Analisis-de-polimorfismos-de-un-solo-nucleotido-SNP-del-gen-modulador-de-especies-reactivas-de-oxgeno-1-romo1-en-pacientes-mexicanos-con-osteoartritis-de-rodilla

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS DE UN SOLO NUCLEÓTIDO 
(SNP) DEL GEN MODULADOR DE ESPECIES REACTIVAS 
DE OXÍGENO 1 (ROMO1) EN PACIENTES MEXICANOS 
CON OSTEOARTRITIS DE RODILLA. 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
 
PRESENTA 
CLAUDIA FRIDA BLANCAS MEZA 
 
 
 
 CIUDAD UNIVERSITARIA, CD.MX., 2016. 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: María Benita Leonor Fernández Salgado 
VOCAL: Tzvetanka Dimitrova Dinkova 
SECRETARIO: Javier Fernández Torres 
1er. SUPLENTE: Claudia Teresa Tovar Palacio 
2° SUPLENTE: Alberto Ortega Vázquez 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
Laboratorio de Líquido Sinovial 
Instituto Nacional de Rehabilitación “Luis Guillermo Ibarra Ibarra” 
Secretaría de Salud 
 
 
ASESOR DEL TEMA: M. EN C. Javier Fernández Torres 
 
 
 
 
SUSTENTANTE: Claudia Frida Blancas Meza 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Soy de las que piensan que la ciencia tiene una gran belleza. 
Un científico en su laboratorio no es sólo un técnico: es 
también un niño colocado ante fenómenos naturales que le 
impresionan como un cuento de hadas.” 
 
Marie Curie 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 Página 
Índice de figuras i 
Índice de tablas ii 
Abreviaturas iii 
Resumen v 
1. Introducción 1 
1.1 Osteoartritis y su prevalencia 1 
1.2 Fisiología del cartílago articular 2 
1.3 Fisiopatología y clasificación de la OA 4 
1.4 Las especies reactivas de oxígeno y estrés oxidante 7 
1.5 El papel del estrés oxidante en la OA 9 
1.6 Modulador de especies reactivas de oxigeno 1 (ROMO1) 11 
1.7 Polimorfismos genéticos 13 
2. Justificación 16 
3. Pregunta de investigación 16 
4. Hipótesis 16 
5. Objetivo 17 
5.1 Objetivo general 17 
5.2 Objetivos particulares 17 
6. Material y métodos 17 
6.1 Población de estudio 17 
6.2 Criterios de inclusión 18 
6.2.1 Grupo de pacientes 18 
6.2.2 Grupo de contraste (controles) 18 
6.3 Criterios de exclusión 18 
6.4 Criterios de eliminación 18 
6.5 Operacionalización de variables 19 
6.5.1 Definición y operacionalización de variables 19 
6.6 Descripción general del estudio 19 
 
 
 
6.6.1 Recolección de muestras 19 
6.6.2 Determinación de parámetros bioquímicos 20 
6.6.3 Obtención del ADN genómico 20 
6.6.3.1 Material, reactivos y equipos para aislar el ADN genómico 20 
6.6.3.2 Técnica para aislar ADN genómico 21 
6.6.4 Preparación del gel de agarosa al 1% y su visualización 22 
6.6.5 Selección de los SNPs del gen ROMO1 23 
6.6.5.1 Características generales de los SNPs analizados 24 
6.6.6 Genotipificación y características de la PCR 24 
6.7 Análisis estadístico 27 
6.8 Condiciones éticas 28 
7. Resultados 29 
7.1 Cantidad y calidad del ADN 29 
7.2 Descripción de la población de estudio 29 
7.3 Frecuencias genotípicas y alélicas para los polimorfismos del gen 
ROMO1 
30 
7.4 Asociación de los polimorfismos de ROMO1 con la OA 33 
8. Discusión 38 
9. Conclusiones 40 
10. Perspectivas 41 
11. Referencias 42 
12. Anexos 49 
Anexo I. Carta de consentimiento informado 49 
Anexo II. Medidas de bondad de ajuste para la OA 
 
51 
 
 
 
 
 
 ii 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura Página 
1 Prevalencia de la OA a nivel mundial 2 
2 Composición del cartílago articular 3 
3 Factores implicados en el desarrollo y progresión de la OA 4 
4 Escala radiográfica de Kellgren y Lawrence para clasificar los 
grados de OA 
5 
5 Estrés oxidante y su repercusión en la salud 9 
6 Mecanismos moleculares durante el desarrollo de la OA 10 
7 Mecanismos relacionados con el estrés oxidante en la 
patogénesis de la OA 
11 
8 Ubicación de la proteína Romo1 en la mitocondria 12 
9 SNP, la cadena de ADN en 1 difiere de la del ADN en 2 en un 
solo par de bases 
14 
10 Clasificación de SNPs de acuerdo con su localización en el 
genoma 
15 
11 Gel de agarosa al 1% para muestras de ADN 23 
12 Ubicación de los SNPs estudiados en el gen ROMO1 24 
13 Funcionamiento de las sondas TaqMan 25 
14 Discriminación alélica de los SNPs del gen ROMO1 en ambos 
software 
27 
 
 
 
 
 
 
 
 
 iii 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
Tabla Página 
1 Localización y causa de manera particular para cada tipo de 
OA 
6 
2 Definición y operacionalización de variables 19 
3 Características generales de los SNPs analizados 24 
4 Polimorfismos de un solo nucleótido estudiados y su cambio 
en la secuencia de ADN 
26 
5 Cuantificación de ADN en muestras de pacientes con OA y 
controles 
29 
6 Descripción de la población de estudio 30 
7 Frecuencias genotípicas y alélicas para los polimorfismos del 
gen ROMO1 
32 
8 Razones de momio para los polimorfismos del gen ROMO1 y 
OA (Modelo bivariado) 
34 
9 Razones de momio para los polimorfismos del gen ROMO1 y 
OA (Modelo multivariado) 
35 
10 Razones de momio estratificadas por género para los 
polimorfismos del gen ROMO1 y OA (Modelo multivariado) 
37 
11 Comparación de los SNPs analizados en diferentes 
patologías reportadas en la literatura. 
37 
 
 
 
 
 
 
 
 
 iv 
 
ABREVIATURAS 
ADAMTS A disintegrin and metalloprotease. Las agrecanasas son enzimas 
proteolíticas que degradan agrecano. 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
AR Artritis Reumatoide 
ATP Trifosfato de adenosina 
CAR Colegio Americano de Reumatología 
CAT Catalasa 
DSV DNA sequence variant (variantes de la secuencia de ADN) 
EO Estrés oxidante 
ERO Especies reactivas de oxígeno 
GPX Glutatión peróxidasa 
IC Intervalo de confianza 
IL Interleucina 
IMC Índice de masa corporal 
INR Instituto Nacional de Rehabilitación 
KDa Kilo Daltones 
K-L Escala radiográfica de Kellgren y Lawrence 
KOOS Evaluación de rodilla: Knee Injury and Osteoarthritis Outcome Score 
µL Microlitro, millonésima parte de un litro (0.000001 L) 
MEC Matriz extracelular 
MMP Metaloproteinasas o metaloproteasas 
ng Nanogramo, mil millonésima parte de un gramo (0.000000001 g) 
ng/µL Unidad de concentración en nanogramos por microlitro 
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato 
NPY Neuropéptido Y 
OA Osteoartritis 
ON Óxido nítrico 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa 
PGE2 Prostaglandina E2 (Dinoprostona) 
 
 v 
 
Redox Reacción de reducción-oxidación u óxido-reducción 
RM Razón de momio (Odds Ratio, OR en inglés) 
ROMO1 Reactive oxygen species modulator 1 (modulador de especies 
reactivas de oxígeno 1) 
SNP Single Nucleotide Polymorphism (polimorfismo de un solo nucleótido) 
SOD Superóxido dismutasa 
TNF Tumor necrosis factor (factor de necrosis tumoral) 
UTR Región no codificante (untranslated region) 
UV Luz Ultravioleta 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 vi 
 
RESUMEN 
La osteoartritis (OA) es un desorden degenerativo multifactorialque se caracteriza 
por la destrucción del cartílago articular, formación de osteofitos y esclerosis del 
hueso subcondral; su desarrollo y progresión están mediados por citocinas pro-
inflamatorias y especies reactivas de oxigeno (ERO), las cuales generan un 
estado de estrés oxidante (EO). El EO daña a las células en todos sus niveles 
(ADN, proteínas y lípidos). Recientemente, se ha identificado una proteína 
mitocondrial denominada Romo1 que modula las ERO en diferentes estados de 
EO, la cual es codificada por el gen ROMO1. Este gen, presenta polimorfismos de 
un solo nucleótido (SNPs) y se desconoce si éstos SNPs puedan tener 
implicaciones en la modulación de ERO. Métodos. Se determinaron las 
frecuencias alélicas y genotípicas de los SNPs rs6060567, rs5050565, rs6058303 
y rs3088078 del gen ROMO1 en muestras de pacientes mexicanos con OA de 
rodilla comparándolas con un grupo de contraste. Se analizaron 100 muestras de 
OA y 100 controles por el método de discriminación alélica utilizando PCR en 
tiempo real mediante el uso de sondas TaqMan. El método de análisis estadístico 
fue mediante modelos bivariados y multivariados ajustados por edad, género, IMC, 
lugar de nacimiento y parámetros bioquímicos. Resultados. Hubo una asociación 
estadísticamente significativa del heterocigoto G/C del polimorfismo rs6060567 
(RM=0.44, P=0.03, IC95%=0.21-0.91), la cual confiere protección al desarrollo de 
OA. La distribución de los otros polimorfismos fue similar en los dos grupos de 
estudio; sin embargo, se observa una tendencia hacia la protección. Conclusión. 
La presencia del SNP rs6060567 del gen ROMO1 se asoció favorablemente como 
un factor de protección contra la OA. Explorar otros SNPs de regiones funcionales 
podría aportar mayor evidencia sobre la participación de ROMO1 en el desarrollo 
de la OA. 
 
 
 
 
 1 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1 Osteoartritis y su prevalencia 
La osteoartritis (OA) es una enfermedad crónico-degenerativa que se caracteriza 
por la pérdida del cartílago articular y es considerada uno de los padecimientos 
musculo-esqueléticos más comúnes en el mundo; tiene un gran impacto en salud 
pública debido a que es la causa más frecuente de dolor y discapacidad en 
adultos mayores. A pesar de esto, la OA sigue siendo una condición enigmática 
para el epidemiólogo [1]. Puede afectar a gran parte de las articulaciones, como 
cadera y manos; sin embargo, su incidencia es más frecuente en las rodillas, lo 
que condiciona mayor discapacidad en la población [2]. De acuerdo a su 
severidad, puede generar crepitación, hinchazón, deformidad y destrucción de la 
articulación, provocando dolor crónico y discapacidad [3]. 
 
A nivel mundial, el 10% de la población con 60 años o más, tiene problemas 
clínicos significativos que pueden ser atribuidos al desarrollo de OA; además, se 
estima que el 9.6% de los hombres y 18% de las mujeres mayores de 60 años 
presentan algún signo y/o síntoma de OA, de acuerdo a los reportes de la 
Organización Mundial de la Salud (OMS) [4, 5] (Figura 1). La OA de rodilla, a 
diferencia de otras articulaciones, se caracteriza por presentar manifestaciones 
clínicas más severas, afectando a un 16% a mujeres y a un 5% a hombres 
mayores de 60 años [6]. Debido al incremento en la esperanza de vida media de la 
población, se estima que la prevalencia de la OA aumente significativamente en 
los próximos años [7]. 
 
 
 
 
 
 
 2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Prevalencia de la OA a nivel mundial [4] (Diseño de autor). 
 
 
1.2 Fisiología del cartílago articular 
El cartílago articular es considerado como un tejido avascular, aneural y alinfático, 
constituido únicamente por células llamadas condrocitos, y una compleja matriz 
extracelular (MEC) sintetizada por ellas. La MEC se compone de proteoglicanos, 
colágeno y agua; además, sufre una remodelación continua regulada por factores 
anabólicos (factores de crecimiento) y catabólicos (interleucinas, radicales libres, 
prostaglandinas, etc.). La regulación de la diferenciación de los condrocitos y la 
homeostasis de la MEC, son fundamentales para la función adecuada de la 
articulación [8, 9] (Figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Composición del cartílago articular [8]. 
 
 
El cartílago articular presenta baja actividad metabólica debido a su escasa 
celularidad, a pesar de que los condrocitos son células metabólicamente muy 
activas puesto que son capaces de responder a diversos estímulos. El condrocito 
es el principal contribuyente para la producción de MEC, además de que 
proporcionan la capacidad funcional y mecánica para soportar compresión, tensión 
y cizallamiento a través de las diartrosis o articulaciones sinoviales [10]. 
 
La regulación metabólica del cartílago articular está mediada por diversas rutas de 
señalización, que pueden verse alteradas por factores presentes en su entorno 
bioquímico y mecánico. Dentro de éstos factores destacan las citocinas pro-
inflamatorias y los factores de crecimiento, los cuales tendrán un efecto en el 
equilibrio del metabolismo anabólico y catabólico. Por ello los condrocitos son 
fundamentales, puesto que mantienen la homeostasis del cartílago, a través de la 
producción de componentes de la MEC [11]. 
 
 4 
 
1.3 Fisiopatología y clasificación de la OA 
La etiología y génesis de la OA son múltiples, ya que existen diversos causantes 
de la enfermedad que generan alteraciones fisiológicas del cartílago articular [9]. 
En la Figura 3 se muestra una construcción conceptual de la etiología 
multifactorial de la OA, donde se observan los factores de riesgo que provocan el 
desarrollo y progresión de la OA. Dentro del desarrollo destaca la genética, la 
edad, raza y género (prevalentemente en mujeres), el índice de masa corporal 
(IMC), obesidad, factores hormonales (menopausia) y nutricionales (déficit de 
vitamina C y D). En cuanto a la progresión se encuentra la carga articular, lesión 
local repetida, cirugías, traumatismos, malformaciones y desgaste articular en 
deportistas de alto rendimiento [12, 13]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Factores implicados en el desarrollo y progresión de la OA (Diseño de autor). 
 
 
 5 
 
Además de factores de desarrollo y progresión, también influyen factores 
moleculares. En las primeras fases de la OA se observa el depósito de fibras de 
colágena y proteoglicanos en cúmulos desordenados, lo que refleja una mayor 
producción de estas sustancias como respuesta a la destrucción aumentada. Sin 
embargo, debido al desequilibrio en la homeostasis que se genera en la MEC, el 
estado redox también se ve afectado ocasionando un incremento en la síntesis de 
radicales libres y por ende un estado de estrés oxidante (EO) persistente [9]. 
 
Debido a la heterogeneidad de la OA, el Colegio Americano de Reumatología 
(CAR) estableció criterios clínicos y radiológicos para clasificar la OA. Desde el 
punto de vista clínico, se incluyen grado de dolor y la aparición de nódulos, los 
cuales pueden causar crepitación, deformidad y por ende afectar la movilidad de 
las articulaciones, hasta llegar a la rigidez de la mismas; a nivel radiológico, se 
estableció la escala de Kellgren y Lawrence (K-L) donde se identifican alteraciones 
óseas y/o la presencia de osteofitos, formación de quistes, irregularidades en el 
contorno articular y disminución del espacio articular [14-16] (Figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Escala radiográfica de Kellgren y Lawrence para clasificar los grados de OA. Las flechas 
indican la presencia de osteofitos, el desgaste y disminución del espacio articular [15]. 
 
 
 6 
 
Además de la escala radiológica, se emplea una clasificación tradicional que 
divide a la OA en primaria o idiopática, donde la causa no es conocida y se basa 
en la localización del sitio principalde compromiso a nivel esquelético (rodillas, 
columna, cadera, falanges, etc.), determinando que no sólo el cartílago articular es 
el responsable del desarrollo de la patología, sino que desde el punto de vista 
anatómico estructuras totalmente desprovistas de cartílago también lo favorecen; y 
la secundaria o artrosis pos-traumática, en la que se conoce la causa y toma en 
cuenta a factores metabólicos, anatómicos, inflamatorios, desórdenes congénitos 
y de trauma (Tabla 1). Además, se ha reportado que la prevalencia de riesgo de 
OA secundaria es mayor en hombres y mujeres deportistas de gran rendimiento 
[17-19]. 
 
Tabla 1. Localización y causa de manera particular de cada tipo de OA. 
Clasificación Localización/Causa 
Primaria o 
idiopática 
Manos: OA erosiva. 
Rodilla: Diversos factores inician proceso de degradación del 
cartílago articular. 
Columna: Espondilitis, Articulaciones intervertebrales. 
Secundaria o 
post-traumática 
Traumática: Fractura, infección, cirugía articular. 
Desórdenes congénitos: Dislocación de la cadera, displasia 
condral. 
Metabólica: Depósito de cristales de calcio, hemocromatosis. 
Inflamatoria: Artritis reumatoide, artritis séptica. 
Otros desórdenes óseos y articulares: Necrosis avascular. 
 
 
 
 7 
 
Desde el punto de vista anatómico la OA, se clasifica de acuerdo a su sitio de 
origen, que incluye al cartílago debido a daño por traumatismo, condroplastias o 
factores genéticos; ligamentos, causado por lesiones de ligamento cruzado 
anterior; meniscos por degeneración meniscal, extrusión meniscal; membrana 
sinovial por inflamación ante presencia de cristales de urato monosódico y 
pirofosfato de calcio o por casusas autoinmunes; y finalmente, en hueso 
favorecido por necrosis a vascular o fracturas [19]. 
 
