Estudio-de-la-actividad-antimicrobiana-de-cepas-de-lactococcus-aisladas-de-alimentos-fermentados-tradicionales

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UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
Estudio de la actividad antimicrobiana de cepas de 
Lactococcus aisladas de alimentos fermentados 
tradicionales. 
 
TESIS 
PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICO DE ALIMENTOS 
 
PRESENTA 
CRISTOPHER MALDONADO BOLAÑOS 
 
 
 
 
 
 
 
Ciudad Universitaria, CD. MX. 2016 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Aurora Irma Ortegón Ávila 
VOCAL: Gloria Díaz Ruiz 
SECRETARIO: Francisco Ruiz Terán 
1er. SUPLENTE: Aleida Mina Cetina 
2° SUPLENTE: Ma. Del Carmen Wacher Rodarte 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO 324, DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA CONJUNTO 
E, FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
Asesor: Gloria Díaz Ruiz 
 
 
 
Asesor técnico: Ma. Del Carmen Wacher Rodarte 
 
 
 
Sustentante: 
 
 
 
 
Cristopher Maldonado Bolaños 
 
 
Índice 
 
1. Introducción ......................................................................................................................... 1 
2. Antecedentes ........................................................................................................................ 3 
2.1 Alimentos fermentados tradicionales ....................................................................... 3 
2.2 El Pozol ............................................................................................................................... 3 
2.2.1 Elaboración del pozol ............................................................................................. 4 
2.3Atole agrio .......................................................................................................................... 5 
2.4 Bacterias acido lácticas (BAL) ........................................................................................... 6 
2.4.1 Bacterias acido lácticas en los alimentos fermentados tradicionales ......... 6 
2.4.2. Bacterias lácticas amilolíticas en alimentos fermentados tradicionales. .. 7 
2.4.3 Uso de las BAL en la industria ................................................................................. 8 
2.4.4 Clasificación de bacterias ácido lácticas ............................................................ 8 
2.4.1 Lactococcus lactis ....................................................................................................... 9 
2.4.5 Metabolismo .................................................................................................................. 9 
2.5 Metabolitos antimicrobianos producidos por Bacterias Ácido Lácticas .................... 11 
2.5.1 Ácidos orgánicos ....................................................................................................... 11 
2.5.2 Ácido láctico ................................................................................................................ 11 
2.5.3 Peróxido de hidrógeno ............................................................................................. 12 
2.6 Bacteriocinas ........................................................................................................................ 12 
2.6.1 Clasificación de las bacteriocinas ........................................................................ 13 
2.6.2 Biosíntesis de las bacteriocinas................................................................................ 17 
2.6.2.1 Modo de acción de las bacteriocinas .............................................................. 18 
2.6.3 Aplicación de las bacteriocinas en la industria alimentaria.......................... 20 
2.7 Lantibióticos y sus aplicaciones .............................................................................. 21 
2.8 Bacterias patógenas presentes en los alimentos ........................................................ 23 
2.8.1 Listeria monocytogenes .......................................................................................... 23 
2.8.2 Escherichia coli .......................................................................................................... 24 
2.9.3 Salmonella .................................................................................................................... 26 
2.9.4 Staphylococcus aureus ........................................................................................... 26 
2.9.5 Streptococcus mutans ............................................................................................. 27 
2.9.6 P. aeruginosa .............................................................................................................. 27 
3. Justificación ...................................................................................................................... 29 
4. Hipótesis ............................................................................................................................. 30 
5. Objetivos ............................................................................................................................. 30 
6. Metodología ......................................................................................................................... 32 
6.1 Microorganismos .................................................................................................................. 32 
6.1.2 Microorganismos indicadores. .............................................................................. 32 
6.2 Reactivación de cepas y confirmación de la pureza de las cepas a estudiar. ....... 34 
6.2.1 Conservación de las cepas lácticas, patógenas y de descomposición. ... 35 
6.3 Obtención de sobrenadantes. ............................................................................. 35 
6.4 Preparación de medio de cultivo Infusión cerebro –corazón amortiguado (BHI-A) 37 
6.4.1 Preparación de placas BHI-A .................................................................................. 37 
6.4.2 Preparación de sobrecapa BHI-A .......................................................................... 37 
6.5 Preparación de cepas patógenas y de descomposición ................................... 38 
6.6 Método de difusión en agar. ..................................................................................... 39 
6.7 Tratamiento de los sobrenadantes y ensayo de actividad antimicrobiana ............... 41 
6.7.1 Neutralización de los sobrenadantes y tratamiento térmico ........................ 41 
6.7.2 Neutralización, tratamiento térmico y concentración ..................................... 41 
6.7.3 Determinación de la naturaleza proteica de las sustancias similares a 
bacteriocinas producidas BAL. ....................................................................................... 41 
6.8 Identificación de bacterias ácido lácticas por comparación de secuencias del gen 
rRNA 16S. .................................................................................................................................... 44 
6.8.1 Extracción y purificación del ADN ........................................................................ 44 
6.8.2 Amplificación mediante PCR de la región V1 del gen rRNA 16S. .............. 44 
6.8.3 Purificación de los productos de PCR ...............................................................45 
6.8.4 Obtención y Comparación de secuencias .......................................................... 46 
6.9 Prueba de reto en medio MRS de las bacterias ácido lácticas productoras 
de compuestos similares a bacteriocinas y Listeria monocytogenes ................. 46 
6.10 Prueba de viabilidad de Listeria monocytogenes en los sobrenadantes de BAL 
neutralizados y tratados térmicamente. ................................................................................. 50 
6.11 Cuantificación de proteína de los sobrenadantes ............................................ 51 
7. Resultados y discusión ...................................................................................................... 52 
7.1 Estudio de la actividad antimicrobiana de cepas de Lactococcus aisladas 
de alimentos fermentados tradicionales. ...................................................................... 52 
7.1.1 Reactivación, confirmación de pureza y conservación de las cepas BAL y 
patógenas. .............................................................................................................................. 52 
7.2 Conservación de las cepas ........................................................................................ 53 
7.3 Evaluación de la actividad antimicrobiana de las cepas de Lactococcus aisladas 
del pozol y del atole agrio. Sobrenadantes sin neutralizar y sin tratamiento térmico. .. 54 
7.4 Tratamiento de los sobrenadantes .......................................................................... 57 
7.5 Actividad de la posible bacteriocina concentrada en los sobrenadantes ... 57 
7.6 Determinación de la naturaleza proteica de los sobrenadantes con actividad 
antimicrobiana ............................................................................................................................. 57 
7.7 Identificación de bacterias ácido lácticas por comparación de secuencias del gen 
rRNA 16S ..................................................................................................................................... 60 
7.7.1 Extracción del ADN .................................................................................................. 60 
7.7.2 Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa del gen rRNA 16S 
de cepas de Lactococcus. ................................................................................................. 61 
7.7.3 Purificación de los productos de PCR ................................................................ 62 
7.7.4 Comparación de secuencias .................................................................................. 63 
7.5 Resultado de prueba de reto de BAL frente a Listeria monocytogenes en 
caldo MRS .............................................................................................................................. 65 
7.6 Prueba de viabilidad ..................................................................................................... 70 
7.7 Cuantificación de proteína por el método de Bradford ..................................... 72 
8. Conclusiones..................................................................................................................... 75 
9. Perspectivas ...................................................................................................................... 76 
ANEXOS ...................................................................................................................................... 77 
Bibliografía ................................................................................................................................... 94 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resumen 
El atole agrio y el pozol son bebidas ácidas, no alcohólicas a base de maíz 
fermentado, han sido consumidas desde la época prehispánica en el centro y 
sureste de México. La microbiota de los alimentos fermentados tradicionales es 
compleja, siendo las bacterias lácticas el grupo más importante. 
Las bacterias ácido lácticas producen diversos metabolitos que además de 
aportar en las características sensoriales de los productos en los que se 
desarrollan pueden inhibir a microorganismos patógenos. Dentro de esos 
metabolitos se encuentran las bacteriocinas que son compuestos proteicos con 
actividad antimicrobiana. El género Lactococcus es uno de más importantes, ya 
que es capaz de producir nisina, un metabolito reconocido como GRAS. 
En el presente trabajo se estudiaron 26 cepas de Lactococcus lactis aisladas 
del pozol y del atole agrio, la presencia de posibles bacteriocinas se evaluó 
mediante el método de difusión en agar utilizando a 10 microorganismos 
indicadores: S. aureus, B. cereus, E. faecalis, L. monocytogenes, E. coli 0157: 
H10, S. Typhimurium, P. aeruginosa, S. oralis, S. mutans y S. sanguinis. Siete 
cepas de Lactococcus presentaron actividad antibacteriana contra Gram 
positivas. Se evaluó la naturaleza proteica de los compuestos similares a 
bacteriocinas de las siete cepas de Lactococcus que presentaron actividad 
antimicrobiana. Se verificó la identidad de las cepas de bacterias lácticas 
mediante la comparación de secuencias del gen rRNA 16S. Finalmente con los 
sobrenadantes del crecimiento de las cepas de Lactococcus se realizó una 
prueba de reto donde L. monocytogenes es inhibido hasta por 48 h y una prueba 
de viabilidad en la que L. monocytogenes se inhibió por periodos de tiempo más 
cortos.
 
