Cuantificacion-de-la-expresion-de-colageno-en-celulas-pulmonares-expuestas-a-hipoxia

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE 
COLÁGENO EN CÉLULAS PULMONARES 
EXPUESTAS A HIPOXIA 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 
 
BIÓLOGO 
 
 
 
 P R E S E N T A : 
 
DANIEL OROZCO VARGAS 
 
 
 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
 
DR. ARNOLDO AQUINO GÁLVEZ 
 
 
 
MÉXICO, D.F. 2014 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
JURADO ASIGNADO: 
PRESIDENTE: M. en C. Martha Montaño Ramírez 
VOCAL: Dr. Jorge Antonio García Alvarez 
SECRETARIO: Dr. Arnoldo Aquino Gálvez 
1° SUPLENTE: Dr. José Guadalupe Cisneros Lira 
2° SUPLENTE: M. en C. María de los Remedios Josefina Ramírez Rangel 
 
Este trabajo experimental fue realizado en el Departamento de Oncología Biomédica 
del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, Ismael Cosío Villegas. 
 
 
 
ASESOR: 
Arnoldo Aquino Gálvez 
 
SUSTENTANTE: 
Daniel Orozco Vargas 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
A MIS PADRES 
 
Saúl y Rachel. Por sus sacrificios para sacar adelante mi devenir; por darme 
amor, educación, principios y valores. Por todo el apoyo moral y recursos 
necesarios que me ofrecieron durante el trayecto de mi carrera. Quienes por 
ellos soy ahora quien soy, por enseñarme sobre el valor de las cosas, y 
siempre esforzarse por cumplir para obtener todos los logros posibles. 
 
 
A MI HERMANA 
 
Sandra. Por su apoyo moral, impulso, ánimos para continuar y los buenos 
momentos que hemos compartido a lo largo de nuestra vida. 
 
 
A MIS AMIGOS 
 
Ehécatl. Por todos los momentos tan “PRO” que hemos vivido con la 
comunidad de la rosca hasta ahora. Verenice, Mariana, Adylene, Erika y sus 
respectivas familias. Por siempre recibirme en su casa y hacerme parte, 
además por su alegría, afecto, consejos y buenos momentos que hemos vivido. 
A ustedes en general por sostener una amistad tan genial y perdurable. 
 
 
A MIS PRIMOS 
 
Leticia, Erick y Rodrigo. Quienes gracias a ustedes tuve una infancia tan 
bonita, tan divertida, con todas la travesuras que un niño debe de vivir para 
sentirse muy bien acompañado y con muchas ganas de ir al siguiente día a 
visitarlos para más. 
 
 
A todos ustedes, solo quiero decir que tal vez me haya quedado corto de 
palabras, algo me dice que podría escribir más sobre ustedes, pero me tomaría 
muchas más páginas si quisiera desglosar todas las cosas invaluables que me 
han brindado. Entonces quiero decirles a todos ustedes que son personas 
medulares en mi vida, que me siento bendecido por tenerlos cerca y espero 
que así siga siendo por muchísimo tiempo y compartir nuevas experiencias. 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Mis compañeros de la Facultad 
 
A Teresa Beatriz, Yashir Jonathan , Karina , Janette , Armando , Lynn ; que no 
solo han sido mis compañeros o colegas, sino también grandes amigos de 
quienes también he podido extraer un valioso significado a nuestra convivencia 
y espero que esta amistad siga fortaleciéndose. 
 
 
Ana Belén CJ 
 
Por todo su apoyo incondicional, su comprensión, cariño y lecciones 
transmitidas, tanto en el ámbito académico como en el ámbito personal. 
Durante esta bonita relación contigo he vivido nuevas experiencias: muy 
valiosas y muy bonitas; de las cuales espero ser reciproco, y puedas obtener 
algo provechoso de mí. A todo esto, muchas gracias por estar a mi lado. 
 
 
El equipo del Laboratorio de Oncología Biomédica 
 
Dra. Georgina Gonzáles, Dr. Arnoldo Aquino (como mi tutor), QFB Rosa A. 
Gonzáles, Técnico Cuauhtémoc Sandoval por su apoyo, amistad y enseñanzas 
durante este largo proceso de concluir un pequeño proyecto de investigación. Y 
en especial Biólogo Javier Delgado Tello por todos sus invaluables consejos y 
anécdotas, por prevenirme, por sus divertidísimas pláticas y sentido del humor, 
y por todo su apoyo desinteresado durante mi estancia en el laboratorio. Eres 
una de las personas a quienes más admiro y me han transmitido un valioso 
ejemplo a seguir. 
 
 
Los equipos de investigación del: 
 
Departamento de Investigación en Fibrosis Pulmonar. Por proporcionarnos 
amablemente los cultivos primarios de fibroblastos y prestarnos algunos 
equipos necesarios para este trabajo. 
Departamento de Biología Molecular. Por prestarnos equipo y reactivos 
necesarios para los ensayos de expresión génica. 
Departamento de investigación en inmunología. Por prestarnos el equipo 
para los ensayos de expresión génica. 
 
 
Dr. Manuel de Jesús Castillejos López 
Por asesorarnos y ayudarnos a elegir el análisis estadístico más apropiado 
para este estudio 
 
 
ÍNDICE 
 
Resumen 
 
Lista de abreviaturas 
 
Antecedentes……………………………………………………………………...…...1 
Fibrosis Pulmonar Idiopática……..…………………………………………..1 
 
Hipoxia y fibrosis……………………………………………………………………....5 
Factor de Transcripción Inducible por Hipoxia (HIF)……..………………..6 
 
Factor de Crecimiento Transformante Beta 1 (TGF-β1) y α-Actina de Músculo 
Liso (α-SMA).…………………………………………………………………………..9 
 
Metaloproteasa de Matriz 1 (MMP-1) e Inhibidor Tisular de Metaloproteasas 1 
(TIMP-1)…...……………………………………….………………………………....11 
 
Colágena……………………………………………………………………………...15 
Síntesis de la colágena………………………………………...……………18 
 
Fibroblasto…………………………………………………………………………….21 
Miofibroblasto…………………………………………………………………23 
 
Justificación………………………………………………………………………......25 
 
Hipótesis……………………………………………………………………………....26 
 
Objetivo general………………………………………………………………………27 
 
Objetivos particulares………………………………………………………………..27 
 
Material y métodos…………………………………………………………………...28 
Cultivo celular…………………………………………………………...……28 
Extracción de RNA……………………….…………………………………..28 
Transcripción Inversa………………………………………………………..30 
 
Análisis de la expresión génica por PCR en tiempo real………………………...31 
Cuantificación Relativa……………………………………………………....31 
Sonda TaqMan®………………………………………………………………32 
Gráficas de amplificación con PCR en tiempo real……………………....33 
Procedimiento de la cuantificación relativa………………………………..34 
Elección del gen endógeno como normalizador de los resultados……..35 
Análisis de los ensayo de la cuantificación relativa………………………36 
Evaluación de genes implicados en la fibrosis pulmonar idiopática en 
células pulmonares expuestas a hipoxia………………………………..…37 
 
 
Análisis estadístico…………………………………………………………………..39 
 
Resultados…………..……………………………………………………………......40 
 Expresión de HIF-1α en fibroblastos FN y FF……….……………….…...40 
 Expresión de HIF-2α en fibroblastos FN y FF…………….….…………...42 
 Expresión de TGF-β1 en fibroblastos FN y FF……………………..….....44 
 Expresión de α-SMA en fibroblastos FN y FF………………………….....46 
 Expresión de Col-I en fibroblastos FN y FF…………………..…………...48 
 Expresión de Col-III en fibroblastos FN y FF………………………..…….50 
 Expresión de MMP-1 en fibroblastos FN y FF…………………...............52 
 Expresión de TIMP-1 en fibroblastos FN y FF…………………………….54 
 
