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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POR MI R
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FACULTAD DE QUÍMICA
MÉXICO, D.F. 2012
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
PRESENTA
JOSÉ DAVID ZAYAS GUTIÉRREZ
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES
CONTROLADAS DE LABORATORIO
QUÍMICO DE ALIMENTOS
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: MARíA DEL CARMEN WACHER RODARTE 
VOCAL: Profesor: GLORIA DíAZ RUíZ 
SECRETARIO: Profesor: FRANCISO RUíZ TERÁN 
1er. SUPLENTE: Profesor: NORMA ANGÉLICA CAMACHO DE LA ROSA 
2° SUPLENTE: Profesor: BEATRIZ RUÍZ VILLAFÁN 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO 324, CONJUNTO E, FACULTAD DE QUÍMICA, CIUDAD UNIVERSITARIA, UNAM. 
 
ASESOR DEL TEMA: 
MARÍA DEL CARMEN WACHER RODARTE 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
MARÍA TERESA FLORES ESPINOSA 
SUSTENTANTE: 
JOSÉ DAVID ZAYAS GUTIÉRREZ 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1 
2. ANTECEDENTES .......................................................................................................... 2 
2.1.PULQUE........................................................................................................... 2 
2.2.HISTORIA DEL PULQUE ................................................................................. 2 
2.3.TIPOS DE FERMENTACIÓN DEL PULQUE Y MICROORGANISMOS 
RELACIONADOS ................................................................................................... 7 
2.3.1.FERMENTACIÓN............................................................................... 8 
2.3.1.1.FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA......................................... 8 
2.3.1.2.FERMENTACIÓN 
LÁCTICA…..……………………………………………......................... 9 
2.3.1.3.PRODUCCIÓN DE MATERIAL EXTRACELUAR ................. 9 
2.4.PROCESOS DE ELABORACIÓN DEL PULQUE ........................................... 10 
2.4.1.COMPOSICIÓN QUÍMICA ............................................................... 13 
2.4.2.FERMENTACIÓN DEL AGUAMIEL ................................................. 14 
2.4.3.MICROORGANISMOS IDENTIFICADOS EN EL PULQUE 
EMPLEANDO TÉCNICAS MOLECULARES ............................................. 15 
2.4.3.1.Lactobacillus sp. HOMOFERMENTATIVO Y 
HETEROFERMENTATIVO ....................................................................... 16 
2.4.3.2.Leuconostoc mesenteroides .............................................. 19 
2.4.3.3.Zymomonas mobilis ........................................................... 20 
2.4.3.4.LEVADURAS ..................................................................... 21 
 2.4.3.5.Acetobacter spp. ................................................................ 22 
2.5.CAMBIOS EN EL PERFIL SENSORIAL DEL AGUAMIEL DURANTE LA 
FERMENTACIÓN COMO CONSECUENCIA DE LOS MICROORGANISMOS 
INVOLUCRADOS EN LA FERMENTACIÓN ........................................................ 23 
2.6.PRODUCCIÓN INDUSTRIAL ......................................................................... 24 
3.JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................... 28 
4.HIPÓTESIS................................................................................................................... 28 
5.OBJETIVOS GENERALES ........................................................................................... 29 
6.OBJETIVOS PARTICULARES ..................................................................................... 29 
7.SIMBOLOGÍA ............................................................................................................... 30 
 
 
 
 
8.MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 31 
8.1. MATERIA PRIMA .......................................................................................... 31 
8.2.MÉTODO DE FERMENTACIÓN .................................................................... 32 
8.2.1.PREPARACIÓN DEL AGUAMIEL .................................................... 32 
8.2.2. PREPARACIÓN DE LA SEMILLA .................................................... 32 
8.2.3.FERMENTACIONES ........................................................................ 32 
8.2.3.1.MUESTREO ...................................................................... 35 
8.2.3.1.1.ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO ............................ 35 
8.2.3.1.1.1.AISLAMIENTO DE BACTERIAS 
LÁCTICAS Y LEVADURAS ..................................... 36 
8.2.3.1.1.2.TINCIÓN DE GRAM PARA BAL ............ 36 
8.2.3.1.1.3.PRUEBA DE CATALASA PARA BAL .... 36 
8.2.3.1.1.4.CONSERVACIÓN DE BAL .................... 36 
8.2.3.1.1.5.TINCIÓN DE GRAM PARA LEVADURAS
................................................................................ 36 
8.2.2.1.1.6.CONSERVACIÓN DE LEVADURAS ..... 36 
8.2.3.1.2.CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES DURANTE LA 
FERMENTACIÓN DEL AGUAMIEL .................................... 37 
8.2.2.1.2.1.AZÚCARES TOTALES. MÉTODO 
FENOL-SULFÚRICO .............................................. 37 
8.2.2.1.2.2.AZÚCARES REDUCTORES. MÉTODO 
DEL ÁCIDO 3-5, DINITROSALISÍLICO ................... 38 
8.2.2.1.2.3.CUANTIFICACIÓN DE ETANOL ........... 38 
8.2.3.1.3. EVALUACIÓN SENSORIAL ............................... 39 
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN..................................................................................... 42 
9.1. CARACTERIZACIÓN DE AGUAMIEL Y SEMILLA ........................................ 42 
9.2. FERMENTACIÓN .......................................................................................... 48 
9.2.1.CAMBIOS EN EL pH ........................................................................ 48 
9.2.2.CAMBIOS ENLOS ºBrix ................................................................... 51 
9.2.3.CAMBIOS EN LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES 
REDUCTORES ......................................................................................... 54 
9.2.4.CAMBIOS EN LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES TOTALES .. 57 
9.2.5.CAMBIOS EN LA CONCENTRACIÓN DE ETANOL ........................ 62 
 
 
 
 
9.2.6.CUANTIFICACIÓN DE GRUPOS MICROBIANOS ........................... 65 
9.2.6.1.LEVADURAS ..................................................................... 65 
9.2.6.2.BAL .................................................................................... 69 
9.2.6.3.DETERMINACION DE ENTEROBACTERIAS EN EL 
AGUAMIEL .................................................................................... 73 
9.2.6.4. DETERMINACION DE COLIFORMES EN EL AGUAMIEL 76 
9.2.7.EVALUACIÓN SENSORIAL ............................................................. 79 
10. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 84 
11. ANEXO I .................................................................................................................... 85 
11.1 AZÚCARES REDUCTORES ......................................................................... 85 
11.2 AZÚCARES TOTALES .................................................................................87 
11.2 CUANTIFICACIÓN DE ETANOL ................................................................... 87 
12. ANEXO II ................................................................................................................... 92 
12.1 COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO .......................................... 92 
12.1.1.PDA................................................................................................ 92 
12.1.2. MRS .............................................................................................. 92 
12.1.3. VRBA ............................................................................................ 92 
12.1.4. VRBGA .......................................................................................... 93 
12.1.5. GELPA .......................................................................................... 93 
12.1.6. APT SEMISÓLIDO ........................................................................ 93 
13. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 94 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
A Dios por guiarme en el buen camino a lo largo de toda mi vida y 
permitirme realizar mis sueños. 
 
A la máxima casa de estudios, la UNAM, por ser mi segundo hogar, que ha 
hecho de mí un gran profesionista, un hombre con buenos valores y sobre todo 
por creer en mí. 
 
A la Dra. Carmen Wacher por ser un ejemplo a seguir y permitirme ser parte 
de su grupo de trabajo, siendo para mí un gran honor. 
 
A Teresa Flores por su ayuda en la realización de todo el proyecto, sus 
consejos y su valiosa amistad. 
 
Ala Dra. Gloria Díaz por brindarme su apoyo incondicional durante el 
desarrollo de todo el proyecto. 
 
A mis compañeros de laboratorio por brindarme nuevas experiencias y 
apoyo en los momentos que lo necesité. 
 
A Nekutli® S. A. de C. V., al Ing. Manuel Cruz, por su apoyo para la 
realización de este trabajo y por la beca que se me otorgó; a la Maestra en 
Ciencias Isabel Gracia, que llevó a cabo la administración del proyecto y al Ing. 
Abel Blancas, de la planta piloto en el Instituto de Investigaciones Biomédicas de 
la UNAM por el apoyo en la realización de este proyecto. 
 
 
 
 
DEDICATORIAS 
A mis padres por creer en mí, apoyarme y estar a mi lado en todo momento 
sin condición. Siendo mi inspiración, mi luz y motivo de seguir adelante. 
 
A Sara y Alfredo, mi hermana y cuñado, por comprender mi forma de 
pensar y aconsejarme durante toda mi trayectoria estudiantil siempre preocupados 
por mi bienestar. 
 
A César y Adriana, mi hermano y cuñada, por ser un ejemplo a seguir 
demostrándome que todo es posible en la vida si el esfuerzo es constante. 
 
A Joshua, Rafael, César, Matías y a un ángel que está en camino, mis 
sobrinos, por hacerme reír y hacerme disfrutar cada detalle de la vida. 
 
A toda mi familia de todas partes, tíos, primos, sobrinos, que aunque estén 
lejos siempre están en mí. 
 
A Areli por darme inspiración y fuerza. Por ser una persona especial en mi 
vida, por su apoyo en todo momento y ayudarme a realizar mis sueños. 
 
