Chopita - 7- Biotecnologías en yegua

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Biotecnologías reproductivas en la yegua – 2da parte 
Transferencia embrionaria
· Consiste en la inseminación de una yegua donante con el semen de un padrilo, ambos de alto valor productivo, para luego transferir el embrión a una yegua receptora que llevará a cabo la gestación.
· Tiene como objetivo principal el de aumentar el número de potrillos por año de una misma yegua. (Dato de color, el récord es 12 potrillitos provenientes de una yegua donante –en distintas receptoras, obvio- Re loco) 
· Sirve también para poder producir crías de yeguas en entrenamiento, que no pueden parar de competir por estar gestando, o para yeguas con alto valor genético pero con historia de abortos recurrentes. Esto puede deberse a problemas reproductivos o no reproductivos, como por ejemplo la infosura, que causa una endotoxemia impidiendo que llegue con la preñez a término.
· Es importante tener en cuenta que las yeguas viejas no son buenas donantes.
Manejo de la yegua donante
Debe realizarse un examen reproductivo para verificar que la fertilización pueda ocurrir, y que el útero esté apto para abastecer al embrión hasta que llegue el momento de ser transferido. Es aconsejable evitar situaciones de estrés.
Es muy importante registrar el día de la ovulación (obviamente) porque esto va a determinar cuándo tengo que hacer el lavaje, es decir, cuándo tengo que extraerle el embrión. En yeguas viejas, este será 1 día más tarde que lo normal.
Manejo de yeguas reproductoras
Son caras y difíciles de conseguir, entonces no podés joder con esto tampoco. Generalmente se dispone de un lote de yeguas receptoras y se va seleccionando de acuerdo a la disponibilidad. Como siempre, hay que darle importancia al manejo sanitario, examen reproductivo y EOG particularmente a:
· La conformación perineal –por las cosas que ya vimos en patologías de yegua.
· La salud dental, que me asegura que sea capaz de alimentarse.
· La mansedumbre.
· Sanidad Mismo plan sanitario que la donante! (Vacunas, ATP, etc)
· Desarrollo de las gl. mamarias. 
· Biopsia uterina – Es lo más importante, que tenga el útero apto para recibir al embrión.
· Tamaño corporal – No conviene que la receptora sea mucho más pequeña que la donante. Una distocia por tamaño NO sería algo común en equinos, el problema radica en que el potrillo podría nacer más pequeño de lo que debería.
· Acá también es aconsejable evitar yeguas viejas y situaciones de estrés.
Sincronización donante – receptora
Al estar en temporada reproductiva, tanto la donante como la receptora estarán ciclando. Por ende, como se imaginarán, es imprescindible que los ciclos de ambas estén sincronizados. Generalmente es complicado lograr que ovulen el mismo día, entonces elijo un par de yeguas como posibles receptoras, y veo cuál se ajusta mejor al ciclo de la donante para elegirla. Igual como verán a continuación, en verdad conviene que la receptora ovule un poquito después..
Entonces, ¿cuándo conviene realizar la transferencia embrionaria?
Respecto a la yegua donante, el lavaje uterino y la recuperación del embrión (que después les explico cómo se hace), se realiza en el día 7-8 del ciclo, luego de lo cual tengo, como máximo, 24 horas para colocarlo en la receptora.
Respecto a la receptora, tenemos 3 opciones. 
· La mejor opción es cuando la receptora ovula un poco más tarde. Yo le transfiero el embrión ANTES de que ovule la receptora. En el gráfico vemos como días “+1, +2 Y +3” a los posibles días en donde ovulará la receptora CON RESPECTO a la donante. Para tirar un ejemplo concreto: si dice +3, significa que ovuló 3 días después que la donante. Ahora, a esta altura tenemos ree claro que la PGF2alfa se secreta en el día 15-16 del ciclo. Entonces, siguiendo el mismo ejemplo, la yegua receptora ovuló 3 días después que la donante. Para el momento de la transferencia embrionaria, estará más o menos en el día 4 de su ciclo (porque recuerden que la hago en el día 7-8 del ciclo de la DONANTE, el cual en este caso en particular coincide con el día 4 de la RECEPTORA). Entonces al embrión le van a quedar 11 días para hacer el reconocimiento materno fetal y así evitar la liberación de PG (léanlo 2 ó 3 veces y lo van a entender, igual con los demás casos seguro lo terminan de cerrar)
· La segunda opción que tenemos es que ovule el mismo día la donante y la receptora. Entonces, cuando sea la transferencia, ambas van a estar en el día 7 del ciclo, dejando un menor margen de tiempo para el reconocimiento materno de la preñez, es decir, 8 días.