 
1 
 
1. Introducción. 
 
Los alimentos fermentados son aquellos en los cuales ocurren cambios 
microbiológicos/enzimáticos en los sustratos utilizados para su elaboración 
generando nuevos sabores, aromas y texturas. Algunos alimentos fermentados 
tradicionales se obtienen sin añadir inóculos, por lo que actúan los 
microorganismos naturalmente presentes en el alimento y están constituidos por 
microbiotas complejas. Se consumen y preparan con ingredientes disponibles en 
la región y muchos de ellos no se conocen fuera de las zonas de producción 
(Díaz y Wacher, 2003). 
El pozol es una bebida ácida no alcohólica, que se obtiene de la fermentación 
espontánea de masa de maíz nixtamalizado. La microbiota es bastante 
compleja, desde diversos tipos de bacterias hasta mohos y levaduras. Las 
principales bacterias encontradas durante todo el proceso de fermentación son 
las bacterias lácticas, dentro de este grupo de bacterias predominan bacterias 
de los géneros Streptococcus, Lactococcus y Leuconostoc. En el pozol se han 
encontrado bacterias ácido lácticas amilolíticas, las cuales fueron identificadas 
por ribotipificación y análisis de secuencias del gen rRNA 16S, como: 
Streptococcus bovis, Streptococcus infantarius, Streptococcus macedonicus, 
Lactococcus lactis y Enterococcus sulfureus (Díaz-Ruiz et al., 2003). 
 
En el estado de Tabasco diversos grupos indígenas y mestizos consumen una 
bebida regional, ácida no alcohólica preparada con masa elaborada con maíz 
de dobla, no nixtamalizado, que se conoce como atole agrio. Se le llama 
localmente maíz de dobla debido a que el tallo de la planta es doblado a la mitad 
con el fin de que el maíz pierda humedad, evitando la acción de 
microorganismos. El doblado del tallo se realiza alrededor de treinta días antes 
de cosechar. Este atole se elabora únicamente en el periodo de dobla, en los 
meses de mayo y septiembre. El tipo de maíz (de dobla en vez de uno maduro), 
sin nixtamalizar y que se puede fermentar en forma sólida o líquida son 
diferencias que presenta esta bebida con respecto a otras bebidas de maíz. 
 
 
 
2 
Las sustancias antagónicas que las bacterias ácido lácticas producen para 
dominar en su hábitat son muy diversas, y entre ellas se incluyen los ácidos 
orgánicos, el peróxido de hidrógeno, el diacetilo y las bacteriocinas (Savadogo 
et al., 2006). 
La aplicación de bacteriocinas en los alimentos ha tenido una importante 
contribución,en especial la nisina, ya que es considerada como un aditivo GRAS 
en la conservación de alimentos. Por tal motivo la investigación de cepas de 
Lactococcus productores de esta bacteriocina es de gran importancia. 
En el presente proyecto se determinó si las cepas de Lactococcus aisladas del 
pozol y del atole agrio, eran capaces de producir sustancias similares a 
bacteriocinas, para el control de bacterias patógenas y de descomposición 
presentes en los alimentos y en bacterias de cavidad oral. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
2. Antecedentes. 
 
2.1 Alimentos fermentados tradicionales. 
 
Algunos alimentos fermentados tradicionales se obtienen sin añadir inóculos, 
por lo que actúan los microorganismos naturalmente presentes en el alimento y 
están constituidos por una microbiota compleja (Díaz y Wacher, 2003). 
Algunos alimentos fermentados han trascendido sus fronteras de origen para 
convertirse en productos cotidianos en más de un continente; sin embargo, 
aquellas que se producen en forma artesanal o semi-comercial, o bien para el 
consumo de culturas particulares se denominan “tradicionales”. Las 
fermentaciones implicadas en estos alimentos revisten una enorme complejidad, 
y su estudio ha aportado y seguirá aportando enorme riqueza al conocimiento 
biotecnológico, específicamente a la biotecnología alimentaria. 
Estudios han revelado que estos tipos de alimentos como el pozol contiene un 
gran número de microorganismos benéficos, como las bacterias ácido lácticas 
que son las responsables de acidificar la bebida, produciendo ácido láctico 
impartiendo un sabor fresco y agradable al producto. Destacan las bacterias 
amilolíticas como Streptococcus infantarius, Díaz Ruiz et al., (2003.) Estas 
bacterias convierten el almidón del nixtamal en compuestos de menor peso 
molecular y algunos llegan a glucosa y maltosa y posteriormente en ácidos, las 
bacterias lácticas también ayudan a proteger el producto de bacterias patógenas 
y de descomposición, además aportan aromas y textura (Wacher, 1993). 
 
2.2 El Pozol. 
 
El pozol viene del vocablo náhuatl pozolli, que significa espumoso. Es un 
alimento fermentado tradicional del sureste de México, que se elabora a partir de 
masa de maíz nixtamalizado, a la que se le puede o no adicionar algún 
saborizante, ya sea sal, azúcar, miel, cacao o chile (Nuraida et al., 1995). Esta 
bebida es a un consumida en algunos estados como Chiapas, Tabasco, Oaxaca 
y Campeche (Figura 1). 
 
 
 
4 
 
Figura 1. Pozol. Tomado de www.udual.wordpress.com 
 
 
2.2.1 Elaboración del pozol. 
 
La elaboración del pozol conlleva a diferentes etapas de elaboración, ocho son 
las operaciones para obtener al pozol (Figura 2). El proceso comienza con la 
limpieza del maíz, a continuación los granos de maíz se hierven en agua con cal. 
El maíz cocido, llamado nixtamal se escurre y se lava con agua limpia. El 
nixtamal limpio se muele en metate o en molino hasta obtener una masa con la 
que se hacen bolas que se envuelven en hojas de plátano para mantener la 
humedad. En esta forma, se deja reposar a temperatura ambiente por varios días 
para que se lleve a cabo la fermentación (1 a 30 días). Una vez fermentada la 
masa, se bate en agua y se bebe. Esta bebida se puede preparar de dos formas: 
pozol mestizo e indígena, la diferencia es que en el pozol mestizo se realiza una 
segunda cocción después de nixtamalizar el maíz (Cañas et al., 1993). 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
Figura 2. Diagrama de elaboración del pozol. 
*Solo la realizan los productores mestizos (Cañas et al., 1993; Wacher et al., 1993). 
 
 
2.3 Atole agrio. 
 
El atole agrio es una bebida que puede elaborarse de diferentes formas y se 
consume desde el centro hasta el sureste del país. Poco se sabe sobre la 
microbiota y las propiedades de la bebida. El atole agrio de dobla es una forma 
de prepararlo en Villahermosa, Tabasco, la mazorca se dobla dentro de la misma 
planta y se deja que pierda humedad. Una vez cosechado, el maíz se desgrana 
y se muele; posteriormente, el proceso se puede llevar a cabo de dos diferentes 
maneras: para el proceso líquido se agrega agua a la masa y se deja fermentar 
por 6 horas a temperatura ambiente. En cambio, para el proceso sólido, se 
forman bolas con la masa obtenida y se deja fermentar durante 12 horas. Al final 
se tamiza el producto y se coloca en ebullición hasta que espese (Valderrama, 
2012). Las principales bacterias ácido lácticas encontradas en el atole agrio han 
sido Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii y Lactococcus lactis ssp. 
lactis, Serratia marcescens, Raoultella terrígena, Klebsiella pneumoniae spp. 
pneumoniae, Enterobacter cloacae, Morganella morganii spp. sibonii., 
Pseudomonas luteola y Pseudomonas aeruginosa (Esquivel, 2012; Valderrama, 
2012). Siendo las especies de Lactobacillus y Lactococcus las bacterias ácido 
lácticas encargadas de acidificar la bebida, ya que esta alcanza un pH entre 4.05 
y 4.46 al final de la fermentación (Valderrama, 2012). 
Limpieza del Maíz 
Nixtamalización 
Lavado de 
Nixtamal 
*Segunda cocción 
Remojo 
Molienda Formación de bolas 
Envoltura en hoja 
de plátano 
Fermentación 
 
 
6 
2.4 Bacterias acido lácticas (BAL). 
 
