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Aprendiendo Biologia

23/7/2022

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOMEDICINA
DESARROLLO Y CARACTERIZACIÓN DE MATERIALES BIODEGRADABLES PARA LA
REGENERACIÓN DE TEJIDOS
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS
PRESENTA:
BIOL. MARCO VLADIMIR GRANADOS HERNÁNDEZ

TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. MARCO ANTONIO ÁLVAREZ PÉREZ
DEPeI FACULTAD DE ODONTOLOGÍA U.N.A.M.

COMITÉ TUTOR: DR. LUIS FELIPE JIMÉNEZ GARCÍA
FACULTAD DE CIENCIAS U.N.A.M.
DR. JUAN JOSÉ MONTESINOS MONTESINOS
HOSPITAL DE ONCOLOGÍA CENTRO MÉDICO NACIONAL S. XXI I.M.S.S.

CD. MX AGOSTO, 2018

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TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. MARCO ANTONIO ÁLVAREZ PÉREZ
DEPeI FACULTAD DE ODONTOLOGÍA U.N.A.M.

COMITÉ TUTOR: DR. LUIS FELIPE JIMÉNEZ GARCÍA
FACULTAD DE CIENCIAS U.N.A.M.
DR. JUAN JOSÉ MONTESINOS MONTESINOS
HOSPITAL DE ONCOLOGÍA CENTRO MÉDICO NACIONAL S. XXI I.M.S.S.

MÉXICO, CD. MX AGOSTO, 2018

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLOGICAS
FACUL TAD DE CIENCIAS
DIVISION ACADEMICA DE INVESTIGACION Y POSGRADO
COORDINACION
OFICIO FCI E/DAIP/558/2018
ASU NTO: Oficio de Jurado
Lie. Ivanne Ramirez Wenee
Direetara General de Administraeion Esealar, UNAM
Pres e nte
Me perm ito informar a usted que en la reunion ordinaria del Comite Academieo del Posgrado en
Ciencias Biol6gicas. celebrada el dia 30 de abril de 2018. se aprob6 el siguiente jurado para el
examen de grado de DOCTOR EN CIENCIAS del (Ia) alumna (a) GRANADOS HERNANDEZ MARCO
VLADIMIR con ntlmero de euenta 300250747 con la tesis titulada : "DESARROLLO Y
CARACTERIZACION DE MATERIALES BIODEGRADABLES PARA LA REGENERACION DE TEJIDOS",
realizada bajo la direcci6n del (la) DR. MARCO ANTONIO ALVAREZ PEREZ:
Presldente'
Vocal :
Secretaflo:
Suplente.
Suplente:
ORA. MARiA CRISTINA PINA BARBA
ORA. CYNTHIA GEORGINA TREJO IRIARTE
DR. JUAN JOSE MONTESINOS MONTESI NOS
ORA, PATRICIA GONzALEZ ALVA
ORA. ANA MARiA FERNANDEZ PRESAS
Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo.
AGNSNMVAlASRlipp
ATENTAMENTE
" POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU"
Ciudad Universitaria, Cd. Mx., a 06 de junio de 2018
COORDINACION
l nidad de P"'grado ' Coordinacion del Posgrado en Clencia< Biologica, EdilklO D. ler, PhD. C Ifrulto de Po'grado, Cd. L'ni\ef>lIana
Delegacion Coyoadn c.!'. 04510 Cd, Mx. Tel. 56~3 '002 http: pcbiol.p'''grad".unam,lll\

AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES
Al Posgrado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de
México por la formación y apoyo otorgados durante mis estudios de posgrado, así
como el apoyo para congresos.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CoNaCyT) por haberme otorgado
la beca de Doctorado con el número 299078.
Se agradece el apoyo financiero por parte del programa DGAPA-UNAM: PAPIIT
IN210815 e IT203618 que ha permitido la realización de esta investigación.
Se agradece al Dr. Fernando Suaste Olmos, por la asesoría y por su excelente
asistencia técnica durante el desarrollo de esta investigación.
Se agradece a la Dra. Janeth Serrano Bello por la asesoría y asistencia técnica
durante el desarrollo experimental de esta tesis.
A mi comité tutoral, Dr. Juan José Montesinos, Dr. Luis Felipe Jiménez García y
Dr. Marco Antonio Álvarez Pérez por el apoyo y asesoría constructiva e incondicional a
lo largo de este proyecto.

iii

AGRADECIMIENTO Y DEDICATORIA A TÍTULO PERSONAL
A mi comité sinodal por la lectura, revisión y comentarios de esta tesis.
Al Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos de la DEPeI de la Facultad de
Odontología UNAM por la oportunidad de realizar mi proyecto de investigación en sus
instalaciones, en especial al Dr. Marco Antonio Álvarez por su asesoría, compromiso y
paciencia para la realización del mismo.
A mis compañeros de laboratorio, José Luis, Nancy, Gaby, Iri, Laurita, Osmar,
Miguel, Febe y Zulema.
A los Doctores: Eduardo Villarreal, Janeth Serrano, Adriana Pérez Soria, Patricia
González Alva, por sus comentarios y consejos; compartir su experiencia y
conocimiento no tiene precio, nuevamente gracias.
A mi madre Alejandra Granados por estar ahí en mis buenos y malos ratos, por
tu paciencia y apoyo en mis decisiones, mostrándome que tu amor es infinito e
incondicional, eres mi ejemplo a seguir, nunca pierdes la fe en mí, gracias ma…
Gracias a mi incansable esposa Luz por ser y estar, creer en mí siempre y
demostrarme que no hay imposibles, tu vida es un ejemplo a seguir, gracias por
compartirla conmigo, sin tu apoyo esto no hubiera sido posible.
A mi hermana Somalia por estar siempre en los momentos en los que más te he
necesitado.
A la familia Granados que aunque no nos vemos ya tan seguido sé que cuento
con su cariño.

A mis amigos de mil batallas por siempre ser ejemplo y compañía en las buenas
y en las malas, Pablo Cabañas, Pablo Muñoz, Carlos Guillen, Berber, Quique, Ayin,
Emmanuel, Coni, Domingo, Elis, Haven, Chava, Llorens, Marel, Yair, Zarza, Cartas,
Deya, Karla, Ámbar, Yaz, Roberto, Quiroz, Moreno, Cesar, Fabian, Julio, Axel, Sergio
Mendoza, Ángel Meza, Israel, Pablo García, Kurt, Abraham Isaac, Djibril, Joaquín,
Diego, Quique Vega, Beto, Mich, Daniel (Quick), Dan, León, Mike.
A Betsain por su incondicional cariño y apoyo, un escalón más primo.
A los que ya no están en lo físico, pero siempre en el recuerdo Pachita, Esther y
Pascual Granados por sus consejos y cariño, siempre serán parte de lo que ahora soy.
Gracias Cacho y Ayin por apoyarme a lo largo de esta etapa, sobre todo en
momentos difíciles, sus consejos siempre me abrían el panorama.
Gracias a la Comunidad Pumas Basquetbol somos una familia.
A la comunidad del Colegio Ciudad de México (Directores, maestros y alumnos) por
apoyarme siempre, con especial mención a la Directora María Alicia Junco Esteban por
las facilidades y apoyo incondicional en la recta final de este escrito.

Por las tesis que se quedaron en el tintero…Mario Antonio Chávez Árias (†)
Aquí comienza a romperse el dique…

RESUMEN
Los andamios fibrilares son de gran importancia como biomateriales en el campo
de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa. En este sentido, en el presente
trabajo se han optimizado los parámetros para la síntesis de diferentes concentraciones
(6, 7, y 10 % p/v) de andamios de poliácido láctico (PLA) por la técnica de hilado por
propulsión de gas (AJS por sus siglas en inglés). Dichos andamios fueron
caracterizados fisicoquímicamente por espectrometría Infrarroja con Transformada de
Fourier (FTIR), morfológicamente por Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) y su
propiedad estructural por pruebas de mecánicas de tensión y mojabilidad. Nuestros
resultados mostraron que los andamios son fibrilares con diámetros en escalas
nanométricas entre los 200 y los 600 nm, y que el polímero PLA no muestra
alteraciones en su estructura durante la síntesis de los andamios fibrilares y estos
presentan un módulo elástico mayor cuando se depositan por 15 minutos presentando
las mejores propiedades mecánicas los andamios en las concentraciones de 7, y 10%
p/v comparado con los andamios al 6% de PLA que presentan un módulo elástico
pequeño. En la prueba de mojabilidad las tres concentraciones mostraron ángulos de
contacto menores de 90°, lo cual nos indica que los andamios hilados por AJS
presentan un carácter hidrofílico.
La evaluación de la biocompatibilidad celular de los andamios hilados de PLA al
6, 7, y 10% se realizó por medio de los ensayos de adhesión celular, proliferación
celular y de interacción célula-material al cultivar células troncales mesenquimales
estromales de médula ósea (hBM-MSC). Nuestros resultados mostraron que los
andamios de PLA poseían una escala nanométrica que permiten la estabilidad
estructural para la respuesta de las células hBM-MSC al compararse con las películas

vii

delgadas de PLA. Por último, realizamos una prueba in vivo en un modelo animal de
rata en la cual se utilizaron los andamios hilados que mostraron una mejor respuesta in
vitro (7, y 10% de PLA) para evaluar su biodegradación y respuesta inflamatoria. Los
resultados mostraron que la degradación in vitro es influida por la morfología y las
propiedades mecánicas de los nanoandamios de PLA y el ensayo de degradación in
vivo no mostró evidencia de toxicidad con una respuesta inflamatoria leve. Por ello,
técnica de fabricación de andamios por AJS promete ser una alternativa viable y
atractiva para la producción de nanofibras biocompatibles de PLA que podrían ser
consideradas para su aplicación en la regeneración en el campo de la ingeniería de
tejidos.
En conclusión, los resultados de la presente tesis doctoral, demostraron que el
método de síntesis propuesto tiene potencial para la fabricación de andamios hilados
con una facilidad de procesamiento, en escalas nanométricas con geometrías al azar,
biocompatibles y que podrían ser un prometedor biomaterial económico con futuras
aplicaciones en la biomedicina.