Discusión………………………………………………………………………….…..56 
 
Conclusión………………………………..……………………………………….….66 
 
Perspectiva……………………………...……………………………………………67 
 
Referencias……………………………...…………………………………………....68 
Imágenes…………………………………………………………………...…74 
Tablas………………………………………………………………………….74 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
La fibrosispulmonar idiopática (FPI), es una enfermedad de etiología 
desconocida, progresiva y letal. Esta patología se considera el resultado de una 
compleja interrelación de factores ambientales y factores propios del paciente. 
Mediante ensayos de PCR en Tiempo Real, se estudió la expresión génica de 
8 factores implicados en la fibrosis: HIF1α, HIF-2α, TGF-β1, α-SMA, MMP-1, 
TIMP-1, Col-I, Col-III; involucrados en el desarrollo de la FPI en cultivos 
primarios de fibroblastos de pulmón normal o control (FN) y otra de fibroblastos 
derivados de pacientes con FPI (FF), con el objetivo de dilucidar sí la hipoxia 
puede representar un cofactor en el desarrollo de la FPI. 
Los resultados mostraron que en ambos tipos celulares bajo condiciones de 
hipoxia: se manifiesta una mayor expresión de TIMP-1 comparado con MMP-1, 
lo cual sugiere que la hipoxia podría causar un desequilibrio en el metabolismo 
de la MEC; además de que se presenta una sobreexpresión de genes 
implicados en el desarrollo de la FPI (HIF-1α, HIF-2α, TGF-β, α-SMA, Col-I y 
Col-III). 
En este trabajo llegamos a la conclusión de que la hipoxia puede desempeñar 
un papel en el desarrollo de la FPI, por lo tanto puede tener una implicación en 
la sobreexpresión de marcadores profibróticos y proteínas de Matriz 
Extracelular (ECM), además de inducir un desequilibrio en la expresión de 
genes relacionados con el metabolismo de la ECM. 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
18S (Conocido en inglés como “18S ribosomal RNA”) RNA ribosomal 18S 
ARD-1 (Conocida en inglés como “Acetyltransferase”) Acetiltransferasa 
ARNT (Del inglés “Aryl-hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator”) 
Translocador de Receptor para Aril-Hidrocarburos 
bHLH/PAS (Del ingles “basic Helix-Loop-Helix/Per-Arnt-Sim) Hélice-Bucle-Hélice 
básica/dominio PAS 
Col-I (Conocida en inglés como “Collagen-I”) Colágena tipo I 
Col-III (Conocida en inglés como “Collagen-III”) Colágena tipo III 
EPID Enfermedades Pulmonares Intersticiales Difusas 
DMEM (Del inglés “Dulbecco’s Modified Eagle Medium”) Medio Eagle 
Modificado de Dulbecco 
DNA (Del inglés “Deoxyribonucleic Acid”) Ácido Desoxirribonucleico 
cDNA (Del inglés “complementary DNA”) Ácido Desoxirribonucleico 
complementario 
ECM (Del inglés “Extracelular Matrix”) Matriz Extracelular 
EDTA (Conocida en inglés como “Ethylenediaminetetraacetic Acid”) Ácido 
Etilendiaminotetra-Acético 
EGF (Del inglés “Epidermal Growth Factor”) Factor de Crecimiento 
Epidérmico 
EMT (Del inglés “Epithelial to Mesenchymal Transition”) Transición Epitelio 
Mesénquima 
EPO (Conocida en inglés como “Erythropoietin”) Eritropoyetina 
ET-1 (Del inglés “Endothelin-1”) Endotelina-1 
FBS (Del inglés “Fetal Bovine Serum”) Suero Fetal Bovino 
GAPDH (Del inglés “Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase”) 
Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa 
Ham’s F-12 (Conocido en inglés como “Ham's F12 Nutrient Mixture”) Mezcla de 
Nutrientes Ham F-12 
HIF (Del inglés “Hypoxia Inducible Factor”) Factor Inducible por Hipoxia 
HPRT (Del inglés “Hypoxanthine-guanine Phosphoribosyltransferase”) 
Fosforribosiltransferasa de Hipoxantina-Guanina 
HRE (Del inglés “Hypoxia Response Element”) Elemento de Respuesta a 
Hipoxia 
IGF-2 (Del inglés “Insulin-like Growth Factor 2”) Factor de Crecimiento 
Insulínico tipo 2 
IL-1 (Conocida en inglés como “Interleukin-1”) Interleucina 1 
IL-4 (Conocida en inglés como “Interleukin 4”) Interleucina 4 
FPI Fibrosis Pulmonar Idiopática 
MMP (Del inglés “Matrix Metalloproteinase”) Metaloproteasa de Matriz 
ODDD (Del inglés “Oxygen Dependent Degradation Domain”) Dominio de 
Degradación Dependiente de Oxígeno 
OPN (Conocida en inglés como “Osteopontin”) Osteopontina 
PAI-1 (Del inglés “Plasminogen Activator Inhibitor”) Inhibidor del Activador de 
Plasminógeno 1 
PCR (Del inglés “Polymerase Chain Reaction”) Reacción en Cadena de la 
Polimerasa 
PDGF (Del inglés “Platelet-Derived Growth Factor”) Factor de Crecimiento 
Derivado de Plaquetas 
PHD (Conocida en inglés como “Prolyl Hydroxylase”) Prolilhidroxilasa 
RER (Del inglés “Rough Endoplasmic Reticulum”) Retículo Endoplasmático 
Rugoso 
RNA (Del inglés “Ribonucleic Acid”) Ácido Ribonucleico 
mRNA (Del inglés “messenger RNA”) Ácido Ribonucleico mensajero 
RT-PCR (Del inglés “Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction”) 
Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa 
TAD-C (Conocida en inglés como “Terminal Transactivation Domain-C”) 
Dominio Terminal de Transactivación C 
TGF-β1 (Del inglés “Transforming Growth Factor β”) Factor de Crecimiento 
Transformante β1 
TIMP (Del inglés “Tissue inhibitor of metalloproteinase”) Inhibidor Tisular de 
Metaloproteasa 
TNF-α (Del inglés “Tumor Necrosis Factor α”) Factor de Necrosis Tumoral α 
UIP (Del inglés “Usual Interstitial Pneumonia”) Neumonía Intersticial Usual 
VGEF (Del inglés “Vascular Endothelial Growth Factor”) Factor de Crecimiento 
Endotelial Vascular 
pVHL (Conocida en inglés como “protein Von Hippel Lindau”) proteína Von 
Hippel Lindau 
 
 
2014 Orozco Vargas Daniel 
1 
 
ANTECEDENTES 
 
Fibrosis Pulmonar Idiopática 
 
El conocimiento de la estructura del tracto respiratorio es necesario para la 
identificación y el tratamiento de las diversas manifestaciones patológicas de este 
sistema. El sistema respiratorio de manera funcional y dicotómica lo podemos 
dividir en tres secciones (véase figura 1); la “parte conductora” que está 
compuesta por tubos (fosas nasales, faringe, laringe, tráquea, bronquios, 
bronquiolos y bronquiolos 
terminales) que conducen el 
aire a los pulmones; la “parte 
de transición” compuesta por 
tubos que bifurcan en tubos 
aún más pequeños 
(bronquiolos respiratorios y 
conductos alveolares); y la 
“parte respiratoria” que consiste 
de sacos donde se realiza el 
intercambio gaseoso (alvéolos) 
(1). 
 
 
Figura 1. Las principales partes del aparato 
respiratorio [1i] 
2014 Orozco Vargas Daniel 
2 
 
La Fibrosis Pulmonar Idiopática (FPI) es la más frecuente de las 
Enfermedades Pulmonares Intersticiales Difusas (EPID). Esta enfermedad se 
caracteriza por ser la más agresiva de las EPID, siendo progresiva, irreversible y 
letal en un periodo breve de tiempo (≈ 3-6 años a partir del inicio de los síntomas). 
Ocurre habitualmente en sujetos mayores de 50 años y alcanza su pico de 
incidencia alrededor de los 60-65 años (2). 
La patogénesis de la FPI aún no se conoce con claridad pero se presume 
que representa una respuesta anormal de un paciente genéticamente susceptible 
a una agresión al endotelio y/o epitelio alveolar, producido por estímulos de 
variada naturaleza como contaminantes ambientales, agentes infecciosos, 
agentes químicos, genéticos, etc. (3). 
Se ha reportado que en los alveolos la activación aberrante de células 
epiteliales y fibroblastos juega un papel crítico en la patogénesis de la FPI; la 
activación epitelial es seguida por un proceso complejo y dinámico caracterizado 
por la migración y proliferación de los fibroblastos y su diferenciación a 
miofibroblastos. La proliferación de fibroblastos se presenta como una respuesta 
que trata de reparar el daño alveolar. Este proceso dura de 1 a 2 semanas y es 
seguido por depósito de colágena en los meses siguientes (3)(4). 
Una característica esencial para el desarrollo de la FPI es la formación de 
focos de fibroblastos distribuidos ampliamente en el parénquima pulmonar, que 
comportándose como pequeñas áreas de lesión pulmonar aguda, en los cuales se 
destruyen las células que recubren el alveolo (células epiteliales) y se desnuda la 
membrana basal; estos focos de proliferación fibroblástica también contribuyen a 
2014Orozco Vargas Daniel 
3 
 
la acumulación de moléculas de la ECM (principalmente colágena) dañando la 
integridad de los alveolos. Todos estos cambios en el microambiente alveolar 
producen en consecuencia un remodelado en la arquitectura o estructura del 
pulmón (véase Figura 2) afectando la función de intercambio gaseoso (5). 
Existen al menos dos perturbaciones importantes en los pulmones 
fibróticos: la acumulación de ECM en los espacios intersticiales y alveolares y la 
desorganización de las membranas basales. En estadios avanzados, los 
pulmones fibróticos contienen 2 a 3 veces más ECM que los pulmones normales, 
incluyendo colágenas (I, III, V, VI y VII), fibronectina, elastina, y proteoglicanos (6). 
 
2014 Orozco Vargas Daniel 
4 
 
 
Figura 2. Esquema histológico de un pulmón sano y uno con FPI (Imagen 
modificada) [2i] . 
 
(A) Ampliación de la estructura alveolar, con paredes alveolares conservadas y una capa 
intacta de células del epitelio bronquial y alveolar. (B) El epitelio dañado con cambios 
hiperplásicos y apoptóticos, con EMT, contribuyendo a la acumulación subepitelial de 
miofibroblastos activados. El engrosamiento pleural implica un aumento de la proliferación 
y migración de las células mesoteliales y pericitos, contribuyendo a la formación de focos 
de fibroblastos. 
2014 Orozco Vargas Daniel 
5 
 
Hipoxia y fibrosis 
 
Una serie de experimentos quirúrgicos han documentado la existencia de 
un microambiente relativamente hipóxico dentro de zonas lesionadas (7)(8)(9). Se 
ha reportado que los fibroblastos dérmicos humanos sometidos a ambientes 
hipóxicos sobreexpresan Col-Iα un 170% más respecto de los valores basales (0 
hrs en normoxia) a las 24 horas de exposición, por otro lado la expresión de MMP-
3, disminuyó a un 2.2% del valor basal (0 horas en normoxia) a las 48 horas con el 
estímulo; remarcando así un proceso a favor de la deposición de ECM y en contra 
su degradación en varios tejidos en respuesta al daño tisular y la hipoxia (10). 
También se ha escrito que la hipoxia incrementa la proliferación de 
fibroblastos en el pulmón contribuyendo así a la deposición de colágenas fibrilares 
y por ende, la progresión de enfermedades pulmonares asociadas con la hipoxia. 
La hipoxia induce la síntesis de Col-I, disminuye la MMP-2 en células epiteliales 
renales, y aumenta el Inhibidor del Activador de Plasminógeno-1 (PAI-1), al 
Inhibidor Tisular de MMPs 1 (TIMP-1), y al Factor de Crecimiento de Tejido 
Conjuntivo a través de la respuesta transcripcional mediada por HIF (11)(12). 
En un estudio realizado por Storch TM y Talley GD, se hicieron pruebas con 
fibroblastos humanos de epidermis fetal (línea GM6166) exponiéndolas a un 
ambiente hipóxico de 2.5% de O2. En el ensayo se demostró que la condición 
hipóxica incrementa la velocidad de división y la densidad final de los fibroblastos 
cultivados in vitro. En este trabajo se llegó a la hipótesis de que un mecanismo de 
acción podría ser: cambios en la conjugación, agrupamiento e internalización de 
2014 Orozco Vargas Daniel 
6 
 
receptores de superficie, afectando así la respuesta mitogénica a factores de 
crecimiento (13). 
Por otro lado las células endoteliales expuestas a baja tensión de oxígeno 
(hipoxia) han mostrado una actividad proliferativa mayor en comparación a 
condiciones normóxicas (~20% de O2) (14), además de que éstas sintetizan una 
serie de nuevas proteínas reguladas por oxígeno (15). 
En un trabajo reciente se analizaron perfiles de expresión génica por 
microarreglos de un modelo murino de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina y 
se comparó estos resultados con los microarreglos de las bases de datos públicas. 
Se encontró que tanto en el modelo murino como en humanos con FPI la 
señalización por hipoxia se encuentra alterada; con base en estas observaciones 
se propone que la activación de HIF-1α es un evento temprano en la patogénesis 
de la enfermedad (16). 
 