Son un grupo de microorganismos que producen como principal metabolito al 
ácido láctico. Son organismos nutricionalmente exigentes y son capaces de 
hidrolizar péptidos de la leche. Estas bacterias además de contribuir en la 
conservación de los alimentos, mejoran las características sensoriales (sabor, 
olor, textura) y aumentan la calidad nutritiva (Ramírez et al., 2011). Las BAL 
forman un grupo diverso de microorganismos, las de importancia en los 
alimentos pertenecen a los géneros: Carnobacterium, Enterococcus, 
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, 
Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella (Stiles y Holzapfel, 1997). Los 
principales metabolitos producidos por estas bacterias son: diacetilo, 
acetaldehído (aprovechados en la producción de quesos y mantequillas) y ácido 
láctico (aprovechado en la fermentación y preservación de productos lácteos). 
Además de metabolitos, las BAL producen algunas sustancias antimicrobianas, 
las cuales ayudan a conservar la calidad e inocuidad de los alimentos 
fermentados inhibiendo el crecimiento y desarrollo de microorganismos 
patógenos y de descomposición. Dichas sustancias pueden ser tan sencillas 
como el peróxido de hidrógeno hasta más complejas como las bacteriocinas 
(Savadogo et al., 2006). 
2.4.1 Bacterias acido lácticas en los alimentos fermentados tradicionales. 
 
La fermentación del pozol es llevada a cabo por una microbiota compleja, 
constituida por bacterias ácido lácticas, levaduras y hongos (Wacher et al., 
1993), gran parte de la microbiota del pozol son las BAL, las cuales se han 
encontrado y aislado durante todas las etapas de elaboración del pozol y además 
son las principales causantes de la acidificación de la masa. Dentro de este 
grupo de bacterias predominan bacterias de los géneros Streptococcus, 
Lactococcus y Leuconostoc (Ben Omar et al., 2000). 
 En trabajos previos se han logrado encontrar bacterias ácido lácticas no 
amilolíticas: Weissella confusa, Lactobacillus delbrueckii, entre otras (Ben Omar 
et al., 2000) y bacterias lácticas amilolíticas como Streptococcus bovis, 
Streptococcus macedonicus, Lactococcus lactis y Enterococcus sulfureus (Díaz-
 
 
7 
Ruiz et al. 2003). En la Tabla 1 se muestran especies de bacterias lácticas que 
se han identificado en el pozol y el atole agrio. 
Tabla 1. Bacterias ácido lácticas aisladas del pozol y del atole agrio. 
 
Aisladas del pozol Aisladas del atole 
agrio 
Streptococcus 
infantarius e 
Enterococcus 
saccharolyticus c 
Lactobacillus 
casei c,d 
Lactobacillus 
delbrueckii f 
Streptococcus 
macedonicus e 
Streptococcus 
bovis c,e 
Lactobacillusfermentum c 
Lactococcus 
lactis f 
Lactobacillus 
plantarum b,c,d 
Leuconostoc 
mesenteroides a,c 
Lactobacillus 
pentosus b 
Lactobacillus 
plantarum f 
 
Enterococcus 
sulfureus e 
 
Lactobacillus 
alimentarius d 
Weissella 
confusa c 
 
 
Lactobacillus 
delbrueckii c,d 
Lactococcus 
lactis d,e 
 
 
Reportados por: a) Nuraida et al., (1995); b) Ampe et al., (1999); c) Ben Omar et al., (2000); d) 
Escalante et al., (2001); e) Díaz-Ruiz et al., (2003); f) Valderrama et al., (2012) 
 
 
2.4.2. Bacterias lácticas amilolíticas en alimentos fermentados 
tradicionales. 
 
Se han aislado diversas bacterias ácido lácticas amilolíticas (BALA) de diferentes 
alimentos fermentados tropicales elaborados con materias amiláceas, 
principalmente de yuca y cereales (por ejemplo, maíz y sorgo). Cepas de 
Lactobacillus plantarum han sido aisladas de productos a base de yuca 
fermentada en África (Nwankwo et al., 1989). Cepas amilolíticas de Lactobacillus 
fermentum se aislaron por primera vez en Benín, de una masa fermentada de 
maíz (ogi y mawe) por Agati et al., (1998). Sanni et al., (2002) describió cepas 
amilolíticas de L. plantarum y L. fermentum en varios alimentos amiláceos 
fermentados tradicionales de Nigeria. La forma en que la materia prima es 
procesada puede determinar la composición de la microbiota y en particular, la 
aparición de las bacterias lácticas amilolíticas (Guyot et al., 2000). Debido a la 
 
 
8 
capacidad de sus α-amilasas de hidrolizar parcialmente el almidón crudo 
(Rodríguez-Sanoja et al., 2000), BALA pueden fermentar diferentes tipos de 
material amiláceo, como el maíz (Nakamura, 1981), papa (Chatterjee et al., 
1997), o la yuca (Giraud et al., 1991) entre otros. Estudios realizados por Díaz 
Ruiz et al., (2003) determinaron que Streptococcus bovis (actualmente 
Streptococcus infantarius subsp. infantarius) es la especie dominante entre las 
cepas de bacterias lácticas amilolíticas aisladas del pozol. 
 
2.4.3 Uso de las BAL en la industria. 
Las funciones de las BAL en la tecnología de productos alimenticios son: 
formación de sabor ácido, inhibición de organismos patógenos, gelificación de la 
leche, reducción del contenido de lactosa, formación de aromas, proteólisis en la 
maduración de los quesos (Hernández, et al 2007), también han sido muy 
utilizadas como probióticos (Hill, 2002 y Hui, 1993). 
 
2.4.4 Clasificación de bacterias ácido lácticas. 
 
Las bacterias ácido lácticas se clasifican por características como la morfología, 
vías de fermentación de la glucosa, crecimiento a diferentes temperaturas, 
capacidad para crecer a elevadas concentraciones de sal y tolerancia al acido o 
al álcali. Los acercamientos más antiguos en la taxonomía bacteriana 
comenzaron basándose en estas características. Posteriormente, se amplió al 
incluir la composición de la pared celular, ácidos grasos celulares, quinonas y 
algunas otras características de las células. La clasificación no es estática y es 
el centro de numerosos estudios taxonómicos que involucran ahora 
características filogenéticas y fenotipos de las bacterias lácticas (Stiles y 
Holzapfel, 1997, Seppo, 2004). En la naturaleza los géneros Lactococcus, 
Lactobacillus, Lactosphaera, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, 
Aerococcus, Alloinococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus, 
Globicatella, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagacoccus y Weisella (Axelsson, 
1998; Carr y col., 2002) son los más importantes en este grupo de bacterias. 
 
 
 
9 
2.4.1 Lactococcus lactis. 
 
Lactococcus lactis es una bacteria Gram positiva, no móvil, catalasa negativa, 
no esporulada, son cocos de 1.2-1.5 µm de diámetro con formas de cadenas 
variables, metabolismo homo-fermentativo y produce exclusivamente ácido 
láctico L (+) mediante la utilización de carbohidratos fermentables como fuente 
de energía (Roissart, 1994). Lactococcus es un importante género del grupo de 
las bacterias ácido lácticas, originalmente era parte del género Streptococcus 
pero desde 1985 tuvo el estatus de género (Nakarai et al., 2000). 
Durante mucho tiempo Lactococcus lactis ha sido usada en la fermentación de 
la leche, para operaciones tradicionales a pequeña escala, pero esta puede ser 
bien controlada en aplicaciones industriales (Cretenet et al., 2011). Las cepas 
de Lactococcus lactis son cuidadosamente seleccionadas siendo estas los 
principales componentes de cultivos iniciadores para la fermentación de la leche, 
ya que la rápida producción de ácido láctico, contribuye a la formación de la 
cuajada creando óptimas condiciones bioquímicas para la maduración de 
quesos (Parente y Cogan, 2004). L. lactis se ha aislado de productos vegetales 
tales como los cereales. 
 
2.4.5 Metabolismo. 
 
La diferencia destacada entre los grupos de las bacterias ácido lácticas está 
entre los productos formados durante la fermentación de azúcares como 
homofermentativas o heterofermentativas (Figura 3). 
Las homofermentativas como Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, 
Vagococcus y algunos Lactobacillus, poseen la enzima aldosa y producen ácido 
láctico como el producto principal de la fermentación de la glucosa utilizando la 
vía de la glucólisis (Embden-Meyerhof) (Axelsson, 1998). Mientras que, las 
especies de los géneros Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, Carnobacterium, 
Lactosphaera y algunos Lactobacillus son heterofermentativas no poseen la 
enzima aldolasa y convierten hexosas a pentosas, produciendo ácido láctico y 
otros productos como acetato, etanol y CO2 (Carr, 2002). 
 