viii

ABSTRACT
Fiber scaffolds are of great importance as biomaterials in the field of tissue
engineering and regenerative medicine. In this sense, the parameters for the synthesis
of different concentrations (6, 7, and 10% w/v) of poly-lactic acid scaffolds (PLA) by the
air jet spinning technique (AJS) were optimized in this thesis work. The physicochemical
properties were characterized by Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR), the
fiber morphology of the scaffold by Scanning Electron Microscopy (SEM) and the
structural properties by mechanical and wettability tests. Our results by SEM showed a
fibrillar morphology with diameter of fibers on nanometric scale between 200 and 600
nm. Moreover, the PLA polymer chain does not show any kind of alteration during the
synthesized of the scaffold by AJS technology. Scaffolds presented an elastic modulus
greater after 15 minutes of deposit and the best mechanical properties were observed
for the 7, and 10% w/v scaffolds with a small elastic modulus the scaffolds with the
minor concentration of 6% of PLA. The wettability test showed a contact angles with less
than 90°, which indicates that these spun scaffolds, have a hydrophilic property.
The biocompatibility of the PLA fiber scaffolds (6, 7, and 10%) was evaluated by
cell adhesion, cell proliferation and cell-material interaction after seeded with bone
marrow- mesenchymal stem cells (hBM-MSC) onto the surface of the different PLA spun
scaffolds. Our data indicate that fiber membrane of PLA scaffold possessed a nanofiber
size that allow structural stability for hBM-MSC increasing the cellular response and are
not cytotoxic when compared to PLA thin films. Moreover, the PLA fiber scaffold that
showed the best in vitro respond was evaluated for its degradation and inflammatory
response onto a rat in vivo model. Our results showed that the in vitro degradation
assay was influence mainly by the morphology and on the in vivo model there is not any

evidence of any kind of toxicity with a mild inflammatory respond. Moreover, the
airbrushing technology promises to be a viable and attractive alternative technique for
production of biocompatible PLA nanofiber scaffold that could be consider for tissue
engineering regeneration.
In conclusion, our proposed synthesis method has the potential for be an easy
one-step processing nanofiber scaffolds with a random orientation and this fiber spun
membranes are biocompatible, not toxic and could be a promising economical
biomaterial with future potential in on biomedical applications.

INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estructura isoméricas del poli-ácido láctico.
Figura 2 Ingeniería de Tejidos.
Figura 3 Morfología de MSC de fuente adulta y neonatal.
Figura 4 Modelo de la Matriz Extracelular (MEC).
Figura 5 Dispositivo atomizador para el Hilado por propulsión de Gas (AJS).
Figura 6 Equipo INSTRON 55-67 y Módulo de Young.
Figura 7 Mojabilidad y Ángulo de Contacto.
Figura 8 Procedimiento quirúrgico de implantación en el modelo animal.
Figura 9 Micrografías obtenidas por MEB de los andamios de PLA al 6, 7, y
10% con sus respectivos histogramas.
Figura 10 Difractograma de los andamios de PLA al 6, 7, y 10%.
Figura 11 IR de los andamios de PLA al 6, 7, y 10%.
Figura 12
Ensayo de Tensión. Promedio del módulo de Young con una
velocidad de 1mm/segundo. ANOVA 1 vía p < 0.05.
Figura 13 Ensayo de Tensión. Promedio de tensión a la última carga.
velocidad de 1mm/segundo. ANOVA 1 vía p < 0.05.
Figura 14 Micrografías de MEB y estimación de la distribución del diámetro
del tamaño de las fibras de los andamios hilados de PLA al 7% (E y
F) y 10% (G y H) después de 100 días de degradación in vitro en
solución Ringer y de los andamios después de 100 días de
degradación in vitro en agua bidestilada para el 7% (A y B) y para

las del 10% (C y D).
Figura 15 Adhesión celular de las células hBM-MSC en las películas delgadas
(PD) y en los andamios hilados (AH) de PLA a diferentes
concentraciones (6, 7, y 10%) después de un periodo de incubación
de 2, 4, y 24 horas de cultivo.
Figura 16 Micrografías de fluorescencia de las células hBM-MSC en los
andamios hilados de PLA a diferentes concentraciones (a y d) 6 %,
(b y e) 7%, y (c y f) 10 % después de un periodo de incubación de
24 h de cultivo.
Figura 17 Grafica de viabilidad celular determinada por MTT de las células
hBM-MSC en los andamios hilados (AH) y en las películas delgadas
(PD) de PLA a diferentes concentraciones (6, 7, y 10 %)
Figura 18 Imágenes de los andamios de PLA (7% y 10%) y del Gelfoam
después 8 a 100 días de implantación en la espalda de ratas Wistar
macho adultas teñidas con hematoxilina y eosina.
Figura 19 Imágenes histológicas de corte transversal del andamio control
(Gelfoam)
y de los andamios de PLA (7% y 10%) teñidas con
tricrómica de Masson a los 8 y 100 días después de la
implantación.
Figura 20 Evaluación del ensayo de citotoxicidad indirecta in vitro de
andamios hilados de PLA (7, y 10% p/v) y medio con 10% de etanol
sobre las células hBM-MSC.

xii

TABLA DE ABREVIATURAS
IT Ingeniería de Tejidos.
hBM-MSC Células Mesenquimales Estromales de Médula Ósea Humana.
MEC Matriz extracelular.
PLA Poli-ácido láctico.
PCL Poli-caprolactona.
PGA Poli-ácido glicólico.
FDA Food and Drug Administration.
AJS Air Jet Spinning.
µm Micrómetros.
nm Nanómetros.
AH Andamio Hilado.
PD Película Delgada.
DRX Difracción de Rayos X.
FITR Espectroscopia de Infrarrojo de Transformada de Fourier.
MEB Microscopia Electrónica de Barrido.
SFB Suero Fetal Bovino.

xiii

SDS Solución Amortiguadora de Fosfatos.
PFA Para formaldehído.
MTT Ensayo de Azul de Tetrazolio.
𝛍m Micrómetros.
nm Nanómetros.
GPa Gigapascales.
MPa Megapascales.

xiv

ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES ................................................... ii
AGRADECIMIENTO Y DEDICATORIA A TÍTULO PERSONAL .................. iii
Resumen ....................................................................................................... vi
Abstract ........................................................................................................ viii
CAPÍTULO 1 FUNDAMENTO TEÓRICO
1. Biomateriales ................................................................................ 2
1.1 Biomateriales poliméricos biodegradables .................................... 3
1.2 Poli-ácido láctico (PLA) .................................................................. 5
1.3 ingeniería de tejidos (IT) ............................................................... 7
1.4 Células Troncales Mesenquimales Estromales de Médula Ósea
(HBM-MSC). .................................................................................................. 9
1.5 La Matriz Extracelular (MEC) ..................................................... 11
1.6 Hilado por Propulsión de Gas (Air Jet Spinning) ....................... 14

CAPÍTULO 2 DISEÑO EXPERIMENTAL
2. Justificación ................................................................................ 18
2.1 Objetivos generales y Específicos ............................................... 20
2.2 Objetivo General: ..................................................................... 20
2.3 Objetivos Específicos: ............................................................. 20
2.4 Hipótesis ...................................................................................... 22
CAPÍTULO 3 METODOLOGÍA
3.1 Técnica de hilado por propulsión de gas.................................. 24
3.1.1 Materiales ........................................................................... 24
3.1.2 Diseño de Andamios Hilados por Propulsión de Gas ....... 24
3.2 Caracterización de las membranas ......................................... 25
3.2.1 Difracción de Rayos X ....................................................... 25
3.2.2 Espectroscopía Infrarroja ................................................... 25
3.2.3 Microscopía Electrónica de Barrido ................................... 25
3.3 Prueba Mecánica (tensión) .......................................................... 26
3.4 Mojabilidad y ángulo de contacto ................................................. 28

xvi

3.6 Ensayos biológicos....................................................................... 30
3.6.1 Cultivo celular ..................................................................... 30
3.6.2 Ensayo de Adhesión Celular (Cristal Violeta).................... 30
3.6.3 Interacción célula-material ................................................. 32
3.6.4 Ensayo de viabilidad Celular (MTT)................................... 33
3.7 Modelo Animal (estudio de degradación in vivo) ......................... 34
3.7.1 Procedimiento quirúrgico general en ratas Wistar. ........... 34
3.7.2 Sacrificio de los animales. ................................................. 35
3.7.3 Evaluación histológica. ...................................................... 35
3.8 Análisis estadístico ....................................................................... 37
CAPÍTULO 4 RESULTADOS
4.1 Caracterización morfológica de las fibras de concentración 6, 7,
y 10%. ...................................................................................................... 39
4.2 Difracción de Rayos-X .............................................................. 41
4.3 Espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR)
..................................................................................................................... 42

xvii

4.4 Pruebas Mecánicas ...................................................................... 43
Tabla 1. Propiedades mecánicas del PLA al 6%, 7% y 10% a 15
minutos de deposición. ........................................................................ 44
4.5 Determinación del ángulo de contacto en los andamios de PLA al
6, 7, y 10 % .................................................................................................. 46
4.7 Ensayos biológicos....................................................................... 49
4.7.1 Adhesión celular................................................................. 49
4.7.2 Interacción célula-material ................................................. 51
4.7.3 Ensayo de MTT ................................................................. 52
4.8 Modelo Animal (Degradación in vivo) .......................................... 54
CAPÍTULO 5 DISCUSIÓN
5.1 Discusión ...................................................................................... 61
CAPÍTULO 6 CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
6.1 Conclusiones .............................................................................. 70
6.2 Perspectivas………………………………………………………….71

xviii

CAPITULO 7 ANEXO
7.1 Anexo 1…………………………………………………………72
7.2 Productos………………………………………………………73
CAPÍTULO 8 LITERATURA CITADA…………………………………….75

Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos
1

CAPITULO 1
FUNDAMENTO TEÓRICO

Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos
2
1. BIOMATERIALES
El rendimiento de los materiales en el cuerpo puede clasificarse de muchas
maneras. Los biomateriales se utilizan para hacer dispositivos que reemplacen una
parte o una función del cuerpo de forma segura, fiable, económica y fisiológicamente
aceptable [1]. Gran variedad de dispositivos y materiales actualmente se utilizan en el
tratamiento de enfermedades o lesiones, estos incluyen elementos comunes como
suturas, agujas, catéteres, placas, rellenos dentales, etc. [2-5]. Un biomaterial puede
definirse simplemente como un material sintético utilizado para reemplazar parte de un
sistema vivo o estar en contacto íntimo con el tejido vivo. La Junta Asesora de
Biomateriales de la Universidad de Clemson formalmente definió a un biomaterial como
"una sustancia sistémica y farmacológicamente inerte diseñada para la implantación o
incorporación con sistemas vivos" [6]. También pude definirse como "un material no
inerte utilizado en un dispositivo médico, destinado a interactuar con sistemas
biológicos" [7]. Otras definiciones han incluido "materiales de origen sintético, así como
de origen natural en contacto con tejidos, sangre y fluidos biológicos, destinados a
aplicaciones de prótesis, diagnósticos, terapéuticos y de almacenamiento sin afectar
adversamente al organismo vivo y sus componentes" [8].
Dentro del grupo de biomateriales existen diferentes tipos que se pueden
clasificar según su origen, estos son los metálicos, los cerámicos y los poliméricos, de
los cuales en este trabajo doctoral nos enfocaremos a los biomateriales poliméricos
biodegradables.

Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos
3
1.1 BIOMATERIALES POLIMÉRICOS BIODEGRADABLES
El término biodegradable está asociado con materiales que podrían
descomponerse por la naturaleza ya sea a través de mecanismos hidrolíticos sin la
ayuda de enzimas y/o mecanismos enzimáticos. Otros términos tales como absorbibles,
erosionables y reabsorbibles también se han utilizado en la literatura para indicar la
propiedad biodegradable [9]. El interés en los biomateriales poliméricos biodegradables
para el uso en la ingeniería de tejidos ha aumentado dramáticamente durante la última
década. Esto se debe a que esta clase de biomateriales tiene dos ventajas principales
con respecto a los biomateriales no biodegradables. En primer lugar, no provocan
reacciones crónicas permanentes de cuerpo extraño debido a que son gradualmente
absorbidas por el cuerpo humano y no dejan rastros de residuos en los sitios de
implantación [9]. En segundo lugar, recientemente se ha descubierto que algunos de
ellos son capaces de regenerar tejidos, a través de la interacción de su biodegradación
con células inmunológicas como los macrófagos. Por lo tanto, los implantes quirúrgicos
hechos de biomateriales biodegradables podrían ser utilizados como un andamiaje
temporal para la regeneración de tejidos. Este enfoque para la reconstrucción de tejidos
lesionados, enfermos o envejecidos es uno de los campos más prometedores en el
siglo XXI [9].
Los polímeros están definidos como largas cadenas de moléculas orgánicas. La
polimerización es el proceso mediante el cual los monómeros o heterómeros según sea
el caso, se unen para crear estas largas moléculas. Comparados con los metales y las
cerámicas, los polímeros presentan bajas propiedades de resistencia, rigidez y

Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos
4
temperatura de fusión [10].
Los polímeros utilizados en ingeniería de tejidos pueden ser de origen natural o
sintético. Entre los naturales encontramos el almidón, alginato, quitosano y derivados
del ácido hialurónico, así como proteínas como la soya, colágena, seda, gel de
fibronectina, etc. Dentro de los sintéticos está el poli hidroxibutirato (PHB), poli-
caprolactona (PCL), poliácido láctico (PLA), poli ácido-glicólico (PGA), entre otros
[11,12].
Los polímeros sintéticos tienen relativamente buena resistencia mecánica, su
tasa de degradación y forma pueden ser modificadas fácilmente, su superficie suele ser
hidrofóbica y no presenta señales de reconocimiento celular, mientras que los
polímeros de origen natural tienen la ventaja de tener un reconocimiento biológico
potencial, pero tienen bajas propiedades mecánicas [11, 13,14].
La familia Poli (-ésteres) son polímeros termoplásticos sintéticos
biodegradables con enlaces éster alifáticos, hidrolíticamente lábiles orientados en su
cadena central, los cuales son la clase de polímeros más ampliamente investigados [11,
15,16] debido a que son biocompatibles, biodegradables y están aprobados por la FDA
(Food and Drug Administration) para uso clínico [11,16].
Por su mecanismo de síntesis (a través de la apertura de anillo o polimerización
por condensación) y su disponibilidad comercial, estos polímeros, han sido usados en
diferentes campos como la ingeniería de tejidos, biomedicina y la industria [11]

Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos
5
1.2 POLI-ÁCIDO LÁCTICO (PLA)
El poli-ácido láctico es un poliéster alifático del ácido láctico, esta es una
molécula quiral simple en la cual existen dos estero-isómeros L-y D- ácido láctico, la
forma L difiere de la forma D en su efecto sobre la luz polarizada, es decir para el L-
ácido láctico el plano quiral rota levógiramente, mientras que en la forma D rota
dextrógiramente [17, 18] (Figura 1).
La conversión del ácido láctico a PLA de alto peso molecular se lleva a cabo
principalmente por dos rutas [19]. La primera es un proceso libre de solventes y con un
sistema de destilación para producir una gama de polímeros con la finalidad de pasar
del ácido láctico al ácido poliláctico (PLA) de bajo peso molecular, seguido de una
despolimerización controlada para producir el dímero cíclico comúnmente referido como
lactida, el cual se mantiene en forma líquida para ser purificado posteriormente por
destilación [20]. La apertura del anillo catalítico de los estados intermedios de la lactida
resulta en la producción de PLA de peso molecular controlado, el proceso es continuo y
sin necesidad de separar el intermediario de lactida [18]. En la otra ruta de obtención de
PLA el uso de solventes es la base del proceso, en la cual un polímero de alto peso
molecular es producido por condensación directa usando destilación azeotrópica para
remover el agua de la continua condensación [18].
En la actualidad el PLA es de manufactura económica ya que se obtiene de
recursos renovables como el almidón y azúcar, es por tanto biodegradable,
característica que lo hace un candidato óptimo como otros polímeros para su utilización
en el estudio y aplicación de biomateriales. Una de estas aplicaciones es muy

Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos
6
importante en la ingeniería de tejidos (IT) ya que se busca la construcción de andamios
fibrilares que provean una plataforma para la adhesión y función celular, ya que permite
controlar y dirigir la función celular haciendo uso de las nuevas metodologías de diseño
de la IT con el objetivo final de imitar la matriz extracelular (MEC) específica para
mejorar la función del tejido a regenerar.

Figura 1. Estructura isomérica del poli-ácido láctico a) L-ácido láctico y b) D-ácido láctico.

Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos
7
1.3 INGENIERÍA DE TEJIDOS (IT)
Langer y Vacanti en 1993 definieron por primera vez ingeniería tisular como una
aproximación de siembra de células a andamios hechos de biomateriales sólidos y
rígidos preformados para la fabricación de tejidos, estos andamios poseían además la
característica de ser biocompatibles [21]. Sin embargo, el Dr. Fung, de la Universidad
de California en San Diego, en 1985, introdujo el término "ingeniería de tejidos" [22].
Como consecuencia de los procesos de enfermedad o daño traumático, los sistemas de
órganos y tejidos pierden la capacidad de llevar a cabo su función biológica y
estructural, por lo cual han surgido diferentes estrategias para tratar de recuperar la
salud de los tejidos.
La ingeniería de tejidos es una nueva estrategia tecnológica en el campo
biomédico que busca las vías para restaurar y mantener el normal funcionamiento de
tejidos enfermos o dañados [23]. Hay 4 tecnologías fundamentales en la ingeniería de
tejidos: 1) diseño de un andamiaje que favorezca la proliferación y diferenciación
celular, 2) el aislamiento y el cultivo de células, 3) un sistema de liberación de fármacos
(DDS) y/o factores de crecimiento, 4) mantenimiento del espacio para inducir la
regeneración del tejido [23].
El diseño de andamios es clave en la regeneración de tejidos, ya que con el
diseño de estos se trata de imitar la parte fibrilar de la matriz extracelular nativa (MEC)
de los tejidos, la cual cumple diferentes funciones: Estructural, para soportar a las
células y proveer de un sustrato para la proliferación y migración celular [24-25],
bioquímica, para secuestrar factores de crecimiento y otras señales químicas que

Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos
8
regula el destino celular y por último, biológica en la cual se presentan secuencias de
péptidos bioactivos que puedan unirse directamente a receptores que induzcan la
activación intracelular de rutas de señalización celular (Figura 2)
[26].

Figura 2. Campos en los cuales se fundamenta la bioingeniería de tejidos, como el cultivo
celular, el uso de factores de crecimiento, el diseño de matrices, que tienen la finalidad de
inducir a la regeneración de tejidos [Tomada de Stevens MM, Science.2005]

Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos
9
1.4 CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES ESTROMALES
DE MÉDULA ÓSEA (HBM-MSC).
La definición de célula troncal debe hacerse de acuerdo a criterios funcionales,
ya que estas no poseen características morfológicas que puedan distinguirlas del resto
de las células del tejido al que pertenecen, de acuerdo con esto, las células troncales se
han definido como células inmaduras no diferenciadas, con una alta capacidad de
autorrenovación y que puede diferenciarse a uno o más linajes celulares especializados
con funciones específicas en el organismo [27]. Actualmente la forma de reconocer a
estas células incluye tanto el análisis inmunofenotípico (es decir la expresión de
moléculas de membrana como antígenos o moléculas intracelulares) como el análisis
de expresión de ciertos genes que pueden actuar como marcadores. Sin embargo, son
los ensayos funcionales tanto in vivo como in vitro, los que determinan sin lugar a
dudas, la identidad de toda célula troncal [27].
La médula ósea (MO) se ha definido como un órgano donde se localizan dos
tipos de células troncales, las células troncales hematopoyéticas (HSC, del inglés
Hematopoietic Stem Cells) y las células troncales mesenquimales (MSC, del inglés
Mesenchymal Stem Cells). Las HSC son las células troncales que más se han
caracterizado y las responsables de mantener la producción de las células sanguíneas
a lo largo de la vida del individuo [28]. Por su parte, las MSC originan a la mayoría de
las células que constituyen al estroma de la MO encargadas de mantener la
hematopoyesis y además tienen la capacidad para dar lugar a la formación de hueso,
cartílago y músculo [29]. Se ha demostrado que las MSC están localizadas en muchos
tipos de tejidos como músculo, tejido adiposo, folículos pilosos, pulpa dental, gelatina

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10
de Wharton, pulmón, placenta, hígado, bazo, entre otros muchos tejidos [30,31].
Por su capacidad de diferenciación hacia distintos linajes, mantener la formación
de células sanguíneas e incluso la inmunosupresión, han hecho que sean de gran
interés en varios campos de la ciencia, tal es el caso de la IT y la medicina regenerativa
(Figura 3) [28].
Las hBM-MSC representan una población heterogénea de células no
hematopoyéticas con potencialidad y plasticidad que es la habilidad de dar origen a
múltiples líneas celulares. En 2006, la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISC,
International Society for Cellular Therapy), propuso ciertos criterios para definir las
células troncales mesenquimales: estas células deben ser adherentes en cultivo,
presentar la expresión fenotípica de marcadores, CD73, CD90, CD105 y la ausencia de
CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a, CD19, y HLA-DR [28,32]. Bajo condiciones
apropiadas, se diferencian en adipocitos, condrocitos, osteoblastos y otros tipos
celulares incluyendo las células epiteliales. Su capacidad para proliferar, para ser
expandidas in vitro y para diferenciarse en varios linajes de células las hace un blanco
atractivo para su aplicación en la medicina regenerativa [33].
Figura 3. Morfología de MSC de fuente adulta y neonatal a) Médula ósea, b) Cordón umbilical y
c) Placenta, [tomada de JJ Montesinos et al. 2009].

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11
1.5 LA MATRIZ EXTRACELULAR (MEC)
La matriz extracelular (MEC) es una estructura tridimensional acelular, que está
presente en todos los tejidos y es esencial para la vida. Cada órgano tiene una MEC
con composición única que es generada en los estadios embrionarios tempranos [34].
La función de la MEC va más allá de sólo proveer soporte físico para la integridad y
elasticidad de los tejidos: es una estructura dinámica que está en constante
remodelamiento para controlar la homeostasis tisular [34]. La importancia funcional de
la MEC está ejemplificada por un amplio rango de defectos tisulares y en los casos más
severos hay incompatibilidad con la vida desde etapas embrionarias, causada por
mutaciones en los genes que codifican para los componentes de la MEC (Figura 4)
[35,36].
En mamíferos la MEC está compuesta por alrededor de 300 proteínas conocidas
como matrisoma e incluye proteínas tales como colágena, proteoglicanos (PGs), entre
otros. Existen dos tipos principales de MEC que difieren en cuanto a su ubicación y
composición: la matriz de tejido conectivo intersticial, que rodea las células y
proporciona un andamiaje estructural para los tejidos; y la membrana basal la cual es
una forma especializada de la MEC que separa el epitelio del estroma circundante. Los
componentes de la MEC se encuentran en constante interacción con el epitelio,
sirviendo como ligando para receptores celulares como las integrinas, transmitiendo así
señales que regulan la adhesión, la migración, la proliferación, la apoptosis,
supervivencia o diferenciación celular [39].

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12
La MEC también puede secuestrar o liberar localmente factores de crecimiento
tales como el factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento de
fibroblastos (FGF) y otras moléculas de señalización como WNTs o de la familia del
TGF[37]Los componentes de la MEC liberados a través de la ruptura o remodelación
de esta, también regulan la arquitectura de la MEC e influyen en el comportamiento
celular [34]. Además, las células están constantemente reconstruyendo y remodelando
la MEC mediante síntesis, degradación, reensamblaje y modificación química [38].
Estos procesos son complejos y necesitan ser estrictamente regulados para mantener
la homeostasis del tejido, especialmente en respuesta a una lesión. De hecho, la
remodelación desregulada de la MEC se asocia con condiciones patológicas y puede
exacerbar la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, la deposición y la rigidez
anormales de la MEC se observan en fibrosis y cáncer [38], y la degradación excesiva
de la MEC está relacionada con la osteoartritis [40]. Es por eso que el entendimiento de
la MEC es importante en la IT y la medicina regenerativa, para diseñar las estrategias
adecuadas para la regeneración de tejidos dañados o ausentes.

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13

Figura 4. Modelo de matriz extracelular en el cual se observan los componentes de esta y su
estructura espacial en 3D [Tomada de Jampieer Sánchez Castillo 2010
http://biologiamedica.blogspot.mx/2010/09/la-matriz-extracelular.html].

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14
1.6 HILADO POR PROPULSIÓN DE GAS (AIR JET SPINNING)
Entre las nuevas metodologías que han tomado relevancia en la ingeniería de
tejidos se encuentra la técnica de hilado por propulsión de gas (air jet spinning “AJS”,
por sus siglas en inglés) [41]. Está técnica nanotecnológica es rápida, eficiente y
sencilla, que se emplea en la preparación de micro- y nano- fibras de materiales
poliméricos degradables y sintéticos que ha empezado a recibir una creciente atención
en la literatura especializada para su aplicación en el campo de la biomedicina [42,43].
Esto debido a que cuando los diámetros de las fibras de polímeros disminuyen hasta
alcanzar valores de micras (1-5 µm); y nanómetros (5-1000 nm) emergen una serie de
características nuevas como son: 1) la elevada proporción superficie/volumen; 2)
flexibilidad en la funcionalización de superficies, 3) propiedades mecánicas superiores,
y 4) una elevada interconexión porosa [43].
La técnica de AJS se basa exclusivamente en el uso de un gas inerte (nitrógeno
u argón) que se
dispensa a una velocidad extrema entre los 25 y 35 psi con el fin de
estirar la solución polimérica en forma de fibras finas en la salida de la boquilla de un
dispositivo de atomización de gas o aerógrafo.
El equipo se compone principalmente de un dispositivo de atomización de gas,
un tanque gas presurizado, y la propia solución de polímero a trabajar (Figura 5).
Las fibras se forman debido a que en el mismo instante que sale disparado la
solución polimérica de la punta del dispositivo, el disolvente comienza a evaporarse
debido a que el gas propulsor compite por el oxígeno y continúa haciéndolo después de
que las fibras se han depositan sobre el colector [44]. A pesar de que la técnica de AJS

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15
es relativamente fácil de usar, hay una serie de parámetros o variables en el
procesamiento que deben ser optimizados con el fin de generar fibras en lugar de gotas
y que pueden afectar significativamente la morfología fibrilar [41].
Las variables que principalmente intervienen en la formación de las fibras son: 1)
la viscosidad de la solución polimérica, ya que de ella depende que tan eyectable
puedes ser la solución a través del dispositivo, ya que hay soluciones que por su
concentración/viscosidad no son candidatas para usarse por esta técnica, 2) la
volatilidad del solvente, de esta variable depende que tan rápido el polímero logra
conformar las fibras sin formar gotas que interfieren en la arquitectura final de las fibras,
3) la velocidad del flujo del polímero, esta va directamente relacionada a la
viscosidad de la solución y a la presión aplicada para ser eyectada, y 5) la distancia
entre la aguja del dispositivo y el colector, en conjunto con las variables antes
mencionadas, esta variable influirá directamente en el grosor de las fibras, y un
adecuado equilibrio entre las variables nos permitirá la formación de fibras a escalas
adecuadas para la utilización en la IT [41,42].
La capacidad de ajustar el tamaño de las fibras es uno de los puntos importantes
de la técnica de AJS puesto que las fibras con diámetros en el rango de nanómetros se
asemejan mucho a las escalas de las proteínas fibrilares que se encuentran en la MEC
de muchos tejidos del cuerpo humano [41]. Por tal motivo, en la presente tesis doctoral
se propone utilizar la técnica de AJS junto con el ácido poliláctico (PLA) para la
fabricación de andamios fibrilares para su utilización en la regeneración tisular.