1.4 Las especies reactivas de oxígeno y estrés oxidante 
Las especies reactivas de oxigeno (ERO) se producen continuamente en el 
organismo como parte del metabolismo y también actúan como segundos 
mensajeros en vías de señalización. Las ERO, tales como anión superóxido (O2.), 
peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (HO•); y del nitrógeno (ERN), tales 
como óxido nítrico (ON•) y anión peroxinitrito (ONOO-), son átomos o moléculas 
pequeñas que tienen electrones en la capa de valencia no apareados, lo que 
provoca que éstos acepten fácilmente otro electrón o que transfieran su electrón 
no apareado a otra molécula cercana [20]. Existen múltiples fuentes de ERO en la 
célula, como la NADPH oxidasa presente en células fagocíticas y no fagocíticas, 
xantina oxidasa, citocromo oxidasa, ciclooxigenasa, entre otras [21]. Sin embargo, 
la mayor producción de ERO se da en la mitocondria, ya que es el organelo que 
genera la mayor parte de energía de la célula, en forma de trifosfato de adenosina 
(ATP) [22]. 
 
La mitocondria, es conocida por su función energética a través de la respiración 
celular. Pero además de proveer energía a toda la célula mediante la generación 
de ATP, también está involucrada en la síntesis de cofactores, regula la 
homeostasis iónica de la apoptosis y es el principal productor de ERO durante los 
procesos normales oxidativos del metabolismo, principalmente a través de las 
reacciones de óxido-reducción que ocurren en los complejos de transferencia de 
electrones y que tienen al oxígeno como el último aceptor de electrones. Dando 
 
 8 
 
lugar a la cadena de transporte de electrones que se encuentra en la membrana 
mitocondrial interna, durante el proceso de fosforilación oxidativa. La fuga de 
electrones en el complejo I y complejo III de la cadena de transporte de electrones 
conduce a la reducción parcial de oxígeno para formar O2-. Posteriormente, el O2- 
es dismutado en menor cantidad por sí solo a H2O2 y de manera rápida, por medio 
de un método enzimático llevado a cabo por 3 variantes de la superóxido 
dismutasa (SOD): la SOD1 (CuZn-SOD1) localizada en el citosol, caracterizada 
por la presencia de un cofactor de Cobre/Zinc; la SOD2 (Mn-SOD 2) que contiene 
manganeso y está localizado en el espacio intermembranal de la mitocondria; y la 
SOD3 (EC-SOD, SOD3) localizada en la parte extracelular. En conjunto, el ion 
superóxido y el H2O2 generados en este proceso, son considerados como ERO 
mitocondrial [23-25]. 
 
Las células responden a las ERO de diferente forma dependiendo la intensidad, 
duración, contexto de la señalización y el estado celular. A nivel intracelular, debe 
existir un equilibrio entre los factores pro-oxidantes y los antioxidantes encargados 
de regular el exceso de ERO, y así evitar la disminución del sistema de defensa de 
dichas especies químicas, en nuestro organismo. Cuando el nivel de oxidante no 
excede las capacidad del sistema antioxidante de las células, las ERO se ven 
implicadas en varias funciones celulares. Por el contrario, cuando la capacidad 
antioxidante celular es insuficiente para neutralizar las ERO, se produce un estado 
de EO. Que daña severamente al ADN, proteínas y lípidos, alterando su estructura 
y función normal, lo que conduce a la citotoxicidad. Este desequilibrio a nivel 
celular entre ERO y antioxidantes, genera apoptosis con la consecuente liberación 
del contenido al medio extracelular, lo que conduce a fenómenos de mutagénesis 
y carcinogénesis, para finalmente repercutir en la salud [26] (Figura 5). 
 
 
 
 
 
 
 9 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Estrés oxidante y su repercusión en la salud. 
 
 
1.5 El papel del estrés oxidante en la OA 
A nivel molecular, durante el desarrollo de la OA, se forman excrecencias óseas 
(osteofitos), hay esclerosis del hueso subcondral e inflamación de la membrana 
sinovial. Estos mecanismos son mediados por la secreción de moléculas 
catabólicas y pro-inflamatorias (IL-1β, IL-8, IL-6, TNF-α), producidas por los 
condrocitos, macrófagos y células T. La citocinas IL-1β, IL-8, IL-6 y TNF-α, inhiben 
la expresión de colágena tipo II y de agrecano, e inducen la síntesis de 
metaloproteinasas MMP2, MMP3, MMP9 y MMP13, así como agrecanasas 
(ADAMTS-4 y ADAMTS-5) que degradan componentes de la MEC; por su parte, la 
prostaglandina E2 (PGE2) y algunos neuropéptidos (NPY, SP) favorecen el 
proceso de resorción ósea [27-30] (Figura 6). 
 
 10 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Mecanismos moleculares durante el desarrollo de la OA (Tomado y modificado de 
Chevalier, et al. 2013). 
 
 
A bajas concentraciones, las ERO que se producen dentro de los condrocitos 
articulares, están mediadas principalmente por la NADPH oxidasa, y participan en 
el mantenimiento del cartílago articular; así mismo, modulan la apoptosis de 
condrocitos, la expresión génica, la síntesis y degradación de la MEC y la 
producción de la citosinas (Figura 7). Sin embargo, tanto en estado basal y en 
sobreproducción de ERO hace que actúen como segundos mensajeros 
contribuyendo a la degradación de biomoléculas que forman parte de la 
articulación, como son la colágena tipo II, proteoglicanos y el ácido hialurónico, 
propiciando un estado de EO durante la OA [32, 33]. 
 
 
 
 
 
 11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Mecanismos relacionados con el estrés oxidante en la patogénesis de la OA (Tomado y 
modificado de Lepetsos, et al. 2016). 
 
 
En el caso de las enzimas antioxidantes, tales como la catalasa (CAT), SOD y 
glutatión peróxidasa (GPX), principalmente, se ha observado que tienen un papel 
importante en la protección y mejora del cartílago articular de la rodilla, y salud de 
los huesos [34, 35]. Sin, embargo la disminución de éstas contribuye al 
envejecimiento del cartílago y la patogénesis de la OA. 
 
1.6 Modulador de especies reactivas de oxigeno 1 (ROMO1) 
Como se mencionó, uno de los principales sitios de producción de ERO es la 
mitocondria, donde se ha determinado que un 3% del oxígeno molecular (O2-) 
consumido, a través de las cadenas de transporte de electrones,es reducido de 
forma incompleta a anión O2- [36]. A través de mediadores inflamatorios, 
alteraciones bioquímicas y el estado de EO, la viabilidad de los condrocitos se ve 
comprometida con un incremento de EO en el cartílago articular. 
 
 12 
 
Recientemente se identificó una proteína transmembranal de la mitocondria 
asociada con la regulación de ERO llamada modulador de especies reactivas de 
oxigeno 1 (Romo1) la cual consta de 79 aminoácidos (PM=8.9 KDa) [39, 40]. 
Originalmente se identificó en células tumorales, asociándola a un incremento en 
su proliferación desencadenando la aparición de cáncer [37] (Figura 8). Romo1 es 
esencial para la coordinación de la morfología mitocondrial y la proliferación 
celular, y debido a las características ambientales en las que sobreviven los 
condrocitos, se sugiere que puede desempeñar un papel importante en la 
señalización redox para mantener las funciones metabólicas del cartílago articular 
[38, 39]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Ubicación de la proteína Romo1 en la mitocondria. 
 
 
Aunque hay indicios de que Romo1 modula la producción de ERO, su papel y 
mecanismo de acción no están completamente comprendidos. Esta proteína es 
codificada por el gen ROMO1, el cual se localiza en la banda 11.22 del brazo largo 
del cromosoma 20, está constituido por 3 exones y cuenta con una extensión 
genómica de 1.6 Kb [41, 42]. Se han identificado poco más de 300 polimorfismos 
de un solo nucleótido (SNPs, por sus siglas en inglés) dentro de esta región [43], 
los cuales pueden ejercer un efecto directo en su transcrito con implicaciones en la 
 
 13 
 
modulación de ERO. A la fecha, no se han descrito polimorfismos del gen ROMO1 
asociados con la OA en población mexicana, por lo resulta interesante explorar 
este gen y determinar su participación en el desorden reumatológico de la OA. 
 
1.7 Polimorfismos genéticos 
Los SNPs representan variaciones genéticas localizadas en el genoma humano. 
Debido a su amplia distribución, estos polimorfismos se localizan en cualquier 
parte de la estructura de los genes y el genoma. El estudio de polimorfismos 
puede tener diversas aplicaciones, principalmente en estudios de genética de 
poblaciones para reconstruir parte de la historia evolutiva, aplicación en medicina 
forense, en el estudio de las enfermedades poligénicas y multifactoriales, etc. 
 
Existen varios tipos de polimorfismos, los de inserciones, deleciones, cambios en 
el número de secuencias repetidas; sin embargo, los más frecuentes son los 
SNPs. Aquellos polimorfismos que afectan la secuencia codificante o reguladora y 
producen cambios importantes en la estructura de la proteína o en el mecanismo 
de regulación de la expresión, pueden traducirse en diferentes fenotipos. Un SNP 
consiste en una variación en la secuencia de ADN que afecta a una sola base 
nitrogenada de una secuencia del genoma (nucleótido): adenina (A), timina (T), 
citosina (C) o guanina (G); por ejemplo, la sustitución de una A (adenina) por una 
C (citosina), etc. (Figura 9). Los polimorfismos se distinguen terminológicamente 
de las mutaciones por su frecuencia. Las formas alternativas de los polimorfismos 
(llamados “alelos”) son más frecuentes que las mutaciones; esto es, tienen una 
frecuencia mayor al 1% en la población de estudio [44-46]. Los SNPs son formas 
alternativas del genoma humano y no se modifican mucho de una generación a 
otra, por ello es sencillo seguir su evolución en estudios de población. 
 