 
 
10 
Fermentación 
Homofermentativa 
Fermentación 
Heterofermentativa 
 
 
Figura 3. Fermentación de la glucosa de las bacterias lácticas 
homofermentativas y heterofermentativas (Parra, 2012). 
ALDOLASA 
 
 
11 
2.5 Metabolitos antimicrobianos producidos por Bacterias Ácido Lácticas. 
 
Las bacterias lácticas convierten los azúcares en ácidos orgánicos, lo que hace 
que disminuya el pH. Además de estos, se reconoce que estas bacterias son 
capaces de producir una variedad de sustancias antimicrobianas de bajo peso 
molecular que incluyen: bacteriocinas, diacetilo, peróxido de hidrógeno (Niitynen 
et al., 2009). 
 
2.5.1 Ácidos orgánicos. 
 
La producción de ácidos orgánicos es, sin duda, el factor determinante para 
aumentar la vida útil y la seguridad del producto final. La acidificación es un 
método muy utilizado de conservación durante la producción de muchos tipos de 
alimentos, como la leche, las verduras fermentadas y salchichas. La inhibición 
de los microorganismos patógenos y de descomposición depende también de 
una formación rápida y suficiente de estos ácidos orgánicos (Ammor, 2007). 
 
2.5.2 Ácido láctico. 
 
El ácido láctico y su producción por BAL tienen una larga historia en la industria 
alimentaria. A principios del siglo pasado se establecieron los procesos 
microbianos para la producción de ácido láctico. Está presente en muchos 
alimentos de forma natural o como un producto de la fermentación microbiana in 
situ, como en aceitunas y encurtidos de hortalizas, yogurt, suero de leche y otras 
leches fermentadas, panes de masa fermentada y muchos otros alimentos 
fermentados. Se utiliza como acidulante, saborizante, agente tampón de pH y 
como inhibidor de deterioro bacteriano en una amplia variedad de alimentos 
procesados (Datta, 2006). 
El mecanismo de inhibición de ácido láctico está probablemente relacionado con 
la solubilidad del ácido láctico no disociado que atraviesa la membrana 
citoplasmática, que causa la acidificación del citoplasma y la pérdida de la fuerza 
protón motriz. Con el tiempo influye en el gradiente de pH transmembrana y 
disminuye la cantidad de energía disponible para que las células puedan crecer 
(Wee, 2006). 
 
 
 
12 
2.5.3 Peróxido de hidrógeno. 
 
En presencia de oxígeno, las BAL pueden producir peróxido de hidrógeno, el 
cual genera radicaleshidroxilo que causan peroxidación a los lípidos de la 
membrana y susceptibilidad de la célula microbiana de muchos microorganismos 
(Ouwehand, 1999). 
 
 
 
 
2.6 Bacteriocinas. 
 
Las bacteriocinas son sustancias deseables producidas por bacterias ácido 
lácticas (BAL), las cuales controlan el crecimiento de poblaciones microbianas 
en alimentos fermentados, lo cual le confiere al alimento una mayor vida de 
anaquel e inocuidad. Las bacteriocinas, producidas por las BAL, son péptidos o 
proteínas biológicamente activas, sintetizados ribosomal mente, que tienen 
actividad contra otras bacterias similares (Rea et al., 2010). Las bacteriocinas 
producidas por BAL, incluyendo las de los géneros Lactococcus, Lactobacillus, 
Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, Carnobacterium y Streptoccoccus 
han sido las más estudiadas debido a que podrían ser potencialmente usadas 
para la preservación y seguridad de los alimentos, en medicina humana y 
veterinaria (Cotter et al., 2005). La acción de las bacteriocinas depende de la 
composición de la membrana citoplasmática, la estructura y la expresión de la 
proteína además de la composición química del medio (Monroy, 2009). 
 
Son compuestos catiónicos cuya carga neta positiva es mayor a pH ácido, 
asimismo, sus propiedades bactericidas se acentúan a valores de pH bajos, 
permanecen estables a temperaturas relativamente altas y no se ven afectadas 
por solventes orgánicos. En este sentido, son las enzimas proteolíticas las que 
logran hidrolizar y, por tanto, inhibir su actividad. Son bastantes estables bajo 
condiciones de refrigeración y congelación, pero si contienen metionina, ésta 
puede oxidarse a sulfóxido de metionina, el cual reduce el poder antimicrobiano 
(Chen y Hoover, 2003; Savadogo, 2006; Ray y Bhunia, 2008). 
 
 
13 
 
 
Es importante destacar que las bacteriocinas difieren de los antibióticos en que 
las primeras son, como ya se mencionó anteriormente, compuestos proteicos 
con una especificidad inhibitoria contra bacterias del mismo género o 
estrechamente relacionadas; mientras que los antibióticos, además de que 
pueden causar reacciones alérgicas en el huésped, poseen una actividad poco 
específica contra células vivas, pudiendo así afectar a las mismas células o a la 
microbiota normal del hospedero (Riley y Wertz, 2002; Chen y Hoover, 2003); 
además, los antibióticos son moléculas de bajo peso molecular, no-proteicos, 
producidos por diferentes microorganismos como metabolitos secundarios y 
clasificados según su estructura química, pues pueden ser sulfonamidas, 
tetraciclinas y glicilciclinas entre otras (Todar, 2011). 
 
 
2.6.1 Clasificación de las bacteriocinas. 
 
La clasificación de las bacteriocinas está siempre cambiando. Sin embargo, se 
han definido cuatro clases de bacteriocinas sobre la base de la estructura 
química, peso molecular y estabilidad térmica (Klaenhammer, 1993). 
Con respecto a las bacteriocinas producidas por las bacterias Gram-positivas, 
las producidas por bacterias de ácido láctico (BAL), incluyendo los géneros 
Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, 
Carnobacterium y algunos miembros del género Streptococcus, han sido objeto 
de una atención especial. Sus péptidos asociados potencialmente pueden ser 
empleados en una variedad de maneras, incluyendo la conservación de 
alimentos, la seguridad alimentaria y en la medicina humana y veterinaria (Cotter 
et al., 2005; Piper et al., 2009). Lactococcus lactis produce nisina A, es la más 
ampliamente caracterizada de todas las bacteriocinas, y el interés significativo 
en la investigación relacionada con la bacteriocina se puede remontar, en gran 
medida, al desarrollo exitoso de la nisina de la observación inicial de la actividad 
inhibitoria por una cepa de L. lactis contra Lactobacillus bulgaricus (Rogers y 
Whittier, 1928), hasta su aprobación regulatoria como un agente de 
bioprotección para la alimentación (Delves, 2005) 
 
 
14 
 
Klaenhammer agrupó las bacteriocinas en clases y subclases. Estas 
agrupaciones han formado la base de todos los esquemas posteriores de 
clasificación para las bacteriocinas de bacterias Gram - positivas. Klaenhammer 
sugirió cuatro clases de bacteriocinas como sigue a continuación: 
 
 Clase I o lantibióticos: se definen como pequeños péptidos activos de 
membrana (<5 kDa) que contiene el aminoácido inusual lantionina o β-
metil lantionina (de ahí el nombre de lantibióticos) y los residuos 
deshidratados. La nisina es la más caracterizada de las bacteriocinas de 
clase I. 
 Clase II: definidos como pequeños péptidos activos de membrana que no 
contienen lantionina, termoestables y caracterizados por la presencia de 
un sitio de procesamiento de Gly-Gly en el precursor de bacteriocina, la 
presencia de hélices anfifílicas con regiones variables de hidrofobicidad y 
de moderada a alta estabilidad al calor. Estos se subdividen en tres 
subgrupos: 
o Subclase IIa: Péptidos activos contra Listeria, tienen la secuencia 
consenso en la región N-terminal de Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-
Cy, y sus representantes característicos son la pediocina PA-1 y 
la sakacina P. 
o Subclase IIb: se refiere a dos componentes (dos péptidos 
separados), bacteriocinas que requieren dos péptidos para 
trabajar sinérgicamente con el fin de tener una actividad 
antimicrobiana. 
o Subclase IIc: péptidos que requieren residuos de cisteína para su 
actividad antimicrobiana. 
 
• Clase III: proteínas termolábiles grandes, a menudo con actividad enzimática. 
 
• Clase IV: proteínas complejas compuestas de uno o más restos químicos, ya 
sean lípidos o hidratos de carbono. 
 
 
 
15 
Esta clasificación ha sido retomada y modificada por varios autores. Rea y 
colaboradores (2011) presentan una clasificación actualizada: 
 
 Clase I: Bacteriocinas modificadas post traducción. Este grupo se divide 
en: 
o Clase Ia: Lantibióticos 
o Clase Ib: Labirintopéptidos, nombrados en consecuencia de su estructura 
de “laberinto”, se distinguen por la presencia de labionina, un aminoácido 
modificado post traducción. 
 