A todos mis amigos que han sido parte de mi vida desde la primaria, 
secundaria, preparatoria y universidad por los mejores momentos de mi vida, su 
apoyo en los momentos difíciles, celebraciones de todo tipo, y su valiosa amistad; 
ya que sin ellos no podría haber llegado hasta donde estoy ahora.
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 1 
 
1. INTRODUCCIÓN. 
En México el pulque ha perdido el gusto de ser consumido por los jóvenes; 
sin embargo, en la actualidad hay interés por el consumo de la bebida en otras 
partes del mundo. Existe también demanda por parte de mexicanos que viven en 
el extranjero, así como de consumidores de productos naturales. Sería necesario 
entonces buscar la forma de producirlo en condiciones controladas, con el objeto 
de garantizar su inocuidad, ofrecer una calidad constante y de esta manera 
hacerlo más atractivo para el consumidor. 
El interés del consumo del pulque se da principalmente en la zona sur de 
los Estados Unidos de América (California y Texas),donde se populariza cada día 
más entre quienes gustan de conocer un tipo de bebidas diferente a las que 
tradicionalmente son ofrecidas en tabernas, restaurantes de lujo o servidas en la 
casa (Zendejas, 2001). 
Hoy en día, se observa una nueva visión de la bebida. El pulque es 
promovido en restaurantes y en festivales gastronómicos en un intento por 
recuperar viejas tradiciones y está llegando a ser popular entre la gente joven. 
La hipótesis de este trabajo es: si se estandarizan la concentración del 
inóculo (la semilla) y las condiciones de fermentación entonces será posible 
obtener un pulque con características deseadas y agradable para el consumidor, 
por lo que el objetivo general fue obtener en el laboratorio pulque similar al 
tradicional, estandarizando la concentración del inóculo y las condiciones de 
fermentación. Se evaluó la variabilidad en las características bioquímicas 
(concentración de etanol, carbohidratos totales y reductores), fisicoquímicas 
(grados Brix, pH) y microbiológicas (bacterias ácido lácticas y levaduras, 
enterobacterias y coliformes totales) de pulques elaborados con el método 
tradicional, a una concentración de inóculo y de temperatura determinadas, se 
aislaron y conservaron bacterias lácticas y levaduras que predominan. Se 
determinó finalmente la similitud de los pulques elaborados en el laboratorio con 
pulques comerciales, mediante evaluación sensorial. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 2 
 
2. ANTECEDENTES. 
2.1. Pulque. 
El pulque es una bebida alcohólica fermentada mexicana, elaborada y 
consumida principalmente por las comunidades rurales del centro de México. Su 
producción fue dominada por los aztecas, existen reportes que indican que se 
comenzó a producir por el año 990 a. C. (Tovar et al., 2008). La materia prima 
utilizada es el aguamiel, que es la savia del maguey, que es una planta oriunda de 
México que pertenece al orden de las Amarilidáceas y al género Agave, del cual 
se usan varias especies: Agave salmiana, Agave ferox, Agave hookori, Agave 
americana, Agave atrovirens y Agave mapisaga, pero principalmente del aguamiel 
deAgave atrovirens. Estas variedades de agave crecen en zonas semiáridas y 
templadas, suelos pobres, con lluvias escasas e irregulares. 
El pulque tiene un olor penetrante y consistencia blanca y espesa. Para 
"curarlo" se le agregan ingredientes como piña, apio, limón, cacahuate o naranja, 
entre muchos otros. 
Los principales estados donde se produce el pulque son: Estado de México, 
Tlaxcala, Hidalgo, Querétaro, México D.F., Puebla, San Luis Potosí y 
Morelos(López-Munguía et al., 2004). 
2.2. Historia del Pulque. 
En el México antiguo, el pulque tenía una presencia dominante en la vida 
diaria de las poblaciones indígenas, así como una influencia decisiva en rituales 
religiosos y de guerra. Esto ha sido ilustrado en códices prehispánicos y 
posthispánicos (figuras 1 y 2). 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 3 
 
 
Figura 1. Un viejo ofreciendo el pulque a Quetzalcóatl (LA INTERPRETACIÓN ASTRONÓMICA DE LOS 
MITOS, Stanislaw Iwaniszewski, México, http://www.fundacion-
jung.com.ar/forum/astronomiamitica.htm, fecha de consulta 7/Nov/2011). 
 
 
Figura 2. Toltécatl, uno de los dioses del pulque (LA INTERPRETACIÓN ASTRONÓMICA DE LOS 
MITOS, Stanislaw Iwaniszewski, México, http://www.fundacion-
jung.com.ar/forum/astronomiamitica.htm, fecha de consulta 7/Nov/2011). 
 
Los Aztecas distinguieron diversos tipos del pulque: el metoctli o vino de 
Agave, el iztacoctli o vino blanco, y el teoctli o vino ceremonial o de dios, y el 
nombre de poliuhquioctli que fue dado al vino descompuesto con un sabor y un 
olordesagradables. 
http://www.fundacion-jung.com.ar/forum/astronomiamitica.htm
http://www.fundacion-jung.com.ar/forum/astronomiamitica.htm
http://www.fundacion-jung.com.ar/forum/astronomiamitica.htm
http://www.fundacion-jung.com.ar/forum/astronomiamitica.htm
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 4 
 
Cuando cayó el imperio Azteca, el pulque perdió su importancia religiosa, 
pero conservó su importancia como suplemento alimenticio y sustituto del agua. 
La bebida llegó a ser profana y su consumo fue introducido a las ciudades, 
principalmente a la Ciudad de México. 
El pulque era una bebida tradicional y profundamente arraigada, y parte de 
la dieta alimenticia de los mexicanos junto con los frijoles, las tortillas y el picante. 
Así mismo, era utilizado con fines medicinales. Las mujeres que acababan de 
tener un hijo lo ingerían para producir más leche. Además del agave de los 
magueyes, se extraía un producto llamado Agaván, utilizado como remedio para la 
próstata y la vejiga. 
Durante el siglo XIX era la bebida predilecta de muchos mexicanos (ricos y 
pobres, jóvenes y adultos) y podía encontrarse en las mesas de la mayoría de los 
hogares del país. Para el inicio del siglo XX, era común toparse con alguna 
pulquería en las ciudades y pueblos de México (Ramírez, 2007). Las fachadas de 
estos establecimientos estaban pintadas con murales y, en el interior, casi todas 
tenían el piso cubierto de aserrín, o de tierra apisonada, porque uno de los rituales 
de los bebedores consistía en derramar un poco de éste, para que la "madre 
tierra" también "saciara su sed" (Figura 3). 
Figura 3. Pulquería final del siglo XIX y principios del XX Santa Cecilia Acatitlán Edo. México (Base México maravilloso, 
http://www.pbase.com/osita/staceciliaacatitlan&page=10, 10/Abril/2010). 
 
http://www.pbase.com/osita/staceciliaacatitlan&page=10
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 5 
 
 Para degustarlo se usaban contenedores de vidrio de diferentes tamaños, 
según la cantidad. Eran comunes las macetas, cañones y chivitos, de dos, uno y 
medio litro, respectivamente; las catrinas (en forma de taza), los tornillos (como 
caballitos de tequila) y los jarros de barro. Además de las pulquerías, este 
fermentado también se podía disfrutar en los restaurantes familiares, 
especialmente los domingos, detallan las escenas costumbristas. 
El pulque alcanzó su mayor auge durante el porfiriato, al ponerse en 
marcha los ferrocarriles, que lo transportaban a los principales centros urbanos de 
la República. Así, de la carga diaria que llegaba a la ciudad de México, 30 por 
ciento lo constituía esta bebida. En esa época existían entre mil 200 y mil 500 
pulquerías en la capital; eran tantas, que fue necesario reglamentar su ubicación, 
y establecer una separación de por lo menos 60 metros (Ramírez, 2007).En 
promedio, los adultos consumían tres litros diarios, cantidad razonable si se toma 
en cuenta que sólo tiene cuatro grados de alcohol, pues la mayor parte es agua. 
Sin embargo, existieron campañas en su contra por parte de la Iglesia Católica, el 
gobierno e intelectuales, al manifestar que "embrutecía" a la población; se trataba 
de campañas antialcohólicas en todo el mundo occidental. 
Por ello, el pulque se consideró degradante, pues se argumentaba la 
pérdida de la belleza e inteligencia de los indígenas; esa idea fue fomentada por 
algunos diputados federales y la prensa católica, donde se publicaba una columna 
titulada Tragedias de Pulquería, que hacía alarde de los crímenes y desgracias 
ocurridas en esos lugares. 
Según una encuesta realizada por Daniel Cosío Villegas, citó el especialista 
Mario Ramírez Rancaño, en ese entonces el gasto mensual de las familias, 
cuando el salario mínimo era de 30 pesos diarios, se dividía en el alquiler, cinco 
pesos; el consumo de pulque, otros cinco; para la carne, 3.5; para ropa, cuatro; y 
cinco más para maíz, frijol y chile. Además, el 17 por ciento de las viviendas eran 
pulquerías, es decir, de cuatro mil 600 establecimientos en la Ciudad de México, 
990 se dedicaban a la venta de la bebida por la mañana, y 369 por la noche. En 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 6 
 
contraste, existían 703 cantinas, mil 143 expendios de tabaco, 364 carnicerías, y 
sólo 41 panaderías. 
El declive del consumo sucedió al término de la Revolución. Para 1882, de 
todas las bebidas consumidas en México, 94 por ciento era pulque, en 1929 el 
porcentaje se redujo a 58, y después de la Segunda Guerra Mundial fue de 48. 
En 1913 vio su fin casi definitivo, pues Calles llevó a cabo campañas 
antipulqueras. Con el reparto de tierras, en el periodo de Venustiano Carranza, se 
divide la zona de Apan, donde estaban las haciendas pulqueras (Ramírez, 2008). 
Durante el periodo presidencial del general Lázaro Cárdenas (1934-1940) 
se organizaron campañas antialcohólicas que tuvieron como finalidad suprimir por 
completo su ingestión. 
Hasta hace algunos años, se podía encontrar pulque sólo en algunos sitios 
de la ciudad, y los expendios en los estados o municipios eran cada vez menos 
numerosos, pues su consumo había disminuido notablemente; incluso, había 
quienes jamás lo habían probado y ni siquiera lo conocían(Ramírez, 2007). 
En la primera mitad del siglo 20, la producción de pulque constituyó una 
industria rentable en México, pero posteriormente decayó. Además, el consumo 
del pulque tuvo un decremento dramático frente a la cerveza, la cual representa el 
54% del total del consumo de etanol comparado con el 11% del pulque. Como 
resultado, el cultivo del agave pulquero fue desalentado porque ya no 
representaba una fuente rentable de ingresos (Ortíz-Basurto, 2008). 
Anteriormente, existía la Cámara de la Industria Pulquera, pero para 
mediados del siglo XX tal organismo había desaparecido, y no hay ya ningún dato 
que dé cuenta del pulque. 
La industria pulquera como tal ha desaparecido; no obstante, aún quedan 
restos de ella en algunos puntos de la ciudad; son pocos los lugares donde aún se 
expende y la tradición se ha perdido. Una de las principales razones, es que los 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 7 
 
