una filtración HEPA para el aire recircularizado en cada ciclo y una filtración HEPA del aire 
exhausto (de salida al medio). Los sucesivos diseños que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten 
clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases: 
 Tipo A. En este tipo el 30% del aire es eliminado en cada ciclo y el 70% es recircularizado. El escape al medio de los 
agentes potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente