10-Virologia- Antivirales y vacunas

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antivirales y vacunas
Antivirales
Definicion
Son fármacos que tienen la capacidad de interferir en algún paso del ciclo viral de tal modo que inhibe la replicación del mismo, y de esta forma se controla la diseminación de la infección dentro de los tejidos del huésped.
Desarrollo de un antiviral: 
1- conocimiento de la estructura y modelo de proteínas virales.
2- metodologías de alto número de experimentos simultaneos.
3- in vitro screening en células, menor toxicidad/mayor porcentaje de inhibición.
4- fase de aprobación: cohorte de voluntarios, escala mayor seguridad, cumplimiento de requerimientos regulatorios
Condiciones que debe cumplir:
· Alta especificidad y seguridad
· Baja toxicidad, acción mutagenica, carcinogénica, teratogenica.
· Buena solubilidad y biodisponibilidad
· Dosificación y costo de tratamiento conveniente.
Clasificación
1- según sitio de interacción:
1. Síntesis de ADN/ARN
2. Interaccion virus/celula
3. Desensamblaje
4. Síntesis proteica
5. Modificaciones post-traduccionales
6. Ensamblaje y egreso
2 según modo de acción
1. Terminador de cadena (análogo y no análogo de nucleosido)
2. Inhibidores de la maduración
3. Péptidos miméticos
4. Moléculas solubles
5. siRNA
Antivirales que intervienen en la sintesis de Acidos nucleicos
1. Acyclovir
2. Ganciclovir
3. Ribavirin
4. Azidotimidina/Zidovudina
5. Abacavir
6. Lamivudina
7. Emtricitabine
8. Foscarnet- no nucleosido
Acyclovir y derivados
Acyclovir
Estructura química: Análogo de nucleosido. Estructuralmente es similar al nucleosido desoxiguanosina. Es un análogo de la guanosina aciclico.
Modo de acción: Está dirigido a la ADN polimerasa viral. Antes de poder intervenir en la síntesis de ADN, necesita ser trifosforilada por tres enzimas distintas (por lo que es una prodroga). La primer fosforilacion ocurre por la timidina kinasa (TK) que es una enzima viral, por lo que solo es activa en células infectadas.
Por un lado el Aciclovir inhibe a la ADN polimerasa viral (y en menor medida la celular), y además es un terminador de cadena, o sea que lo incorpora en la cadena de ADN que está sintetizando, lo cual luego no puede incorporar el nucleosido siguiente (no tiene la desoxirribosa)
Espectro antiviral: Herpesvirus- Varicella Zostervirus.
Parte del ciclo inhibido: Replicación del genoma
Comentarios: no es activo en el estado de latencia del virus
Cidofovir
Es también un análogo de nucleosido (citidina), puede verse como un nucleosido aciclico con un motivo fosfato. Tiene como blanco la ADN polimerasa viral. A diferencia del anterior requiere dos fosforilaciones solamente y es independiente de la timidin kinasa. Inhibe la síntesis de ADN, enlenteciendo gradualmente la elongación de la cadena, terminándola.
Accion frente a: herpersvirus, poxvirus y adenovirus
Ganciclovir
Es un análogo del nucleosido guanina pero aciclico (o sea un nucleosido de guanina aciclico). Cuando ingresa a la celula es trifosforilado, primero por una kinasa viral y luego por las celulares. Su modo de acción interferir con la síntesis de ADN viral compitiendo con la desoxiguanosina trifosfato por la enzima, pero a diferencia de acyclovir no es terminador de cadena. Interfiere mas con la ADN polimerasa viral que con la celular.
Accion frente Herpesvirus particularmente contra citomegalovirus (mononucleosis)
Valaciclovir (valtrex®) y Famiciclovir (famvir®)
Valacyclovir L-varyl-ester de acyclovir. Análogo nucleosido. Inhibe la síntesis de ADN viral. Acción sobre herpesvirus. Mayor ventaja en comparación al acyclovir. Es prodroga, permite su administración oral aumentando su biodisponibilidad.