magueyes de los que se extraía no habían sido renovados y, en su lugar, se 
sembraron otro tipo de plantas. Fue así como poco a poco se hizo menos popular 
y, por lo tanto, ahora se consume menos. 
Actualmente, el pulque persiste como bebida típicamente popular, y hasta 
hace poco se vendía solamente en pulquerías (Tovar, 2008). Su consumo varía 
con la edad y el tipo de consumidor, así como la ocasión (festividades o cultos). 
Para la población de bajos ingresos, el pulque sigue siendo la bebida estimulante 
preferida y se sabe que forma parte importante de su dieta diaria, debido a su 
aporte de vitaminas y de aminoácidos esenciales (Steinkraus, 1997; Ramírez et 
al., 2004).Estudios especializados afirman que el pulque es una de las bebidas 
alcohólicas más completas y balanceadas, debido a sus niveles vitamínicos y 
energéticos (Peña-Espinosa, 2004; Martínez- Salvador et al., 2005). 
Los estudios de Sánchez Marroquín sentaron las bases para la producción 
de esta bebida a nivel comercial y su planta de Santa María Tecajete, Hidalgo, 
constituyó el primer intento de industrialización del pulque. 
En la actualidad, el pulque se considera una bebida artesanal; sin embargo, 
las nuevas generaciones no cargan con los estigmas y las leyendas negras y, por 
ello, es el momento más viable para rescatarlo. (Chipréz, 2011). 
2.3. Tipos de fermentaciones en el Pulque y microorganismos 
relacionados. 
Aunque se han identificado más de 30 géneros de microorganismos en el 
pulque, 2 principales fermentaciones ocurren en el proceso: una fermentación 
alcohólica que se lleva a cabo por Zymomonas mobilis y varios géneros de 
levaduras como Saccharomyces cerevisiae,una fermentación láctica llevada a 
cabo por bacterias ácido lácticas y una producción de material extracelular 
comúnmente conocida como ―fermentación viscosa‖ en la cual Leuconostoc 
mesenteroides produce dextranas, que da a la bebida una textura viscosa. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 8 
 
Aunque se hayan hecho algunos experimentos para producir el pulque de cultivos 
puros, su producción todavía es realizada por la fermentación espontánea. 
 
2.3.1. Fermentación. 
La fermentación es un proceso catabólico de oxidación incompleta, 
totalmente anaeróbico, siendo el producto final un compuesto orgánico. Estos 
productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones. 
El proceso de fermentación es anaeróbico ya que se produce en ausencia 
de oxígeno; ello significa que el aceptor final de los electrones del NADH 
producido en la glucólisis no es el oxígeno, sino un compuesto orgánico que se 
reducirá para poder re-oxidar el NADH a NAD+. El compuesto orgánico que se 
reduce (acetaldehído, piruvato) es un derivado del sustrato que se ha oxidado 
anteriormente. 
Las fermentaciones pueden ser: naturales, cuando las condiciones 
ambientales permiten la interacción de los microorganismos y los sustratos 
orgánicos susceptibles; o artificiales, cuando el hombre propicia condiciones y el 
contacto referido (Lopatinsky, 2008). 
2.3.1.1. Fermentación alcohólica. 
La fermentación alcohólica (denominada también como fermentación del 
etanol o incluso fermentación etílica) es un proceso biológico de fermentación en 
plena ausencia de aire (oxígeno) originado por la actividad de algunos 
microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general 
azúcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el 
almidón, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol 
(CH3-CH2-OH), dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de 
ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular 
energético anaeróbico. El etanol resultante se emplea en la elaboración de 
http://es.wikipedia.org/wiki/Catabolismo
http://es.wikipedia.org/wiki/Oxidaci%C3%B3n
http://es.wikipedia.org/wiki/Anammox
http://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgeno
http://es.wikipedia.org/wiki/Electr%C3%B3n
http://es.wikipedia.org/wiki/Nicotinamida_adenina_dinucle%C3%B3tido
http://es.wikipedia.org/wiki/Gluc%C3%B3lisis
http://es.wikipedia.org/wiki/Compuesto_org%C3%A1nico
http://es.wikipedia.org/wiki/Piruvato
http://es.wikipedia.org/wiki/Catabolismo
http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n
http://es.wikipedia.org/wiki/Aire
http://es.wikipedia.org/wiki/Hidrato_de_carbono
http://es.wikipedia.org/wiki/Glucosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Fructosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Sacarosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Almid%C3%B3n
http://es.wikipedia.org/wiki/Alcohol
http://es.wikipedia.org/wiki/Etanol
http://es.wikipedia.org/wiki/Carbono
http://es.wikipedia.org/wiki/Carbono
http://es.wikipedia.org/wiki/Carbono
http://es.wikipedia.org/wiki/Carbono
http://es.wikipedia.org/wiki/Hidroxilo
http://es.wikipedia.org/wiki/Di%C3%B3xido_de_carbono
http://es.wikipedia.org/wiki/Gas
http://es.wikipedia.org/wiki/Adenos%C3%ADn_trifosfato
http://es.wikipedia.org/wiki/Metabolismo
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 9 
 
algunas bebidas alcohólicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, 
etc.(Lea et al., 2003).Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar también 
etanol mediante la fermentación a nivel industrial a gran escala para ser empleado 
como biocombustible (Vázquez , 2007). 
Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno son 
microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran 
medida al sabor de los productos fermentados (Kun, 2006). Una de las principales 
características de estos microorganismos es que viven en ambientes 
completamente carentes de oxígeno (O2), máxime durante la reacción química, 
por esta razón se dice que la fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico. 
2.3.1.2. Fermentación láctica. 
Fermentación láctica es un proceso biológico por el cual los azúcares como la 
glucosa, fructosa y sacarosa, se convierten en energía celular y en lactato siendo 
el subproducto metabólico. Se trata de una reacción de fermentación anaeróbica 
que se produce en algunas bacterias y células de animales, tales como células 
musculares, en ausencia de oxígeno (Fermented Fruits and Vegetables, FAO 
Corporate Document Repository, 1998, fecha de consulta: 8/Nov/2011). 
 
 
Si el oxígeno está presente en la célula, muchos organismos pasarán por 
alto la fermentación anaeróbica y se someten a respiración celular, sin embargo, 
los organismos anaerobios facultativos fermentarán y experimentarán la 
respiración en presencia de oxígeno (Campbell et al., 2005). La lactato 
deshidrogenasa cataliza la interconversión de piruvato y lactato con 
interconversión concomitante de NADH y NAD +. 
2.3.1.3. Producción de material extracelular. 
La ―fermentación viscosa‖ en el pulque está dada principalmente por la 
bacteria Leuconostoc mesenteroides el cual produce dextranas, que le dan al 
http://es.wikipedia.org/wiki/Bebida_alcoh%C3%B3lica
http://es.wikipedia.org/wiki/Vino
http://es.wikipedia.org/wiki/Cerveza
http://es.wikipedia.org/wiki/Sidra
http://es.wikipedia.org/wiki/Cava
http://es.wikipedia.org/wiki/Fruta
http://es.wikipedia.org/wiki/Cereal
http://es.wikipedia.org/wiki/Sabor
http://es.wikipedia.org/wiki/Alimentos_fermentados
http://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgeno
http://es.wikipedia.org/wiki/Anaer%C3%B3bico
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 10 
 
pulque una textura gomosa, sin embargo esta producción de material extracelular 
no es una fermentación, ya que no hay ganancia de ATP. 
La biosíntesis de dextranas y levanos no implica sistemas multienzimáticos, 
azúcares activados o lípidos portadores intermediarios. Su producción es 
enteramente extracelular e implica enzimas que catalizan la polimerización de 
polisacáridos (Torres, 2010). 
La dextrana es un polímero de D-glucosa compuesta principalmente por 
enlaces α(1-6) en la cadena linear y α(1-2), α(1-3) y/o enlaces ramificados α(1-4). 
Además de Leuconostoc, varias especies de Lactobacillus y Streptococcus 
sintetizan una dextransacarasa extracelular y en algunos casos una 
glicosiltransferasa responsable de la síntesis de dextranas a partir de sacarosa. La 
estructura química de la dextrana es altamente específica a la glucosiltransferasa. 
Por ejemplo, la dextrana producida por L. mesenteroides NRRL B-512F contiene 
95% de enlaces α(1-6) y 5% de α(1-3) considerando que esta cepa produce dos 
glucosiltransferasas (Chellapandian et al, 1998). 
2.4. Proceso de elaboración del Pulque. 
Cuando el maguey tiene la edad adecuada (8 a 12 años de plantado), se 
observa un adelgazamiento en la base del ―meyolote‖ (cogoyo o yema central) y 
se procede a efectuar la operación de ―capado‖. De no caparse, del cogoyo surge 
la flor. La cantidad y calidad de aguamiel depende de un capado en el tiempo 
adecuado. El ―tlachiquero‖ efectúa la operación que consiste en cortar con un 
cuchillo las púas laterales de las pencas hasta llegar al corazón, para después 
cortar éste y extraerle un trozo del extremo inferior, que los campesinos llaman 
―huevo‖ (figura 4). 
Es conveniente cortar la flor antes de que crezca, porque una vez que crece 
la composición de azúcares del aguamiel cambia, es decir, la concentración de 
estos disminuye, debido a que la producción de la flor requiere energía la cual es 
obtenida de los azúcares presentes. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 11 
 
 
Posteriormente, el maguey se deja reposar hasta por 6 meses y se inicia 
entonces el ―raspado‖ y extracción del aguamiel. 
 
El aguamiel es obtenido por succión con ayuda del―acocote‖ (figura 5), que 
es una calabaza larga agujereada por ambos extremos que se usa para extraer 
por succión el aguamiel del maguey(Diccionario de la Lengua Española, Real 
Academia Española,http://buscon.rae.es/draeI/SrvltGUIBusUsual?LEMA=acocote, 
consultado 8/Nov/2011).Este instrumento no ha cambiado desde la época 
prehispánica e impide el contacto del aguamiel con los labios del tlachiquero que 
lo succiona. Actualmente existen acocotes fabricados de plástico para facilitar su 
lavado. 
 