Factor de transcripción inducible por hipoxia (HIF) 
 
El factor de transcripción inducible por hipoxia 1 alfa (HIF-1α) es una 
proteína requerida para la inducción de varios genes implicados en la sobrevida 
celular y homeostasis de oxígeno. Algunos de esos genes son Factor de 
Crecimiento Vascular y Endotelial (VGEF), Factor de Crecimiento Derivado de 
Plaquetas (PDGF), Factor de Crecimiento Transformante-β1 (TGF-β1), 
Eritropoyetina (EPO) y varias enzimas glicolíticas. En estudios previos se encontró 
que los fibroblastos expuestos a hipoxia o en altas concentraciones de lactato y 
2014 Orozco Vargas Daniel 
7 
 
dentro del microambiente de la lesión incrementan la tasa de síntesis de colágena 
(17). 
La regulación de HIF-1α y de HIF-2α se opera vía hidroxilación enzimática 
mediante prolil-hidroxilasas (PHD1, PHD2 o PHD3). Estas enzimas contienen 
hierro en su sitio activo, utilizan el oxígeno molecular y el 2-oxoglutarato, para 
modificar los residuos prolil de las proteínas HIF-1α y HIF-2α, permitiendo su 
reconocimiento para ser destruidas por un proteosoma (18). 
HIF-1 en su forma funcional es un heterodímero compuesto por dos 
subunidades, HIF-α (HIF-1α, HIF-2α, o HIF-3α) que es de vida corta, y HIF-β que 
también es conocida como Translocador del Receptor para Aril-Hidrocarburos 
(ARNT), la cual es expresada constitutivamente en el núcleo. Ambas subunidades 
pertenecen a la familia de los factores de transcripción con dominios bHLH/PAS 
(basic Helix-Loop-Helix/Per-Arnt-Sim) que son determinantes para la unión al DNA 
(19) (20). 
 En condiciones de normoxia las unidades HIF-α tienen una vida media muy 
corta, ya que las células sintetizan y degradan continuamente esta proteína HIF-α 
(21). Sin embargo, en virtud de la disminución de la concentración de oxígeno, la 
degradación de HIF-α se ve reducida (22). 
La interfase entre el oxígeno y la subunidad HIF-α es proporcionada por 
distintas reacciones enzimáticas (véase figura 3): la hidroxilación de dos residuos 
prolina (Pro402 y Pro564) mediante la actividad de prolil hidroxilasas (PHD’s) (23) 
y la acetilación de un residuo lisina (Lys-532) por medio de una Acetiltransferasa 
(ARD1) en el Dominio de Degradación Dependiente de Oxígeno (ODDD) de la 
subunidad α (24). Esta hidroxilación y acetilación dependientes de oxígeno regulan 
2014 Orozco Vargas Daniel 
8 
 
la interacción de la subunidad HIF-α con la proteína supresora tumoral Von Hippel-
Lindau (pVHL). pVHL es el componente de reconocimiento de un complejo 
ubiquitina ligasa conocida como E3 que dirige a HIF-α para su proteólisis por 
medio un proteasoma, conocido como 26S (22). 
 Por el contrario, bajo condiciones de hipoxia, la prolil hidroxilación y lisil 
acetilación son suprimidas, HIF-α escapa de la destrucción proteasomal y es 
acumulada (25). Esta subunidad es translocada al núcleo celular, su dominio C 
terminal de transactivación (TAD-C) interactúa con un coactivador (p300/CBP) y 
de esta manera HIF-1α dimeriza con HIF-1β (26); entonces este complejo 
heterodimérico de trans-activación se une a los Elementos de Respuesta a 
Hipoxia (HRE) que son de esta forma promotores o inductores activos de una 
amplia gama de genes (27). 
 
Figura 3. Mecanismo molecular de la estabilidad de HIF-1 α en hipoxia y normoxia 
(imagen modificada) [3i]. 
 
El nivel de O2 regula la degradación mediada por hidroxilación (P402 y P564 mediante 
PHD) y acetilación (K532 medianteARD1) de sus residuos de aminoácidos. En normoxia 
la unidad N803 es hidroxilada y se inhibe la asociación de p300/CBP a HIF-1α, llevando a 
la inhibición transcripcional de HIF-1α. 
2014 Orozco Vargas Daniel 
9 
 
La relevancia que tiene HIF-1 en el desarrollo de la fibrosis puede 
contrastarse por lo reportado en un estudio realizado por Higgins D.F. en células 
epiteliales renales; el cual sugiere que la hipoxia y la señalización a través de HIF-
1 contribuyen al desarrollo de fibrosis intersticial por un incremento en la expresión 
de factores que modifican a la ECM, un aumento en la expresión de genes para 
lisil-oxidasa (enzimas encargadas de la formación estable de colágena) y por 
potenciar el proceso conocido como Transición Epitelio Mesenquima (EMT) (28). 
 
Factor de Crecimiento Transformante Beta 1 (TGF- β1) y α-Actina de Músculo 
Liso ( α-SMA) 
 
TGF-β1 es una proteína perteneciente a la superfamilia de factores de 
crecimiento transformante beta. Es un péptido que regula una amplia variedad de 
funciones celulares incluyendo proliferación celular, muerte celular programada, 
especialización celular y algunos procesos clave en el desarrollo embrionario (29). 
Se sintetiza como un precursor inactivo, que debe ser escindido proteolíticamente 
para generar la proteína activa. Esta se une a dos receptores celulares (tipo I y II) 
con actividad serina-treonina kinasa, y desencadena la fosforilación de factores 
citoplásmicos denominados Smads. Estos Smads fosforilados se unen a Smad4 
para formar heterodímeros que entran en el núcleo y se asocian a otras proteínas 
de unión a ADN para activar o inhibir la transcripción de genes específicos (30). 
Uno de sus efectos descritos en el desarrollo de la fibrosis es la 
estimulación en la formación de matriz extracelular (ECM), mediante la activación 
transcripcional de una amplia gama de genes que codifican una diversidad de 
2014 Orozco Vargas Daniel 
10 
 
moléculas profibróticas (31)(32). Esta citocina se ve sobreexpresada en 
fibroblastos humanos dérmicos y fibroblastos de pulmón de ratón, bajo el estímulo 
de algún alérgeno y en un ambiente hipóxico (33)(34). Un estudio realizado por 
Norman J.T. et al. en fibroblastos derivados de riñón expuestos a hipoxia, 
demostró que se manifiesta un incremento de la síntesis de colágena en respuesta 
a la hipoxia de una manera dependiente de TGF-β1 (35). 
Se ha observado que TGF-β1 induce en las células epiteliales la EMT (28) y 
estimula en los fibroblastos su transdiferenciación a miofibroblastos (36) al inducir 
la sobreexpresión de α-actina en su citoesqueleto, así como generar un aumento 
en su capacidad de síntesis de proteínas de ECM (37)(38). 
La actina es una proteína muy abundante en prácticamente todas las 
células eucariotas y participa en funciones estructurales y de motilidad celular. En 
ensayos funcionales, todas las actinas parecen idénticas, pero a pesar de su alto 
grado de similitud en base a las secuencias de aminoácidos se han podido 
distinguir dos grupos principales de actinas: actinas específicas de músculo 
(actinas-α) y las actinas no musculares (actinas β y γ) (29). 
La α-actina de musculo liso es expresada de manera transitoria durante el 
desarrollo de músculo cardiaco y músculo esquelético, pero es principalmente 
expresada en músculo liso adulto. Mientras que las isoformas β y γ están 
involucradas en la regulación de la motilidad celular, la α-actina es el constituyente 
principal del aparato contráctil, y también es encontrada en músculo esquelético 
(39). 
 
2014 Orozco Vargas Daniel 
11 
 
Metaloproteasa de Matriz 1 (MMP-1) e Inhibidor Tisular de Metaloproteasas 1 
(TIMP-1) 
 
El tejido conjuntivo se encuentra constantemente en remodelación, esta 
remodelación es en respuesta al crecimiento o debido a alguna lesión del tejido 
(40). Las fibras de colágena se caracterizan por su resistencia a las proteasas 
tales como pepsina, tripsina o quimiotripsina. Estas proteínas solo pueden ser 
degradadas por la acción proteolítica de la familia de las Metaloproteasas de 
Matriz Extracelular (MMPs) (41). 
Las metaloproteasas componen a una superfamilia de proteasas o enzimas 
dependientes de zinc. Éstas participan en procesos fisiológicos (desarrollo y 
sanación de heridas) y patológicos (oncogénesis y metástasis). Las MMP’s se 
encargan de degradar los variados componentes de la ECM como: proteoglicanos, 
glucosaminoglicanos, proteínas estructurales y de adhesión (véase Tabla 1). 
Incluso tienen la capacidad de activar factores de crecimiento, receptores de 
superficie y moléculas de adhesión (42)(43). 
La MMP-1 también se le conoce como colagenasa-1 o colagenasa 
intersticial. Es una metaloproteasa capaz de degradar colágenas fibrilares de tipo 
I, II y III (las proteínas más abundantes de la MEC); tiene una estructura que 
consiste en un dominio “pre”, un dominio “pro”, un dominio catalítico, una región 
conectora y un dominio de hemopexina (6). 
Cabe señalar que TGF-β1 (un potente factor profibrogénico sobreexpresado 
en el desarrollo de la FPI) y la osteopontina (otro mediador fibrogénico) han 
demostrado tener un efecto inhibitorio sobre la transcripción de MMP-1; y un 
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12 
 
efecto estimulante en la expresión de TIMP-1, que es el inhibidor natural de varias 
MMP’s, incluyendo la MMP-1 (6). 
 
Tabla 1. Metaloproteasas y respectivos sustratos [1t]. 
 