Famiciclovir famiciclovir es una prodroga que se convierte en panciclovir por metabolismo. Esta última es la que tiene acción contra los herpesvirus del mismo modo que Aciclovir
Rivavirin
Estructura química: Analogo de nucleosido de purina.
Modo de acción: una vez administrado es trifosforilado por enzimas celulares. Su mecanismo de acción concreto se desconoce pero se postula que:
1. Inmunomodulacion: permitiría el paso de LTh2LTh1 aumentando el efecto posterior de los LTcd8. Su acción es sin fosforilar
2. Inhibe la IMPDH: impidiendo la fosforilacion de GMPGTP. Acción como rivavirin monofosfato
3. Inhibe la ARN polimerasa dependiente de ARN acción como trifosfato.
4. Mutagenesis de los ARN virales: partículas virales defectuosas acción como trifosfato
Espectro antiviral: Amplio rango de virus ARN. Administración en aerosol contra el virus respiratorio sincicial (RSV). Su administración oral junto a interferón alfa 2ª es usado para combatir el virus de la hepatitis C (HCV). Actúa contra lassa fever virus (Arenavirus-LFV)
Parte del ciclo inhibido: Replicación del genoma
Comentarios: efectos adversos. Supresión de la medula osea y daño oxidativo de membranas.
Sofosbuvir
Estructura química: análogo nucleotidico
Mecanismo de acción: inhibe la polimerasa viral NS5B
Espectro antiviral: virus de Hepatitis C
Parte del ciclo inhibido: replicación del genoma
inhibidores de la transcriptasa reversa
Se los divide en dos grupos:
A- inhibidores de la TR no nucleosidos se unen al sitio activo de la TR en un sitio diferente al de los nucleosidos naturales análogos. Estos compuestos inducen un cambio conformacional de la enzima alterando el sitio catalítico. Son inhibidores no competitivos de la TR del HIV-I. no requieren fosforilacion intracelular para actuar.
· Delaviridine
· Nevirapine
B- inhididores de la TR nucleosidos Stavudina es un análogo de nucleosido artificial y lamivudina es un análogo de citosina. Necesitan ser trifosforilados por kinasas celulares para actuar. Son inhibidores competitivos de la TR. Son terminadores de cadena.
· Zidovudina
· Lamivudina
· Stavudina
Azidotimidina (AZT)
Estructura química: Analogo de nucleosido (timidina)
Modo de acción: una vez incorporado a la celula es trifosforilado por enzimas celulares. Es un inhibidor competitivo de la TR, la cual incorpora este análogo en la cadena naciente de ADN proviral imposibilitando la terminación de la misma (terminador de cadena).
Espectro antiviral: HIV-1 HIV-2. VIF. retrovirus
Parte del ciclo inhibido: Retrotranscripcion del genoma
Comentarios: efectos adversos. Supresión de la medula osea por acumularse en células de alta tasa de división también.
Adefovir fosfonato de nucleosido aciclico. Es activo contra retrovirus y hepdnavirus. Solo necesita dos fosforilaciones y puede evadir una reacción que limita la actividad de análogos como el AZT.
inhibidores de proteasas
Las proteasas virales son cruciales para muchos virus tales como el HIV, picornavirus y flavivirus
Los inhibidores utilizados en el caso de HIV imitan el sitio de clivado en los precursores gag y gag-pol (análogo de péptido.es inhibidor competitivo de la proteasa). Esta droga difunde por la célula y es incorporada dentro del virion cuando se produce la salida por gemación.
Dentro de estas drogas tenemos: 
· Amprenavir
· Ritonavir
· Saquinavir
Parte del ciclo inhibido: maduración en el caso del HIV. Lo que genera partículas no infectivas
Ej: la proteasa del HIV cliva gag-pol y gag generando proteínas estructurales (p17-p24-p9-p7) y proteínas funcionales (proteasa-RT-RNAasaH e integrasa)
compuestos que bloquean los canales ionicos
· Amantadina
· Rimantadina
Amantadina
Estructura química: amina tricíclica
Modo de acción: bloquea M2, por lo que cuando se produce la acidificación del endosoma y se produce la fusión de las membranas, está imposibilitado el paso de protones por el canal M2 por lo que no se acidifica dentro del virion imposibilitando la liberación de M1 de las ribonucleoproteinas.