· La tercera y peor opción es que la yegua receptora ovule antes que la donante. Si ovula un día antes, cuando la yegua donante esté en el día 7 lista para donar el embrión, la receptora estará en el día 8. Entonces el embrión va a tener menor tiempo para el reconocimiento, es decir, unos 7 días.
Lo importante es que entiendan que cuanto mayor tiempo para reconocer al embrión haya, mejores serán las chances de que la preñez se mantenga Mándenme audio si no entienden, porque dijo que es súper importante!!!
Y doctora, dígame, ¿cómo hago para sincronizare el celo? Y bue, ya sabemos de antes que se hace con PGF2alfa y progestágenos. Si además queremos sincronizar ovulación, usamos progesterona y 17 beta estradiol.
Importante!! A la donante SIEMPRE le doy PGF2alfa luego de donar el embrión. Esto es por 2 motivos
1) Para que cicle de nuevo y poder hacer otro lavaje cuando se preñe otra vez (recordemos el objetivo de esta técnica, sacar varias crías al año de una misma madre)
2) Por las dudas que haya quedado otro embrión, en el caso de que hayas tenido la mala suerte de que hizo ovulación doble.
Lavaje y recuperación del embrión
El lavaje se realiza con esta sonda cuyo nombre no anoté, pero les expico cómo funciona (perdón por la foto )
A- Solución ringer lactato
B – Jeringa para insuflar el manguito, igual que en un tubo endotraqueal, pero en este caso el balón se encuentra sellando el cérvic, para no correr el riesgo de que al aspirar, se me escape el embrión y quede en la vagina.
C – Filtro muy fino que va a retener el embrión cuando el líquido caiga por gravedad luego del lavaje. Es MUY IMPORTANTE colocar una jarra medidora debajo de este filtro, porque necesito recuperar el 100% del líquido que ingresó, para evitar que quede el embrión dentro del útero sin querer. Es importante también cuidar de que el filtro no quede vacío a medida que voy pasando líquido, porque si esto ocurre, el embrión podría pegarse a las paredes del filtro y lesionarse. 
Se realizan 2 lavajes de 2 litros cada uno con ringer lactato. Es imprescindible esterilizar todo el material a utilizar. Luego del lavaje, se aplica PGF2alfa para contraer el útero y para sacar cualquier líquido residual (y por las razones que ya expliqué antes)
Factores que afectan la tasa de recuperación embrionaria
· Sanidad, alimentación, estrés
· Manejo reproductivo de la donante
· Errores del operario en el lavaje uterino
Manejo e identificación del embrión
Luego del lavaje, coloco el embrión en una placa y lo observo al microscopio o con lupa. Una vez que lo encuentro, lo paso a un medio enriquecido inmediatamente.
Respecto a la observación microscópica, se pueden clasificar los embriones encontrados según si es una mórula o un blastocisto, y a su vez, de acuerdo a su morfología clasificarlos en distintos grados. Pero en la práctica esto no se usa, porque 
como es tan caro, transferís cualquier cosa y le prendés velitas a tu santo favorito.
También puedo observar ovocitos no fertilizados. Si veo esto, tengo que seguir buscando, porque sí o sí tiene que haber embrión. Recordemos que el único capaz de abrir la papila es el embrión, por lo tanto, si en el cuerpo uterino hay ovocitos, seguramente habrá un embrión. Estos ovocitos provienen de ciclos anteriores. Quedan retenidos en el oviducto y obviamente si son de ciclos anteriores, a esta altura ya son inviables, porque si se acuerdan, el ovocito permanece solo 12 horas viable.
Una vez obtenido el embrión, puedo transferirlo inmediatamente, puedo llevarlo a otro lugara temperatura ambiente si es un viaje corto, o enviarlo a un centro de receptoras. Aguanta refrigerado 24hs a 5°C, y se conserva en el equitainer igual que el semen.
Eventualmente se puede hacer criopreservación a largo plazo, con congelamiento convencional o vitrificación. Este último consiste en realizar curvas de congelamiento extremadamente rápidas, a razón de 20000°C (sí, veinte mil) por minuto. –o sea que lo dejás menos de un segundo y se vitrifica por así decirlo jajaja-
Acá hay un esquemita de cómo debería armarse la pajuela para transportar al embrión. Esta disposición sirve para protegerlo en caso de que se mueva.
· Para la transferencia embrionaria se usan pipetas especiales. Básicamente se coloca el contenido dentro de las mismas y se vacía en el cuerpo uterino. Se ingresa con una mano sosteniendo la pipeta y se palpa el orificio cervical externo. Se introduce la pipeta en el mismo y se descarga el contenido. 