Figura 4. Proceso de elaboración del pulque. (A) Maguey en producción, (B) Raspado de la penca de maguey, (C) Aguamiel 
(Cervantes-Contreras et al., 2007). 
http://buscon.rae.es/draeI/SrvltGUIBusUsual?LEMA=acocote
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Después de la extracción, se raspa el fondo del tronco con un raspador de 
metal (figura 5) y se tapa el centro de la planta con pencas y piedras para proteger 
el jugo de la lluvia e insectos. Cada planta puede producir durante 6 meses, dos 
veces al día, una cantidad diaria de 3 a 4 L de aguamiel, después de lo cual la 
planta perece. El aguamiel es vaciado en las ―castañas‖ o bidones de plástico para 
su transportación (López-Munguía et al., 2004). 
 
Figura 5. Tlachiquero, acocote y raspador de metal empleado en la extracción de aguamiel en Ixmiquilpan, Hidalgo. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 13 
 
2.4.1. Composición química. 
Dentro de la composicion química del aguamiel y el pulque que se observa 
en la tabla 1,la cantidad de proteina presente es baja. Igualmente el porcentaje de 
cenizas es bajo (0.2 y 0.4%). El aguamiel y el pulque tiene oligoelementos y 
vitaminas las cuales se encuentran en cantidades muy pequeñas. Los 
carbohidratos son los macronutrientes presentes en el aguamiel que se 
encuentran en mayor cantidad (tabla 2). 
Los principales carbohidratos identificados en el aguamiel son glucosa, 
sacarosa, fructosa y algunas pentosas (tabla 2). Las concentraciones varían 
durante el año, debido sobre todo a la presencia o ausencia de lluvias. 
 
Tabla 1. Composición química del pulque y del aguamiel (López-Munguíaet al., 2004). 
Componente Pulque Aguamiel 
Proteína (%) 0.44 0.3 
Cenizas (%) 0.2 0.4 
Calcio (mg%) 10 20 
Fósforo (mg%) 10 9 
Fierro (mg%) 0.7 - 
Tiamina (mg%) 0.02 0.02 
Piridoxina (mg%) - - 
Riboflavina (mg%) 0.03 0.04 
Niacina (mg%) 0.3 0.4 
Vitamina C (mg%) 6.2 6.7 
 
 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 14 
 
Tabla 2. Composición media del aguamiel de Tres Plantas de A. mapisaga en sus periodos de cosecha 
(Ortiz-Basurto, 2008). 
Componente Peso Medio % (en materia seca) 
Fructosa 32.4±3.9 
Glucosa 26.5±2.7 
Sacarosa 8.8±6.5 
Fructo-oligosacáridos 10.2±5.7 
Aminoácidos libres 0.26±0.05 
Proteína 3.0±0.6 
Cenizas 3.3±0.8 
 
2.4.2. Fermentación del Aguamiel. 
La fermentación del aguamiel toma lugar debido a la presencia de 
microorganismos en el ambiente o agregando el jugo del agave con el sedimento 
del pulque fermentado anterior. El ―tinacal‖ es el lugar de producción de pulque 
donde la fermentación se desarrolla en grandes tinas de madera o en los ―toros‖, 
recipientes de piel vacuna sin curtir con el pelo hacia dentro (figura 6). La 
capacidad es de 500 a 800 L. El mayordomo es el encargado de la producción. El 
pulque es inoculado con la ―semilla‖, ―nana‖, ―madre‖ o ―pie de cuba‖, lo que 
disminuye el tiempo que tomara la fermentación espontánea, de más de dos 
semanas a 36 horas. El inóculo es preparado mediante fermentación natural de 
aguamiel de alta calidad, en tinas de 25 L protegidos generalmente con manta de 
cielo. La producción del inóculo llega a tomar de 25 a 30 días (López-Munguía et 
al., 2004). 
Durante la fermentación el aguamiel se vuelve ácido, debido a la producción 
de ácido láctico y otros ácidos orgánicos. El producto final, pulque, es blanco, 
líquido, viscoso con alrededor de 45 g/L de etanol y un pH de 3.4 (Tovar, 2008). 
La complejidad del proceso fermentativo se manifiesta en la facilidad con la 
que el pulque adquiere características no deseables. Así, existe un gran número 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 15 
 
de adjetivos para la clasificación de pulques defectuosos; algunos de los cuales 
pueden relacionarse con los procesos microbiológicos: ―picado‖ (sufrió una 
fermentación láctica), ―delgado‖ (deficiente producción de dextranas), ―agrio‖ 
(excesiva fermentación láctica), ―chamalte, tlachique o aguamielado‖ (deficiente 
fermentación alcohólica), ―empachado‖ (aguamiel sin transformar por insuficiente 
inoculación), ―húmedo o desabrío‖ (aguamiel diluido por lluvias o fraudes), 
etcétera. Los fraudes son por adulteraciones donde se agregan fuentes de 
azúcares distintas a las contenidas en el aguamiel, como por ejemplo; organillo 
molido (un cactus), sacarina, linaza, sacarosa e intencionalmente alcohol. 
 
Figura 6. Corrida o pulque maduro (“Crónicas del sabor” Hernández, 2010) 
 
2.4.3. Microorganismos identificados en el pulque empleando técnicas 
moleculares. 
 
Recientemente Escalante et al. (2004) determinaron la diversidad 
bacteriana del pulque mediante la secuenciación del gen 16r ARN. Observaron la 
dominancia de especies de Lactobacillus (80.97%) e identificaron por primera vez 
en el pulque las especies Lactobacillus cepa ASF36 y L. acidophilus, las cuales 
forman parte de la microbiota del intestino en animales y humanos, y otras ya 
descritas fueron Lactobacillus acetotolerans, L. hilgardii, L. kefir, L. plantarum, 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 16 
 
Leuconostoc pseudomesenteroides, Microbacterium arborescens, Flavobacterium 
johnsoniae, Acetobacter pomorium, Gluconobacter oxydans y Hafnia alves 
(Escalante et al., 2004). 
 
Lappe-Oliveras et al (2008), encontraron LAB (Lactobacillus spp., L.brevis, 
L. plantarum, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum, L. mesenteroides ssp. 
mesenteroides), Zymomonas mobilis ssp. mobilis, no-Saccharomyces (Candida 
spp., C. parapsilosis, Clavisporalusitaniae, Hanseniaspora uvarum, Kluyveromyces 
marxianus, Kluyveromyces lactis, Pichiamembranifaciens, Pichia spp. Torulaspora 
delbrueckii) y levaduras Saccharomyces (S. bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus) 
en el pulque. En el proceso industrializado se usa un cultivo mixto como iniciador. 
 
2.4.3.1. Lactobacillus sp. homofermentativo y heterofermentativo. 
Lactobacillaceae es una familia de bacterias del ácido láctico. Son bacilos 
Gram positivos. Mediante metabolismo anaerobio producen la fermentación de los 
glúcidos, transformándolos en láctico. Se encuentran regularmente en la mucosa 
del tracto intestinal de humanos y de otros animales, en alimentos y productos 
lácteos, así como en jugos de productos vegetales fermentados. 
El género Lactobacillus está comprendido por bacterias en forma bacilar de 
0,5 -1,2 y 1,0 -10,0 μm, comúnmente se asocian en cadenas cortas, son 
anaerobias facultativas ó microaerófilas, catalasa y citocromo negativos (Foo et 
al., 1993). Excepcionalmente pueden poseer motilidad, se mueven ayudados por 
flagelos perítricos. Los lactobacilos son auxótrofos quimioorganotróficos, necesitan 
medios complejos para su crecimiento, degradan la sacarosa para producir 
lactato. La temperatura óptima de crecimiento de los lactobacilos está entre 30 y 
40 °C (Foo et al., 1993; Morishita et al., 1981). Su hábitat natural es variado 
pudiéndolos encontrar en el aparato gastrointestinal de mamíferos y aves, incluyen 
alimentos de origen vegetal y animal (Callon et al., 2004; Holt et al., 1998). 
 
http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivos_l%C3%A1cticos
http://es.wikipedia.org/wiki/Anaerobio
http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n
http://es.wikipedia.org/wiki/Gl%C3%BAcidos
http://es.wikipedia.org/wiki/Mucosahttp://es.wikipedia.org/wiki/Tracto_intestinal
http://es.wikipedia.org/wiki/Productos_l%C3%A1cteos
http://es.wikipedia.org/wiki/Productos_l%C3%A1cteos
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 17 
 
Lactobacillus es un género de bacterias Gram positivas anaerobias 
facultativas, denominadas así debido a que la mayoría de sus miembros convierte 
lactosa y otros monosacáridos en ácido láctico. Normalmente son benignas e 
incluso necesarias, habitan en el cuerpo humano y en el de otros animales, por 
ejemplo, están presentes en el tracto gastrointestinal y en la vagina. Muchas 
especies son importantes en la descomposición de material vegetal. La producción 
de ácido láctico hace que su ambiente sea ácido, lo cual inhibe el crecimiento de 
bacterias dañinas. 
 La fermentación de hexosas se realiza por tres vías metabólicas principales 
(Fig. 7) (Kandler, 1983). Los lactobacilos homofermentativos como son 
estreptococos y pediococos utilizan la vía de glucosa EMP, y se caracterizan por 
degradar fructosa –1, 6–difosfato aldolasa en dos triosasfosfatos, los cuales son 
convertidos en lactato (Kandler, 1983; Hiyama et al., 1968). Teóricamente esta vía 
origina a partir de un mol de glucosa, dos moles de lactato. Sin embargo, el 
rendimiento real a condiciones de laboratorio e incluso de operación es de 
aproximadamente el 90% del rendimiento teórico (Bruno–Bárcena et al., 1999; 
Akeberg et al., 1998). Algunas especies del género Lactobacillus son 
heterofermentativos facultativos; en condiciones de anaerobiosis y microaerobiosis 
se comportan como homofermentativos, y en condiciones aeróbicas forman 
además de ácido láctico, ácido acético, acetoína y peróxido de hidrógeno (Li et al., 
2006; Porro et al., 1999). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Vías metabólicas en la fermentación de hexosas por bacterias lácticas (Kandler, 1983). 
http://es.wikipedia.org/wiki/Lactosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Monosac%C3%A1ridos
http://es.wikipedia.org/wiki/Tracto_gastrointestinal
http://es.wikipedia.org/wiki/Vagina
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 18 
 
Las bacterias heterofermentativas obligadas como por ejemplo el género 
Leuconostoc, oxidan la glucosa 6 fosfato a 6 fosfogluconato. El producto final de 
su metabolismo es una mezcla equimolar de lactato, CO2 y etanol ó acetato 
(Kandler, 1983). 
 