Amantadina interactúa con la región trasmembrana del canal. M2 está formado por 4 estructuras idénticas. Tiene 3 dominios: ectodominio-transmembrana-endodominio
Espectro antiviral: influenza tipo A
 Parte del ciclo inhibido: Decapsidacion o denudacion
Comentarios: influenza tipo B tiene una proteína diferente: NB. No es toxico. Actúa dentro de las 48 hs?. Rápida mutación en animales, no se registra mutación en humanos.
Rimantadina: es un alfa metilderivado de amantadina. Actúa del mismo modo que el anterior y es igual en todas sus características excepto que no atraviesa la BHE.
Inhibidores de la neuraminidasa
· Zanamivir
· Oseltamivir
Estructura química: análogo del ácido sialico
Modo de acción: Bloquea la función de la actividad de neuraminidasa. La neuraminidasa (=sialidasa) viral cumple la función de digerir los componentes de ácido neuraminico que es un componente del ácido sialico, que se encuentra en las membranas de las células para que cuando salen por gemación no se “peguen” entre ellos. Al no removerse el ac. Sialico, los virus geman de la célula pero siguen adheridos, se forman acúmulos de virus bajando la infectividad.
Espectro antiviral: influenza tipo A y B
 Parte del ciclo inhibido: Salida
Comentarios: no tóxicos. Administración oral en Oseltamivir, e inhalatoria en Zanamivir.
Favipiravir
Estructura química: derivado de la pirizinamida
Mecanismo de acción: actúa inhibiendo la acción de la enzima RNA polimerasa, esencial para la replicación del virus. Favipravir se convierte en ribofuranosil-trifosfato por enzimas celulares, esta sustancia inhibe de forma selectiva la RNA polimerasa de los virus ARN, sin producir toxicidad aparentemente sobre las células de mamífero. 
Espectro viral: influenza y otros virus ARN (inclusive Ebola en ratones)
Resistencia a los antivirales
Generalmente todos los microorganismos se pueden volver resistentes a un antiviral debido a mutaciones que se generan en el sitio blanco de acción de la droga. Para un efectivo tratamiento antiviral una respuesta inmune competente es esencial para una recuperación clínica. Las fallas con antivirales se reportan en individual no competentes inmunológicamente o por la emergencia de variantes mutantes.
La adquisición de resistencia es multifactorial e incluye:
Mutacion puntuales cuando las polimerasas virales copian el genoma y agregan mal un nucleótido, no poseen una exonucleasa que corrija luego ese error. Esto ocurre mas en ARN que ADN virus. Esto sumado a la alta tasa de replicación genera una población de mutantes que son resistentes al tratamiento.
Los tratamientos con antivirales terminan ejerciendo una presión selectiva en los virus naturalmente por dicha mutaciones generan resistencia
Recordatorio de ADN
vacunas
	Caracteristicas
	Replicativas
	No replicativas
	Inmunidad mediada por LTcd8
	Si. alta
	Baja o nula
	Duración de la inmunidad
	Larga
	Corta
	Necesidad de adjuvante
	No 
	Si 
	Numero de dosis
	Una en gral
	Varias 
	Via de administración
	Iny. U oral
	Iny.
	Estabilidad térmica
	Labil
	Estable
	Reversion de virulencia
	Raro 
	No 
	Cantidad de antígeno por dosis
	Pequeña 
	Mucha
	Uso en hembras gestantes
	No 
	Si 
vacunas replicativas
Contiene virus vivo prporcionando que el agente replique en el organismo del hospedadero con el resultado de una amplificación viral con aumento de presentación antigénica al SI semejantes a una infección natural.