 Clase II: Bacteriocinas no modificadas. Este grupo se divide en cuatro 
subgrupos. 
o Clase IIa: Bacteriocinas similares a pediocina 
o Clase IIb: Bacteriocinas no modificadas de dos péptidos 
o Clase IIc: Bacteriocinas circulares 
o Clase IId: Bacteriocinas no similares a pediocina, sin modificar, lineales 
 Bacteriolisinas, anteriormente Bacteriocinas Clase III, de hidrofobicidad 
variable y estabilidad al calor de moderada a alta. Esta a su vez se divide 
en 3 subgrupos: subclase IIa, subclase IIb, subclase IIc. 
 Clase III: (Proteínas no modificadas), proteínas grandes, termolábiles, 
algunas con actividad enzimática. 
 Clase IV: Proteínas complejas con uno o más grupos de lípidos o 
carbohidratos. 
 
Las bacteriocinas mejor estudiadas de las BAL son las de las clases I y II, ya que 
posiblemente al ser termoestables son adecuadas para ser utilizadas en la 
industria alimentaria (Tabla 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
 
Tabla 2. Clasificación de Bacteriocinas según Klaenhammer. 
 
Clase Características Ejemplo 
representativo 
BAL productora 
Clase I: 
Lantibióticos 
Péptidos termoestables (<5KDa) 
Ia Péptidos elongados (4KDa), 
carga neta positiva, forma poros 
en la membrana celular blanco 
Nisina 
 
 
Plantaricina A 
Lactococcus lactis 
subsp lactis 
 
Lb. plantarum C11 
Ib Péptidos globulares (1.8-2.1 
KDa) actividad antimicrobiana 
por inhibición enzimática 
Mersacidina 
 
 
Bacillus sp. HILY- 
85.54728 
Clase II : no 
lantibióticos 
No contienen aminoácidos 
modificados estables al calor y 
al pH, peso molecular 
(<10KDa), 
 
IIa Alta actividad contra Listeria 
Formación de poros en la 
membrana celular 
 
Secuencia N-terminal: -Tyr-Gly-
Asn-Gly-Val-Xaa-Cys 
Pediocina PA-1 
 
 
Sakacina A 
 
Leucocina A 
 
Curvacina A 
 
 
Mesentericina Y105Pediococcus acidilactici 
y Lactobacillus 
plantarum WHE92 
Lb. sake Lb706 
 
Leu. gelidum UAL 187 
 
Lactobacillus curvatus 
LTH1174 
 
Leuconostoc 
mesenteroides 
IIb Necesitan dos péptidos para 
generar actividad 
Lactacina F 
 
Lactococcina G 
 
Lactococcina B 
 
Lb. acidophilus 11088 
 
Lac. lactis LMG2081 
 
L. lactis subsp cremoris 
9B4 
 
IIc Termoestables 
 
Acidocina G Lb. acidophilus M46 
Clase III Peso molecular (>30KDa) 
Termo lábiles 
Helveticina J 
 
Lactacina B 
Lb. helveticus J 
 
Lb. Acidophilus N2 
Clase IV Incorporan carbohidratos o 
lípidos en la molécula para tener 
actividad 
Leucocina S 
 
Lactocina 27 
Leu. 
paramesenteroides 
 
Lb. helveticus LP27 
Tomado y modificado de Llanos, 2015. 
 
 
 
 
17 
2.6.2 Biosíntesis de las bacteriocinas. 
 
Las bacteriocinas son sintetizadas como pre-propéptidos, los cuales son 
procesados y excretados mediante la maquinaria celular de transporte. En las 
bacterias ácido lácticas, la producción de bacteriocinas está asociada con el 
crecimiento: generalmente que se da en la fase exponencial y se detiene al 
término de la misma, aunque existen casos, como el de la nisina en los que la 
producción ocurre a la mitad de la fase log, llegando a su máximo cuando las 
células entran en la fase estacionaria (Riley y Wertz, 2002).Las bacteriocinas 
pueden sintetizarse a través del uso de distintos azúcares (sacarosa y xilosa), 
se ha visto que, en general, la glucosa es la mejor fuente para una producción 
neta mayor (Muñoz- Rojas, 2003; Savadogo et al., 2006). 
La mayoría de las bacteriocinas son sintetizadas como un pre-propéptido 
inactivo con una secuencia N-terminal líder enlazada al extremo C-terminal del 
propéptido; sin embargo, existen ciertas diferencias en cuanto al tipo de genes 
que necesitan para su liberación. Para el caso de los lantibióticos, los genes 
necesarios son los siguientes: 
 
 
 Un gen estructural lanA, que codifica para el pre-propéptido 
 Genes de inmunidad: lanI, lanE, lanF y lanG, que codifican para 
proteína que protegen a la célula productora del lantibiótico a 
formar 
 Un gen lanT, que codifica para las proteínas relacionadas con el 
sistema de transporte ABC 
 Un gen lanP, el cual codifica para una proteinasa-serina encargada 
de remover la secuencia terminal líder del pre-propéptido 
 Dos genes, lanB y lanC (y en algunos casos, sólo lanM), que 
codifican para enzimas responsables de la formación de la 
lantionina y metil-lantionina. 
 Dos genes, lanK y lanR, que codifican para las proteínas 
regulatorias encargadas de transmitir la señal extracelular que 
induce la producción de lantibióticos (Chen y Hoover, 2003; 
Savadogo et al., 2006). 
 
 
18 
 
El sistema de regulación de la producción de bacteriocinas se compone de tres 
componentes: un péptido inductor (o factor de feromona de activación), la 
histidina cinasa transmembranal (receptor de feromona) y un regulador de 
respuesta. El péptido inductor se sintetiza en el ribosoma en niveles de baja 
concentración como un prepéptido, que se divide y se excreta al medio. Cuando 
este compuesto alcanza una concentración umbral, se activa la histidina cinasa 
transmembranal, lo que conduce a la autofosforilación del residuo de histidina, 
por lo tanto, se produce la transferencia de fosfato a una proteína reguladora de 
respuesta. El regulador fosforilado activa la transcripción de la bacteriocina, 
además de los elementos que componen el sistema de regulación, iniciando una 
retroalimentación positiva. 
 
2.6.2.1 Modo de acción de las bacteriocinas. 
 
Las bacteriocinas demuestran alta actividad bactericida que se relaciona 
principalmente con el contenido de cistina; y de acuerdo con ello, se establecen 
tres espectros de acción: 
 
a) Bacteriocinas con espectro inhibitorio estrecho, cuyos productos inhiben 
microorganismos de la misma especie. 
 
b) Bacteriocinas con espectro inhibitorio intermedio, cuyos productos inhiben 
otros géneros de BAL y algunas bacterias patógenas Gram-positivas presentes 
en alimentos. 
 
c) Bacteriocinas con amplio espectro de inhibición que actúan contra un gran 
número de bacterias Gram-positivas. 
 
Las bacteriocinas de bacterias Gram-positivas presentan diferentes modos de 
acción de acuerdo con su clasificación (Figura 5). 
 
 
 
 
19 
El modo de acción de los lántibioticos se atribuye a la desestabilización (debido 
a la formación de poros) de las funciones de la membrana citoplasmática. La 
estructura de estos péptidos, α-hélice o β-laminar, pueden formar dos caras, una 
hidrofílica y otra hidrofóbica creando oligómeros que pueden atravesar la 
membrana formando poros (Chen y Hoover, 2003). El lado apolar de la molécula 
se situará próxima a los lípidos de la membrana y el lado polar al centro del poro. 
Como consecuencia, se observa una pérdida de iones K+, ATP y, en algunos 
casos aminoácidos y moléculas pequeñas. La pérdida de estas sustancias 
origina a su vez una pérdida del potencial de la membrana, consumo de las 
reservas energéticas celulares, descenso de la síntesis de proteínas, originando 
la muerte celular (McAuliffe et al., 2001). 
 
Figura 5. Modo de acción de los lantibióticos (Clase I), no-lantibióticos (Clase II) y 
bacteriolisinas (Clase III) (Adaptado de Cotter et al., 2005). 
 
 
 
 
20 
 
Los no-lantibióticos contienen dos péptidos en su estructura principal, los cuales 
pueden presentar actividades duales distribuidas a través de sus dos péptidos. 
En general, los péptidos de esta clase tienen una estructura anfifílica helicoidal, 
lo que les permite orientarse e insertarse en la membrana de la célula, 
provocando la muerte celular. El modo de acción principal se debe a las 
interacciones con la membrana celular, se inicia con el reconocimiento entre la 
bacteriocina y el receptor de la membrana celular, seguido de una serie de 
interacciones electrostáticas, que le permite insertarse dentro de la membrana 
interfiriendo con su estructura y conduciendo a una despolarización y muerte (Hu 
et al., 2006). 
 