Sanchéz-Marroquín realizó experimentos en aguamiel enriquecido con 
glucosa, usando Lactobacillus homofermentativos aisaldos del pulque, los cuales 
asimilaron 53% del azúcar presente, dando un rendimiento de 141% de acido 
láctico. Donde las condiciones óptimas de crecimiento son 28ºC y un pH 6.6 a 6.9. 
(Sanchéz-Marroquín et al, 1953). 
 
El seguimiento de una fermentación del pulque bajo condiciones de 
laboratorio mediante un enfoque polifásicohan mostrado la presencia de bacterias 
lácticas (LAB) no reportadas priviamente para esta bebida, entre las que destacan 
las LAB homofermentativas Leuconostoc citreum, L. mesenteroides y L. kimchi y 
las LAB homofermentativas del género Lactobacillus acidophilus y 
heterofermentativas L. mesenteroides, Lactococcus lactis subsp. lactis (Escalante 
et al, 2008). De los microorganismos aislados del pulque, diversas cepas de L. 
acidophilus han sido reportadas como LAB con capacidades probióticas utilizadas 
para la elaboración de diferentes productos comerciales (Mattila-Sndholm et al, 
2002). 
 
Los productos formados por estas especies heterofermentativas que crecen 
bajo las mismas condiciones que las homofermentativas, son el ácido láctico, 
etanol y dióxido de carbono en algunos cultivos, y en otros ácido láctico, acido 
acético y dióxido de carbono. 
 
Lactobacillus fermenti es heterofermentativo y es capaz además, de dar 
buen crecimiento a temperaturas elevadas (45 ºC, 113 ºF). 
 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 19 
 
 
2.4.3.2. Leucnostoc mesenteroides. 
 
Leuconostoces un género de bacteria láctica Gram positivas de la familia 
Leuconostocaceae. Las especies de Leuconostoc tienen generalmente forma de 
cocoide ovoide y a menudo forman cadenas. Son resistentes intrínsecamente a la 
vancomicina y catalasa-negativos (lo cual los distingue de Staphylococcus). Son 
heterofermentativos, capaces de producir dextrana partir de la sacarosa. 
Aunque inicialmente se consideraban comensales no-patógenos en 
humanos, desde la descripción en 1985 del primer caso de bacteremia por 
Leuconostoc spp., algunas especies son también capaces de producir infecciones 
a los seres humanos (Sonia et al, 2002). Se consideran patógenas oportunistas 
aunque en muy baja frecuencia, que se pueden encontrar en pacientes 
críticamente enfermos, inmunocomprometidos y con infecciones intra-
hospitalarias. Generalmente, se asocian a bacteriemia por dispositivos intra-
vasculares y al uso de nutrición parenteral total. Sin embargo, también se han 
descrito otras infecciones asociadas, dentro de las que se cuentan meningitis, 
osteomielitis, infección del torrente sanguíneo, de vías urinarias y peritonitis 
(Vagiakou-Voudris et al, 2008). 
Debido a que estas enfermedades son raras, los kits de identificación 
comerciales estándar a menudo no identifican estos organismos (Kulwichit et al, 
2007). 
Leuconostoc, junto con otras bacterias del ácido láctico tales como 
Pediococcus y Lactobacillus, se utiliza para la fermentación del repollo en la 
elaboración de chucrut. Durante este proceso, los azúcares de las coles frescas 
son transformados en ácidos lácticos que le dan un sabor agrio y permiten que se 
conserven en buenas condiciones. 
http://es.wikipedia.org/wiki/Leuconostocaceae
http://es.wikipedia.org/wiki/Vancomicina
http://es.wikipedia.org/wiki/Catalasa
http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus
http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n
http://es.wikipedia.org/wiki/Dextrano
http://es.wikipedia.org/wiki/Sacarosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteriemia
http://es.wikipedia.org/wiki/Meningitis
http://es.wikipedia.org/wiki/Osteomielitis
http://es.wikipedia.org/wiki/Infecci%C3%B3n
http://es.wikipedia.org/wiki/Aparato_excretor
http://es.wikipedia.org/wiki/Peritonitis
http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivos_l%C3%A1cticos
http://es.wikipedia.org/wiki/Lactobacillus
http://es.wikipedia.org/wiki/Chucrut
http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_l%C3%A1ctico
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 20 
 
También se considera a Leuconostoc oenos principal responsable del inicio 
de los procesos de fermentación maloláctica muy apreciada en los procesos 
vinícolas. 
Es el causante de la produccion de dextranos (fermentación viscosa)en el 
aguamiel y la produccion de un jarabe de alta viscosidad. 
 
Cantidades apreciables de dextranos pueden ser obtenidas del aguamiel 
con variaciones en el contenido de sacarosa añadido de 4.6 a 7.5 % despues de 
incubar por 24 horas a 23°C (Sanchéz-Marroquin et al, 1953). 
 
2.4.3.3. Zymomonas mobilis. 
 
Ádemas de las bacterias lácticas mencionadas anteriormente Zymomonas 
mobilis se ha visto que tiene un papel importante en la fermentación del pulque. 
En cuanto a la produccion de etanol y también ácido láctico y acetil carbinol lo que 
le da el aroma característico al pulque. 
 
Zymomonas mobilis es una bacteria que pertenece a la género 
Zymomonas. Es importante por su capacidad para producir bioetanol, la cual 
supera a la levadura en algunas aspectos. Originalmente se aisló de bebidas 
alcoholicas como el vino de palma africano, el pulque mexicano (Cervantes-
Contreras et al., 2007) y también como contaminación en sidra y cerveza en 
paises europeos. 
 
Z. mobilis degrada el azúcar a piruvato usando la ruta metabolica Entner- 
Doudoroff. El piruvato es entonces fermentado a etanol y dioxido de carbono como 
unicos productos (análogos a la levadura). 
 
A partir de diferentes muestras de pulque obtenidas de un procesoartesanal en el estado de Tlaxcala, México, se recuperó e identificó un consorcio 
microbiano formado por Saccharomyces sp., Lactobacillus sp. y Zymomonas sp., 
http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n_malol%C3%A1ctica
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 21 
 
el cual es responsable de la fermentación ácida, alcohólica y viscosa del pulque 
(Cervantes-Contreras et al., 2007). 
 
2.4.3.4. Levaduras. 
 
Las levaduras aisladas del pulque son del género Saccharomyces sp. Su 
nombre significa saccharo: azúcar y myces: hongo. Se encuentran naturalmente 
en uvas, frutos, melazas, mieles y aguas azucaradas. Tiene un metabolismo 
aeróbico y anaeróbico. El alcohol es producido por vía anaeróbica (Glicólisis 
anaeróbica) se produce etanol, CO2 y células como producto de la fermentación 
(Cervantes-Contreras, 2008). 
 
La fuente principal de producción de energía en la levadura, 
Saccharomyces cerevisiae, es la glucosa y la glicolisis es la vía general para la 
conversión de glucosa a piruvato, por la que la producción de energía en forma de 
ATP esta acoplada a la generación de intermediarios y a la potencia de reducción 
en forma de NADH por las rutas biosintéticas (Feldmann, 2005). En la figura 8 se 
muestra la ruta metabólica empleada por las levaduras en condiciones aeróbicas y 
anaeróbicas. Donde los principales productos de la fermentación anaeróbicas son 
etanol, CO2, glicerol y succinato. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 22 
 
 
Durante la fermentación alcohólica de azúcares, las levaduras re-oxidan el 
NADH a NAD+ en dos pasos de reacción del piruvato, el cual es primeramente 
descarboxilado por la piruvato descarboxilasa posteriormente por una reducción 
del acetaldehído, catalizado por la alcohol deshidrogenasa (ADH). Concomitante, 
el glicerol se genera del fosfato dihidroacetona para asegurar la producción de 
este compuesto (Feldmann, 2005). 
 
2.4.3.5. Acetobacter spp. 
 
Acetobacteres un género de bacterias del ácido acético caracterizado por 
su habilidad de convertir el alcohol (etanol) en ácido acético en presencia de aire. 
Hay muchas especies en este género y también otras bacterias son capaces de 
formar ácido acético bajo varias condiciones; pero todas son reconocidas por esta 
habilidad característica (Madigan, 2005). 
Figura 8. Metabolismo de las levaduras bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Modificado de Yeast metabolism, 
Feldmann, 2005. 
http://es.wikipedia.org/wiki/Acetobacteria
http://es.wikipedia.org/wiki/Etanol
http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ac%C3%A9tico
http://es.wikipedia.org/wiki/Aire
http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 23 
 
 
Acetobacter spp. posee los mecanismos funcionales del ciclo del ácido 
tricarboxílico y por ellos puede oxidar el acetato a CO2. Cuando crece a expensas 
de etanol, convierte rápidamente este sustrato, como ya se mencionó, en ácido 
acético, el cual es oxidado más lentamente hasta completar el proceso, por lo que 
se les denominan superoxidantes (Stanier et al., 1992). 
 
Se ha encontrado en pulque Acetobacter pomorium AJ001632 formando 
parte de un consorcio microbiano (Cervantes- Contreras, 2007). 
 
2.5. Cambios en el perfil sensorial del aguamiel durante la fermentación 
como consecuencia de los microorganismos involucrados en la 
fermentación. 
 