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Figura 5. Dispositivo atomizador de gas de un equipo de hilado por propulsión de gas (AJS).

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CAPITULO 2
DISEÑO EXPERIMENTAL

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2. JUSTIFICACIÓN
La justificación para el desarrollo de este trabajo de tesis doctoral se sustenta en
que una de las características básicas que se le deben dar al material que formará el
andamio es: tener una máxima área superficial, una rigidez mecánica adecuada, una
forma tridimensional y necesita ser lo más parecida estructuralmente a la matriz
extracelular del tejido que se pretende regenerar. Dado que la función del andamio es
dirigir la interacción y crecimiento celular, ya sea de los tejidos adyacentes o de las
células sembradas en él, para que sinteticen y colonicen la superficie del andamio.
Para lograr lo anterior, el material debe proveer una adecuada adhesión celular,
y en ciertos casos debe favorecer la propagación y migración celular. Por ello; la
presencia de una rugosidad superficial, una estructura porosa e interconectada, es de
suma importancia ya que le provee al andamio dos funciones críticas. Primero, los
canales del poro proveen puertos de entrada para la migración de las células. Segundo,
una disponibilidad de una máxima área para la interacción de numerosas células
específicas. Entre las diferentes técnicas de procesamiento utilizadas para producir
nanofibras, la tecnología de hilado por propulsión de gas permite la fabricación de fibras
de con diámetros que van desde las decenas de nanómetros a decenas de
micrómetros, con una definida porosidad, una estructura tridimensional, un área de
superficie extremadamente grande, y pueden imitar la estructura de las proteínas
fibrilares de la matriz extracelular, que proporcionan apoyo al crecimiento celular.
Como perspectiva de una fuente de células troncales para la regeneración
tisular, las células troncales mesenquimales estromales de médula ósea humana (hBM-

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MSC) se pueden proponer como una alternativa; dado que estas células se pueden
expandir in vitro, para la aplicación en la regeneración tisular. Además, una
característica importante de estas células es que tienen propiedad inmunosupresora y
por lo tanto pueden atenuar la respuesta inflamatoria dañina en el sitio de implante del
andamio en tratamientos de terapia de regeneración tisular.
Por ello, la justificación y originalidad del estudio doctoral estará enfocada en el
diseño de los andamios nanofibrilares por medio de la técnica de hilado por prolusión
de gas a partir del polímero PLA, que es altamente biocompatible, biodegradable y que
en sus propiedades se presenta como un material adecuado para el crecimiento de
células troncales mesenquimales.

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2.1 OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS
2.2 OBJETIVO GENERAL:
Diseñar andamios poliméricos fibrilares biodegradables de poli-ácido láctico
(PLA) por medio de la técnica de hilado por propulsión de gas (AJS) a diferentes
concentraciones de PLA, con la finalidad de ofrecer una matriz sintética que imite a la
matriz extracelular (MEC) nativa de los tejidos del cuerpo humano.
2.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Diseño y fabricación de andamios fibrilares a partir de polímeros sintéticos como el
poli-ácido láctico (PLA) por medio de la técnica de hilado por propulsión de gas a
diferentes concentraciones 6, 7, y 10% (peso/volumen).
2. Determinar los parámetros de distancia, de las soluciones de PLA disueltas en
solventes con diferentes polaridades con el fin de estudiar y caracterizar su importancia
en relación a la calidad y estructura fisicoquímica; de morfología; organización de las
fibras; del diámetro; y de superficie; para el diseño y fabricación de las membranas de
PLA por medio de la técnica de AJS.
3. Caracterizar fisicoquímicamente los andamios poliméricos de PLA (6, 7, y 10%) por
medio de las técnicas de Rayos-X, Microscopia electrónica de barrido (MEB) y
Espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier (FT-IR)
4. Determinar las propiedades estructurales de los andamios hilados de PLA por medio
de pruebas mecánicas de tensión y mojabilidad.

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5. Implementar los cultivos de células troncales mesenquimales de médula ósea (hBM-
MSC) en los andamios fibrilares de poli-ácido láctico.
6. Establecer el efecto de la morfología superficial de los andamios hilados de PLA (6,
7, y 10%) en la adhesión, proliferación e interacción célula-material de las células hBM-
MSC en cultivos celulares in vitro.
7. Evaluar la biodegradación y respuesta inflamatoria de los andamios hilados de PLA
en un modelo de rata in vivo.

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2.4 HIPÓTESIS
Los andamios hilados de poliácido láctico (PLA) sintetizados por la técnica de
AJS generarán una alta área superficial, una interconexión porosa y por tanto tendrán
una influencia directa sobre la respuesta de biocompatibilidad, bioactividad y
biodegradabilidad en modelos de cultivo celular in vitro y en un modelo animal de rata in
vivo; debido a que imitan la estructura fibrilar de la MEC nativa
de los tejidos.

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CAPITULO 3
METODOLOGÍA

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3.1 TÉCNICA DE HILADO POR PROPULSIÓN DE GAS
3.1.1 Materiales
Se adquirieron pellets de poliácido láctico (PLA) (C3H6O3, con un peso molecular
de 192.000, denominado Ingeo 2003D) de la compañía Promaplast, México. Los
solventes como cloroformo (CHCl3) y alcohol etílico absoluto anhidro (CH3CH2OH) se
compraron a la compañía J. T. Baker. Todos los productos se usaron tal como se
recibieron sin purificaciones adicionales. Se prepararon soluciones poliméricas a
concentraciones de 6%, 7%, y 10% en peso/volumen de PLA, respectivamente,
disueltas en cloroformo (CHCl3) y agitando durante 20 horas y después se añadió
etanol (CH3CH2OH) y se dejó la solución agitando durante 30 minutos hasta obtener
una solución homogénea. La relación en volumen de cloroformo/etanol fue de 3:1.
3.1.2 Diseño de Andamios Hilados por Propulsión de Gas
El proceso de elaboración de los andamios fibrilares de PLA se llevó a cabo al
disolver 6, 7, y 10 gramos del polímero de PLA en 100mL de una solución
cloroformo/etanol a una razón de 3:1.
En todos los casos, la solución polimérica se colocó en un aerógrafo disponible
comercialmente modelo ADIR 699 con un diámetro de boquilla de 0.3 mm con una
alimentación gravitatoria de la solución polimérica para la síntesis de las membranas
fibrilares. El aerógrafo se conectó a un tanque de argón presurizado (número CAS
7740-37, concentración> 99%, PRAXAIR México) y para la deposición de las fibras se
mantuvo constante una presión de 30 psi con 15 cm por de distancia de la boquilla al

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25
blanco como parámetros para la obtención los andamios fibrilares de PLA.
3.2 CARACTERIZACIÓN DE LAS MEMBRANAS
3.2.1 Difracción de Rayos X
La estructura semicristalina de las membranas fibrilares de PLA a las diferentes
concentraciones (6, 7, y 10%) se determinó por medio de difracción de rayos X (DR-X)
usando un difractómetro D8 Focus Bruker AXS con radiación Cu-kα en el intervalo 2Ɵ
entre los ángulos 10-35º.
3.2.2 Espectroscopía Infrarroja
Los andamios hilados de PLA a las diferentes concentraciones 6, 7, y 10% se
sometieron a un análisis de espectroscópico infrarrojo por transformada de Fourier
(FTIR) equipado con un sistema de muestreo por reflectancia atenuada (ATR) que
dispone de un soporte con cristal de diamante, permitiendo realizar las mediciones de
manera fácil, rápida y directa, pues no se requiere una preparación previo al análisis de
las membranas, utilizando el equipo IRAffinity-1S (SHIMADZU, Excellence in Science),
haciendo 40 barridos por muestra en un rango de longitud de onda de 400-4.000 cm-1,
esto para localizar las bandas de absorción del polímero PLA.
3.2.3 Microscopía Electrónica de Barrido
Las muestras obtenidas de los andamios de PLA fueron recortadas en forma
circular de 8 mm y colocadas sobre barriles de aluminio y cinta carbón para observar la
morfología y estructura de las fibras con un microscopio electrónico de barrido de