 14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. SNP, la cadena de ADN en 1 difiere de la del ADN en 2 en un solo par de bases. Los 
SNP pueden aparecer cada 100, 500 o 1000 pares de bases a lo largo del genoma. 
 
 
El enfoque de los estudios genéticos humanos es principalmente en las variantes 
de la secuencia de ADN (DSV, por sus siglas en inglés) entre los individuos, lo que 
contribuye a entender posibles mecanismos de susceptibilidad a una enfermedad, 
resultados clínicos o la respuesta a una determinada terapia. 
Existen más de 37 millones de variantes entre los seres humanos. Cada genoma 
contiene cerca de 4 millones de DSV que afectan colectivamente la mitad de los 
genes en cada genoma. La gran mayoría de las DSV en el genoma son SNPs 
[46]. 
La mayoría de los SNPs tienen dos alelos representados por una sustitución de 
una base por otra. En las poblaciones, este tipo de alelos se clasifican en alelo 
principal o “silvestre”, y alelo raro o mutante. Debido a que los humanos son 
diploides, un individuo puede tener uno de tres genotipos: homocigoto para el alelo 
más frecuente, heterocigoto (ambos alelos), u homocigoto para el alelo menos 
frecuente. Los SNPs pueden estar presentes en la región codificante y provocar 
un cambio en un aminoácido, afectando directamente la función de la proteína que 
 
 15 
 
codifica. Así mismo, existen otros SNPs que pueden estar localizados en la región 
promotora del gen, influenciando la actividad transcripcional del gen. Otro tipo de 
SNPs se localizan en regiones intrónicas, los cuales modulan el procesamiento del 
transcrito en sitios de “splicing alternativo” (lugar donde ocurre la eliminación de 
intrones y unión de exones), o los localizados en regiones intragénicas. Por otro 
lado, los SNPs llamados “sinónimos” o silenciosos, que no alteran la conformación 
del gen, pero que pueden tener consecuencias funcionales por algún tipo de 
mecanismo aún desconocido [47, 48] (Figura 10). 
 
Según su localización en el genoma, los SNPs se clasifican en: iSNP, si están 
localizados en regiones intrónicas; cSNP, en regiones codificantes (exones); 
rSNP, en regiones reguladoras, y gSNP, localizados en regiones intergénicas. Los 
cSNP pueden estar representados por SNP sinónimos (sSNP) o no sinónimos 
(nsSNP) [47, 48]. 
 
Figura 10. Clasificación de SNPs de acuerdo con su localización en el genoma. E: exones; 
I: Intrones; UTR: Regiones no codificantes (Tomado y modificado de Marco Antonio Checa 
Caratachea, et al. 2007). 
 
 
Los SNPs son de gran utilidad como marcadores genéticos en investigación 
médica, en la detección de genes de protección o susceptibilidad en 
enfermedades, identificación personal, etc. En los humanos, los SNPs forman 
hasta el 90% de todas las variaciones genéticas y aparecen en promedio uno cada 
 
 16 
 
100 a 500 o 1000 bases a lo largo del genoma. Estas variaciones en la secuencia 
de ADN pueden afectar la respuesta de los individuos a diversas enfermedades, 
bacterias, virus, productos químicos, fármacos, etc. [49]. 
Con estos antecedentes, el presente trabajo se enfocó en determinar cuál es el 
papel que juegan de los SNPs del gen ROMO1 en el desarrollo de la OA en 
nuestra población. 
 
 
2. JUSTIFICACIÓN 
En México, la OA es considerada la primera causa de consulta reumatológica, 
posicionándose como una de las principales enfermedades causantes de 
discapacidad física entre hombres y mujeres mayores de 60 años según la OMS. 
Debido a su alta prevalencia, se considera un problema de salud púbica [4]. 
 
Se sabe que el EO que se genera en diversos tejidos es regulado principalmente 
por Romo1; sin embargo, a la fecha no hay reportes que den una explicación, 
desde el punto de vista genético, sobre la participación del gen ROMO1 en el 
cartílago articular. De esta manera, los resultados que se generen en el presente 
estudio ampliarán el conocimiento sobre la fisiopatología de la OA y sus 
implicaciones clínicas. 
 
 
3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
¿Están asociados los SNPs rs6060567, rs6060565, rs6068303, rs3088078 del gen 
ROMO1 con el desarrollo de la OA de rodilla en población mexicana? 
 
 
4. HIPÓTESIS 
Los polimorfismos del gen ROMO1 están asociados al desarrollo de la OA en 
población mexicana. 
 
 
 17 
 
5. OBJETIVOS 
 
5.1 Objetivo general 
Analizar la asociación de los polimorfismos de un solo nucleótido rs6060567,rs6060565, rs6068303 y rs3088078del gen ROMO1 en pacientes Mexicanos con 
OA de rodilla. 
 
5.2 Objetivos particulares 
- Determinar parámetros clínicos y antropométricos en pacientes con OA de 
rodilla y grupo control (sin signos ni síntomas de OA). 
- Analizar la distribución de los polimorfismos del gen ROMO1 en pacientes 
con OA y grupo control. 
- Evaluar la asociación de las frecuencias génicas y alélicas de los 
polimorfismos del gen ROMO1 en pacientes con OA y grupo control. 
 
 
6. MATERIAL Y METODOS 
 
6.1 Población de estudio 
En este estudio de casos y controles, participaron 200 individuos mayores de 40 
años, de ambos géneros, nativos de la región central de México, con padres y 
abuelos del mismo origen. Los participantes fueron evaluados por médicos 
adscritos al Servicio de Reumatología del Instituto Nacional de Rehabilitación 
(INR) “Luis Guillermo Ibarra Ibarra”. Al momento del reclutamiento los participantes 
fueron notificados sobre el contenido del protocolo y firmaron una carta de 
consentimiento informado para hacer uso de la muestra biológica (Anexo I). Este 
estudio forma parte de la segunda fase del proyecto “Evaluación de polimorfismos 
de un solo nucleótido de los genes HIF1A y WISP1 en pacientes con osteoartritis 
de rodilla en población mexicana” con número de registro institucional INR-18/13. 
El análisis de este estudio partió de un banco de muestras de ADN; sin embargo, 
 
 18 
 
los nuevos participantes que se fueron incluyendo, se les aplicó el consentimiento 
informado y la toma de muestras. 
 
6.2 Criterios de inclusión 
 
6.2.1 Grupo de pacientes 
Se reclutaron 100 pacientes con OA primaria de rodilla que acudieron al Servicio 
de Reumatología del INR “Luis Guillermo Ibarra Ibarra”. El diagnóstico de la OA se 
basó en parámetros clínicos y radiográficos (escala de K-L ≥ 2) de acuerdo a los 
criterios del CAR [14, 15]. 
 
6.2.2 Grupo de contraste (controles) 
El grupo control estuvo constituido por 100 individuos clínicamente sanos 
pareados por edad y género, sin antecedentes familiares de OA, los cuales fueron 
evaluados por reumatólogos del INR quienes certificaron la ausencia de signos y 
síntomas de OA de rodilla. Además, durante la evaluación clínica, a los 
participantes se les aplicó la encuesta de lesión de rodilla y puntaje para la 
osteoartritis de rodilla (KOOS, por sus siglas en inglés). 
 
6.3 Criterios de exclusión 
- La presencia de una enfermedad autoinmune análoga con la OA (por 
ejemplo, artritis reumatoide). 
- Pacientes con displasias óseas y articulares. 
- Artropatías microcristalinas (gota y seudogota). 
 
6.4 Criterios de eliminación 
- Zona gris o dudosa en la interpretación de radiología. 
- Muestras con indicios de contaminación de ADN 
- Retiro voluntario del paciente. 
 
 
 19 
 
6.5 Operacionalización de variables 
 
6.5.1 Tabla 2. Definición y operacionalización de variables 
 
6.6 Descripción general del estudio 
 
6.6.1 Recolección de muestras 
Se recolectaron dos muestras de sangre periférica por venopunción a cada 
participante. Una muestra sin anticoagulante se utilizó para obtener suero, el cual 
fue inmediatamente congelado a -80° C para realizar pruebas bioquímicas; la 
segunda muestra se recolectó en tubos con EDTA para la extracción y 
genotipificación del ADN genómico. 
 