Cada uno de estos microorganismos contribuye al cambio en el perfil 
sensorial de aguamiel hasta llegar al producto final (Pulque). Los cambios 
químicos que se presentan en el sustrato (Aguamiel) propician el desarrollo y 
sucesión de diversos grupos microbianos, como sigue: 1) bacterias productoras de 
ácido láctico de los géneros Leuconostoc y Lactobacillus (especies homo y 
heterolácticas), que incrementan la acidez de la bebida; 2) Levaduras no-
Saccharomyces y Saccharomyces y bacterias (Zymomonas mobilis ssp. mobilis) 
que transforman los azúcares en etanol y otros metabolitos secundarios que 
repercuten en el perfil sensorial de la bebida, 3) bacterias productoras de 
dextranas (Leuconostoc spp.) que confieren la viscosidad al pulque; y 4) bacterias 
acéticas (Acetobacter spp.) que junto con las BAL acidifican la bebida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 24 
 
2.6. Producción industrial. 
 
En los años sesenta se desarrollaron tecnologías tendientes entre otras cosas, a 
la estandarización del proceso de producción de pulque. 
 
 Materia prima: el aguamiel pasteurizado 
 Inóculo: se prepara un inóculo con cultivos puros de S. cerevisiae y Z. 
mobilis para le fermentación alcohólica, Lactobacillus spp. para la 
fermentación láctica y L. mesenteroides como agente de viscosidad. 
 Fermentación: para una planta con capacidad de producir 50 000 litros 
diarios de pulque, los autores proponen 10 tanques de 5 000 litros y 5 
tanques de 10 000 litros. Los primeros para una etapa de fermentación y los 
segundos para una etapa de maduración. Dado que se menciona que el 
proceso dura de 48 a 72 horas, la producción debe ser mucho menor que la 
mencionada. Además todos los tanques se esterilizan y la fermentación se 
controla entre 20 y 25°C (López-Munguía, 2004). 
 
En el mercado el precio del pulque es bajo muy variado ya que en algunas 
zonas puede valer de 3 a 8 pesos el litro. El consumo del pulque fresco está 
disminuyendo considerablemente, sin embargo el estudio de mercado que se tiene 
en relación al pulque envasado presenta mucha rentabilidad (Abundis-Vagas, 
2007; BANCOMEXT, 2007). 
La exportación del pulque enlatado es ahora un negocio de alto crecimiento 
(tabla 3), a pesar de la dificultad que presenta la producción, por el delicado y 
largo proceso que implica la siembra, cuidado y destino final del maguey (Notimex, 
2008). 
 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 25 
 
Tabla 3. Compañías productoras de pulque enlatado y embotellado en México (BANCOMEXT, 2007). 
Compañía Producción Exportación al 
extranjero 
Marca Estado 
Torre Grande 300 mil latas por 
mes 
90% a E. U. A. Hacienda 1881 Tlaxcala, Puebla 
e Hidalgo 
Poliqhui 800 mil botellas* 50 mil botellas 
mensuales a 
China y 150 
botellas a E. U. 
A. 
Cool Pasion Epazoyucan e 
Hidalgo 
Pulquemex 250 mil cajas de 
pulque enlatado* 
Principalmente a 
E. U. A. 
La Lucha Pachuca e 
Hidalgo 
Néctar del Razo * Canadá, E. U. A., 
Colombia e 
Inglaterra 
Néctar del Razo Tlaxcala 
*No se especifica la cantidad de productos por tiempo. 
Con base en un estudio de mercado en Europa y Asia se ha llegado a la 
conclusión de que el pulque enlatado podría competir de manera exitosa, en una 
presentación innovadora que cumpla con estándares de calidad mundial (Colunga-
García y May-Pat, 1993; Franco, 1995; BANCOMEXT, 2007). Para lograr esto es 
necesario producirlo en condiciones controladas. 
Néctar del Razo, S.A. de C.V. es una empresa mexicana que se constituye 
en 1990 por dos socios. Su función principal es la producción y comercialización 
de pulque enlatado de diversos sabores. El año clave para esta organización es 
1996, cuando los socios consiguieron de forma exitosa la fórmula para enlatarlo 
conservando sus propiedades, y comenzaron a comercializarlo en el mercado 
nacional y a distribuirlo en el extranjero. Actualmente se ha estructurado un nuevo 
corporativo de carácter internacional llamado Torre Grande INC, integrado por 
cinco socios. Este cumple con la función de ser la matriz controladora y sede de 
las oficinas comerciales de la empresa. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 26 
 
Esta empresa cuenta con la experiencia de haber iniciado anteriormente su 
proceso de internacionalización mediante la exportación a países como Estados 
Unidos y Alemania, además de contar con un cuerpo directivocapaz y experto y 
cuyos esfuerzos se enfocan en lograr el crecimiento y posicionamiento de la 
marca en un contexto global (Sánchez, 2005). 
Desde hace 8 años el pulque se exporta en lata a Estados Unidos, 
Alemania y ahora Ucrania. En nuestro país solo se consume en zonas productoras 
como Tlaxcala, Estado de México, Hidalgo y Puebla. Donde el 90% de la 
producción en lata se va a EU y el resto a Alemania y Ucrania (Pulque mexicano, 
http://www.sipse.com/noticias/44303-pulque-mexicano-conquista-ucrania.html, 
2010). 
La compañía además de tener pedidos en países europeos, próximamente 
está a punto de ingresas al mercado de Corea (El pulque enlatado, un éxito en EU 
y Europa, http://www.publimetro.com.mx/noticias/el-pulque-enlatado-un-exito-en-
eu-y europa/pjff!nRmRSZeFAfvjYS5PWuObPg/, 2010). 
La empresa poblana ―Pulque Hacienda 1881‖ dedicada al enlatado de 
pulque, exporta el 90 por ciento de su producción a Estados Unidos, y el 10 por 
ciento restante lo comercializa en Alemania, Austria y México, y están próximos a 
ingresar al mercado chino y ruso. 
El 90 por ciento de la producción se exporta a Estados Unidos lugar donde 
la bebida ha tenido una importante aceptación ya que muchos centros nocturnos 
lo utilizan como base para la preparación de cócteles y bebidas, el resto de la 
producción se comercializa en Alemania y Austria, así como en algunos estados 
de México como Jalisco, Estado de México y por supuesto Puebla. 
Actualmente, dicha empresa está en planes de expansión a Rusia, China y 
Portugal, por lo que no se descarta que se esté comercializando la bebida a esos 
países. Es importante señalar que por sus características energéticas, la bebida 
http://www.sipse.com/noticias/44303-pulque-mexicano-conquista-ucrania.html
http://www.publimetro.com.mx/noticias/el-pulque-enlatado-un-exito-en-eu-y%20europa/pjff!nRmRSZeFAfvjYS5PWuObPg/
http://www.publimetro.com.mx/noticias/el-pulque-enlatado-un-exito-en-eu-y%20europa/pjff!nRmRSZeFAfvjYS5PWuObPg/
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 27 
 
está en competencia con productos como el Red Bull y algunas otras 
energizantes, por lo que pese a tener un 5 por ciento de alcohol no se le puede 
comparar con la cerveza u otras bebidas alcohólicas (Enlatadora de pulque 
poblana exporta exitosamente a Europa, Contraparte, 
http://www.contraparteinformativa.com/despliegue-noticia.php?-Noticias-Puebla-
Econom%EDa-Enlatadora-de-pulque-poblana-exporta-exitosamente-a-
Europa&id_noticia=22587, 2009). 
Tecnología e innovación en Pulque Industrial S. A. de C.V. es una empresa 
de productores que procesa pulque de calidad, estandarizado y embotellado, de 
sabor natural y frutas (tuna, maracuyá, litchi, café) para exportación y para 
consumo nacional. Cuenta con 5000 hectáreas de maguey pulquero, 500 de ellas 
en certificación orgánica. 
La empresa tiene una capacidad instalada para procesar 40, 000 litros 
diarios de pulque en botella de 355 ml. (120, 000 botellas al día), con centros de 
acopio en Puebla (Zacatlán, Aquixtla, Ixtacamaxtitlan y Guadalupe Victoria), 
Tlaxcala (Sanctorum y Españita) y estado de México (Otumba), los productores 
interesados adquieren partes sociales de la empresa con lo que aseguran la venta 
de su producción y además son parte de la empresa. (Tecnología e innovación en 
Pulque Industrial S. A. de C.V., mexico.acambiode.com empresas que 
intercambian,http://mexico.acambiode.com/empresa/tecnologia-e-innovacion-en-
pulque-industrial-s-a-de-c-v_147594, fecha de consulta 9/Nov/2011). 
 
Uno de los productos que esta empresa comercializa es el pulque 
envasado. El producto es llamado ―Total Maguey‖ cuyos primeros lotes se 
obtuvieron hace poco más de seis años. 
Los primeros lotes de Total Maguey fueron enviados tanto a Estados 
Unidos como a Japón (Pulque a Japón II: Los hombres del altiplano, El Universal 
online, http://www.eluniversal.com.mx/columnas/55433.html, 2006). 
 
http://www.contraparteinformativa.com/despliegue-noticia.php?-Noticias-Puebla-Econom%EDa-Enlatadora-de-pulque-poblana-exporta-exitosamente-a-Europa&id_noticia=22587
http://www.contraparteinformativa.com/despliegue-noticia.php?-Noticias-Puebla-Econom%EDa-Enlatadora-de-pulque-poblana-exporta-exitosamente-a-Europa&id_noticia=22587
http://www.contraparteinformativa.com/despliegue-noticia.php?-Noticias-Puebla-Econom%EDa-Enlatadora-de-pulque-poblana-exporta-exitosamente-a-Europa&id_noticia=22587
http://mexico.acambiode.com/empresa/tecnologia-e-innovacion-en-pulque-industrial-s-a-de-c-v_147594
http://mexico.acambiode.com/empresa/tecnologia-e-innovacion-en-pulque-industrial-s-a-de-c-v_147594
http://www.eluniversal.com.mx/columnas/55433.html
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 28 
 
3. JUSTIFICACIÓN. 
El pulque es una bebida fermentada mexicana que ha perdido el gusto de 
ser consumido por los jóvenes; sin embargo existe un gran interés del consumo 
del pulque en Estados Unidos de América, principalmente en la zona sur, donde 
una porción importante de la población son mexicanos. Además se populariza 
cada día más entre quienes gustan de conocer un tipo de bebidas diferente a las 
que tradicionalmente son ofrecidas en tabernas, restaurantes de lujo o servidas en 
la casa (Zendejas, 2001). 
Este interés actual por el consumo de esta bebida en otras partes del mundo, 
permite buscar la forma de producirlo en condiciones controladas. De esta forma 
será posible garantizar su inocuidad, ofrecer una calidad constante y de esta 
manera hacerlo más atractivo para el consumidor. 
4. HIPÓTESIS. 
Ya que el pulque es producido tradicionalmente por la fermentación de 
aguamiel que se inocula con una ―semilla‖, su calidad será variable, pero si se 
utiliza aguamiel recién extraído del agave y se estandarizan la concentración de 
inóculo y las condiciones de fermentación, será posible obtener una bebida 
parecida al pulque y agradable para el consumidor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 29 
 
5. OBJETIVOS GENERALES. 
Determinar la posibilidad de obtener pulque en condiciones de laboratorio 
usando el método tradicional, a partir de aguamiel y de semilla de los productores. 
6. OBJETIVOS PARTICULARES. 
Determinar la variabilidad en las cuentas microbianas de bacterias ácido 
lácticas y levaduras usando aguamiel y semillas de diferentes procedencias. 
 