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26
emisión de campo (FE-SEM, JSM-7800F, JEOL). El voltaje de operación para el haz de
electrones fue 15 kV. Las muestras se prepararon previamente con un recubrimiento de
una película de oro mediante la pulverización catódica asistida por plasma para
favorecer la conductividad de la muestra. Las micrografías obtenidas de MEB de los
andamios de PLA fueron insertadas en el software “Image J” el cual permitió analizar el
diámetro de las fibras. En total se llevaron a cabo 150 mediciones por cada porcentaje
de PLA (6, 7, y 10%).
3.3 PRUEBA MECÁNICA (TENSIÓN)
La propiedad elástica del PLA fue medida bajo una prueba de tensión en la cual
se monitorea la carga necesaria para producir una elongación dada conforme el
espécimen se somete a una tensión a una razón constante. Se utilizó el equipo
INSTRON 55-67 de acuerdo con la Norma ASTM D1708 SPECIMEN (mm) [18] con la
finalidad de conocer que tan elástico o que tan duro es el material (Módulo de Young)
con el que se diseñan los andamios, así como para determinar qué concentración es la
más adecuada para su utilización en la ingeniería de tejidos. El espesor de las muestras
fue de 0.5 a 1.0 mm, la prueba se realiza a una velocidad de deformación de 10
mm/min, posteriormente los datos fueron registrados y analizados en Lab-VIEW [18]
para realizar las gráficas correspondientes del comportamiento mecánico de los
andamios de PLA (Figura 6).

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27

Figura 6. (a) Equipo INSTRON 55-67, (b) Curva que ejemplifica el comportamiento plástico de
un polímero dado en una prueba de tensión, se pueden observar las diferentes fases o zonas
por las que un material pasa para poder conocer sus características y comportamiento elástico.

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28
3.4 MOJABILIDAD Y ÁNGULO DE CONTACTO
Las fuerzas atractivas entre las moléculas del líquido, causantes de la tensión
superficial, se llaman fuerzas de cohesión (Figura 7 (a)). Dependen sólo de la
naturaleza del líquido. Con ellas compiten las fuerzas de adhesión, entre el líquido y el
sólido con el que está en contacto, dependiendo de la naturaleza de ambos. Unas
veces las fuerzas adhesivas predominan (ejemplo: agua-vidrio) (Figura 7 (b)) [45]. Otras
veces las fuerzas cohesivas predominan (ejemplo: mercurio-vidrio) (Figura 7 (c)). El
ángulo de contacto es una propiedad superficial de los sólidos que cuantifica su
tendencia a la hidrofobicidad como parámetro importante para analizar los mecanismos
de interacción entre las fases sólida y líquida que se presentan entre los biomateriales y
los sistemas biológicos [45]. Sea el ángulo θ que forma la superficie sólida con la
tangente a la superficie líquida en el punto de contacto (pasando por el líquido).

Figura 7. Ángulo de contacto (a), fuerzas de adhesión (b) y fuerzas de cohesión (c). [Tomado
de Carlos A. Ramírez. http://biomateriales.org/blog/2011/09/angulo-de-contacto-en-
nanoparticulas/]

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29

Determinar el ángulo de contacto es importante para saber si la interacción entre
los andamios y los fluidos intracelulares y la misma célula serán adecuadas. Por tal
motivo se llevó a cabo este estudio y para determinar el ángulo de contacto, se utilizó
un inyector (gotero), una lente y los andamios de PLA en sus diferentes
concentraciones. El ensayo partió por depositar gotas de 4mL sobre las muestras al 6,
7, y 10 % de PLA con una distancia de 0.5 cm entre cada gota las cuales fueron
fotografiadas y analizadas con el programa Image J para determinar el ángulo de
contacto y poder obtener si los andamios presentan características hidrofóbicas o
hidrofílicas debido al procesamiento y a las escalas logradas durante la síntesis.
3.5 DEGRADACIÓN IN VITRO
Para los estudios de degradación se utilizaron 5 andamios de las membranas
hiladas PLA al 7% y 10%, debido a que están mostraron mejores comportamientos
tanto fisicoquímica como mecánicamente, además de tener una mejor respuesta
celular. Los andamios nanofibrilares se colocaron individualmente en viales de vidrio
que contenían 25 ml de una solución de Ringer (CaCl2 y C3H5O3Na, pH 6.36) para el
grupo experimental y agua bidestilada (pH 8.16) para el grupo de control. Todas las
muestras se mantuvieron en un horno a 37ºC hasta pasado los 100 días del tiempo de
incubación. Después del tiempo de incubación, las muestras se extrajeron con pinzas,
se lavaron minuciosamente con agua desionizada y se colocaron en viales vacíos para
incubarlos en un ambiente de vacío
durante 60 minutos para su secado.
Posteriormente, la superficie de los andamios de las muestras se analizó mediante

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30
MEB.
3.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS
3.6.1 Cultivo celular
Las células mesenquimales estromales de médula ósea humana (hBM-MSC)
fueron donadas para este proyecto por el Dr. Juan José Montesinos Montesinos de
Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas del Centro Médico
Nacional Siglo XXI, IMSS de la Ciudad de México.
Las células hBM-MSC fueron cultivadas y expandidas en medio de cultivo alpha-
MEM suplementado con 5% de suero fetal bovino (SFB), una solución de antibióticos
[penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 μg/ml) y fungisona (0.3 μg/ml)] y 100mM de
glutamina. Los cultivos se mantuvieron a una temperatura de 37°C y en una atmósfera
de 95% de aire y 5% de CO2 en un ambiente con 100% de humedad [25, 26]
3.6.2 Ensayo de Adhesión Celular (Cristal Violeta)
Para establecer el efecto de los andamios de PLA sobre la adhesión celular, las
células hBM-MSC se cultivaron en contacto directo sobre los andamios hilados y sobre
las películas delgadas de PLA utilizadas como control. Previo al experimento, se
cortaron discos de 8mm de diámetro de los andamios de PLA al 6, 7, y 10% así como
de las películas delgadas a las mismas concentraciones. Se esterilizaron en una
solución de antibiótico con etanol al 75% durante 1 hora y se dejaron secar.
Posteriormente se sometieron a 30 min de luz ultravioleta en la campana de cultivo

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31
celular para garantizar su esterilidad.
Los andamios se colocaron en placas de cultivo de 24 pozos y se sembraron las
células hBM-MSC a una densidad celular de 5x103 células/mL, cultivandose durante 2,
4, y 24 horas. Al cabo del tiempo propuesto se realizaron tres lavados con PBS
(solución amortiguadora de fosfatos) para remover las células que no se adhieran a las
superficies. Las células adheridas al andamio se fijaron con paraformaldehído al 4%
durante 1 hora. Posteriormente se realizaron tres lavados con PBS para continuar con
el ensayo de adherencia celular.
La adherencia celular fue evaluada de acuerdo al método del cristal violeta. A los
andamios previamente lavados con PBS, se les adicionan 300 μL de una solución al
0.1% de cristal violeta en cada pozo y se deja interactuar durante 30 min. Pasado el
tiempo, se realizan aproximadamente 6 lavados con agua bidestilada para remover el
colorante no específico y después de los lavados se adicionan 300 μL de una solución
de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1%, y se deja por 1 hora. De la solución obtenida se
retiran 200 μL que se colocaron en una placa de 96 pozos para ser llevado a lectura
espectrofotométrica a una absorbancia de 570 nm. Los valores de la absorbancia
obtenidos fueron extrapolados para determinar el porcentaje de células adheridas en
los andamios con respecto al control que fueron las células sembradas sobre la misma
placa de cultivo (plástico) que se considera como el 100% de adherencia. Los
experimentos de adhesión celular se realizaron por triplicado, repitiéndose por lo menos
tres veces.

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32
3.6.3 Interacción célula-material
Para observar la interacción de las células en lo andamios se utilizó el kit Cell
Tracker Fluorescents. El kit CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein
diacetate) es un colorante fluorescente que se utiliza para la localización y movimientos
celulares. Después de que la sustancia CMDF es cargado en las células y metabolizado
enzimaticamente, el medio de contraste es bien retenido, lo que permite el seguimiento
de los movimientos celulares, ya que el colorante tiene paso libre a través de la
membrana.
Las células hBM-MSC se sembraron a una concentración de 5x103 células/mL
sobre los andamios hilados de PLA y se incubaron durante 24 horas. Posteriormente se
lavaron con PBS y se incubaron a 37°C con medio sin rojo fenol y con el colorantes cell
tracker a una concentración de 0.5 µM en presencia de DAPI a una concentración de
0.5 μg/mL. Las células se dejaron incubar durante 45 minutos en condiciones de
crecimiento estándar. Posteriormente, se lavan con PBS y se adiciona medio fresco y
precalentado y se incuban por otros 30 minutos a 37°C. Durante este tiempo, el grupo
clorometilo del colorante sufre modificación y se secreta al citosol de la célula, se retira
el medio, y se lava con PBS y después se fijan las células-andamios con formaldehído
al 4% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente, y nuevamente se lavan con
PBS. Una vez fijadas y teñidas de observaron las muestras por microscopía de
fluorescencia para obtener imágenes de la interacción entre las células hBM-MSC y los
andamios hilados de PLA al 6, 7, y 10%.