Consecuentemente, por su gran espectro de activación e inhibición, estas 
moléculas poseen la capacidad de alterar del destino celular e intervenir en el 
desarrollo del organismo. Por lo tanto, estas enzimas también llamadas matrixinas 
MMP (tipo) Denominación Sustrato ECM 
Colagenasas 
MMP-1 Colagenasa 1 Colágenas I, II, III, VII, VIII y X, gelatina, proteoglucanos, tenascina, 
entactina 
MMP-8 Colagenasa 2 Colágenas I, II, III, V, VIII y X, gelatina, agrecan 
MMP-13 Colagenasa 13 Colágenas I, II, III, IV, IX, X y XIV, gelatina, tenascina, fibronectina, 
agrecan, osteonectina 
Gelatinasas 
MMP-2 Gelatinasa A Colágenas I, IV, V, VII, X, XI y XIV, gelatina, elastina, fibronectina, 
laminina, agrecan, versican, osteonectina, proteoglucanos 
MMP-9 Gelatinasa B Colágenas IV, V, VII, X y XIV, gelatina, elastina, agrecan, versican, 
proteoglucanos, osteonectina 
Estromelisinas 
MMP-3 Estromalisina 1 Colágenas III, IV, V y IX, gelatina, agrecan, versican, proteoglucanos, 
tenascina, fibronectina, laminina, osteonectina 
MMP-10 Estromalisina 2 Colágenas III, IV y V, gelatina, caseina, agrecan, elastina, 
proteoglucanos 
MMP-11 Estromalisina 3 Caseína, laminina, fibronectina, gelatina, colágena IV, transferrina 
Tipo membrana 
MMP-14 MT1-MMP Colágenas I, II y III, caseína, elastina, fibronectina, vitronectina, 
tenascina, proteoglucanos, laminina, entactina 
MMP-15 MT2-MMP Tenascina, fibronectina, laminina 
MMP-16 MT3-MMP Colágena III, gelatina, caseína, fibronectina 
MMP-17 MT4-MMP ND 
MMP-24 MT5-MMP ND 
MMP-25 MT6-MMP ND 
Otras 
MMP-7 Matrilisina Colágenas IV y X, gelatina, agrecan, proteoglucanos, fibronectina, 
laminina, entactina, tenascina, caseína transferrina, integrina b4, 
osteonectina, elastina 
MMP-12 Metaloelastasa Colágenas IV y IV, gelatina, elastina, caseína, laminina, 
proteoglucanos, fibronectina, vitronectina, entactina 
MMP-20 Enamelisina Amelogenina 
MMP-23ª MMP-21 ND 
MMP-23B MMP-22 ND 
MMP-26 Matrilisina 2 Colágena IV, fibrinógeno, fibronectina, caseína 
MMP-27 ND ND 
MMP-28 Epilisina Caseína 
ECM: Matriz Extracelular; MMP: Metaloproteasas; ND: NoDeterminado 
2014 Orozco Vargas Daniel 
13 
 
son precisamente moduladas bajo un estricto control durante su activación por 
inhibidores endógenos, α-macroglobulinas, e inhibidores tisulares de 
metaloproteasas (TIMPs) (43)(44). 
Los TIMP’s pertenecen a una familia de proteínas (véase Tabla 2) que son 
inhibidores naturales de las MMP’s (45). Se ha reportado que en el padecimiento 
de Fibrosis Pulmonar Idiopática los niveles de estos TIMP’s se manifiestan 
incrementados (37), de tal manera que la degradación de ECM por medio de 
MMP’s se ve contrarrestada, favoreciendo a un gradiente de acumulación frente a 
la degradación de ECM en los tejidos (45)(46). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 2. Inhibición de metaloproteasas por TIMPs [2t]. 
Las marcas con “X” indican que se ha observado inhibición de la actividad enzimática y 
con “-“ que no se ha estudiado. 
 
MMP No. TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 
MMP-1 X X X X 
MMP-2 X X X X 
MMP-3 X X X X 
MMP-7 X X X X 
MMP-8 X X - - 
MMP-9 X X X X 
MMP-10 X X - - 
MMP-11 X - - - 
MMP-12 X - - - 
MMP-13 X X X - 
MMP-14 No X X - 
MMP-15 - X X - 
MMP-16 X X - - 
MMP-17 - - - - 
MMP-18 - - - - 
MMP-19 - X - - 
MMP-20 - - - - 
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14 
 
Uno de los paradigmas centrales en la patogénesis de la FPI hace énfasis 
en el desequilibrio de la expresión de las metaloproteasas, lo cual incluye tres 
componentes: 1) la sobreexpresión de proteínas de matriz extracelular, 2) la 
inhibición de las Metaloproteasas de Matriz (MMPs) y 3) la sobreexpresión del 
Inhibidor Tisular de Metaloproteasas (TIMPs). Un papel importante de los MMPs 
en el desarrollo de la fibrosis es la activación proteolítica o inactivación de 
moléculas señalizadoras y receptores de membrana, con lo que se afecta casi 
cualquier aspecto del comportamiento celular (47). 
Existen algunas condiciones clínicas bajo las cuales el epitelio alveolar está 
expuesto a concentraciones bajas de oxígeno (hipoxia). Se ha reportado que la 
expresión génica de las MMPs y TIMPs cambia significativamente bajo este 
estímulo. Ya que la expresión enzimática y su actividad son críticas para el 
balance entre la acumulación de proteínas y su degradación, se ha formulado la 
hipótesis de que estos cambios favorecen la acumulación frente a la degradación 
de las colágenas (18)(10)(46). 
Se ha reportado que en el padecimiento de Fibrosis Pulmonar Idiopática los 
niveles de estos TIMP’s se manifiestan incrementados (37), de tal manera que la 
degradación de ECM por medio de MMP’s se ve contrarrestada, favoreciendo a un 
gradiente de acumulación frente a la degradación de ECM en los tejidos (45)(46). 
TIMP-1 es un inhibidor encontrado en células intersticiales (48), y posee un amplio 
espectro de supresión contra MMP’s (49). 
 
 
 
2014 Orozco Vargas Daniel 
15 
 
Colágena 
 
La matriz extracelular está compuesta por macromoléculas que pertenecen 
a la familia de las colágenas, los proteoglicanos y glicoproteínas, y en algunos 
tejidos, las elastinas. Estas sustancias son segregadas por células del tejido 
conectivo como fibroblastos, condrocitos y osteoblastos (50). 
Se pueden distinguir varios tipos de matriz extracelular. La más 
generalizada es la matriz intersticial o estroma, donde las células están embebidas 
y sus componentes mayoritarios son las colágenas que forman fibras, la 
glicoproteína fibronectina y proteoglicanos del tipo condroitín y dermatán sulfato 
(40). 
La principal proteína estructural de la matriz extracelular es la colágena. 
Pertenece a una familia de proteínas constituida al menos por 27 miembros 
diferentes (véase Tabla 3). La molécula está constituida por tres cadenas 
polipeptídicas o dominios (con 1000 aminoácidos), agrupadas en una estructura 
helicoidal y estabilizadas por aminoácidos hidroxilados (lisina y prolina) que 
forman puentes de hidrógeno intercatenarios durante la síntesis (véase Figura 4) 
(51). 
Las colágenas son las proteínas más abundantes en mamíferos y llegan a 
constituir entre un 25% y 35% del contenido proteico de un animal (52). En el 
humano son el principal constituyente de los tejidos como: la piel en un 74%, 
tendones y ligamentos el 90%, córnea el 64%, cartílago el 50%, hueso cortical el 
23%, aorta entre un 12-14%, pulmón el 10%, e hígado el 4% (40). 
2014 Orozco Vargas Daniel 
16 
 
Los dominios de las colágenas están formados por 330 repeticiones de 
tripletes con la secuencia de aminoácidos Gly-X-Y. En la posición X suele 
aparecer la prolina (Pro), y en la posición Y la hidroxiprolina (Hyp); la glicina (Gly) 
constituye la tercera parte de los aminoácidos de cada cadena, lo que la diferencia 
de entre todas las proteínas del organismo (53)(54). 
Las diferentes moléculas de colágena sirven en el cuerpo en gran medida 
para el mantenimiento de la integridad estructural de tejidos y órganos. Gracias a 
su interacción con receptores especializados participan en una variedad de 
funciones como: adhesión, diferenciación, crecimiento, desarrollo de órganos, 
cicatrización y reparación tisular. De esta manera las colágenas ejercen funciones 
importantes en el ambiente celular y están implicados en la liberación de 
mediadores celulares como son los factores de crecimiento (41). 
En el parénquima pulmonar normal se encuentran al menos cinco tipos 
diferentes de colágena: En el espacio intersticial, las colágenas tipo I y III, con una 
relación 2:1, son las más abundantes; las colágenas tipo V y VI se encuentran en 
pequeñas cantidades y en las membranas basales del epitelio alveolar y endotelio 
capilar es muy abundante la colágena tipo IV (55). 
 
 
 
 
 
 
 
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17 
 
 
Tabla 3. Tipos de colágena [2t] [3t] [4t]. 
 
 
 
 
Tipo Tipo de asociación Composición Distribución 
I Fibrilar [α1(I)]2 [α2(I)] Piel, hueso, tendón, ligamentos, 
córnea, pulmón, dentina. Supone 
el 90% de la colágena del cuerpo 
II Fibrilar [α1(I)3] Cartílago, humor vítreo, 
notocorda 
III Fibrilar [α1(II)]3 Acompaña a tipo I en fibrillas 
heterotípicas: vasos sanguíneos, 
piel, pulmón 
IV Reticular o formadora de 
redes 
[α1(IV)]2 [α2(IV)] α3(IV) α4(IV) 
α5(IV) 
Membranas basales 
V Fibrilar [α1(V)]3 
[α1(V)]2 [α2(V)] 
α1 (VI) α2(VI) α3(V) 
Acompaña a tipo I en fibrillas 
heterotípicas, fibrillas delgadas 
VI Filamentosa α1(VI) α2(VI) α3(VI) Filamentos en rosario de matrices 
del estroma que interactúan con 
fibrillas 
VII Cadena larga asociada a 
redes 
[α1(VII)]3 Filamentos de anclaje que se 
unen a membranas basales 
epiteliales 
VIII Cadena corta [α1(VIII), α2(VIII)] Membranas de descemet, 
matrices subendoteliales 
IX Asociada a fibras (FACIT) α1(IX) α2(IX) α3(IX) Superficie de fibras de colágena 
tipo II en cartílago hialino, humor 
vítreo 
X Cadena corta [α1(X)]3 Cartílago hipertrófico 
XI Fibrilar α1(XI) α2(XI) α3(XI) Acompaña a la tipo II en fibras 
heterotípicas 
XII Asociada a fibras (FACIT) [α1(XII)]3 con algunas fibrilares de 
tipo I 
Tendón y piel embrionarios; 
acompaña algunas matrices que 
contienen tipo I, tendón, 
ligamentos 
XIII Transmembrana [α1(XIII)]3 Células endoteliales 
XIV 
 
Asociada a fibras (FACIT) [α1(XIV)]3 Piel fetal y tendón 
XV Multiplexina [a1(XV)]3 Fibroblastos, células de músculo 
liso, riñón, páncreas 
XVI Multiplexina [a1(XVI)]3 Fibroblastos, queratinocitos, 
amnios 
XVII Transmembrana [a1(XVII)]3 Dermis y epidermis 
XVIII Multiplexina [a1(XVIII)]3 Pulmones e hígado 
XIXAsociada a fibras (FACIT) [a1(XIX)]3 Observado en rabdomiosarcoma 
humano 
XX Asociada a fibras (FACIT) [a1(XX)]3 Epitelio de córnea, piel 
embrionaria, cartílago esternal, 
tendón 
XXI Asociada a fibras (FACIT) [a1(XXI)]3 Pared de vaso sanguíneo 
2014 Orozco Vargas Daniel 
18 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Estructura general de la colágena [4i]. 
 