El mecanismo de acción de las bacteriocinas de la clase III “bacteriolisinas” es 
menos complejo con respecto a los lantibióticos y los no-lantibióticos, ya que 
actúan directamente sobre la pared celular de las bacterias Gram-positivas lo 
que conduce a la muerte y lisis de la célula (Cotter et al., 2005). 
Los investigadores se han centrado en realizar estudios para determinar el efecto 
inhibitorio que presentan las bacteriocinas sobre las bacterias Gram-negativas y 
han encontrado que su inhibición es menor. Esta resistencia posiblemente se 
debe a que éstas cuentan con la presencia de una membrana externa, que 
contiene lipopolisacáridos que actúa como una barrera de permeabilidad efectiva 
(Chung y Yousef, 2005). 
 
 
2.6.3 Aplicación de las bacteriocinas en la industria alimentaria. 
 
Hoy en día, las bacteriocinas se utilizan ampliamente, especialmente en el 
campo de la conservación de alimentos. El uso de bacteriocinas en la industria 
alimentaria, especialmente en lácteos, huevo, vegetales y productos cárnicos ha 
sido ampliamente investigado. Entre las bacteriocinas de BAL la nisina ha 
demostrado ser altamente eficaz contra agentes microbianos que causan 
intoxicación y el deterioro de los alimentos. Además, la nisina es la única 
bacteriocina que se ha empleado oficialmente en la industria de los alimentos y 
su uso ha sido aprobado en todo el mundo (Moll et al., 1999, Deegan et al., 
 
 
21 
2006). Numerosos métodos de conservación, se han utilizado con el fin de 
prevenir el deterioro y enfermedades causadas por microorganismos presentes 
en los alimentos. Estas técnicas incluyen el tratamiento térmico (pasteurización, 
esterilización por calor), reducción en los valores de pH y de aw (acidificación, 
deshidratación) y adición de conservantes (antibióticos, compuestos orgánicos 
tales como propionato, sorbato,benzoato, lactato, y el acetato). Aunque estos 
métodos han demostrado ser de gran éxito, hay una demanda creciente de 
productos naturales, microbiológicamente seguros que proporcionan al 
consumidor altos beneficios para la salud (Deegan et al., 2006). 
 
 
 
2.7 Lantibióticos y sus aplicaciones. 
 
En la actualidad se han identificado más de 95 estructuras de diversos 
lantibióticos y varias exhiben una actividad muy interesante que los hacen 
candidatos para futuras aplicaciones en diversas áreas. Además, los lantibióticos 
tienen muchas características y propiedades químicas, bajo peso molecular 
estables al calor, falta de toxicidad, baja tendencia a generar resistencia, esto los 
hace adecuados para aplicaciones potenciales asociadas con el cuidado de la 
salud como en la medicina humana y veterinaria, en la industria bioquímica, 
farmacéutica y la industria alimentaria agrícola. 
El primer lantibiótico en ser usado comercialmente fue la nisina (Figura 6), este 
exhibe una actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram positivas, 
incluyendo los agentes que causan deterioro de los alimentos como Listeria 
monocytogenes (Denny, 1961) o Clostridium, por lo que se ha utilizado como 
conservante biológico de alimentos (E234, Nisaplin ®) en productos lácteos 
procesados, así como frutas y verduras por más de 50 años. La nisina también 
se utiliza comercialmente en productos de cuidado de los animales para la 
prevención de la mastitis bovina causada por Staphylococcus aureus o 
Streptococcus agalactiae. En la tabla 3 se muestran algunos lantipéptidos. 
 
 
 
22 
 
Tabla 3.Clasificacion de lantibióticos de acuerdo con Knerr y van der Donk 
(2012). 
Clase 1 Procedencia Clase 2 Procedencia 
Nisina A Lactococcus lactis 
ATCC11454 
Lactacin 481 Lactococcus lactis 
Nisina Q Lactococcus lactis Macedocina Streptococcus 
macedonicus 
ACADC198 
Nisina U Streptococcus 
uberis 42 
Lactocina 3147 Lactococcus lactis 
subspec. lactis 
DPC3147 
Nisina Z Lactococcus lactis 
 
 
 
 
 
Figura 6. Estructura de diferentes lantipéptidos (Dischinger, 2014). 
 
 
23 
2.8 Bacterias patógenas presentes en los alimentos. 
 
Los microorganismos patógenos son aquellos que al ingresar a un hospedero, 
son capaces de provocar una enfermedad o infección en ellos. Las 
enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son términos que se aplican a 
todas las enfermedades que se adquieren por medio del consumo de alimentos 
contaminados. Las causas más comunes son intoxicaciones e infecciones, se 
estima que en el mundo unos 600 millones de personas se enferman al año por 
consumir alimentos contaminados por bacterias (OMS, 2015). 
 
 
 
 
2.8.1 Listeria monocytogenes. 
 
Listeria monocytogenes es una bacteria facultativa Gram-positiva, móvil 
mediante flagelos, anaerobio facultativo, es una de las principales causas de 
muerte por enfermedades transmitidas por alimentos. 
L. monocytogenes; es tolerante a la sal y no sólo puede sobrevivir en 
temperaturas de refrigeración, sino también puede crecer en estas condiciones, 
a diferencia de muchos otros agentes patógenos. También es notable por su 
persistencia en entornos de fabricación de alimentos. La bacteria es ubicua en 
el medio ambiente y se puede encontrar en ambientes húmedos, el suelo y la 
vegetación en descomposición. 
De las otras cinco especies del género Listeria; L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, 
L. seeligeri y L. welshimeri, solamente L. ivanovii se considera patogénico, y 
sobre todo en los rumiantes, en lugar de en los seres humanos. Listeria afecta 
en mayor medida a personas de los extremos de edad de la vida, mujeres 
embarazadas y personas con algún tipo de inmunodepresión, fundamentalmente 
celular, o enfermedad debilitante, como neoplasias hematológicas, 
trasplantados, tratados con corticoides o antagonistas del factor de necrosis 
tumoral, cirrosis hepática, enfermedades por depósito de hierro 
(hemocromatosis), insuficiencia renal avanzada, diabetes mellitus y 
enfermedades autoinmunes. 
 
 
24 
L. monocytogenes es una de las principales causas de muerte por enfermedades 
transmitidas por alimentos. Un informe reciente (2011) de los Centros para el 
Control y Prevención de Enfermedades (CDC) estima que en los Estados 
Unidos, cada año 1600 personas se enferman gravemente de listeriosis y 260 
de ellas mueren (CDC, 2012). 
 
2.8.2 Escherichia coli. 
 
Este microorganismo es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo, móvil 
por flagelos y no tiene la capacidad de formar esporas, la mayoría de las cepas 
de Escherichia coli no son patógenas y forman parte de la microflora entérica 
normal del colon humano. Sin embargo unas cuantas cepas son potencialmente 
patógenas y se transmiten por alimentos. Todas estas cepas son patógenos 
intestinales y varias de ellas se caracterizan por su capacidad de producir 
enterotoxinas muy potentes. Existen unas 200 cepas patógenas conocidas de 
E.coli. Algunas causan enfermedades diarreicas graves e infecciones del tracto 
urinario. Las cepas patógenas se pueden dividir según el tipo de toxina que 
producen (Tabla 4) y la enfermedad especifica que causan (Brock, 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
Tabla 4. Características de los grupos de Escherichia coli patogénicas. 
Grupo Síntomas Epidemiologia Factor de 
virulencia 
Serotipo y 
serogrupos más 
comunes 
Enteropatógena 
EPEC 
 
Diarrea 
secretora 
Lactantes Adherencia 
localizada, 
Adherencia intima 
O26:H11 
O56:H6 
O86:H32 
O111:H2 
0114:H 
O127:H9 
 
Enterotoxigénica 
ETEC 
Diarrea 
secretora 
Mayores de 5 
años 
Enterotoxinas ST 
y/o LT Factores 
antigénicos de 
colonización 
O6:H11 
O8:H9 
O11:H27 
O20:NM 
025:H42 
O78:H11 
Enteroinvasiva 
EIEC 
Diarrea 
inflamatoria 
Todas las 
edades 
Invasividad O28ac:NM 
O29:NM 
O112ac:NM 
O115:NM 
O124:H30 
Enterohemorrágica 
EHEC 
Diarrea 
sanguinolen
ta 
inflamatoria 
Todas las 
edades 
Citotoxinas 
similares a la toxina 
de shiga 
O26:H11 
O45:H2 
O111:H8 
O121:H19 
O157:H7 
Enteroagregativa 
EAEC 
Diarrea 
persistente 
y aguda 
Todas las 
edades 
Adherencia, 
Toxinas Pet y Pic 
O44:H18 
O55 
O111 
O125 
O126 
O128 
Tomado y modificado (Eslava, 2015). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
26 
2.9.3 Salmonella. 
 