· OJO! La irritación mecánica puede producir la liberación de PGF2alfa, lo cual nos cagaría todo! Esto ocurre cuando el operador no tiene experiencia y manosea mucho el cérvix para encontrar el orificio. Para evitarlo, hay otro método con un vaginoscopio y una pinza de tracción cervical (es una pinza de prensión continua con ramas laaaaargas). Con el vaginoscopio visualizás el cérvix, traccionás el borde con la pinza y queda bien visible y abierto el orificio cervical, y ya podés entrar tranqui. 
· Para disminuir el riesgo de luteólisis, aplicamos megluminato de flunixin. Luego de la transferencia, aplicamos progesterona para asegurar el cierre del cérvix. Además se debe controlar el estado del útero luego de la misma: edema, líquido intrauterino y disminución del tono son todas malas noticias (?
· La tasa de preñez post transferencia es afectada por factores propios del embrión, condiciones del laboratorio y material con el que se manipuló (Temperatura, exposición a la liz), técnica de transferencia (operario), y factores relacionados a la receptora (los que ya vimos)
Por último, es clave tener en cuenta el manejo hormonal de las yeguas involucradas. Una yegua dadora que sea de salto, se la pasa el día en un box, expuesta a luz artificial. Esto genera que su temporada reproductiva sea más larga. En cambio, la receptora, al no cumplir con esta característica, tendrá una temporada más fiel a lo fisiológico. Entonces, tendría una época en la que la yegua dadora esté todavía en temporada reproductiva y la receptora no, se entiende? Ahora bien, a la receptora puedo usarla aunque no esté ovulando. El tema es que como no hubo ovulación, no hay cuerpo lúteo. Y recordemos que este se encarga de mantener la preñez durante el primer tercio de la gestación. Entonces a esta yegua le voy a tener que dar progesterona justamente durante todo el primer tercio. Luego de eso, recordemos que ya se forman las copas endometriales que secretan eCG y toda la bola. En conclusión, me va a salir un toque más caro poder hacer esto. Pero bueno, en esta industria la plata no suele ser un impedimento.
Los resultados esperados son una recuperación embrionaria del 70%. Se logran 4 preñeces por año de una misma donante en promedio. No lo van a tomar, es para que tengan una idea de la eficacia.
Superovulación – Consiste en lograr una ovulación doble, con el objetivo de obtener dos embriones para transferencia, o al menos, asegurarse uno. Se emplea Desloreína y hCG, para inducir la ovulación. Si bien teóricamente se podrían estimular múltiples folículos, debido a las particularidades anatómicas de la yegua (fosa de ovulación), con este método puedo obtener 2 ovulaciones como máximo, ya que después se forma un coágulo en la fosa de ovulación, impidiendo la salida de otro ovocito.
Criopreservación de embriones
Ya algo había dicho antes. Se puede hacer congelación o vitrificación. La congelación da bajos resultados, esmás conveniente la vitrificación. Antes de realizarla, se debe exponer al embrión a concentraciones altas y crecientes de crioprotectores. Con este método, no se forman cristales de agua.
La vitrificación es más efectiva para embriones de menos de 300 micras, es decir, en un lavaje uterino temprano.
Transferencia de ovocitos – Recolección del OVOCITO de una yegua donante y transferencia al OVIDUCTO de una yegua receptora inseminada, que criará y gestará al producto. Como la aplicación es direcamente en el oviducto, la técnica es quirúrgica, mediante laparotomía o laparoscopía. Es útil para yeguas viejas, sin capacidad de fertilización, con problemaes en el tracto reproductivo o alteraciones en la ovulación
Con este método, la sincronización entre yegua donante y receptora debe ser EXACTA, por lo cual debo hacer un seguimiento diario. El protocolo indica la aplicación de desloreína y hCG para inducir la ovulación. La aspiración en la donante y aplicación en la receptora deben hacerse dentro de las 24-35hs post inducción. Luego de la cirugía, se insemina a la yegua receptora.