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33
3.6.4 Ensayo de viabilidad Celular (MTT)
Se evaluó el efecto de los andamios nanofibrilares y de su interconexión porosa
por medio de la viabilidad celular utilizando el ensayo de azul de triazol (MTT) basado
en la habilidad de la enzima deshidrogenada mitocondrial para oxidar una sal de
tetrazolio (3-[4,5-dimetiltiazol-2-y]-2-5 bromuro difeniltetrazolio) a un producto insoluble
de color azul. El MTT se utiliza para evaluar la viabilidad celular como función del
potencial redox. Las células respiratorias activas convierten el MTT soluble en agua en
formazán morado insoluble y a manera de cristales. A continuación, el formazán se
solubiliza y su concentración se determina mediante densidad óptica. Para ello, las
células hBM-MSC se cultivaron sobre las películas delgadas y los andamios hilados de
PLA a una densidad celular de 5x103 células/mL durante 3, 5, 7, 14, y 21 días de
cultivo. Después de cada periodo experimental, las células se incubaron con MTT (50
mg/ml) a 37°C por 4 horas. Pasado este tiempo, el sobrenadante fue removió y se les
adiciono 400 μL de dimetilsulfoxido (DMSO) dejándose incubar a 37°C por 30 min.
Pasado el tiempo de incubación, el sobrenadante fue removido a una placa de 96 pozos
y se llevó a un lector para obtener la densidad óptica a una longitud de onda de 570 nm.
Debido a que la generación del producto azul es (directamente) proporcional a la
actividad oxidativa de la enzima deshidrogenasa, una disminución en los valores que se
obtengan en la absorbancia se puede correlacionar con un fenómeno de citotoxicidad
celular por parte de los andamios. Sin embargo, si no hay disminución se correlaciona
con una proliferación celular sobre los andamios. Los experimentos se realizaron por
triplicado repitiéndose tres veces.

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3.7 MODELO ANIMAL (ESTUDIO DE DEGRADACIÓN IN VIVO)
3.7.1 Procedimiento quirúrgico general en ratas Wistar.
Se utilizaron 24 ratas macho cepa Wistar de 12 semanas con 250g de peso y
estos animales se dividieron aleatoriamente en seis grupos de cuatro ratas cada uno,
correspondientes a los períodos de tiempo establecidos (8, 20, 40, 60, 80 y 100 días). A
los especímenes de cada grupo se les realizó un implante quirúrgico siguiendo los
procedimientos establecidos por el comité de ética de la Facultad de Odontología
aprobado con número CIE/10/01/2015 y la norma oficial mexica NOM-062-ZOO1999.
Los andamios de PLA de los porcentajes 7 y 10% que fueron los que dieron una mejor
respuesta tanto fisicoquímica como celular fueron los empleados en este estudio.
Los especímenes se tranquilizaron y sedaron por vía intramuscular con Ketamina
(80 mg/kg) y Xilacina (10mg/kg). La zona quirúrgica se rasuro y se realizó antisepsia de
rutina con yodopovidona, se aplicó de manera tópica mepivacaína con epinefrina y a
continuación se realizó una incisión a través de la piel para realizar tres colgajos
triangulares de aproximadamente 2 cm, organizados de la siguiente manera: uno
en
parte superior derecha donde se colocó el andamio de PLA al 7%; uno a la izquierda
donde se colocó el andamio de PLA al 10% y en la parte inferior derecha se colocó
Gelfoam como andamio control (Figura 8). Cada andamio fue suturado a la dermis con
Nylon 5-0 para estabilizarlos y no perder su posición. Posteriormente se realizó un
seguimiento clínico posquirúrgico, valorando una serie de parámetros: estado general
del animal, aspecto de la herida y de la zona intervenida, sangrado, exudado o
colecciones o extrusión de los biomateriales. Las ratas permanecieron en condiciones

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35
de fotoperiodo de 12 horas y una humedad relativa al 50% y alimentadas con rodent
diet 5001 ad libitum.
3.7.2 Sacrificio de los animales.
Al final del periodo del tiempo establecido (8 a 100 días), los animales de
experimentación se sacrificaron utilizando monóxido de carbono para evitar dolor y
sufrimiento hasta llegar al paro cardio-respiratorio, de acuerdo con lo establecido en el
Comité de Investigación y Ética de la Facultad de Odontología, DEPeI-UNAM.
Los andamios tanto experimentales como control se disectaron de la rata con
un margen de seguridad de 5 mm en toda la periferia del andamio, posteriormente se
lavó cuidadosamente la muestra con PBS y se colocó en formol al 10% durante 24
horas para su fijación.
3.7.3 Evaluación histológica.
Una vez fijadas las muestras, se lavaron durante 2 horas con agua
bidestilada y posteriormente las muestras se colocaron en un Histokinnet, para su
deshidratación en alcohol en concentraciones crecientes de 50%, 70%, 90% y 100%.
Posterior a su deshidratación se incluyeron en parafina y se realizaron cortes seriados
de 5 micrómetros de espesor para ser analizados por tinción con Hematoxilina y Eosina
para evaluar el tipo celular presente, así como infiltrado inflamatorio. Para valorar el
grado de fibrosis y de la degradación de las nanofibras, las muestras fueron teñidas con
tricrómica de Masson.

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36

Figura 8. Imágenes representativas del procedimiento quirúrgico para la implantación de los
andamios de PLA al 7 y 10% teniendo como control Gelfoam. A: señalización de los lugares
donde se colocaron los andamios y el control; B: incisión vertical con hoja de bisturí No. 15; C:
fijación del andamio con sutura de Nylon 5-0; D: cierre de la incisión con técnica de sutura
simple.

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37

3.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los ensayos de adhesión y viabilidad celular se evaluaron estadísticamente, los
valores se expresan como media ± DS. Se realizaron comparaciones múltiples con un
análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y con una p < 0.05 se consideró
estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad
Prism versión 6.01.

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38

CAPITULO 4
RESULTADOS

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39
4.1 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LAS FIBRAS DE
CONCENTRACIÓN 6, 7, Y 10%.
La morfología de los andamios fibrilares de PLA y el tamaño del diámetro de las
fibras fueron evaluados por microscopía electrónica de barrido (Figura 9). Las
micrografías de los andamios muestran que el proceso de hilado por propulsión de gas
al sintetizar las diferentes concentraciones de la solución polimérica de PLA (6, 7, y
10%) presentan fibras con morfología homogénea en las diferentes concentraciones de
PLA, con una organización aleatoria y con un cambio notable en la uniformidad cuando
la concentración de PLA aumenta. Asimismo, las diferencias que se encontraron entre
los andamios hilados de PLA fueron en cuanto al diámetro de las fibras. Los andamios
fibrilares con un 6% en peso de PLA presentar un diámetro promedio de 261 nm (Figura
9 a y b), el andamio con un 7% en peso de PLA muestran un diámetro promedio de 407
nm (Figura 9 c y d) y finalmente, las fibras con una alta concentración de PLA, 10% en
peso, presentan un diámetro promedio de 599 nm (Figura 9 e y f). Esto significa que la
concentración de PLA tiene un efecto directo en el diámetro de las nanofibras al ser
sintetizadas por la técnica de hilado por propulsión de gas.

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40

Figura 9. Imágenes obtenidas por MEB y sus histogramas del promedio del diámetro de las
fibras de los andamios fibrilares de PLA a la concentración de polímero de (a y b) 6%, (c y d)
7% y (e y f) 10%, depositadas por la técnica de AJS.

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41
4.2 DIFRACCIÓN DE Rayos-X
Las propiedades estructurales de las fibras de PLA fueron evaluadas por
difracción de rayos X.
Los resultados muestran la presencia de la fase amorfa donde hay algunos picos
máximos que sugieren una pobre fase cristalina en los ángulos de 16.6, 21.5, y 23° a
2Ɵ de distancia como resultado del estiramiento de las cadenas poliméricas durante el
proceso de síntesis de las membranas de PLA por la técnica de hilado por propulsión
de gas (Figura 10). Estos resultados concuerdan con los picos característicos de la
estructura ortorrómbica en forma de α según el documento PDF-2-2006 número 00-
054-1917, Diffract Plus 2005 [27, 28]. Además, este resultado es importante porque una
membrana de PLA amorfo presenta una tasa de degradación más rápida en los
procesos de regeneración de tejidos.

Figura 10. Patrón de difracción de rayos X (XRD) de los andamios hilados de PLA fabricado a
través de la técnica de AJS a diferentes concentraciones del polímero (A) 6%, (B) 7%, y (C)
10%.

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4.3 ESPECTROSCOPIA DE INFRARROJO POR TRANSFORMADA DE
FOURIER (FTIR)
La estructura química de las membranas fibrilares de PLA sintetizadas con
diferentes concentraciones (6, 7, y 10%) se obtuvieron por medio de espectroscopía IR
y se compararon para identificar si existían cambios estructurales por el efecto de la
técnica de hilado por propulsión de gas [29]. En los tres espectros se observan las
mismas curvas de absorción del espectro IR mostrando las bandas características de
las asignaciones del espectro de PLA como son las bandas de estiramiento simétricos y
asimétricos para el CH de 3200-2800 cm- 1, CH, CH3 y COC de 1500-1000 cm- 1 (Figura
11).