El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae, son bacilos 
Gram negativos, no formadores de esporas, anaerobios facultativos, provistos 
de flagelos y móviles (Jurado et al., 2010). Las bacterias de este género son 
ubicuas y resistentes, pueden sobrevivir varias semanas en ambientes secos y 
muchos meses en agua. Por esta razón son una causa importante de 
enfermedades transmitidas por alimentos en humanos. 
Se conoce como salmonelosis al grupo de infecciones producidas por bacterias 
del género Salmonella, las cuales se adquieren por la ingesta de alimentos o 
bebidas contaminados (Uribarren, 2014). La salmonelosis es una de las 
enfermedades transmitidas por alimentos más comunes a nivel mundial. Los 
serotipos causantes de enfermedades en humanos, a menudo lo hacen de forma 
invasiva y puede ser mortales si no se cuenta con el tratamiento adecuado 
(WHO, 2016). Se conocen tres formas clínicas de salmonelosis en el humano: 
gastroenteritis (causada por Salmonella enterica ser. Typhimurium, Salmonella 
enterica ser. Enteritidis, etc.), fiebre entérica (causada por Salmonella enterica 
ser. Typhi y Salmonella enterica ser. Paratyphi) y una enfermedad invasiva 
sistémica ocasionada por Salmonella enterica ser. cholerasuis (Romero, 2007). 
 
 
2.9.4 Staphylococcus aureus. 
 
 
Los miembros del género Staphylococcus son cocos Gram positivos que se 
agrupan regularmente en racimos, inmóviles, no esporulados, dan positiva la 
reacción de la catalasa y por lo general producen una microcápsula de 
naturaleza polisacárida (Bannerman, 2003). Algunos de los miembros delgénero 
Staphylococcus forman parte de la microbiota de la piel en humanos. Las 
personas son el reservorio principal de los estafilococos involucrados en la 
enfermedad humana, incluyendo S. aureus. Llegan al alimento ya sea por la 
inoculación de este microorganismo en la preparación de alimentos, higiene 
deficiente en su preparación o mala limpieza de los utensilios (Doyle y Beuchat, 
2007). 
Staphylococcus aureus, el patógeno más importante del género, produce 
infecciones de piel y tejidos blandos, infecciones invasoras y cuadros tóxicos, 
 
 
27 
genera enterotoxinas termoestables que actúan sobre el intestino delgado, 
causando secreción masiva de líquidos en la luz intestinal. Los síntomas de 
intoxicación alimentaria estafilocócica suelen ser los siguientes: náuseas, 
vómito, retortijones abdominales intensos, diarrea, sudoración, cefalalgia, 
abatimiento y un eventual descenso de la temperatura corporal. Estos síntomas, 
que generalmente duran de 24 a 48 horas, suelen aparecer dentro de las 4 horas 
siguientes a la ingestión del alimento contaminado. Este microorganismo se 
encuentra frecuentemente en productos lácteos y cárnicos (Brock, 2009). 
 
2.9.5 Streptococcus mutans. 
 
Streptococcus mutans es una bacteria Gram positiva, en forma de coco, se 
considera el microorganismo más cariogénico de la placa bacteriana, teniendo 
un papel activo en el desarrollo de la caries, siendo importante en la primeras 
etapas de desarrollo de la lesión; éstos son eficientes fermentadores de glúcidos, 
además son microorganismos acidúricos (tolerantes al ácido) y acidógenos 
(productores de ácido); por lo que son capaces de reducir el pH de la placa 
bacteriana (Menaker et al, 1986). 
 
2.9.6 P. aeruginosa. 
 
Pseudomonas aeruginosa son bacilos Gram negativos, móviles con flagelos 
polares, aerobios estrictos, metabolismo oxidativo no fermentativo. La principal 
especie es la Pseudomona aeruginosa, crecen entre 10 y 42ºC, se encuentra 
ampliamente distribuida en la naturaleza, se puede aislar de muestras de suelo, 
aguas contaminadas, así como de plantas y animales. Esta bacteria es capaz de 
utilizar una enorme variedad de compuestos orgánicos como sustrato para 
crecer, capacidad que le permite colonizar nichos en los que son escasos los 
nutrimentos que otros organismos pueden asimilar, P. aeruginosa presenta 
problemas en la industria alimentaria ya que puede descomponer los alimentos 
que se mantienen en refrigeración al mantener un metabolismo basal en estas 
condiciones y producir enzimas hidrolíticas. P. aeruginosa representa un 
problema importante de salud. Una vez que se establece la infección, P. 
aeruginosa produce una serie de compuestos tóxicos Entre las proteínas que 
 
 
28 
intervienen en la infección de P. aeruginosa encontramos toxinas, como las 
exotoxinas A y S, así como enzimas hidrolíticas que degradan las membranas y 
el tejido conjuntivo de diversos órganos. Esta situación se ve agravada por la 
dificultad para tratar las infecciones por P. aeruginosa, ya que esta bacteria 
presenta una muy alta resistencia natural a distintos antibióticos y a 
desinfectantes (Microbios en línea. (s.f.). Recuperado 12 Agosto del 2015, de 
http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/index.html) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
3. Justificación. 
 
En los últimos años ha habido un aumento en los métodos de conservación de 
alimentos, los métodos biológicos como el uso de microorganismos 
antagonistas y sus metabolitos antimicrobianos que pueden tener uso potencial 
como conservador natural, como regulador del crecimiento y como 
antimicrobiano de microorganismos indeseables en los alimentos, son una 
opción muy utilizada. 
Las bacterias ácido lácticas (BAL) forman parte de un gran número de alimentos 
fermentados, ya sean los producidos a gran escala o alimentos fermentados 
tradicionales, como lo son el pozol y el atole agrio, las BAL no solo imparten 
seguridad alimentaria también le dan calidad organoléptica a los alimentos. La 
aplicación de bacteriocinas en los alimentos ha tenido una importante 
contribución, en especial la nisina ya que es considerada como un aditivo GRAS 
en la conservación de alimentos, por tal motivo la investigación de cepas de 
Lactococcus productores de esta bacteriocina es de gran importancia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
4. Hipótesis. 
 
Si los sobrenadantes neutralizados y tratados térmicamente de las cepas de 
Lactococcus aisladas del pozol y del atole agrio son capaces de inhibir a 
algunas bacterias patógenas y de descomposición presentes en alimentos, 
entonces estas sustancias podrían ser bacteriocinas. 
 
 
5. Objetivos. 
Objetivo general 
 
Determinar si las cepas de Lactococcus aisladas del pozol y del atole agrio, son 
capaces de producir sustancias similares a bacteriocinas, para el control de 
bacterias patógenas y de descomposición presentes en los alimentos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
Objetivos particulares 
 
1. Identificar mediante la comparación de secuencias del gen rRNA 16S a 
las bacterias lácticas que presentaron actividad antimicrobiana. 
 
2. Comprobar la naturaleza proteica de las sustancias antimicrobianas 
producidas por las cepas de Lactococcus aisladas del pozol y del atole 
agrio. 
 
3. Evaluar el potencial antimicrobiano de las cepas de Lactococcus aisladas 
del pozol y del atole agrio frente a bacterias patógenas y de 
descomposición presentes en alimentos mediante el método de difusión 
en agar. 
 
4. Determinar el efecto antimicrobiano de las cepas de Lactococcus aisladas 
del pozol y del atole agrio frente a bacterias del género Streptococcus 
presentes en cavidad oral, por el método de difusión en agar. 
 
5. Observar la viabilidad de Listeria monocytogenes en sobrenadantes 
tratados térmicamente y neutralizados de cepas de Lactococcus con 
actividad antimicrobiana. 
 
6. Estudiar la interacción entre Listeria monocytogenes y las bacterias ácido 
lácticas aisladas del pozol y del atole agrio productoras de compuestos 
con actividad antimicrobiana, mediante una prueba de reto. 
 
 
 
 
 
 
 
32 
6. Metodología. 
 
6.1 Microorganismos. 
 
6.1.1 Bacterias Ácido Lácticas usadas en el experimento 
Las BAL empleadas en el estudio pertenecen a la colección de cepas del 
laboratorio 324, Conjunto E, Facultad de Química, UNAM y hasta el momento 
fueron identificadas como bacterias pertenecientes al género Lactococcus. Las 
cepas fueron aisladas de diferentes muestras de pozol originario de Tabasco y 
Chiapas, además de atole agrio originario de Tabasco. Dichas cepas se 
mantuvieron conservadas en caldo MRS al 20% de glicerol a -70ºC (Tabla 5). 
 