 
Síntesis de la colágena 
 
Los precursores polipeptídicos de colágena se forman en los fibroblastos 
(véase Figura 5) y son segregados a la matriz extracelular, estas proteínas 
contienen una secuencia de aminoácidos especial en sus extremos N-terminales. 
Esta secuencia actúa como una señal que marca el polipéptido a sintetizar para 
que sea secretado de la célula, entonces este precursor es escindido en el 
Retículo Endoplásmico Rugoso (RER) para proporcionar un precursor del 
colágena denominado procadena α (53). 
La siguiente etapa comprende la hidroxilación, de las procadenas α 
mediante una serie de eventos enzimáticos dentro del RER. Los residuos de 
prolina y de lisina encontrados en la posición Y de la secuencia –Gly-X-Y- pueden 
2014 Orozco Vargas Daniel 
19 
 
ser hidroxilados por tres hidroxilasas diferentes, prolil 3-hidroxilasa, prolil 4-
hidroxilasa, lisilhidroxilasa dentro del RER para formar residuos de hidroxiprolina e 
hidroxilisina, estas reacciones de hidroxilación precisan la formación de enlaces de 
hidrógeno entre cadenas, y con esto la creación de una triple hélice estable (56). 
Después de la hidroxilación y la glicosilación, las procadenas α forman la 
procolágena, entonces estas moléculas son transportadas al aparato de Golgi, 
donde se empaquetan en vesículas secretoras que las llevan al espacio 
extracelular y entonces ocurre la formación de la triple hélice de procolágena (57). 
La estabilización de esta hélice se logra mediante la formación de puentes 
hidrógeno que se forman entre las tres cadenas formando interacciones 
cooperativas entre los puentes hidrógeno: 1) los que se establecen entre los 
grupos amino peptídicos de los residuos glicina (Gly) y los grupos carbonilo 
peptídico de los residuos de la otra cadena y 2) los que se establecen entre los 
grupos hidroxilo de los residuos de Hidroxiprolina (Hyp) y las moléculas de agua 
(52). 
Entonces las moléculas de procolágena pasan por la escisión extracelular, 
las moléculas son escindidas por las N y C-procolágenopeptidasas, que retiran los 
propéptidos terminales y liberan las moléculas de “tropocolágena” helicoidales 
triples (50). Cada una de las moléculas de tropocolágena forma hélices triples en 
las que las cadenas polipeptídicas se enrollan estrechamente una alrededor de la 
otra, en disposición ordenada, en paralelo solapante (53). 
Por último para obtener fibras de colágena madura, las moléculas de 
tropocolágena se autoensamblan en fibras de colágena insoluble siendo 
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20 
 
estabilizadas por la formación de entrecruzamientos intermoleculares derivados de 
aldehídos (50). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Esquema general de la síntesis de colágena [5i]. 
 
 
 
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21 
 
Fibroblasto 
 
Los fibroblastos (véase Figura 6) participan en los procesos de reparación y 
regeneración en casi todos los tejidos humanos. Estos son los principales 
constituyentes celulares de tejido conectivo. Morfológicamente tienen 
prolongaciones citoplasmáticas irregulares, un núcleo claro de forma ovoidal con 
un nucléolo evidente; el citoplasma es rico en retículo endoplasmático rugoso y un 
complejo de Golgi bien desarrollado (1). 
La función principal de los fibroblastos es secretar proteínas de la ECM que 
aportan un tejido de soporte para eventos normales de reparación. La disolución 
eventual de este andamio y la apoptosis de fibroblastos son críticos para la 
restauración de la arquitectura normal del tejido (58). 
La definición funcional de los fibroblastos se puede referir por la descripción 
de una población de células que; 1) sintetizan y secretan una compleja serie de 
moléculas de la ECM estructurales (colágenas y fibronectina) y no estructurales 
(trombospondina y osteopontina); 2) organizar y remodelar activamente la ECM a 
través de la producción de proteasas (MMP’s); 3) tener comunicación con células 
cercanas a través de comunicación paracrina, autocrina, y otras formas de 
comunicación. Finalmente, los fibroblastos a través de diversas manifestaciones, 
participan de manera directa e indirecta en heridas que no sanan y en 
enfermedades fibróticas (59). 
Los fibroblastos tienen múltiples orígenes embrionarios; la primera de estas 
poblaciones son las células madre mesenquimales, que pueden diferenciarse en 
múltiples tipos de células de tipo mesenquimal; una segunda población son los 
2014 Orozco Vargas Daniel 
22 
 
fibrocitos, los cuales surgen a partir del hueso adulto y son caracterizados por 
asumir también un fenotipo similar al de fibroblastos en zonas lesionadas (60). 
Los fibroblastos activados adquieren un fenotipo “agresivo” y son 
considerados como los principales responsables de la acumulación de colágena 
en los pacientes diagnosticados con FPI (61). 
El patrón anatomopatológico de la FPI es heterogéneo; con áreas de 
fibrosis pulmonar que se manifiestan con focos de proliferación fibroblástica, 
causados por daño y activación epitelial. Los focos de fibroblastos se localizan en 
el intersticio pulmonar, y caracterizan por la proliferación de fibroblastos y 
miofibroblastos, junto con una disminución en la apoptosis e hiperrespuesta a 
citocinas fibrogénicas (62). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Esquema de fibroblasto [6i]. 
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23 
 
Miofibroblasto 
 
 En la cicatrización de las heridas la principal célula encargada de dicho 
proceso es el miofibroblasto por la capacidad contráctil de esta célula, lo cual es 
fundamental en el cierre de la cicatriz formada. Estás células tienen morfología de 
fibroblasto, pero la principal propiedad de los miofibroblastos es la de expresar 
fibras de α-actina (proteína presente en el fenotipo de células de músculo liso) 
conectadas entre el citoesqueleto de estos miofibroblastos y con la ECM, además 
de poseer un amplio espectro de síntesis de moléculas que componen la ECM; 
por lo que los miofibroblastos son considerados como intermediarios entre 
fibroblastos y células de músculo liso (63)(64) y también son considerados como 
los protagonistas de la formación anormal de depósitos de colágena (37)(65). 
Entre las moléculas que sintetizan se encuentran diversos tipos de 
colágenas, pero principalmente las colágenas de tipo I y III; glicoproteínas como 
los proteoglicanos y fibronectina; además de otras proteínas y proteasas. Estas 
células además son capaces de interactuar con diversas células locales e 
inflamatorias por medio de diferentes mediadores químicos como las interleucinas, 
quimiocinas, neuropéptidos y diversos factores de crecimiento (66). 
TGF-β1 es el principal factor que induce la transdiferenciación de 
fibroblastos a miofibroblastos, confiriendo a estas células diferenciadas; protección 
contra apoptosis; expresión de α-actina en su citoesqueleto (característica 
principal de fenotipo). Además se ha observadoque esta citosina desencadena el 
fenómeno conocido como Transición Epitelio Mesénquima (EMT), de la cual se 
2014 Orozco Vargas Daniel 
24 
 
asevera que es la causante de múltiples orígenes (véase Figura 7) de este 
fibroblasto “activado” (64). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Múltiples orígenes de los miofibroblastos [7i]. 
1.- Transdiferenciación de fibrocitos derivados de la médula ósea. 
2.- En hígado los miofibroblastos son reclutados de las células madre hematopoyéticas, 
3.- En pulmón la EMT puede proporcionar otro mecanismo para originar miofibroblastos. 
4.- Durante la formación de la placa ateromatosa, la desdiferenciación de las células madre 
hematopoyéticas del medio son propuestas como una importante fuente de miofibroblastos, 
 
 
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25 
 
 
 
 
 
 
 
JUSTIFICACIÓN 
� La fibrosis tisular es una causa común de la pérdida de la función de 
algunos órganos. Por consiguiente, la búsqueda de los mecanismos 
básicos en su iniciación y progresión son un paso esencial para establecer 
nuevas estrategias terapéuticas. El conocimiento de la regulación génica 
por hipoxia sobre la expresión de algunos genes catalogados como pro-
fibrosantes, tiene implicaciones relevantes para el entendimiento de la 
fibrosis, tal es el caso de la FPI. 
 
� Con este estudio esperamos dilucidar las diferencias en la expresión de 
genes relacionados con la fibrosis pulmonar en fibroblastos de pulmón 
normal y una línea de fibroblastos provenientes de un paciente con FPI bajo 
condiciones de hipoxia 
 
 
 
 
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26 
 
 
 
 
 
 
 
HIPÓTESIS 
 
� La hipoxia en fibroblastos provenientes de pulmón derivado de un paciente 
con FPI, promueve una mayor expresión de colágenas (Col-I y Col-III) y 
algunos otros genes implicados en el desarrollo de la FPI (HIF-1α, HIF-2α, 
TGF-β1, α-SMA, MMP1 y TIMP1) en comparación con fibroblastos de 
pulmón normal. 
 
 
 
 
 
 
 
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27 
 
 
 
OBJETIVO GENERAL 
 
� Determinar si en un cultivo primario de fibroblastos provenientes de 
pacientes con fibrosis (FF) y otro de fibroblastos normales (FN) bajo 
condiciones de hipoxia, producen un aumento (o desequilibrio) en la 
producción de factores y mediadores de degradación (MMP-1, TIMP-1) y de 
síntesis (Col-I y Col-III) de la ECM. 
 