Variable Tipo de 
variable 
Definición conceptual Operacionalización Escala de 
medición 
OA Variable 
dependiente 
La OA es una enfermedad 
crónica y discapacitante. 
Se caracteriza por la 
pérdida gradual del 
cartílago articular, 
inflamación de la 
membrana sinovial y la 
presencia de osteofitos. 
Influyen factores de 
riesgos mecánicos, 
ambientales y genéticos. 
Se establece el 
diagnóstico de la OA 
dependiendo el 
grado en el que se 
encuentre, esto se 
realiza con la escala 
radiológica K-L ≥ 2. 
Determinar si tiene 
o no OA. Variable 
cualitativa: Escala 
visual de K-L. 
SNP Variable 
independiente 
Secuencias de ADN con 
cambios o sustituciones 
puntuales de una base por 
otra. Se traduce si hay un 
cambio en su proteína 
asociada. Y saber si 
puede ser susceptible o 
resistente a ciertas 
enfermedades. 
Con muestras de 
sangre de pacientes, 
se extrajo y se 
amplifico el ADN 
mediante PCR en 
tiempo real, 
utilizando sondas 
TaqMan de los 
SNPs de interés. 
Variable cualitativa: 
Presencia o 
ausencia del SNP 
de estudio en los 
grupos de estudio. 
Sin embargo, para 
determinar la 
presencia del SNP, 
se utilizan 
unidades de 
fluorescencia a 
partir de un punto 
de corte. 
 
 20 
 
6.6.2 Determinación de parámetros bioquímicos 
Se evaluaron los niveles de glucosa, colesterol total, triglicéridos y ácido úrico 
mediante técnicas colorimétricas utilizando un kit comercial para cada analito 
(DiagnosticSystems, Germany), y se cuantificaron por espectrofotometría (iMark, 
BioRad). 
 
6.6.3 Obtención del ADN genómico 
El ADN genómico se extrajo a partir de 200 µL de sangre total mediante el método 
de columna utilizando el kit comercial QIAGEN (Hilden, Germany), siguiendo las 
instrucciones del fabricante. La concentración del ADN se determinó por 
espectrofotometría (Nanodrop 2000, ThermoScientific) teniendo un promedio de 
~50 ng/µL, y la integridad del ADN se verifico con gel de agarosa. 
 
6.6.3.1 Material, reactivos y equipos para aislar el ADN genómico 
 Kit para la extracción de ADN (QIAGEN No. Catálogo 51106). 
 Espectrofotómetro (Nanodrop 2000). 
 Tubos eppendorf de 1.5ml. 
 Microcentrífuga (+14000 rpm). 
 Gradilla para tubos eppendorf. 
 Etanol absoluto. 
 Termoblock o baño maría. 
 Agitador tipo vortex. 
 Puntas para micropipetas. 
 Micropipetas de 1000, 200, 10. 
 Guantes, gasas. 
 Agua grado molecular. 
 Recipientes para RPBI y punzocortantes. 
 Refrigerador 4° C. 
 Ultracongelador de -80° C. 
 Tubos con EDTA y sin anticoagulante 
 
 
 21 
 
6.6.3.2 Técnica para aislar ADN genómico 
a) Preliminar 
- Preparar un baño a 56° C. 
- Acondicionar las muestras a temperatura ambiente. 
- Por cada muestra, rotular 2 tubos eppendorf con su identificación. 
 
b) Extracción de ADN a partir de sangre total 
- Agregar 22 µL de proteinasa K en el tubo eppendorf rotulado. 
- Adicionar 210 µL de sangre total (por pipeteo inverso). 
- Adicionar 210 µL de buffer AL; agitar en vórtex de 5 a 10 segundos. 
- Incubar a 56° C durante 10 minutos. 
- Dar pulso a 15,000 rpm en la Microcentrífuga para recuperar el condensado 
de la tapa. 
- Adicionar 210 µL de etanol absoluto; agitar en el vórtex de 5 a 10 segundos. 
Dar pulso. 
- Rotular una columna del mini Kit Qiamp (no el tubo colector) con la 
identificación de la muestra. 
- Colocar la columna en el tubo colector y vaciar el contenido del tubo 
eppendorf. 
- Tapar la columna y centrifugar a 8,000 rpm durante 1 minuto. 
- Desechar el tubo colector junto con el contenido del líquido obtenido y 
colocar un tubo colector nuevo. 
- Adicionar 500 µL de buffer AW1. Tapar la columna y centrifugar a 8,000 rpm 
durante 1 minuto. 
- Adicionar 500 µL de buffer AW2. Tapar la columna y centrifugar a 13,000 
rpm durante 3 minutos. 
- Desechar el tubo colector (con liquido) y colocar la columna en un tubo 
eppendorf previamente rotulado. 
- Adicionar 70 µL de agua grado molecular o buffer apropiado directamente 
sobre la membrana, tapar y dejar 2.5 minutos a temperatura ambiente, 
centrifugar a 8,000 rpm durante 3 minutos. 
 
 22 
 
- Cuantificar la concentración del ADN de cada muestra obtenida, por 
espectrofotometría. 
- Almacenar a -80° C hasta su uso. 
 
 
6.6.4 Preparación del gel de agarosa al 1% y su visualización 
 Pesar 500 mg de Agarosa (BIO-RAD No. Catálogo 162-0133) y colocarlos 
en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. 
 Adicionar 50 ml de buffer TBE 1x (Promega) y calentar hasta su completa 
disolución. 
 Una vez disuelto, trasvasar a un tubo falcón de 50 ml. Adicionar 2 µL de 
Bromuro deetidio (10mg/1ml) (BIO-RAD No. Catálogo 161-0433). 
Homogenizar. 
 Verter la agarosa en la bandeja de corrida; colocar inmediatamente los 
peines que formaran los pozos. Dejar solidificar. 
 Una vez solidificado, retirar los peines. 
 Poner el gel en la cámara electroforesis y adicionar buffer TBE 1x hasta 
cubrir completamente el gel. Adicionar a cada pozo la muestra de ADN con 
buffer de corrida. 
 Conectar los electrodos de la cámara a la fuente de poder durante 1 hora y 
media a 120 voltios. 
 Visualizar el gel de agarosa en un transiluminador UV a 312 nm 
(Figura 11). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Visualización de muestras de ADN en gel de agarosa al 1%. Muestras de pacientes con 
OA (2OA: 43.0 ng/µL, 5OA: 46.1 ng/µL) y muestras del grupo control (32C: 61.0 ng/µL, 33C: 51.0 
ng/µL, 34C: 59.0 ng/µL, 35C: 57.5 ng/µL). 
 
 
6.6.5 Selección de los SNPs del gen ROMO1 
Los SNPs candidatos fueron seleccionados por los siguientes criterios: i) que 
estuvieran previamente reportados en la literatura científica; ii) que estuvieran 
validados por el proyecto de los 1000 genomas [49]; iii) que el alelo menor tuviera 
una frecuencia en la población mexicana mayor del 1%, y iv) que no se 
encontraran en desequilibrio de ligamiento (DL) entre sí. Se eligieron 4 
polimorfismos del gen ROMO1 que cumplieron con estos criterios, el rs6060567, 
rs6060565, rs6068303 y rs3088078 (Figura 12). En la Tabla 3 se muestran las 
características generales de los cuatro polimorfismos utilizados para el estudio 
[50, 51]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 24 
 
6.6.5.1 Tabla 3. Características generales de los SNPs analizados 
Gen Cromosoma y 
posición 
rs del SNP Localización Tipo de SNP Assay IDa 
Life Technologies 
ROMO1 Chr20:34288250 rs6060567 Intrón 2 C4038G C____434215_10 
Chr20:34285442 rs6060565 Promotor C6846T C__30018014_20 
Chr20:34290281 rs6058303 Downstream A44978G C_____63793_20 
Chr20:35700932 rs3088078 3’UTR C4649424T C__25754170_20 
a. Numero de catálogo 4351379 Life Technlogies (Thermo Fisher Scientific). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Ubicación de los SNPs estudiados en el gen ROMO1. Indicando en color rojo el cambio 
de base que realiza cada SNP. 
 
 
 
6.6.6 Genotipificación y características de la PCR 
El método que se utilizó para la genotipificación de los SNPs candidatos fue por 
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) mediante la 
discriminación alélica de las sondas TaqMan (Applied BioSystem) por medio de 
una 5’ exonucleasa. Se usaron los equipos StepOne Plus (Applied BioSystem), y 
Rotor-Gene Q (Qiagen). 
 
 25 
 
Las sondas TaqMan permiten medir productos de PCR mediante un sistema de 
oligonucleótidos marcados con dos fluorocromos (VIC o FAM). El beneficio, es que 
posee un fluoróforo en un extremo 3’ y una molécula en el 5’ que bloquea su 
emisión de fluorescencia (“quencher” en inglés), esta sonda marcada, se hibrida 
en el centro del producto a adquirir. De esta forma, cuando se efectúa la PCR (con 
la sonda, más el par de cebadores específicos), la sonda hibrida en el amplicón, 
pero debido a la cercanía del fluoróforo al quencher, no se emite fluorescencia; 
cuando la polimerasa se topa con la sonda, la hidroliza mediante su actividad 
exonucleasa 5’-3’, lo que provoca la separación del fluoróforo del quencher y, de 
esta forma la emisión de fluorescencia, la cual está relacionada con la cantidad de 
amplicón producido [52, 53] (Figura 13). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura13. Funcionamiento de las sondas TaqMan. 
 