Figura 11. Espectro IR de los andamios a diferentes concentraciones de PLA (6%, 7% y 10%),
se muestra el valor de las bandas características del espectro IR de PLA.

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43
4.4 PRUEBAS MECÁNICAS
Se obtuvieron datos a partir de la prueba de tensión que nos indican el
comportamiento elástico del PLA a las diferentes concentraciones 6, 7, y 10% a 15
minutos de depósito. De los datos obtenidos se calculó el módulo de Young, la
Tenacidad, la Deformación y la Tensión a carga última (Tabla 1).
En la figura 12 se muestra el promedio de los valores del módulo de Young,
donde cada barra corresponde a una concentración diferente de PLA. El módulo de
elasticidad promedio calculado del PLA 6% es de 46.974 ± 16.706 60 MPa, en los
andamios de PLA 7% la media del módulo de Young es de 193.017 ± 30.772 MPa y en
los andamios de PLA al 10% el promedio del valor del módulo elástico fue de 468.664 ±
101.000 MPa.
En la figura 13 se muestra el ensayo de tensión graficando la tensión de carga
última, que es la máxima tensión a la que se ha sometido el material durante el ensayo.
Nos habla de cuanto resiste el material hasta su ruptura, como se observa el andamio
compuesto de PLA al 7% y 10% en comparación con el PLA al 6% aumenta
significativamente teniendo una resistencia que alcanza poco más de 9.0 MPa.
Las propiedades
mecánicas de los andamios al aumentar la concentración de
PLA son modificadas y eso se observó con el aumento del valor del módulo de Young y
la tensión de carga última, por lo cual se seleccionaron los andamios con las mejores
propiedades mecánicas (7% y 10%) para su caracterización posterior en pruebas in
vitro e in vivo.

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44

Tabla 1. Propiedades mecánicas del PLA al 6%, 7% y 10% a 15 minutos de
deposición.

PLA → d = 15 cm

Tiempo
(min)

Módulo
de
Young
(MPa)

Tenacidad
(MPa)

Deformación
(mm)
Tensión
carga
última
(MPa)

Grosor
de la
fibra
(mm)

PLA
6%

46.974 ±
16.706

0.046 ±
0.016

1.292 ± 0.274

1.271±0.276

0.161

PLA
7%

193.017
± 30.772

0.343 ±
0.003

2.292 ±0.243

4.988 ±
0.676

0.170

PLA
10%

468.664
±
101.000

1.030 ±
0.289

0.750 ± 0.063

9.627 ±
1.677

0.127

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45

Figura 12. Ensayo de Tensión. Promedio del módulo de Young con una velocidad de 1mm/seg.
ANOVA 1 vía, p < 0.05.

Figura 13. Ensayo de Tensión. Promedio de tensión a la última carga. Velocidad de 1mm/seg.
ANOVA 1 vía, p < 0.05.

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46
4.5 DETERMINACIÓN DEL ÁNGULO DE CONTACTO EN LOS
ANDAMIOS DE PLA AL 6, 7, Y 10 %
En la Tabla 2 se muestran las imágenes y los datos procesados por Image J de
las fotografías del goteo en las membranas de PLA al 6, 7, y 10%. En los datos se
aprecian los valores del ángulo de contacto de la gota de agua con los andamios de
PLA, los valores presentados van de los 69.002° a los 78.581°, lo cual representa que
los andamios presentan hidrofilicidad, ya que el ángulo presente en las muestras es
menor a 90°.

Tabla 2. Ángulo de contacto de los andamios de PLA al 6, 7, y 10%.

ÁNGULO
IZQUIERDO

ÁNGULO
DERECHO

IMAGEN

PLA
6%

78.581°

77.979°

PLA
7%

69.002°

68.506°

PLA
10%

77.345°

77.821°

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47
4.6 DEGRADACIÓN IN VITRO
Se realizó un estudio de degradación con la finalidad de entender si los andamios
hilados de PLA en concentraciones de 7, y 10% que mostraron el mejor
comportamiento fisicoquímico, mecánico y como se mostrará más adelante en
comportamiento celular, mantienen su integridad en cuanto a su estructura fibrilar.
Los resultados de las andamios hilados de PLA por MEB usando el análisis de
imágenes, para asociar la degradación que sufren los andamios con las distribuciones
de los diámetros de las fibras después de la prueba de degradación in vitro, nos indican
que el diámetro de las fibras mostró que hubo una tendencia homogénea en aumentar
el diámetro de las fibras en ambas concentraciones sometidas al estudio si las
compramos con los diámetros reportados inicialmente en la Figura 9, donde el diámetro
de las nanofibras de PLA al 7% fue de 407 nm y para el 10% fue de 599 nm.
Los diámetros encontrados cuando los andamios fibrilares de PLA se someten a
degradación en una solución de agua bidestilada se observa que incrementan entre un
10 a un 20% con respecto al inicial reportado; donde el valor encontrado para el
andamio de PLA al 7% tuvieron diámetros promedios de 655 nm y de 650 nm para el
andamio de PLA al 10% (Figura 14).
El mismo comportamiento fue encontrado en cuando los andamios se sometieron a
degradación en la solución de Ringer, donde se obtuvieron diámetros promedios de
fibra de 565 nm para el andamio de PLA al 7% y de 645 nm para el andamio de PLA al
10% (Figura 14).
Por otro lado, se pudo observar en las micrografías que la morfología de las fibras no

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48
era uniforme y algunas parecen hinchadas y parcialmente conglomeradas al comprarse
con las fibras homogéneas reportadas en la figura 9.

Figura 14. Micrografías de MEB y estimación de la distribución del diámetro del tamaño de las
fibras de los andamios hilados de PLA al 7% (E y F) y 10% (G y H) después de 100 días de
degradación in vitro en solución Ringer y de los andamios después de 100 días de degradación
in vitro en agua bidestilada para el 7% (A y B) y para las del 10% (C y D).

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49
4.7 ENSAYOS BIOLÓGICOS
4.7.1 Adhesión celular
En la Figura 15, se muestra la evaluación de la adhesión de las células hBM-
MSC después de un periodo de incubación de 2, 4, y 24 h. Los resultados se presentan
como porcentajes de células adheridas a la superficie de los andamios hilados de PLA
en relación con el cultivo control que son las células hBM-MSC adheridas a la superficie
del plato de cultivo celular. Como se puede observar la adhesión de las células hBM-
MSC se ve favorecida en los andamios hilados de PLA en las diferentes
concentraciones (6, 7, y 10 %) cuando se comparan con las películas delgadas de PLA
(6, 7, y 10 %) a los diferentes tiempos de incubación encontrándose diferencias
estadísticamente significativas a una p<0.05. Al tiempo de 2 h los andamios hilados de
6% y 10 % de PLA muestran un aumento de ~80% en la adhesión celular con respecto
al control y de ~30% más en comparación con las películas delgadas a las mismas
concentraciones (6% y 10 %) de PLA. En cuanto al andamio hilado de 7% de PLA se
observa una respuesta de adhesión celular con valores de ~40% con respecto al
control, sin embargo, en comparación con la película delgada a la misma concentración
se observa que existe una mejor respuesta en la adhesión celular (~ más del 20%). A
las 4 h podemos observar que en el andamio hilado al 6 % de PLA existe un aumento
de más del 100% en la adhesión celular con respecto al control y de ~66% más en
comparación con las películas delgadas a la misma concentración (6 %) de PLA. Sin
embargo, los andamios hilados de 7% y 10 % de PLA muestran un aumento de 60% y
70% en la adhesión celular con respecto al control y de ~20% y 40% más en
comparación con las películas delgadas a las mismas concentraciones (7 y 10 %) de

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50
PLA. A las 24 h se observa un comportamiento similar donde el andamio hilado al 6%
de PLA excede en ~30% más en la respuesta de adhesión celular con respecto al
control y de ~70% más en comparación con las películas delgadas a la misma
concentración de 6% de PLA. Sin embargo, los andamios hilados de 7% y 10%
muestran un aumento de ~70 y 90% en la adhesión celular con respecto al control y de
~20% más en comparación con las películas delgadas. Estos resultados nos indican
que la respuesta de adhesión celular se incrementa en los andamios con fibras en
rangos nanométricos la cual, también es un parámetro de que la superficie no es toxica
para las células mesenquimales derivadas de médula ósea.

%
d
e
A
d
h
e
s
ió
n
c
o
n
R
e
s
p
e
c
to
a
l
C
o
n
tr
o
l
P D 6 % AH 6 % P D 7 % AH 7 % P D 1 0 %AH 1 0 %
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
T ie m p o d e C u ltiv o C e lu la r
2 h o r a s 4 h o ra s 2 4 h o ra s
*
*

Figura 15. Adhesión celular de las células BM-MSC en las películas delgadas (PD) y en los
andamios hilados (AH) de PLA a diferentes concentraciones (6, 7, y 10%) después de un
periodo de incubación de 2, 4, y 24 horas de cultivo. Los asteriscos denotan la diferencia
estadísticamente significativa a p<0.05 entre los andamios hilados y las películas delgadas de
PLA a las diferentes concentraciones (6, 7, y 10%) sintetizadas.

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51
4.7.2 Interacción célula-material
En la Figura 16 se puede apreciar la distribución de las células hBM-MSC sobre
los andamios hilados de PLA a las diferentes concentraciones

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