 
OBJETIVOS PARTICULARES 
 
� Medir y describir el efecto de la Hipoxia (1% O2) en la expresión génica de 
HIF-1α y HIF-2α en fibroblastos de pulmón FN y FF. 
 
� Medir y describir el efecto de la Hipoxia (1% O2) en la expresión génica de 
TGFβ1, α-actina de músculo liso, Colágena I, Colágena III, MMP-1 y TIMP-
1 en fibroblastos de pulmón FN y FF. 
 
 
 
2014 Orozco Vargas Daniel 
28 
 
MATERIAL Y MÉTODOS 
 
Cultivo Celular 
 
Los fibroblastos de pulmón, tanto el normal como del paciente con FPI se 
obtuvieron, como anteriormente se ha descrito (67)(37). Se sembraron células en 
placas de cultivo de 6 pozos a un 80% de confluencia con medio de cultivo Ham’s 
F-12 para fibroblastos (FN y FF), Suero Fetal Bovino (FBS) al 10%, 200 U/ml de 
Penicilina y Estreptomicina. Las placas de cultivo fueron colocadas dentro de 
cámaras de hipoxia, reduciendo la concentración a 1% de O2 mediante el 
suministro de una mezcla de gas Nitrógeno en un 5% y CO2 en un 95%, a una 
presión de 15 L/min. Una vez condicionadas las células a este estímulo se 
incubaron a 37ºC, en una atmósfera humidificada. 
 
Extracción de RNA 
 
Por cada periodo de exposición a hipoxia (0, 12, 24, 48, 72, 96 hrs), las placas de 
cultivo de 6 pozos con células fueron retiradas de las cámaras de hipoxia y se 
realizó un lisado celular con el reactivo de TRIzol® (invitrogen) para extraer RNA 
como a continuación se describe: 
 
2014 Orozco Vargas Daniel 
29 
 
1. Se adicionó 1 ml de TRIzol por cada pozo de la placa, dejando actuar durante 
10 segundos el reactivo y homogeneizando lo mejor posible el lisado celular 
por retropipeteo. 
2. Se recuperó el reactivo con el lisado celular en tubos de centrifuga de 1.5 ml 
estériles y se guardó a -70ºC. Una vez obtenidos todos los tiempos de 
exposición a hipoxia se procedió a realizar la extracción de RNA de todas las 
muestras. 
3. Se adicionó a cada tubo 200 µl de cloroformo por cada ml de TRIzol. 
4. Se homogeneizó vigorosamente cada tubo a mano durante 15 segundos y se 
dejó incubar durante 3 minutos a temperatura ambiente. 
5. Se centrifugó cada muestra a 4ºC por 15 minutos a 12,000 rpm para obtener 
una separación de fases de RNA, DNA y proteínas. 
6. Se extrajo con una micropipeta el sobrenadante acuoso superior (contiene el 
RNA) evitando llevar cualquier otra fase de la suspensión para evitar la 
contaminación de la muestra de RNA, entonces se recuperó en un nuevo tubo 
de centrifuga de 1.5 ml estéril. 
7. Al nuevo tubo se agregó 500 µl de Isopropanol por cada ml de TRIzol utilizado 
inicialmente, se homogeneizó vigorosamente el tubo a mano durante 15 
segundos y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 10 min. 
8. Se centrifugó cada muestra 4ºC por 10 minutos a 12,000 rpm y se removió el 
sobrenadante resultante (se procuró solo dejar el precipitado o pellet de RNA 
para evitar la contaminación de la muestra con fenoles). 
9. Se lavó el pellet con 1 ml de etanol al 75%; se homogeneizó el tubo a mano y 
se centrifugó a 7500 rpm, por 5 minutos a 8°C. Al final se retiró el sobrenadnte. 
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30 
 
10. Se resuspendió el pellet de RNA en 40 µl agua libre de RNAsas. 
 
Transcripción inversa 
 
El RNA aislado se cuantificó en un espectrofotómetro (NanoDrop 2000® de 
Thermo Scientific) y se procedió a obtener el DNA complementario (cDNA) con un 
kit comercial (High Capacity cDNA reverse Transcription Kit - Applied 
Biosystems®), considerando los siguientes pasos: 
 
1. En un tubo para centrifuga se adicionó 1µg del RNA aislado, 1µl de DNAsa, 1µl 
de Buffer RT 10x y se aforó a 10µl con Agua con Dietilpirocarbonto (DEPC). 
2. Se incubó la DNAsa durante 30 min a 37°C en un termociclador de punto final. 
Posteriormente se agregó al tubo, 1µl de EDTA 50mM y se incubó a 65°C 
durante 10 min en un termociclador de punto final. 
3. Se preparó Master Mix para RT-PCR, como se indica en la siguiente tabla: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Master Mix para RT -PCR 
Reactivo Volumen por Reacción 
Buffer RT [10x] 2.0 µl 
dNTP’s [25mM] 0.8 µl 
Primers al azar [10X] 2.0 µl 
Inhibidor de RNAsa [40 U/µl] 1.0 µl 
Transcriptasa Reversa [50 U/µl] 1.0 µl 
H2O 2.2 µl 
Total 9.0 µl 
2014 Orozco Vargas Daniel 
31 
 
4. Se programó el termociclador de punto final con los ciclos indicados en la tabla 
siguiente: 
 
 
 
 
 
 
5. Se llevaron todas las muestras de cDNA a una concentración de 50 ng/ml, para 
posteriormente usar 200 ng totales de cDNA por reacción. 
 
 
Análisis de la expresión génica por PCR en tiempo real 
 
Cuantificación Relativa 
 
Es un método que permite la cuantificación precisa de ácidos nucleicos en 
una mezcla compleja, incluso si la muestra inicial se encuentraen una 
concentración muy baja. En la última década sus aplicaciones han sido 
herramientas ampliamente utilizadas para la cuantificación de secuencias 
específicas en mezclas complejas. Por ejemplo: la técnica ha sido usada para 
genotipificación, cuantificar la carga viral en pacientes, evaluar el número de 
copias de genes en tejido canceroso (68)(69). 
Condiciones en el termociclador de punto final 
25°C durante 10 minutos 
37°C durante 2 horas 
85°C durante 5 segundos 
4°C hasta sacar el tubo 
2014 Orozco Vargas Daniel 
32 
 
Un “primer” es un oligonucleótido corto utilizado en muchas técnicas 
moleculares de PCR para la secuenciación de DNA. Estos cebadores son 
diseñados para tener una secuencia que es el complemento inverso de una región 
de DNA diana de interés. Se requieren para que inicie la replicación del DNA 
debido a que las enzimas que catalizan este proceso (taq polimerasa) sólo pueden 
añadir nuevos nucleótidos a una cadena existente de DNA. La polimerasa inicia la 
replicación en el extremo 3 'del cebador, y copia la cadena opuesta (70)(71). 
Para comenzar la reacción la temperatura es elevada a 95°C (a esta 
temperatura la doble cadena es escindida en dos cadenas simples), después la 
temperatura desciende a 50°C (esto permite a los “primers” unirse al gen de 
interés), para que la enzima trabaje más rápidamente la temperatura es elevada a 
72°C. De esta manera el ciclo de cambios en temperatura (95°C, 50°C y 72°C) es 
repetido y dos copias se convierten en dos, le precede otro ciclo y cuatro copias se 
convierten en ocho, y así sucesivamente hasta efectuar 40-50 ciclos (72). 
 
Sonda Taqman ® 
 
La sonda más comúnmente utilizada es la de tipo Taqman, son fragmentos 
de DNA complementario al gen de interés que se encuentran marcadas con un 
fluoróforo de marcaje o “reportero” en un extremo (el 5’) y al otro (el 3’) una 
molécula inactivadora o “quencher”. El ensayo TaqMan explota la actividad 5'-
exonucleasa de ciertas polimerasas termoestables (Taq o Tth por ejemplo). 
Durante la etapa combinada de reasociación/extensión de la reacción de 
amplificación, la sonda se hibrida con la secuencia diana y la actividad 
2014 Orozco Vargas Daniel 
33 
 
exonucleasa específica (5’->3’) para el DNA de doble cadena de la Taq o Tth, 
escinde al reportero (73). 
La molécula “quencher” absorbe la emisión del fluoróforo reportero pero no 
la emite. Por lo tanto cuando el “reportero” y el “inactivador” son físicamente 
separados la intensidad de la fluorescencia es emitida y detectada por el 
termociclador de tiempo real (72). 
 
Gráficas de amplificación con PCR en tiempo real 
 
Debido a su gran sensibilidad, reproducibilidad y velocidad, la metodología 
de PCR en tiempo real es muy ampliamente usada en la actualidad para la 
realización de análisis de la expresión génica (74). 
La finalidad de una reacción de PCR en tiempo real es mostrar un gráfico 
(Figura 8) que muestra el número de ciclos, frente a la fluorescencia creciente. 
Esto se conoce como un gráfico de amplificación (72). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Gráfica de amplificación de PCR [8i]. 
2014 Orozco Vargas Daniel 
34 
 
La línea horizontal en el gráfico representa un "umbral" establecida por el 
usuario. El punto en el que el gráfico de amplificación cruza este umbral se conoce 
como valor Ct (intersección del umbral) que es una medida relativa de la 
concentración de la secuencia o gen blanco. Entonces cuanto menor sea el valor 
de Ct para una muestra, mayor será la cantidad de partida de DNA en la muestra. 
Así, si dos gráficas de amplificación se comparan podemos deducir que muestra 
contenía la mayor cantidad de DNA de interés por el valor de Ct (72)(69). 
En la gráfica de amplificación se muestran dos fases, una fase exponencial 
seguida por una fase de meseta (no exponencial). Durante la fase exponencial, la 
cantidad de producto de PCR se duplica aproximadamente en cada ciclo. 
Conforme la reacción avanza, componentes de la reacción en cadena se 
consumen, y en última instancia uno o más de los componentes se hacen 
limitantes. En este punto, la reacción se ralentiza y entra en la fase de meseta 
(73). 
 