 
 
 
 26 
 
Tabla 4. Polimorfismos de un solo nucleótido estudiados y su cambio en la 
secuencia de ADN. 
 
SNP Secuencia de contexto para las sondas TaqMan [VIC/FAM] 
rs6060567 ATCATTTACAGAGCACTTACTCTAT[C/G]TTAAGCACTGTGCTAAATACTGTAG 
rs6060565 TCATTTAGCCAGGAAATATGGGAAC[C/T]AATCAAATGCCTGCAGTCAAACTCC 
rs6058303 TTTCACTCAGAATGAGCTGTTTTCT[A/G]TGCACGACACTATTCAAGTTACTAC 
rs3088078 CCATGGTTGCCAACTACATCTGTCC[C/T]TTCCCATCAATCCCAGCCCATGTAC 
 
 
El volumen total de la mezcla maestra fue de 10µL, la cual estaba constituida de la 
siguiente manera: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 a. Numero de catálogo 4351379 Life Technlogies (Thermo Fisher Scientific). 
 
Las condiciones de termociclado fueron: 95°C por 10 minutos, seguido de 40 
ciclos a 92°C por 15 minutos y 60°C por 1 minuto, para el equipo Rotor-Gene Q. 
Para el equipo StepOne las condiciones de termociclado fueron: 60°C por 30 
segundos, seguido de 95°C por 10 minutos y con un número de 40 ciclos dentro 
de ellos se vieron las siguientes condiciones: 95°C por 15 segundos y 60°C por 1 
minuto. 
 
 
 
 Por reacción 
Master Mix: 
Taq Polimerasa 
Buffer 
dNTPs 
MgCl2 
5.0 µL 
H2O grado molecular 1.5 µL 
Sonda TaqMan 20xa 0.5 µL 
ADN (~50 ng) 3.0 µL 
Total 10.0 µL 
 
 27 
 
Para la interpretación de resultados se ocuparon los software correspondientes 
para cada equipo (StepOne software v2.3 y Rotor-Gene Q v2.0.2, 
respectivamente) (Figura 14). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Presentación de la discriminación alélica en los equipos StepOne y Rotor-Gene. 
 
 
6.7 Análisis estadístico 
Se realizó un análisis descriptivo de la población de estudio tomando en cuenta las 
covariables obtenidas de la evaluación clínica y del cuestionario. Estas covariables 
se compararon entre los casos y controles mediante la prueba de U de Mann-
Witnney para variables continuas; y la prueba exacta de Fisher en el caso de las 
variables categóricas. Aquellas covariables que mostraron tener diferencias 
significativas entre ambos grupos de estudio, se incluyeron en los análisis de 
regresión logística multivariada. 
 
Se evaluó el equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) para cada polimorfismo, y su 
distribución genotípica y alélica se comparó entre ambos grupos de estudio 
mediante la prueba exacta de Fisher. Se estimaron las razones de momios (RM) 
mediante modelos de regresión logística bivariada y multivariada con un intervalo 
 
 28 
 
de confianza del 95% (IC95%). Las variables que conformaron el modelo 
multivariado fueron seleccionadas tras realizar un análisis de bondad de ajuste 
con cuatro modelos de regresión distintos. Todo el análisis estadístico se realizó 
con el programa estadístico STATA v12; valores de P<0.05 se consideraron 
estadísticamente significativos. 
 
6.8 Condiciones éticas 
El proyecto fue aprobado por el comité de Investigación del INR “Luis Guillermo 
Ibarra Ibarra” con número de registro INR-18/13. El riesgo de obtener sangre por 
venopunción es minino, indicado por los lineamientos del comité de ética del INR. 
Cabe resaltar que no existió ningún conflicto de interés entre los participantes del 
proyecto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 29 
 
7. RESULTADOS 
 
7.1 Cantidad y calidad de ADN 
Se cuantifico la concentración de ácidos nucleicos y se evaluó la pureza del ADN 
para cada una de las muestras de pacientes con OA y del grupo control. Ambos se 
determinaron midiendo la absorción de la luz ultravioleta (UV) por 
espectrofotometría. El ensayo que nos indica la calidad del ADN es la relación 
260/280. El ADN absorbe casi el doble de UV a 260 nm como lo hace a 280 nm. Si 
no hay proteína presente, la proporción objetivo es de 1,8. En la Tabla 5 se 
muestra el promedio de la concentración de ácido nucleico con la que se trabajó y 
se obtuvo el promedio de la relación 260/280 para pacientes con OA y controles, 
lo que nos dice la buena calidad y pureza del ADN. 
 
 
Tabla 5. Cuantificación de ADN en muestras de pacientes con OA y controles. 
 
 
PROMEDIOS 
Conc. de Ac. 
Nucleicos (ng/µL) 
260/280* 
Pacientes OA (n=100) 56.9 1.87 
Controles (n=100) 60.1 1.88 
 *La relación 260/280 nos permite ver la calidad del ADN. 
 
 
7.2 Descripción de población deestudio 
Al comparar la edad en los dos grupos de estudio observamos una diferencia 
significativa (P<0.01), siendo ésta mayor en los casos (mediana de 49 años) que 
en los controles (mediana de 42 años). Así mismo, encontramos que el índice de 
masa corporal (IMC) también tuvo una diferencia significativa (P<0.01), con una 
mediana de 29.7 kg/m2 en casos, y una mediana de 23.9 kg/m2 en controles. En 
cuanto a las variables bioquímicas, las únicas que presentaron diferencias 
 
 30 
 
significativas entre casos y controles fueron el colesterol y la glucosa (P<0.01); la 
mediana para el colesterol fue de 199.0 mg/dl (casos) y 176.2 mg/dl (controles), 
mientras que la mediana para la glucosa fue de 96.0 mg/dl (casos) y 82.0 mg/dl 
(controles). Por el tipo de diseño del estudio, el género no mostró diferencias en su 
distribución en los grupos de estudio (P=0.11). Sin embargo, el lugar de 
nacimiento tuvo una diferencia significativa (P=0.03), siendo mayor porcentaje en 
los nacidos en el Área Metropolitana de la Ciudad de México (52.9% controles, y 
47.1% casos) que los nacidos en otros estados (32.1% controles y 67.9% casos) 
(Tabla 6). 
 
 
Tabla 6. Descripción de la población de estudio 
Parámetro 
Controles 
(n=100) 
Casos 
(n=100) 
P 
Edad (años) <0.01 
Mediana (RIa) 42 (17.5) 49 (11) 
IMC (kg/m2) <0.01 
Mediana (RIa) 23.9 (5.0) 29.7 (6.8) 
Ac. Úrico (mg/dL) 0.29 
Mediana (RIa) 5.4 (1.8) 5.1 (1.8) 
Colesterol (mg/dL) <0.01 
Mediana (RIa) 176.2 (65.6) 199 (42.8) 
Glucosa (mg/dL) <0.01 
Mediana (RIa) 82 (16.8) 96 (13.2) 
Genero (%) 0.11 
Femenino 75 (46.9) 85 (53.1) 
Masculino 25 (62.5) 15 (37.5) 
Lugar de nacimiento (%) 0.03 
Área Metropolitana de la Ciudad de 
México 
91 (52.9) 81 (47.1) 
Otros estados 9 (32.1) 19 (67.9) 
IMC=Índice de masa corporal, RI= Rango intercuartil. El texto en negritas denota significancia 
estadística. 
 
 
7.3 Frecuencias genotípicas y alélicas en la población de estudio 
Los cuatro polimorfismos evaluados del gen ROMO1 estuvieron en EHW en el 
grupo de controles (P>0.05). Para el polimorfismo rs6060567 observamos que el 
genotipo heterocigoto (G/C) fue el más frecuente en controles que en casos, pero 
 
 31 
 
el genotipo homocigoto para el alelo menor (C/C) fue más frecuente en casos que 
en controles. No obstante, la distribución de los genotipos entre casos y controles 
no fue significativa (P=0.10). En el grupo control para el polimorfismo rs6060565 
se observó una mayor frecuencia del genotipo heterocigoto (C/T) así como del 
homocigoto para el alelo menor (T/T) en comparación a los casos. Sin embargo, la 
diferencia en la distribución de los genotipos entre los grupos de estudio no fue 
estadísticamente significativa (P=0.53). Por su parte, el heterocigoto (A/G) del 
polimorfismo rs6058303 fue más frecuente en casos que en controles, pero el 
homocigoto del alelo menor (G/G) fue más frecuente en controles que en casos. 
Aun así, la distribución de estos genotipos entre los grupos de estudio no fue 
estadísticamente significativa (P=0.28). Por último, para el polimorfismo rs3088078 
observamos que el genotipo heterocigoto (C/T) tuvo mayor frecuencia en casos 
que en controles. Interesantemente, no se observó ningún portador para el 
genotipo T/T (alelo menor) en los grupos de estudio. De igual manera que con los 
polimorfismos anteriormente descritos, la diferencia en la distribución de los 
heterocigotos entre los casos y controles no fue estadísticamente significativa 
(P=0.34) (Tabla 7). 
 