Vacunas a…:
1- Virus patogénico
2- Virus heterologo
3- Virus atenuado
· Naturalmente atenuados
· Por pasaje en cultivos celulares
· Por pasajes en huevo embrionado
· Por pasaje en especies heterologas
· Delecion de genes (deleteadas)
4- Vectores virales
virus patogenico
Se utiliza el virus vivo sin atenuar. Un ejemplo de ello es en el caso del ectima contagioso bovino que genera lesiones orales y el hocico impidiendo que coman. Lo que muchos productores hacen es inmunizar por escarificación de costras de animales enfermos en la región interior de la pelvis de los sanos donde las lesiones cursan sin síntomas
vacuna con virus de especie heterologa
Uso de virus que son antigénicamente similares a otros virus
Por ejemplo el poxvirus bovino es antigénicamente similar al virus de la viruela humana pudiendo ser usado para inducir inmunidad en humanos
Herpesvirus de otra especie para inmunizar contra Marek en aves donde son antigénicamente similares o rotavirus bovino para inmunizar contra rotavirus porcino.
vacuna a virus atenuado
Son virus que fueron sometidos a procedimientos para reducir su poder patogénico manteniendo su capacidad de replicación y preservando sus características antigénicas
La replicación de estos virus una vez administrados se da en la zona de inoculacion impidiendo una diseminación sistémica por eso no produce signos de enfermedad en los vacunados
La inmunidad generada es de mayor magnitud, se genera tanto una rta celular como humoral (activación de linfocitos Th, citotóxicos y produccion de anticuerpos).
Además se genera inmunidad de mucosa.
Desventaja:
No son totalmente segura en el hecho que pueden revertir su virulencia, por ello no se debe vacunar individuos inmunosuprimidos.
Vacunas atenuadas como por ejemplo contra IBR y DVB retienen su capacidad de replicar e infectar fetos y causar perdidas reproductivas por ello no se vacuna animales preñados. 
Ejemplo:
· Enfermedad de marek
· Parvovirus y moquillo canino
· Rinotraquitis felina
· DVB, IBR.
Metodos de atenuación
1- Virus naturalmente atenuado
Uso de cepas virales naturalmente poco virulenta.
Ejemplo: serotipo 1 y 2 de virus de enfermedad de MArek para inmunizar contra serotipo 1 oncogenico.
2- Atenuación por pasajes en cultivo celular
Método mas utilizado. Se evalúa por Efecto citipatico.
Consisten en hacerlo crecer en cultivos celulares e ir pasándolo de uno a otro generándole un ambiente diferente no encontrado en el hospedadero natural sin eliminar la capacidad de replicación.
Los pasajes puede ser usando:
· Linaje celulares de especie diferente a que se va a vacunar
· Pasaje en célula de misma especie pero diferente tejido u órgano al que normalmente lo hace
Durante los pasajes los virus acumulan mutaciones puntuales, algunas probablemente en genes relacionado a la virulencia resultando en la atenuación del virus.
3- Atenuación por pasaje en huevo embrionado
Se utilizan huevo embrionado de gallina. Se evalua por las lesiones que puede causar al embrión. Se usa para infeccciones aviares como LTI o influenza. De hecho la vacuna d ela gripe anual se realiza en huevo embrionario
4- Atenuacion por pasaje en especie heterologa
Por ejemplo hacer pasajes en conejos, ratones, cobayos.
Pierde infectividad para el huésped natural y aumenta en el animal en el cual se hace los pasajes
5- Virus temperatura sensible
Selección de variantes que tienen capacidad limitada de replicar a temperaturas corporales de 37C. replican eficientemente a temperatura bajas como 30-33C
Se seleccionan esas variantes de virus que replica a esa temperatua siendo incapaces de replicar a temperatura corporal
Ejemplo: virus respiratorios e influenza.
La administración intranasal hace que replica cerca de la superficie corporal donde la temperatura es baja.
6- Atenuacion por delecion de genes (vacuna deleteada)
Cuando se conoce los genes de virulencia, mediante técnicas de ADN recombinante y manipulación genetica se pueden remover o inactivar genes relacionados a la virulencia, preservando la capacidad de replicar y reteniendo su capacidad inmunogena pero sin producir enfermedad.