Procedimiento de la Cuantificación Relativa 
 
Se preparó el Master Mix para ensayos de expresión génica tipo “dúplex”, 
estos ensayos implican el manejo de dos sondas en un solo pozo dentro de la 
placa de reacción para PCR (sonda del gen a evaluar y sonda housekeeping o 
gen constitutivo). Se usaron las siguientes proporciones de reactivos por reacción 
o pozo: 
 
2014 Orozco Vargas Daniel 
35 
 
 
Este Master Mix se depositó en los tubos de las placas para reacción de 
PCR en tiempo real, esto dependiendo del número de triplicados de muestras y de 
blancos experimentales o NTC’s (No Template Control), teniendo así un volumen 
de 11 µl por reacción o pozo. Entonces a las reacciones de amplificación se le 
agregaron 4 µl de cDNA de nuestras muestras (usando un total de 200 ng para la 
reacción), y en el caso de los NTC’s se le adicionó el mismo volumen pero de 
agua DEPC, resultando al final con 15 µl de reacción por pozo. 
Las placas fueron montadas en un termociclador para PCR en tiempo real 
de Applied Biosystems® Step One, el cual exporta los resultados en un archivo de 
Excel, entonces se prosiguió a hacer el análisis de expresión por el método de Ct 
comparativo. 
 
Elección del gen endógeno como normalizador de los resultados 
 
Una vez obtenido el cDNA, antes de hacer los ensayos de cuantificación 
relativa para los genes a evaluar, antes se procedió a hacer ensayos de curvas de 
Master Mix para e xpresión génica con PCR en tiempo real 
Reactivo Volumen por reacción 
TaqMan® Gene Expression Master Mix 7.5 µl 
Sonda TaqMan [20X] (Gen de interés) 0.4 µl 
Sonda Taqman [20X] (Gen endógeno) 0.2 µl 
Agua DEPC 2.9 µl 
Muestra cDNA [50ng/µl ] 4.0 µl 
Total 15.0 µl 
2014 Orozco Vargas Daniel 
36 
 
inducción para elegir el gen housekeeping más adecuado para realizar los 
ensayos de expresión génica por PCR en tiempo real. Se hicieron ensayos para 
valorar la inducción de cuatro genes endógenos diferentes: β-actina, RNA 
ribosomal 18S, Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y 
Fosforribosiltransferasa de hipoxantina-guanina (HPRT). 
Con base a los ensayos de inducción observamos que 18S fue el más 
apropiado como gen normalizador para los experimentos de exposición a hipoxia, 
ya que su expresión fue más constante en los diferentes tiempos de exposición al 
estímulo, en comparación con los otros dos genes de expresión constitutiva. 
Además, después de estos ensayos, se encontraron referencias que respaldan la 
aseveración de que 18S es el más apropiado para ensayos de PCR con hipoxia 
como tratamiento (75)(76)(77). 
 
Análisis de los ensayo de la cuantificación relativa 
 
 Para obtener los valores de expresión relativa se empleó el método de Ct 
Comparativo el cual consiste en emplear la formula aritmética 2-∆∆Ct que expresa 
los resultados del ensayo de manera comparativa los niveles de expresión entre 
una muestra calibradora (muestra de referencia o sin tratamiento experimental) y 
una muestra tratada experimentalmente. 
Obtenidos los valores Ct (valores de amplificación) de un gen endógeno y 
un gen interés, entonces se consigue la relación conocida como ∆Ct al restar el 
valor Ct del gen endógeno al valor Ct del gen de interés: 
 
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37 
 
∆Ct = Ct gen blanco – Ct gen endógeno 
 
Después se obtiene el siguiente delta, el cual se obtiene al restar el valor 
∆Ct de la muestra calibradora al valor ∆Ct de la muestra tratada: 
 
∆∆Ct = ∆Ct muestra calibradora – ∆ Ct muestra tratada 
 
Entonces se emplea la fórmula 2-∆∆Ct resultando de ella el número de veces 
en que se expresa nuestro gen de interés con respecto de los niveles basales de 
expresión, es por eso que al método se le denomina de cuantificación relativa. 
 
2-∆∆Ct = Expresión relativa 
 
 
Evaluación de genes implicados en la Fibrosis Pulmonar 
Idiopática en células pulmonares expuestas a hipoxia 
 
Con la finalidad de comprobar si la hipoxia puede ser un factor potenciador 
en un proceso fibrótico, se midió la expresión de 8 genes (HIF-1α, HIF-2α, TGF-
β1, α-actina, Col-I, Col-III, MMP-1 y TIMP-1) en dos líneas de fibroblastos (FN 
fibroblasto normal y FF fibroblasto fibrótico). 
Para su mejor comprensión los genes de interés se dividieron en 4 clases, como 
se muestra en la Tabla 4 : 
 
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38 
 
 
 
 
 
 
Tabla 4. Genes en estudio clasificados de acuerdo a sus funciones. 
 
Se realizaron dos series del experimento por triplicado, a las 0, 12, 24, 48, 
72 y 96 hrs, posteriormente fueron hechos “pull” por cada punto de exposición a 
hipoxia para facilitar el manejo de las muestras (debido también a que las células 
tuvieron las mismas condiciones experimentales). 
Las muestras fueron montadas en las placas de reacción por triplicado, y se 
procesaron los datos con un programa estadístico para obtener valores de 
significancia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Función Genes 
Regulación a la hipoxia celular HIF1A (HIF-1α) EPAS1 (HIF-2α) 
Marcadores pro -fibrosantes TGFB1 (TGF-β1) ACTA2 (α-actina) 
Metabolismo de la matriz extracelular MMP1 (MMP-1) TIMP1 (TIMP-1) 
Proteínas de ECM COL1A1 
(Colágena-I) 
COL3A1 (Colágena III) 
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ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
 
Se utilizó la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney con el paquete estadístico 
SPSS (versión 21.0) debido a que esta prueba nos permite comparar la mediana 
de dos muestras independientes que no se distribuyen de manera normal. Un 
valor de p menor a 0.05 significa que existe una diferencia en la mediana de los 
grupos (por ende que hay significancia estadística); se generaron valores de 
significancia (p) para confirmar la confiabilidad de los cambios en la expresión 
génica durante la cinética, y también para comparar las diferencias de expresión 
génica entre ambas líneas de fibroblastos (FN y FF). 
 
• Valor de p: de todos los puntos de exposición al estímulo (12, 24, 48, 72, 96 
hrs) vs el punto de 0 hrs (o control) dentro de la misma línea celular. 
• Valor de p: de todos los puntos de exposición al estímulo (12, 24, 48, 72, 96 
hrs) comparando entre las dos líneas celulares de fibroblastos (FN y FF). 
 
 
 
 
2014 Orozco Vargas Daniel 
40 
 
RESULTADOS 
 
 
 
 
 
 
Expresión de HIF-1 α en fibroblastos FN y FF 
 
Se observa en los fibroblastos normales (FN) que los niveles de expresión 
de HIF-1α (Gráfica y tabla 1) están aumentados de manera gradual hasta las 48 
horas, siendo su punto más alto de expresión, y posteriormente disminuyen a las 
72 y 96 horas. Por otra parte en los fibroblastos fibróticos (FF) se presenta un 
aumento a las 24 horas de exposición siendo este punto el de máxima expresión, 
y subsiguientemente los valores de expresión disminuyen a las 48, 72 y 96 horas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Gráfica y tabla 1. Expresión relativa de HIF-1 α en fibroblastos FN y FF al 1% de O 2. 
En FN, HIF-1α incrementa con el tiempo hasta las 48 horas ( 12hrs=1.91, p(12hrs vs 0hrs)= 
0.031; 24hrs=3.15, p(24hrs vs 0hrs)=0.047), aunque solo este es el punto que no cumple con 
suficiente significancia estadística respecto a las 0 horas ( 48hrs= 8.26p(48hrs vs 0hrs) = 
0.054); en los subsiguientes puntos de la cinética, la expresión decrementa y con valores 
estadísticamente significativos ( 72hrs=<0.001; 96hrs=0.013). En FF, HIF-1α se presenta 
considerablemente incrementado desde las 24 horas ( 24hrs=16.59, p(24hrs vs 0hrs)=<0.001), 
posteriormente los niveles de expresión decrementan, siendo estadísticamente 
significativos respecto del tiempo 0 ( 48hrs=5.28, p(48hrs vs 0hrs)=<0.001; 72hrs=7.51, p(72hrs 
vs 0hrs)=<0.001; 96hrs=1.12, p(96hrs vs 0hrs)=0.013). Respecto a la significancia estadística 
entre ambos linajes celulares todos los puntos de la cinética presentan diferencias 
significativas, a excepción del punto a las 48 hrs (p48hrs(FN vs FF)= 0.296). 
 
FN FN vs FF FF 
HIF-1α 
 
DE ± p (Xhrs vs 0hrs) p (FN vs FF) HIF-1α 
 
DE ± p (Xhrs vs 0hrs) 
12 h 1.91 0.48 0.031* 0.025* 12 h 1.20 0.07 0.001* 
24 h 3.15 1.32 0.047* <0,001* 24 h 16.59 0.43 <0,001* 
48 h 8.26 4.72 0.054 0.296 48 h 5.28 0.48 <0,001* 
72 h 0.20 0.07 <0,001* <0,001* 72 h 7.51 0.08 <0,001* 
96 h 1.51 0.29 0.013* 0.046* 96 h 1.12 0.11 0.013* 
 (Media); DE ± (Desviación estándar); p (significancia estadística) 
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Expresión de HIF-2 α en fibroblastos FN y FF. 
 