Ovum pick up – OPU : Es parecido a la anterior, pero en este caso, tomamos un FOLÍCULO preovulatorio. Se realiza mediante una aspiración folicular transvaginal con guía ecográfica. Debemos hacer un seguimiento ecográfico del folículo preovulatorio. Recordemos que justo antes de la ovulación disminuye un poquitiiito su tamaño (está la imagen de la eco en la pág 8 del power si la quieren ver, la verdad no se ve una goma si le saco foto), aunque siempre por encima de los 35mm si hablamos de uno preovulatorio. Para esta técnica usamos una aguja de doble vía, es decir, que pueda separar lo que entra de lo que sale. Nótese que como buscamos un folículo, tenemos que llegar hasta el ovario. Inyectamos el medio de aspiración (parecido al lavaje que hacíamos en la transferencia, pero con menos volumen), raspamos el folículo y realizamos varios lavajes, luego de lo cual se aspira y se coloca en un recipiente estéril. Entonces se busca el ovocito -junto con las células del cúmulus ya que todavía no ovuló- 
Esta técnica tiene otras variantes: se puede hacer con folículos pequeños (en diestro), lo cual requerirá, luego de extraer el folículo, madurarlo in vitro. También puedo hacerlo extrayendo folículos de una yegua preñada, porque recordemos que durante el primer tercio de la gestación, aún habrá actividad ovárica (no me pregunten cómo verga hacés si está preñada, me acabo de dar cuenta que no lo explico pero bue)
Transferencia de ovocitos – TO: Se hace luego del OPU(oPU-TO jajaja) Se transfiere el ovocito con las células del cúmulus al oviducto de la receptora. La tasa de recuperación es del 70-90%, y la tasa de preñez es del 32%. Con semen fresco y refrigerado se logra una mayor eficacia que con semen congelado. No dijeron mucho más.-
Producción de embriones in vitro – Mediante FIV (Fertilización in vitro)
La verdad dijo que en equinos no sirve mucho así que les dejo la diapo pero pásensela por el orto. :D
ICSI – Inyección intracitoplasmática de un espermatozoide
Como su nombre lo indica, lo que se hace es tomar el ovocito e inyectarle el Z. Sirve para padrillos subfértiles, para Z congelados o liofilizados de padrillos que murieron, para Z sacados del epidídimo, etc. Respecto a la yegua, sirve cuando tiene fallas en la ovulación. La diferencia con el FIV es que acá directamente agarrás al espermatozoide y al ovocito y los forzás a unirse, entonces tiene más % de éxito.
La técnica se hace con una aguja muuuy chiquita, con la cual se pisa la cola del Z para inmovilizarlo, se aspira, y luego de eyecta el contenido en el citoplasma del ovocito. Luego, el cigoto se cultiva por 7-8 días en estufa hasta el estadío de blastocisto. La transferencia puede ser quirúrgica o no quirúrgica, con las técnicas que vimos antes.
¿Cómo me doy cuenta cuando un ovocito está maduro y listo para fecundar? Cuando observo el 1° corpúsculo polar, que es resultado de la finalización de la meiosis I. El ovocito está ahora en Metafase II. Al ser fecundado, finaliza la 2da división meiótica y recién ahí libera el 2do corpúsculo polar.
Clonación – Es la obtenciónde una copia de un individuo idéntica al original. Tal como vimos allá por genética básica, lo que se hace es transferir una célula somática (2n) a un ovocito que previamente ha sido enucleado, es decir, que se le extrajo el material genético. Básicamente, luego de la enucleación del ovocito, se inyecta un fibroblasto así como viene dentro del mismo. Se le aplica un pulso eléctrico, y esto hace que las membranas del ovocito y del fibroblasto se fusionen, y voilá, lo transferís a una hembra receptora así como está o lo podés cultivar primero. Suena re fácil pero obviamente es muuuy difícil y tiene muuuuuy bajo porcentaje de éxito. Sirve para preservación genética de especies en peligro de extinción, yeguas que no producen más crías, o para aumentar el número de animales de una genética determinada. Muy empleado en la industria del polo.
Sexado de embriones – En la clase 6 habíamos visto sexado del semen, acá directamente lo hacemos sobre un embrión. Se toma el blastocisto, se aspira una pequeña muestra del blastocele (biopsia) y se le hace PCR y electroforesis. Este proceso tarda 1 día, pero uno no espera todo ese tiempo para saber si transferirlo o no porque no te sirve más. Lo que se hace es transferirlo, y si al día siguiente en la electroforesis dice que es macho (recuerden que para el polo queremos hembras), se le da prostaglandina para que aborte y reinicie el ciclo.
Acá hay un mini cuadrito para que no se confundan un par de cositas importantes.
	 
	Transferencia de embriones
	Transferencia de ovocitos
	Transferencia de folículos
	ICSI
	Ovulación
	Conviene que ovule primero la dadora y luego la receptora
	Sincronización exacta entre yegua dadora y receptora
	NO - Se transfiere un folículo preovulatorio
	La yegua dadora ovula y se extrae el ovocito
	Fecundación en…
	Oviducto de yegua dadora
	Oviducto de yegua receptora
	Oviducto de yegua receptora
	In vitro y forzada
	Método de transferencia
	No quirúrgico
	Quirúrgico
	Quirúrgico
	Quirúrgico