El virus se debe mantener viable y estable de la posibilidad de encontrarse mutado evaluando esto por pasajes celulares. 
Ejemplo: herpesvirus tiene un gen que codifica para una timidin finasa (TK) asociada con la capacidad del virus de replicar en neuronas (neurovirulenta). Además tiene genes que codifica para glicoproteínas como gE; gI y gC que no son escenciales para la viabilidad y replicación. La eliminación de TK produce virus atenuado con capacidad reducida de producir infección neurogenica. La delecion conjunta de otro gen resulta en un virus vacunal mas seguro y al mismo tiempo capaz de desarrollar una respuesta inmune en el huésped.
Virus con marcador antigénico (DIVA) 
Son vacunas deleteadas que inducen una respuesta serológica en animales vacundos que puede ser distinguida de una respuesta natural.
Esto es útil para programas de control de enfermedades y erradicación de virus que producen enfermedades latenteso persistentes.
Son obtenidas por deleciones de genes que codifica una proteína de envoltura del virion. La diferenciación se realiza mediante test de ELISA que detecte anticuerpos contra la proteína ausente del vurus vacunal y que si esta presente en el virus de campo.
Ejemplo: la vacuna contra la enfermedad de Aujesky que es producida por HVs porcino tipo 1 sufrio una delecion del gen que codifica para la glicoproteína E (gE, proteína NO escencial para la replicación). De esa forma cuando se extrae suero de animales vacunados, a la prueba de ELISA los no infectados van a dar negativos (sin gE) y los infectados positivos.
vacunas vectorizadas
Son Virus naturales o artificialmente atenuados pueden ser usados para cargar con uno o mas genes que codifican antígenos virales inmunoprotectores contra otros virus funcionando esos virus como vectores vivos para inmuizar.
Los genes de interés son insertados en el genoma del vector por manipulación genética. El resultado es un microrganismo recombinante que no solo expresa sus propias proteínas sino que también expresa proteínas heterologas produciendo una respuesta inmune contra las proteínas de vector y contra las del virus heterologo.
Caracteristicas del vector:
· Poco o nula capacidad replicativa
· Genoma grande
· No debe ser patogénico
· Estimular una respuesta inmune en el mismo sitio que lo haría el virus de interés.
Los vectores virales mas usados: PoxV, HVs y AdVs.
Ejemplo: el poxvirus de canario se utiliza para vacunar contra moquillo. A este vector se le inserta los genes de las glicoproteínas hemaglutininas (H o HA) y los de fusión (F) de moquillo (paramyxovirus). Una vez vacunado el virus replica generando inmunidad contra el virus.
Otro caso interesante son caninos silvestres vacunados contra rabia usando una vacuna recombinante donde el poxvirus expresaba G y RabV. La administración es oral y se dispersaban esos alimentos con vacuna por el bosque asi lo ingerian.
Adenovirus: usado como vector para aftosa o papiloma genital en humanos
Herpesvirus: usado como vectos de rabia, virus sinsicial respiratorio DVB. En porcinos como vector contra circovirus y otros virales porcinos.
Ventaja: 
· No sufren interferencia de inmunidad pasiva materna
· No hay riesgo de que se torne virulento 
· Buena estimulación de la inmunidad de mucosas por replicación en el sitio de entrada y sistémica (penetración intracelular)
Las bacterias también pueden ser vectores que pueden expresar antígenos virales: enterobacterias (E.coli) en vacunas vectorizadas contra virus entéricos, administrados via oral tienen buena llegada a tejido linfoide asociado a mucosa intestinal.
vacunas no replicativas
No contiene el agente vivo, eso hace que sean mas seguras. No ofrece la posibilidad de reversión de la virulencia.