Al calcular las frecuencias alélicas de los polimorfismos rs6060567, rs6060565 y 
rs6058303 se observó una tendencia similar en su distribución que la que se 
describió con los genotipos entre casos y controles. El alelo menor de los SNPs 
rs6060567, rs6060565 y rs6058303 (C, T y G respectivamente) fue más frecuente 
en los controles que en los pacientes con OA; sin embargo, esta diferencia no fue 
estadísticamente significativa (P=0.19 para el rs6060567, P=0.25 para el 
rs6060565 y P=0.62 para el rs6058303). Por otro lado, en el polimorfismo 
rs3088078 se observó lo contrario, ya que su alelo menor (T) fue más frecuente en 
los pacientes con OA que en los controles, y de igual forma no hubo diferencia 
estadísticamente significativa (P=0.68) (Tabla 7). 
 
 
 32 
 
Tabla 7. Distribución de las frecuencias genotípicas y alélicas para los 
polimorfismos del gen ROMO1. 
 
 
SNP/Genotipo 
Controles 
n=100 (%) 
Casos 
n=100 (%) 
P a 
rs6060567 0.10 
G/G 70 (70.0) 81 (81.0) 
G/C 27 (27.0) 15 (15.0) 
C/C 3 (3.0) 4 (4.0) 
Alelos 0.19 
G 167 (83.5) 177 (88.5) 
C 33 (16.5) 23 (11.5) 
EHW 0.73 0.02 
rs6060565 0.53 
C/C 69 (69.0) 77 (77.0) 
C/T 28 (28.0) 21 (21.0) 
T/T 3 (3.0) 2 (2.0) 
Alelos 0.25 
C 166 (83.0) 175 (87.5) 
T 34 (17.0) 25 (12.5) 
EHW >0.99 0.64 
rs6058303 0.28 
A/A 80 (80.0) 81 (81.0) 
A/G 17 (17.0) 19 (19.0) 
G/G 3 (3.0) 0 (0.0) 
Alelos 0.62 
A 177 (88.5) 181 (90.5) 
G 23 (11.5) 19 (9.5) 
EHW 0.11 0.60 
rs3088078 0.34 
C/C 98 (98.0) 96 (96.0) 
C/T 2 (2.0) 4 (4.0) 
T/T 0 (0.0) 0 (0.0) 
Alelos 0.68 
C 198 (99.0) 196 (98.0) 
T 2 (1.0) 4 (2.0) 
EHW >0.99 >0.99 
 a. Valor de P obtenido de la prueba exacta de Fisher. 
 
 
 33 
 
7.4 Asociación de los polimorfismos de ROMO1 con la OA 
En la Tabla 8 se muestran las RM de los cuatro polimorfismos estudiados 
ajustados por edad. Observamos que los portadores del genotipo G/C del 
polimorfismo rs6060567 tienen dos veces menos posibilidades de presentar OA 
(RM=0.44, IC=95%) con respecto al homocigoto G/G, siendo su RM 
estadísticamente significativa (P=0.03), lo que sugiere que este genotipo pudiera 
ser de protección contra la OA. Por su parte, el genotipo C/C de este mismo 
polimorfismo presenta una RM mayor de uno, sin embargo no fue 
estadísticamente significativa. Para los portadores de los genotipos C/T y T/T del 
polimorfismo rs6060565, se obtuvo una RM menor a uno. Para el genotipo A/G del 
polimorfismo rs6058303 se encontró una RM=1.11, lo que indica que los 
portadores de este genotipo tienen 11% más de posibilidades de tener OA 
respecto al homocigoto A/A; además, el homocigoto G/G, presentó una RM=1 lo 
que implica un nulo efecto sobre el riesgo para la OA. Por último, el genotipo C/T 
para el polimorfismo rs3088078 tuvo una RM=1.72, lo que indica que las personas 
que portan este genotipo pudieran tener 72% más posibilidades de tener OA 
respecto al homocigoto C/C; sin embargo, esta RM no fue estadísticamente 
significativa. En relación al análisis por alelos, se obtuvo una RM de 0.17 para el 
alelo menor C del polimorfismo rs6060567, una RM de 0.29 para el alelo menor T 
del polimorfismo rs6060567, una RM de 0.53 para el alelo menor G del 
polimorfismo rs6058303 y una RM de 0.54 para el alelo menor T. Se puede 
observar que todas estas RM fueron menores a uno, pero ninguna fue 
estadísticamente significativa. 
 
 
 
 
 
 
 34 
 
Tabla 8. Razones de momio para los polimorfismos del gen ROMO1 y OA (Modelo 
bivariado). 
 
 
 
Genotipo 
 
RMa 
 
IC 95% 
 
P 
rs6060567 
G/G 1 
G/C 0.44 0.21-0.91 0.03 
C/C 1.53 0.31-7.64 0.60 
Alelos 
G 1 
C 0.66 0.37-1.19 0.17 
rs6060565 
C/C 1 
C/T 0.69 0.35-1.35 0.28 
T/T 0.72 0.11-4.57 0.73 
Alelos 
C 1 
T 0.73 0.41-1.30 0.29 
rs6058303 
A/A 1 
A/G 1.11 0.53-2.32 0.78 
G/G 1 
Alelos 
A 1 
G 0.81 0.42-1.56 0.53 
rs3088078 
C/C 1 
C/T 1.72 0.30-9.70 0.54 
T/T NA NA NA 
Alelos 
C 1 
T 1.70 0.30-9.48 0.54 
RMa=Razones de momio ajustadas por edad; IC=intervalo de confianza. El texto en 
negritas denota significancia estadística. 
 
 
 
Así mismo, se evaluaron cuatro modelos de regresión logística para determinar 
que variables se usarían en el análisis multivariado; para ello, se tomaron en 
cuenta las siguientes variables: edad, género, IMC, colesterol, glucosa, ácido úrico 
y lugar de nacimiento. De estamanera, el modelo que tuvo el mejor ajuste incluyó 
únicamente la edad, IMC, colesterol, ácido úrico y lugar de nacimiento (Modelo B) 
(Anexo II). 
 
 35 
 
Una vez identificado el mejor modelo de regresión logística, nuevamente se 
calcularon las RM de los polimorfismos ajustando por las variables del modelo B. 
 
 
Tabla 9. Razones de momio para los polimorfismos del gen ROMO1 y OA (Modelo 
multivariado). 
 
 
 
SNP/Genotipo 
 
RMa 
 
IC 95% 
 
P 
rs6060567 
G/G 1 
G/C 0.46 0.16-1.30 0.14 
C/C 1.06 1.10-11.40 0.96 
Alelos 
G 1 
C 0.62 0.27-1.44 0.27 
rs6060565 
C/C 1 
C/T 0.56 0.21-1.49 0.25 
T/T 0.18 0.00-6.02 0.34 
Alelos 
C 1 
T 0.53 0.22-1.27 0.16 
rs6058303 
A/A 1 
A/G 1.11 0.37-3.30 0.85 
G/G 1 
Alelos 
A 1 
G 0.91 0.34-2.43 0.85 
rs3088078 
C/C 1 
C/T 0.35 0.00-21.06 0.61 
T/T NA NA NA 
Alelos 
C 1 
T 0.35 0.00-20.76 0.61 
RMa=Razones de momio ajustadas por modelo B (edad, IMC, colesterol, ácido úrico y 
origen); IC=intervalo de confianza. 
 
 
 
 
 
 36 
 
Para el polimorfismo rs6060567, el genotipo heterocigoto mantuvo un RM similar a 
la obtenida en el modelo bivariado, pero perdió la significancia estadística. El 
homocigoto C/C del polimorfismo rs6060567 mantuvo la misma dirección en la RM 
obtenida con el modelo ajustado solo por edad, de igual forma no fue 
estadísticamente significativa. En el polimorfismo rs6060565 se obtuvieron RM 
menores a uno para su genotipo heterocigoto y homocigoto para el alelo menor, lo 
mismo que sucedió en el modelo bivariado, manteniendo la misma significancia 
para ambos genotipos. Para el polimorfismo rs6058303 se obtuvo una RM de 1.11 
teniendo el mismo resultado en el modelo ajustado solo por edad, dando la misma 
magnitud de riesgo; sin embargo, mantuvo un valor de P no significativo en la 
significancia. Finalmente, para el polimorfismo rs3088078 se obtuvo una RM de 
0.35 para el heterocigoto C/T sugiriendo tres veces menos posibilidad de riesgo 
para la OA. Esta RM tuvo la dirección contraria en el modelo bivariado; sin 
embargo, mantiene la misma dirección al no presentar diferencia estadísticamente 
significativa en ambos modelos, no se asegura que este genotipo pueda ser de 
riesgo o no (Tabla 9). 
 
En el análisis por alelo, el alelo menor de los polimorfismos rs6060567, rs6060565 
y rs6058303, mantuvieron la misma dirección en la asociación con la OA que la 
observada en el modelo bivariado, ya que su RM fue menor de uno en todos los 
casos. Lo mismo sucedió en la significancia de las RM de los tres polimorfismos 
mencionados en el modelo multivariado, compartiendo la falta de significancia 
estadística obtenido en el modelo bivariado. Por el contrario, el polimorfismo 
rs3088078 para el alelo menor T no mantuvo la dirección de la asociación 
ajustando solo por edad, pues se obtuvo una RM menor a uno en el modelo 
ajustado por edad, IMC, colesterol, ácido úrico y lugar de nacimiento. No obstante 
esta distinta dirección en la asociación, en el modelo multivariado la RM obtenida 
tampoco fue estadísticamente significativa (Tabla 9). 
 