Determinar la variabilidad en los aspectos bioquímicos (etanol, azúcares 
totales y reductores), fisicoquímicos (ºBrix y pH) y microbiológicos (cuentas y 
aislamiento de bacterias lácticas y levaduras, cuentas de enterobacterias) usando 
aguamiel y semillas de diferentes procedencias. 
Evaluar la calidad sanitaria del pulque mediante la cuenta microbiana de 
coliformes totales. 
Correlacionar los datos obtenidos con una evaluación sensorial. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 30 
 
7. SIMBOLOGÍA. 
A lo largo del trabajo escrito estarán presentes las siguientes claves 
algunas de ellas identificarán cada una de las fermentaciones elaboradas: 
 
 ºBrix: Grado Brix. Es el por ciento de sólidos disueltos en un producto 
derivado de las frutas o de un líquido azucarado. 
 °C: Grado centígrado. 
 APT: Agar All Purpose Tween por sus siglas en inglés. 
 BAL: Bacterias ácido lácticas. 
 COAH: Segunda fermentación con aguamiel de Coahuila. 
 DNS: Dinitrosalisílico. 
 EDO1: Tercera fermentación con aguamiel del Pueblo de San 
Nicolás de Guadalupe San Felipe del Progreso Edo. de México 
 EDO2: Cuarta fermentación con aguamiel del Pueblo de San Nicolás 
de Guadalupe San Felipe del Progreso Edo. de México. 
 GELPA: Agar glucosa, extracto de levadura, peptona bacteriana. 
Para conservación de levaduras. 
 IXMI: Primera fermentación con aguamiel de Ixmiquilpan, Hidalgo. 
 log10 UFC/mL: logaritmo en base diez de las unidades formadoras 
de coloniaspor mililitro. 
 MRS: Agar M.R.S. desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe para 
proveer un medio que pudiera evidenciar un buen crecimiento de 
lactobacilos y otras bacterias ácido lácticas (García et al., 2003). 
 p: Un p valor es la probabilidad de que la hipótesis nula (Ho) sea 
cierta. 
 PET: Tereftalato de polietileno. 
 PDA: Agar papa dextrosa. 
 QDA®: Análisis descriptivo cuantitativo. 
 VRBA: Agar rojo violeta bilis. 
 VRBGA: Agar rojo violeta bilis glucosa. 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 31 
 
8. MATERIALES Y MÉTODOS. 
La figura 10 resume la forma general en que se elaboró el pulque en 
condiciones controladas de laboratorio, desde la recepción del aguamiel y semilla, 
caracterización, pasteurización del aguamiel, almacenamiento de semilla, vaciado 
del aguamiel en los garrafones, inoculación con las semillas correspondientes, 
condiciones de fermentación, hasta el muestreo de parámetros; físico-químicos, 
sensoriales, microbiológicos y bioquímicos. Sin embargo la descripción más 
detallada de todo el proceso se presenta más adelante. 
8.1. Materia prima. 
Se utilizaron aguamiel y semillas del Estado de México y de Hidalgo (Tabla 1). 
El aguamiel recién extraído se colocó en bidones de 4 litros, los cuales se 
colocaron en hieleras con hielo y se transportaron inmediatamente al laboratorio 
en la Ciudad Universitaria. En un caso se usó aguamiel procedente del estado de 
Coahuila, el cual fue pasteurizado y enviado al D.F. por avión. 
Tabla 4. Materia prima, procedencia y condiciones de transporte. 
Fermentación Procedencia Transporte 
Semilla Aguamiel 
1 Hidalgo Hidalgo 15L Bidones de plástico de 4 
litros en hieleras con 
hielo. 
2 Hidalgo (congelada a -
10 ºC de la fermentación 
1 y propagada con el 
Aguamiel de Coahuila) 
Coahuila (Pasteurizado y 
congelado de 
Biomédicas) 15L 
Se transportó en 
recipientes de plástico 
totalmente congelado en 
hieleras con hielo 
3 Pueblo de San Nicolás 
de Guadalupe San 
Felipe del Progreso Edo. 
De México 
Pueblo 15L Bidones de plástico de 4 
litros en hieleras con 
hielo. 
4 Pueblo de San Nicolás 
de Guadalupe San 
Felipe del Progreso Edo. 
De México 
Pueblo 9L Bidones de plástico de 4 
litros en hieleras con 
hielo. 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 32 
 
8.2. Método de fermentación. 
8.2.1. Preparación del aguamiel. 
El aguamiel fue pasteurizado inmediatamente después de haberlo recibido, en 
un pasteurizador Elecrem, a temperatura y tiempo ya establecidos. Posteriormente 
a la pasteurización, el aguamiel se almacenó en dos recipientes de plástico de 
10.1 L, en los cuales se vertieron 7 L del aguamiel únicamente para las 
fermentaciones IXMI, COAH y EDO1; y 4 L para la fermentación EDO2, los 
recipientes se mantuvieron a 4°C en el cuarto frío del laboratorio 324. 
En la fermentación COAH el aguamiel congelado proveniente del Estado de 
Coahuila y almacenado en congelación (-20 °C) en el Instituto de Investigaciones 
Biomédicas, se mantuvo en el cuarto frío a 4°C para descongelarlo y poderlo 
emplear en la fermentación. 
8.2.2. Preparación de la semilla. 
Inicialmente la semilla utilizada para IXMI proveniente de Hidalgo fue congelada a 
-65°C, posteriormente se descongeló para usarla de inóculo en la fermentación 
COAH. Antes de ser inoculada esta semilla fue propagada en aguamiel en dos 
fases: En la Fase 1 se preparó el preinóculo en aguamiel con 10.1°Brix, al 10% de 
semilla descongelada, y se incubó a 30°C durante 24h. En la fase 2 se preparó un 
inóculo al 10% a partir del preinóculo de la fase 1, en Aguamiel con 11.1 °Brix 
incubado a 30°C durante 24h y posteriormente fue utilizado como semilla al 2% 
del volumen total 
8.2.3. Fermentaciones. 
Se utilizaron el aguamiel y la semilla recién recolectados, ambos del mismo lugar 
de procedencia (Tabla 1), excepto en el caso del aguamiel de Coahuila, que se 
usó semilla de Ixmiquilpan, Hidalgo. 
Se realizaron las fermentaciones en recipientes de PET (garrafones) de 10,1 
litros, desinfectados con una solución de cloro al 0.5 %, agitando el garrafón para 
que llegara a todos los lugares dentro del garrafón, dejándola actuar durante 5 
minutos, posteriormente se le agregó agua estéril a cada recipiente para eliminar 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 33 
 
el exceso de cloro, y se dejaron secando. Cada recipiente fue llenado con 7 L de 
aguamiel y cubiertos con un tapón de algodón y gasa estéril (Figura 9). Cada 
fermentación fue llevada a cabo a 30ºC durante 28 h. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Recipientes de PET utilizados en las fermentaciones, con tapones de algodón con gasa estériles. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 34 
 
 
Figura 10. Diagrama de bloques del proceso de fermentación. 
 
Recepción de 
Aguamiel y Semilla 
Caracterización de 
Aguamiel 
Pasteurización 
Vaciado del Aguamiel 
en Garrafones de 
plástico (7 y 4 L) 
Inoculación con 
Semillas al 2% 
Inicio de la 
Fermentación a 30ºC 
durante 28h y 
Muestreo cada 4h 
Análisis Fisico-
Químico 
pH 
ºBrix 
Evaluación Sensorial 
Analisis Sensorial 
Patricia Severiano 
QDA 
Análisis 
Microbiológico 
Cuenta en Placa 
(Levaduras, BAL, 
Enterobacterias y 
Coliformes) 
Aislamiento de 
Levaduras y BAL 
Análisis Bioquímico 
Azúcares Reductores 
Azúcares Totales 
Etanol 
Caracterización de la 
Semilla (Inóculo) 
Almacenamiento de 
(IXMI, EDO1 y EDO2*) 
a 4ºC 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 35 
 