Como desventaje tiene que no replican por ende no se amplifica en antígeno y no inducen respuesta mediada por LTc
Vacunas…:
1- Inactivada
2- a subunidades
3- Proteinas recombinantes
4- Peptidos sintéticos
5- ADN/ARN
vacunas a virus inactivado
Es un virus infectivo original que pasa por la eliminación irreversible de su infectividad por métodos físico o químicos.
Son partículas virales integras muertas que no replican por lo que son seguras, y no hay posibilidad de reversión del virus.
El virus es inicialmente amplificado en sistemas biológicos tradicionales (cultivos celulares o huevo embrionado) hasta conseguir buenos títulos. Luego se somete a esos cultivos a un proceso de inactivación con el objetivo de eliminar la viabilidad procurando conservar la capacidad antigénica.
Agentes para inactivar mas usados:
· Formol
· Etilenemina
· B- propiolactona
La respuesta es mas Th2 que Th1, con una gran producción de anticuerpos por parte de los plasmocitos.
Aun asi se necesita revacunar para estimular las células de memoria y elevar mas los títulos para que sean protectores y en general se requiere de vacunaciones anuales (en el caso de los perros por ejemplo).
Dada que estas vacunas no replican se necesitan grandes concentraciones de antígeno y requiere de uso de potenciadores de la respuesta inmunologicca (adjuvantes).
vacuna de subunidades virales
 El sistema inmune no reconoce una estructura entera de un virus, reconoce pequeñas regiones de proteínas que componen esas partículas virales que no son mas que secuencias de aminoácidos denominados epitopes.
Algunos epitopes son mas inmunogenicos que otros y son capaces de ejercer una buena respuesta inmune si se las incorpora en el organismo.
La producción de esta vacuna consiste en escalarla en cultivos celulares para luego ser purificadas esas estructuras virales por métodos químicos para generar la vacuna que se administra también con adyuvantes para mejorar la presentación antigénica y la respuesta inmune.
Ejemplo: vacuna contra gripe aviar elaborada en huevo embrionado y posteriormente purificada las hemoaglutininas virales para contruir la vacuna.
vacuna de proteinas recombinantes
Los genes de interés de un virus son introducidos (mediante un plasmido) en el genoma de bacterias o levaduras que pasan a producir el antígeno en grandes cantidades posibilitando luego la purificación de tales partículas virales y la posterior administración de la vacuna junto a adyuvantes.
Tiene la ventaja que es de bajo costo la producción (es solo hacer crecer bacterias).
Usando este modelo también se pueden introducir en esos organismos recombinantes genes que codifican para proteínas de capside que pueden ser clonados por plasmidos de transferencia.
La proteínas producidas se organizan como una estructura semejante al capside del virus pero sin el genoma en su interior (virus-like particles) usados como vacuna (ejemplo: rotavirus, calcivirus, picornavirus).
Ejemplo: hay vacunas contra ViLeF producidas por la expresión de la gp70 en Escherichia coli.
vacunas de peptido sintetico
Se elaboran en laboratorio . son químicamente análogos de determinantes antigénicos que contienen 3-10 aminoácidos y son capaces de estimular la producción de anticuerpos neutralizantes.
Pero como los LB reconocen antígenos en su conformación natural a veces esos antígenos no presentan la conformación terciaria o cuaternaria que requiere para ser reconocidas por lo que la inducción de inmunidad es baja.
vacunas Adn y arn
Vacuna ADN
Consiste en un ADN exógeno que contiene un gen de la proteína de interés y una región promotora que regula su expresión.
Lo interesante es que una vez inoculada (intradérmica o intramuscular). Genera una respuesta humoral y celular.
El gen de interés es insertado en un plasmido de expresión que contiene un promotor eucariota con un marcador de selección. La producción de este ADN es mediado por cultivo en células para que produzcan mas plasmideos con el gen (E. coli) siendo purificada e inoculada
Usa adyuvantes: unos lípidos catiónicos
Vacuna ARN
Se usan ARN mensajeros que codifican proteínas virales de interés producidas en vitro e incorporadas en microparticulas para que sean incorporados en las células y asi pueden ser traducidas esas proteínas.