Al comparar HIF-2α (Gráfica y tabla 2) con HIF-1α en FN, se observa que 
HIF-2α aumenta de manera gradual hasta las 72 horas, siendo éste su punto más 
alto de expresión; finalmente la expresión de HIF-2α disminuye a las 96 horas pero 
sin llegar a niveles iguales o menores que HIF-1α. Por otra parte, cuando 
comparamos HIF-2α con HIF-1α en FF, se puede notar que HIF-2α manifiesta una 
inducción más sostenida; puesto que las 24, 48 y 72 horas son los puntos más 
altos de expresión; posteriormente a las 96 horas disminuye sin llegar a valores 
iguales o menores que HIF-1α. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Gráfica y tabla 2. Expresión relativa de HIF-2 α en fibroblastos FN y FF al 1% de O 2. 
En FN, HIF-2α se observa aumentando de manera gradual hasta las 72 horas de 
exposición, sin embargo solo se presenta significancia estadística a las 12 y 72 horas 
( 12hrs=3.25, p(12hrs vs 0hrs)=0.001; 72hrs=8.97, p(72hrs vs 0hrs)=0.025); posteriormente se 
observa un decremento pero sin llegar a niveles basales ( 96hrs=3.33, p(96hrs vs 
0hrs)=0.028). En FF, HIF-2α se observa aumentado de manera considerable y 
estadísticamente significativa en los periodos de 24, 48 y 72 horas ( 24hrs=12.14, p(24hrs vs 
0hrs)=<0.001; 48hrs=7.99, p(48hrs vs 0hrs)=0.002; 72hrs=12.99, p(72hrs vs 0hrs)=<0.001); 
posteriormente se observa un decremento a las 96 horas pero sin llegar a niveles basales 
( 96hrs= 4.24, p(96hrs vs 0hrs)=0.004). Respecto a la significancia estadística entre ambos 
linajes celulares solo los primeros dos puntos de la cinética presentan diferencias 
significativas ( 12hrs(FN vs FF)=0.012; 24hrs(FN vs FF)=0.002). 
FN FN vs FF FF 
HIF-2α DE ± p (Xhrs vs 0hrs) p (FN vs FF) HIF-2α DE ± p (Xhrs vs 0hrs) 
12 h 3.25 0.78 0.001* 0.012* 12 h 1.18 0.13 0.075 
24 h 3.21 2.24 0.144 0.002* 24 h 12.14 0.85 <0,001* 
48 h 5.28 3.91 0.116 0.235 48 h 7.99 1.26 0.002* 
72 h 8.97 3.81 0.025* 0.088 72 h 12.99 1.00 <0,001* 
96 h 3.33 1.62 0.028* 0.355 96 h 4.24 0.83 0.004* 
 (Media); DE ± (Desviación estándar);p (significancia estadística) 
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Expresión de TGF- β1 en fibroblastos FN y FF. 
 
Se puede apreciar que TGF-β1 (Gráfica y tabla 3) en FN se sobreexpresa 
gradualmente hasta las 48 horas, siendo este punto el de máxima expresión; 
posteriormente a las 72 y 96 horas la expresión de TGF-β1 decae sin llegar a 
niveles basales. En el caso de los FF se puede notar que TGF-β1 se presenta 
sobreexpresado a las 24 horas, siendo este punto el de máxima expresión; 
posteriormente se ve un decremento a las 48, 72 y 96 horas, manteniéndose a 
niveles similares de expresión y sin regresar a niveles basales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Gráfica y tabla 3. Expresión relativa de TGF- β1 en fibroblastos FN y FF al 1% de O 2. 
En FN, TGF-β1 se observa una sobreexpresión significativa solo a las 96 horas 
( 96hrs=3.43, p(96hrs vs 0hrs)=0.02). En FF, TGF-β1 se expresa de manera considerable 
hasta las 24 horas de exposición, siendo este punto el de máxima expresión ( 24hrs= 
5.58, p(24hrs vs 0hrs)=0.02); posteriormente se observa un decremento a las 48, 72 y 96 
horas, pero sin llegar a niveles basales ( 48hrs=3.52, p(48hrs vs 0hrs)=0.009; 72hrs=3.75, 
p(72hrs vs 0hrs)=<0.001; 96hrs=4.16, p(96hrs vs 0hrs)=0.001). Respecto a la significancia 
estadística entre ambos linajes celulares, se puede ver que no hay diferencias 
estadísticamente significativas. 
 
 
 
FN FN vs FF FF 
 
TGF-β1 DE ± p (Xhrs vs 0hrs) p (FN vs FF) TGF-β1 DE ± p (Xhrs vs 0hrs) 
12 h 1.43 0.86 0.393 0.901 12 h 1.37 0.13 0.01* 
24 h 5.67 5.84 0.208 0.979 24 h 5.58 2.00 0.02* 
48 h 17.09 12.02 0.075 0.109 48 h 3.52 0.83 0.009* 
72 h 2.54 1.30 0.099 0.121 72 h 3.75 0.32 <0,001* 
96 h 3.43 1.07 0.02* 0.268 96 h 4.16 0.54 0.001* 
 (Media); DE ± (Desviación estándar); p (significancia estadística) 
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Expresión de α -SMA en fibroblastos FN y FF. 
 
Se puede ver que α-actina (Gráfica y tabla 4) en FN tiene la tendencia de 
aumentar su expresión hasta las 48 horas, siendo este punto su pico de expresión; 
posteriormente los niveles de expresión decrecen en los últimos periodos de 
exposición (72 y 96 horas). Por otra parte α-actina en FF se observa en niveles 
muy altos de expresión a partir de las 24 horas de exposición al estímulo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Gráfica y tabla 4. Expresión relativa de α-SMA en fibroblastos FN y FF al 1% de O 2. 
En FN, α-SMA se observa con la tendencia de incrementar con diferencias significativas 
sus niveles de expresión hasta las 48 horas ( 12hrs=10.58, p(12hrs vs 0hrs)=0.001; 
24hrs=5.44, p(24hrs vs 0hrs)=0.001; 48hrs=27.28, p(48hrs vs 0hrs)=<0.001); posteriomente se 
observa un decremento en los periodos de 72 y 96 horas ( 72hrs=9.53, p(72hrs vs 0hrs)=0.4; 
96hrs=2.48, p(96hrs vs 0hrs)=<0.001). En FF, con diferencias significativas en todos los 
puntos de la cinética, α-SMA se expresa a niveles muy elevados a partir de las 24 horas, 
( 24hrs=80.16, p(24hrs vs 0hrs)=<0.001; 48hrs=63.81, p(48hrs vs 0hrs)=<0.001; 72hrs=101.57, 
p(72hrs vs 0hrs)=<0.001; 96hrs=57.4, p(96hrs vs 0hrs)=<0.001). Respecto a la significancia 
estadística entre ambos linajes celulares, se puede ver que en todos los puntos de la 
cinética hay diferencias significativas. 
 
 
FN FN vs FF FF 
 
α-SMA 
 
DE ± p (Xhrs vs 0hrs) p (Xhrs vs 0hrs) 
 
α-SMA 
 
DE ± p (Xhrs vs 0hrs) 
12 h 10.58 2.84 0.001* 0.005* 12 h 4.31 0.58 0.001* 
24 h 5.44 0.57 0.001* <0,001* 24 h 80.16 4.77 <0,001* 
48 h 27.28 3.09 <0,001* <0,001* 48 h 63.81 5.79 <0,001* 
72 h 9.53 4.90 0.4 <0,001* 72 h 101.57 6.98 <0,001* 
96 h 2.48 0.26 <0,001* <0,001* 96 h 57.40 5.43 <0,001* 
 (Media); DE ± (Desviación estándar); p (significancia estadística) 
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Expresión de Col-I en fibroblastos FN y FF. 
 
Podemos observar que Col-I (Gráfica y tabla 5) en FN se ve aumentanda de 
manera gradual hasta las 48 horas, siendo este punto su pico de expresión; 
posteriormente se muestra un decremento a las 72 y 96 horas sin llegar a niveles 
basales. En cambio Col-I en FF se expresa en niveles muy altos a partir de 24 
horas y se mantiene elevado hasta las 96 hrs de exposición. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Gráfica y tabla 5. Expresión relativa de Col-I en fibroblastos FN y FF al 1% de O 2. En 
FN, con diferencias significativas en todos los puntos de la cinética, Col-I incrementa su 
expresión hasta las 48 horas ( 12hrs=2.04, p(12hrs vs 0hrs)=0.03; 24hrs=4.48, p(24hrs vs 
0hrs)=<0.001; 48hrs=5.77, p(48hrs vs 0hrs)=0.002); subsiguientemente se observa un 
decremento a las 72 y 96 horas sin llegar a niveles basales ( 72hrs=2.23, p(72hrs vs 
0hrs)=0.001; 96hrs=3.17, p(96hrs vs 0hrs)=0.022). En FF, con diferencias significativas en 
todos los puntos de la cinética, Col-I se sobreexpresa en gran medida desde de las 24 
hasta las 96 horas ( 24hrs=41.81, p(24hrs vs 0hrs)=<0.001; 48hrs=34.65, p(48hrs vs 0hrs)=<0.001; 
72hrs=32.72, p(72hrs vs 0hrs)=<0.001; 96hrs=20.08, p(96hrs vs 0hrs)=<0.001). Respecto a la 
significancia estadística entre ambos linajes celulares, se puede observar que hay 
diferencias significativas en todos los puntos de la cinética. 
 
 
FN FN vs FF FF 
 
Col-I 
 
DE ± p (Xhrs vs 0hrs) p (FN vs FF) Col-I 
 
DE ± p (Xhrs vs 0hrs) 
12 h 2.04 0.53 0.03* 0.009* 12 h 3.57 0.61 0.003* 
24 h 4.48 0.26 <0,001* <0,001* 24 h 41.81 2.35 <0,001* 
48 h 5.77 0.88 0.002* <0,001* 48 h 34.65 2.08 <0,001* 
72 h 2.23 0.16 0.001* <0,001* 72 h 32.72 0.70 <0,001* 
96 h 3.17 0.99 0.022* <0,001* 96 h 20.08 2.17 <0,001* 
 (Media); DE ± (Desviación estándar); p (significancia estadística) 
2014 Orozco Vargas Daniel 
50 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Expresión de Col-III en fibroblastos FN y FF. 
 
En relación a Col-III (Gráfica y tabla 6), podemos observar que en FN hay 
un aumento considerable a las 48 horas, y posteriormente decae su expresión a 
las 72 y 96 horas sin llegar a niveles basales. Por otra parte se puede ver que Col-
III en FF presenta un comportamiento similar a HIF-2α sobre estás células 
fibróticas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2014 Orozco Vargas Daniel 
51 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gráfica y tabla 6. Expresión relativa de Col-III en fibroblastos FN y FF al 1% de O 2. 
En FN, Col-III se muestra incrementado frente al estímulo con hipoxia, sin embargo solo 
los periodos de 12 y 96 horas presentan diferencias significativas ( 12hrs=2.35, p(12hrs vs 
0hrs)=0.004; 96hrs=4.34, p(96hrs vs 0hrs)=<0.001). En FF, con diferencias significativas en 
todos los puntos de la cinética, Col-III se sobreexpresa en gran medida de 24 a 96 horas 
( 24hrs= 44.83, p(24hrs vs 0hrs)=<0.001; 48hrs=31.35, p(48hrs vs 0hrs)=<0.001; 72hrs=43.93, 
p(72hrs vs 0hrs)=<0.001; 96hrs=21.10, p(96hrs vs 0hrs)=<0.001). Respecto a la significancia 
estadística entre ambos linajes celulares, se puede notar que solo los periodos de 24, 72 
y 96 horas