 
 
 37 
 
Para evaluar si existía alguna relación entre el género y los polimorfismos 
evaluados, se realizó un análisis estratificado por género. En los polimorfismos 
rs5050565, rs6058303 y rs3088078 se mantuvo la misma dirección en ambos 
géneros sin tener diferencia significativa, pero el polimorfismo rs6060567 al 
analizarse en hombres el alelo menor C fue el único que presentó una diferencia 
estadísticamente significativa (RM=0.04, P=0.03) (Tabla 10). 
 
Tabla 10. Razones de momio estratificadas por género para los polimorfismos del 
gen ROMO1 y OA (Modelo multivariado). 
 
 Mujeres n= 160 Hombres n= 40 
 
SNP/alelo 
 
RMa 
 
P 
 
RMa 
 
P 
 
rs6060567 
Alelos 
G 1 1 
C 0.91 (0.36-2.30) 0.84 0.04 (0.00-0.77) 0.03 
RMa=Razones de momio ajustadas por edad, IMC, colesterol, ácido úrico y origen. El texto 
en negritas denota significancia estadística. 
 
 
Tabla 11. Comparación de los SNPs analizados en diferentes patologías 
reportadas en la literatura. 
 
 SNP 
 
RM 
 
P 
OA rs6060567 0.44 0.03 
Cáncer Gástrico55 rs6060567 
rs6060566 
1.85 
1.82 
1.07x10-4 
1.48x10-4 
Retinopatía 
diabética56 
rs6060566 3.3 0.024 
 
 
 
 
 
 
 
 38 
 
8. DISCUSIÓN 
 
Este es el primer estudio que describe una asociación entre los polimorfismos 
rs6060567, rs5050565, rs6058303 y rs3088078 del gen ROMO1 y la OA de rodilla. 
Nuestros resultados sugieren que estos polimorfismos potencialmente juegan un 
papel protector hacia el desarrollo de OA. A la fecha, poco se sabe sobre la 
participación del gen ROMO1 en la fisiopatología de la OA, pero también son 
pocas las patologías donde los SNPs de este gen han sido evaluados. Se sabe 
que Romo1 modula las ERO en diversos procesos normales y patológicos, pero la 
presencia de SNPs en su gen, puede modificar la estructura tridimensional de su 
transcrito alterando las condiciones homeostáticas de los tejidos, permitiendo un 
desequilibrio en el sistema óxido reducción (Redox) lo que provoca un incremento 
de ERO. A nivel condral, las ERO figuran como segundos mensajeros que 
participan en la degradación de moléculas esenciales para la síntesis de MEC, 
tales como colágena tipo II, proteoglicanos, entre otras, alcanzando un estado 
persistente de EO, el cual es un pivote para el desarrollo de OA [32, 33]. 
 
Uno de los principales factores que inducen estrés biomecánico articular asociado 
con el desarrollo de OA, es el sobrepeso [54]. Nuestros resultados muestran que 
el IMC fue mayor en los casos con OA que en el grupo control, lo cual coincide 
con lo reportado. Otro factor representativo de la OA, es la edad, y en este estudio 
se encontró una diferencia significativa en la edad entre casos y controles. Se ha 
demostrado que conforme avanza la edad, incrementa la síntesis de MMPs y 
agrecanasas, las cuales directamente degradan la MEC del cartílago articular [29, 
30]. 
 
Con respecto al análisis de los polimorfismos genéticos de ROMO1, pudimos 
demostrar que el polimorfismo rs6060567 se asoció favorablemente hacia la 
protección de la OA, particularmente cuando el modelo se ajusta por edad y 
género. Posiblemente, al localizarse este SNP en una región intrónica, repercuta 
en el proceso del “splicing alternativo”. Si bien la distribución de los otros 
 
 39 
 
polimorfismos fue similar en los grupos de estudio, hay una clara tendencia 
estadística hacia la protección. Cabe señalar que una de nuestras principales 
limitantes fue el tamaño de la muestra, lo que reduce significativamente el poder 
estadístico. En este sentido, es necesario incrementar la “n” muestral para verificar 
la dirección que puedan tomar las asociaciones resultantes. Por ejemplo, en otras 
patologías donde el tamaño de la muestra fue suficiente para tener un poder 
estadístico mayor al 80%, se puso en evidencia una clara asociación de estos 
polimorfismos, lo que podría dar soporte para entender su mecanismo de acción 
(Tabla 11). 
 
A este respecto, Wu et al., analizaron los polimorfismos rs6060566 y rs6060567 
del gen ROMO1 en pacientes chinos con cáncer gástrico, y determinaron que 
ambos polimorfismos se encontraban asociados con el desarrollo de esta 
patología (genotipo T/C, P=1.48x10-4, RM=1.82; genotipo G/C, P=1.07x10-4, 
RM=1.85, respectivamente) [55]. Posiblemente la presencia de estos 
polimorfismos desregula la producción de ERO, y altera la homeostasis Redox 
intracelular, dañando al ADN, y por ende contribuyendo al desarrollo y progresión 
del cáncer gástrico (Tabla 11). 
 
Por su parte, Petrovic et al. evaluaron el papel del polimorfismo rs6060566 en 
pacientes diabéticos (tipo 2) con y sin retinopatía diabética, donde observaron una 
asociación positiva del genotipo C/C en aquellos pacientes con retinopatía 
(RM=3.3, P=0.024) [56]. Por su carácter intrónico,dicho genotipo podría estar 
asociado a un splicing alternativo y afectar la expresión de Romo1, lo que genera 
un desbalance entre la síntesis y remoción de ERO (situación que favorece la 
acumulación de ERO a nivel celular ocasionando daño a nivel de ADN) en 
patologías que cursan con estrés oxidante crónico, tales como la retinopatía 
diabética y otras enfermedades crónico degenerativas como la OA [20, 32] (Tabla 
11). 
 
 
 40 
 
Por otro lado, y con el fin de poder dar una explicación a nivel funcional de las 
ERO en dos patologías del sistema musculoesquelético, se hizo un estudio 
comparativo sobre los efectos nocivos de las ERO y óxido nítrico en condrocitos 
aislados de cartílagos de pacientes con OA y artritis reumatoide (AR). Se 
demostró que la actividad metabólica del ON fue mayor en OA en comparación 
con la AR. Se sabe que el ON inhibe la síntesis de proteoglicanos para mantener 
la homeostasis de la matriz extracelular [57], por lo que su participación es crucial 
en el desarrollo de OA. Además, se ha visto que las ERO también disminuyen la 
expresión de genes proinflamatorios, así como de genes que contribuyen al 
mantenimiento del cartílago articular [58, 59]. De esta manera, las ERO juegan un 
papel determinante para la degradación de la MEC del cartílago articular; sin 
embargo, la presencia de algunos polimorfismos genéticos en ROMO1, pueden 
ser clave para disminuir o incluso revertir el daño en el desarrollo de OA. 
 
 
9. CONCLUSIÓN 
 
Las ERO juegan un papel fundamental en el metabolismo del cartílago articular, y 
son moduladas por la proteína Romo1. La presencia de SNPs en el gen ROMO1 
es de trascendental importancia en la fisiopatología de la OA de rodilla. En este 
trabajo se compararon las frecuencias génicas y alélicas de polimorfismos de un 
solo nucleótido del gen ROMO1 de muestras de pacientes con osteoartritis 
primaria de rodilla con un grupo de contraste, y se pudo demostrar que el 
polimorfismo rs6060567 se asoció favorablemente a la protección contra la OA. 
Así mismo, se analizaron las variantes génicas rs5050565, rs6058303 y 
rs3088078 del mismo gen, pero no mostraron una asociación significativa. Esto 
nos obliga a explorar otros SNPs de regiones funcionales los que podrían aportar 
mayor evidencia sobre la participación ROMO1 en el desarrollo de la OA. 
 
 
 
 
 41 
 
 
10. PERSPECTIVAS 
 
Para lograr un mejor acercamiento sobre la participación de ROMO1 en la OA, 
proponemos los siguientes puntos: 
 
 Para incrementar el poder estadístico del estudio, será necesario 
incrementar la “n” muestral para obtener más información a este respecto. 
 
 Debido a la importancia de la proteína Romo1 en la modulación de ERO, 
será necesario explorar otras variantes génicas dentro del mismo y analizar 
su participación en el desarrollo de la OA. 
 
 Además, replicar este trabajo en otras poblaciones permitirá dilucidar el 
papel de los SNPs de ROMO1 en el desarrollo de la OA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 42 
 
11. REFERENCIAS 
 
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 49 
 
12. ANEXOS 
 
ANEXO I. 
 
SALVO 
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Tn,,;tuto N.d"" oJ 
do< R<h,b¡lil1LOOO 
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