8.2.3.1. Muestreo. 
Durante el muestreo cada garrafón se agitó con el fin de homogeneizar el 
producto para tomar la muestra. 
En cada tiempo de muestreo se tomaron 500 µl para la determinación de la 
cuenta en placa de los diferentes medios de cultivo. Por otro lado se tomó 1 mL de 
muestra y se guardó en un microtubo de 1.5 mL estéril y se congeló a -10 °C (para 
cuantificación de alcohol). Se tomó 1 mL de muestra y se guardó en un microtubo 
de 1.5 mL estéril y se congeló a -10 °C (para cuantificación de carbohidratos 
reductores y totales). 
Se tomaron 100 µL para medir °Brix en un refractómetro (Fisher 0-32% Japón) 
y 7 mL para medir pH (potenciómetro JENWAY 3020pH Meter), en tubos de 
centrífuga de 15 mL. 
Para los análisis de DNA se tomaron 30 mL y se congelaron en tubos Falcon 
de 60 mL a -10°C. 
A las 24 y 28h de la fermentación se congeló una muestra (200 mL) de EDO2, 
para su posterior evaluación sensorial, dos días después de haber sido 
almacenada. 
8.2.3.1.1. Análisis Microbiológico. 
Para la determinación de la cuenta en placa se utilizaron los medios PDA para 
levaduras, MRS para LAB, VRBA para coliformes y VRBGA para enterobacterias. 
Se homogenizó la muestra de aguamiel fermentado agitando el garrafón, se 
tomaron 500 µl del producto fermentado y se hicieron diluciones seriadas en agua 
peptonada al 0.1 %. Para inocular las cajas se tomaron 100 µL de las diluciones 
correspondientes para cada medio y se sembró superficialmente con ayuda de un 
asa metálica en forma de triángulo. (Aquiahuatl, 2004; NOM-092-SSA1-1994). 
Los medios PDA y MRS se incubaron a 30° C durante 24 h y se realizaron las 
cuentas. Los medios VRBGA y VRBA se incubaron a 37°C durante 24 h. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 36 
 
8.2.3.1.1.1. Aislamiento de bacterias lácticas y levaduras. 
Para el caso de las bacterias lácticas se observó la morfología macroscópica 
de las colonias en los medios MRS tomando en cuenta el tamaño, forma, color, 
tipo de borde, brillo y se realizaron las siguientes pruebas: 
8.2.3.1.1.2. Tinción de Gram para BAL. 
En cultivos jóvenes (24h) para observar morfología microscópica y pureza de 
los aislados. 
8.2.3.1.1.3. Prueba de catalasa para BAL. 
Se colocó una gota de peróxido de hidrógeno en un portaobjetos, 
posteriormente se tomó una asadade la colonia y se colocó sobre la gota. La 
presencia de burbujas indica que la prueba es positiva; por lo tanto, el 
microorganismo posee la enzima catalasa. Solo se seleccionaron las colonias que 
dieron una prueba negativa ya que las LAB son catalasa negativa. 
8.2.3.1.1.4. Conservación de BAL. 
Los aislados de bacterias lácticas se inocularon en el medio semisólido APT y 
se incubaron a 30ºC por 24 h. Después se conservaron a 4ºC. 
Para el caso de las levaduras se observó la morfología macroscópica de las 
colonias en los medios PDA tomando en cuenta el tamaño, forma, color, tipo de 
borde, brillo y se realizaron las siguientes pruebas: 
8.2.3.1.1.5. Tinción de Gram para identificación de 
levaduras. 
En cultivos jóvenes (24h) para observar morfología microscópica y pureza de 
los aislados. 
8.2.3.1.1.6. Conservación de levaduras. 
Los aislados de levaduras se inocularon en el inclinado GELPA (Composición 
por 100 ml: Dextrosa 2g, extracto de levadura 0,5g, peptona bacteriana 1,0 g, agar 
1,5g) y se incubaron a 30ºC por 24 h. Después se conservaron a 4ºC. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 37 
 
8.2.3.1.2. Cuantificación de azúcares durante la fermentación 
del aguamiel. 
8.2.3.1.2.1. Azúcares totales. Método de Fenol-Sulfúrico. 
 
El procedimiento se realizó de acuerdo a lo descrito por Dubios et al., 1956 
(Tabla 5). 
Tabla 5. Reactivos y condiciones del método fenol- sulfúrico. 
Reactivos Condición 
Ácido Sulfúrico* (H2SO4) Concentrado 
Fenol [5 %] 
*Precaución al agregar el ácido sulfúrico, reacción muy exotérmica. 
Procedimiento en Tubos de Ensayo. 
A un tubo de ensayo con 1.0 ml de muestra se agregó 1.0 ml de Fenol. Se 
agitó en Vórtex. Se agregaron 5 ml de ácido sulfúrico por las paredes del tubo* 
posteriormente se agitó en Vórtex se dejó reposar por 10 min para completar la 
reacción a temperatura ambiente. 
Se leyeron las absorbancias a 490 nm en el espectrofotómetro marca 
Spectronic modelo 21Dcon celdas de vidrio o cuarzo. Se ajustó a cero la 
absorbancia del espectro con un blanco de agua tratado bajo el mismo 
procedimiento. 
Se elaboró una curva patrón del azúcar total correspondiente en una 
concentración de 0 a 0.1 mg/ml determinando la ecuación y=mx +b y se 
compararon las absorbancias de las muestras problema con la curva patrón y se 
multiplicó por el factor de dilución realizado para cada muestra. (Dubios et al., 
1956). 
 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 38 
 
8.2.3.1.2.2. Azúcares reductores. Método del ácido 3,5- 
Dinitrosalisílico. 
 
El ensayo se realizó de acuerdo a lo descrito por Miller (1969). 
Reactivos para 100 ml de solución: 
 Hidróxido de sodio (NaOH) 1.4g 
 Ácido 3,5-Dinitrosalisílico0.75g 
 Tartrato de Sodio y Potasio 10.0g 
 Fenol 0.54g 
 Metabisulfito de Sodio 0.59g 
 
Se disolvieron en agua destilada y se dejó reposar la solución 24h antes de 
usarlo en un frasco ámbar. 
Procedimiento en tubos de ensayo consistió en que a 1mL de muestra se le 
agregaron 1.5mL de DNS. Se agitó en Vórtex y se calentó en baño María por 5 
min, posteriormente se enfrió y se agregaron 10 mL de agua destilada. 
Se leyó absorbancia a 540 nm en el espectrofotómetro marca Spectronic y 
modelo 21D, se ajustó a cero con una blanco de agua tratado bajo el mismo 
procedimiento y se elaboró una curva patrón de azúcar reductor (fructosa) en una 
concentración de 0 a 1.0 mg/mL determinando la ecuación y = mx+b, finalmente 
se compararon las absorbancias de las muestras problema con la cuerva patrón y 
se multiplico por el factor de dilución realizado para cada muestra (Miller, 1969). 
8.2.3.1.2.3. Cuantificación de Etanol. 
Se utilizó el kit de Boehringer Mannheim / R-Biopharm Enzymatic BioAnalysis / 
Food Analysis. Método UV para la determinación de etanol en productos 
alimenticios y otros materiales. El procedimiento se realizó de acuerdo con lo 
descrito por el proveedor. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 39 
 
Tratamiento de muestras antes de cuantificar etanol. 
 
Las muestras se centrifugaron y se les separó el sobrenadante a 12000 rpm / 
15 min a 4 ºC. Se calentó el sobrenadante a 80 ºC / 15 min. para la inactivación de 
enzimas proteolíticas. La concentración de etanol de las muestras debió fluctuar 
entre 0.001 y 0.06 g/L; fue necesario realizar diluciones. 
Preparación: 
Se disolvió una tableta 2 con 3 mL de la solución 1; ésta fue la mezcla de reacción 
II como se muestra en el ANEXO I (Tabla 31). 
8.2.3.1.3. Evaluación sensorial. 
Se realizó un análisis descriptivo cuantitativo (QDA), el cual es un método 
desarrollado en 1970 por el Stanford Research Institute, California, que permite 
medir las características relevantes del producto, no las deseables o convenientes 
de él. Funciona como un nexo entre el consumidor y el producto. El método de 
Análisis Descriptivo Cuantitativo da una descripción de las propiedades 
sensoriales de una muestra, compuesta por los atributos sensoriales en el orden 
de la percepción, y con la asignación de un valor de intensidad de cada atributo. 
Se utiliza una línea de escala con las palabras adecuadas de intensidad (baja o 
alta) en los extremos. Éste consiste en pedir a un grupo de personas catar ―n‖ 
productos y puntuar para cada uno la intensidad percibida de los descriptores 
sensoriales. El principal objetivo es comparar los productos desde un punto de 
vista sensorial (Cogollo, 2011). 
De las muestras de 24 y 28h se evaluó la apariencia, olor, textura y flavor, 
utilizando escalas estructuradas de 10 cm de longitud, ancladas con términos 
descriptivos y estándares físicos. La generación de descriptores, la forma de 
evaluarlos y las escalas a utilizar se desarrollaron en las sesiones de trabajo 
grupal durante el entrenamiento del panel. Los panelistas requirieron de 45 
minutos para la evaluación de una muestra por día. La recepción de los 
resultados, se hizo en cuestionarios diseñados en el software FIZZ realizando las 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 40 
 
sesiones en red.El cuestionario realizado para la prueba que fue proporcionado a 
cada uno de los jueces se muestran en las figura 11. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 41 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El pulque elaborado de la EDO2, se envió con la Dra. Patricia Severiano, 
para su evaluación sensorial donde se generaron descriptores, los cuales fueron 
evaluados y comparados con una muestra comercial proveniente de la pulquería 
―Hija de los Apaches‖ en el D.F. 
Se seleccionó y entrenó en la metodología de perfiles descriptivos de papa 
un panel de 13 miembros, 69 % mujeres, 31% hombres con un rango de edad de 
21 a 23 años, estudiantes de la Facultad de Química, UNAM. 
 
 Para cada una de uno de los atributos se realizó un análisis de varianza 
(ANOVA) de una vía y una prueba de Bonferroni múltiple para determinar si había 
diferencias significativas entre las muestras (p 0.05). Con ayuda del software 
Graphpad Prism 5 para Mac OS X Snow Leopard. Con los resultados generados 
en el análisis sensorial, se elaboraron graficas de araña donde fue posible 
identificar el valor de la intensidad de cada atributo evaluado y poder comparar las 
tres diferentes muestras. 
 
Figura 11. Cuestionario diseñados en el software FIZZ, para la evaluación sensorial del pulque. 
 
 
ELABORACIÓN DE PULQUE EN CONDICIONES CONTROLADAS DE LABORATORIO 42 
 
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 
9.1. Caracterización de aguamiel y semilla. 
 El pulque estudiado en este trabajo fue elaborado mediante el proceso 
tradicional, las fuentes de variación más importantes que se presentan a 
continuación son el sustrato (aguamiel) y el inóculo (semilla). Se compararon los 
procesos de elaboración de pulque de diferentes orígenes, con