6.1.2 Microorganismos indicadores. 
 
Para evaluar la posible producción de bacteriocinas de las BAL, se utilizaron 
las siguientes bacterias que se denominaron indicadoras. Se evaluaron tanto 
Gram positivas como Gram negativas. Dichas cepas se mantuvieron 
conservadas en caldo BHI OXOID® al 20% de glicerol a -70ºC. En la Tabla 6 se 
indican las cepas utilizadas, las claves y el origen. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
Tabla 5. Bacterias Ácido Lácticas utilizadas en el presente estudio. 
Clave 
interna 
Clave en 
el 
presente 
trabajo 
Alimento 
de 
origen 
Procedencia 
de la 
muestra 
Clave 
interna 
Clave en el 
presente 
trabajo 
Alimento 
de origen 
Proceden
cia de la 
muestras 
 
*334 33 Pozol Villahermosa, 
Tab. 
22SnC1 22SnC Pozol1 Chiapas 
A45212
2 
A45212 Pozol Villahermosa, 
Tab. 
A1MS3
5 
A1MS3 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
54ch6 54ch Pozol Villahermosa, 
Tab. 
105 10 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
673 67 Pozol Villahermosa, 
Tab. 
IIL6i25 44 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
833 83 Pozol Villahermosa, 
Tab. 
IIS4i2580 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
933 93 Pozol Villahermosa, 
Tab. 
IIS6i35 84 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
253 25 Pozol Villahermosa, 
Tab. 
IIS12i15 91 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
SnC151 SnC15 Pozol Chiapas IL4A25 103 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
SnC231 SnC23 Pozol Chiapas IL6A15 108 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
SnC251 SnC25 Pozol Chiapas IS6A15 113 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
4SnC1 4SnC Pozol Chiapas IS6A35 115 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
21SnC1 21SnC Pozol Chiapas IS10A2
5 
119 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
18SnC1 18SnC Pozol Chiapas IS12A1
5 
120 Atole agrio Villaherm
osa, Tab. 
13SnC1 13SnC Pozol Chiapas 
(1) Nuraida, 1995, (2) Díaz-Ruiz et al, 2003, (3) Becerril, 2010, (4) Tavera, 2010, (5) Valderrama, 
2012,(6) Pilatasig, comunicación personal 
(*) Cepa usada como control positivo (Tavera, 2010) para las pruebas de difusión en agar, para 
el ensayo con Listeria monocytogenes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
Tabla 6. Cepas indicadoras patógenas o de descomposición utilizadas en 
la prueba de difusión en agar. 
Cepa Clave de la cepa Origen de la muestra 
 
G
ra
m
 +
 
S. aureus ATCC 25923 Cepario de la Facultad de Química 
B. cereus 11778 Cepario de la Facultad de Química 
E. faecalis ATCC 29212 Cepario de la Facultad de Química 
L. monocytogenes CFQ-103 Cepario de la Facultad de Química 
Streptococcus 
oralis 
S/clave Cepario de la Facultad de Química 
Streptococcus 
mutans 
ATCC 10449 Colección de microorganismos del Dr. 
Fausto Rivero. 
Streptococcus 
sanguinis 
S/clave Colección de microorganismos de la 
Facultad de Medicina 
G
ra
m
 - 
E.coli 0157 : H10 27377 Colección de microorganismos del 
Laboratorio 324 
Salmonella 
Typhimurium 
ATCC 14028 Cepario de la Facultad de Química 
P. aeruginosa ATCC 27853 Cepario de la Facultad de Química 
 
 
6.2 Reactivación de cepas y confirmación de la pureza de las cepas a 
estudiar. 
 
La reactivación de las cepas de BAL (Tavera, 2010), se realizó en 5 ml de medio 
(MRS DifcoTM), a partir de las cepas conservadas en medio MRS con glicerol al 
20 % a -70ºC. Se inocularon 50 µl, en el caso de las cepas conservadas en medio 
líquido, en el caso de las cepas conservadas en perlas de vidrio se utilizó solo 
una perla para la reactivación y se incubaron a 30°C por 24 h. Las bacterias 
patógenas o de descomposición se reactivaron, 50 µl de cultivo en 5 mL de 
medio BHI OXOID® y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. 
Para la determinación de pureza se realizó una prueba de catalasa y una tinción 
de Gram, tanto para las BAL y las bacterias patógenas o de descomposición. Se 
esperaba que la morfología fuera uniforme al observarse al microscopio y que la 
prueba catalasa fuera negativa para las BAL y positiva para las bacterias 
indicadoras. 
 
 
35 
 
6.2.1 Conservación de las cepas lácticas, patógenas y de descomposición. 
 
 Para conservar las cepas se inoculó una colonia de cada cepa en 5 mL de medio 
MRS para bacterias lácticas y BHI para los microorganismos patógenos o de 
descomposición, los cultivos se incubaron durante 24 h a 30ºC para BAL y 37ºC 
para bacterias patógenas o de descomposición luego se separaron las células 
del medio de cultivo, esto se realizó tomando 1 mL de cada cultivo, en un 
microtubo de 1.5 mL y se centrifugó a 8000 rpm durante 10 minutos, esto se 
realizó dos veces. El pellet de las células se lavó con 1 mL de solución salina al 
0.85%, el cual posteriormente se centrifugó para volver a separar las células de 
la solución salina. Una vez que las células se habían lavado, se resuspendió el 
pellet en medio MRS o BHI con glicerol al 20% según el caso, se transfirió el 
cultivo a un criotubo para así ser conservado en un ultracongelador (Puffer 
Hubbard TM) a -70ºC. 
 
 
 
 
6.3 Obtención de sobrenadantes. 
 
Se reactivaron las cepas seleccionadas en 5 ml de medio MRS, con una alícuota 
de 50 µL de cada cepa de Lactococcus conservadas en congelación. Se incubó 
cada cultivo durante 24 h a 30°C. Después se tomó una alícuota de 1 mL de 
cada cultivo y se colocó en un microtubo de 1.5 mL, se centrifugó a 8000 rpm 
durante 10 minutos (Centrífuga Eppendorf 5417R). Esto para separar las células 
del medio de cultivo. Se separó el sobrenadante, transfiriéndolo a otro microtubo 
de 1.5 mL para poder conservarlo en refrigeración (5ºC para pruebas a corto 
plazo y -20º para pruebas a largo plazo), realizar el tratamiento y realizar las 
pruebas de difusión en agar. Figura 7. Las bacteriocinas son compuestos 
extracelulares, se recomienda el uso de medios libres de células (Vignolo et al. 
1993; Alvarado et al. 2006; Vallejo et al. 2009).
 
 36 
Reactivación de BAL, 50 µL en 5 mL 
 de caldo MRS Realizar un pase a las 1 mL de BAL 
 24 h de incubación de 50 µL 
 
 
BAL conservada a -70°C 5 mL caldo MRS 5 mL caldo MRS 100 mL MRS 
Incubación 
24 h, 30C° 
Incubación 
24 h, 30°C 
 
Incubació
n 
24 h, 30°C 
 
Tubo de 
centrifuga 
Centri
-fugar 10000 rmp 
15 min 4°C 
 
Transferir a un 
matraz estéril. 
100-105°C 
10 min 
Ajustar pH 
a 6-7 
 
Sobrenadante 
listo. 
 
Concentrar al 50% 
con rota vapor 
55°C, 60-100 rpm, 
70 mbar. 
Sobrenadante 
concentrado al 
50%. 
Figura 7. Esquema de la metodología empleada para obtener los sobrenadantes concentrados y sin concentrar para su posterior utilización. 
 
 
37 
6.4 Preparación de medio de cultivo Infusión cerebro –corazón 
amortiguado (BHI-A). 
 
Se preparó un medio tamponado con medio BHI OXOID®, esto con el fin de 
eliminar el efecto inhibitorio de los ácidos orgánicos producidos por las bacterias 
lácticas, de igual forma se preparó una sobrecapa de medio tamponado tal como 
se describe en la Tabla 7. 
Tabla 7. Formulación de medio BHI amortiguado (1000 mL). 
Placa (BHI-A) Sobrecapa (BHI-A) 
BHI OXOID® 37 g BHI OXOID® 15 g 
Agar bacteriológico 17 g Agar bacteriológico 8 g 
Fosfato monobásico de sodio 4.3 g Fosfato monobásico de sodio 4 g 
Fosfato dibásico de sodio 10 g Fosfato dibásico de sodio 10 g 
Agua destilada 1000 mL Agua destilada 1000 mL 
 
6.4.1 Preparación de placas BHI-A. 
 
Para la preparación de placas se mezclaron los componentes en un matraz 
Erlenmeyer según lo describe la Tabla 7. El medio se esterilizó a 121º C durante 
15 min. Enfriado el medio a 40-45ºC se procede a verter 15 mL del medio en 
cajas Petri estériles, una vez solidificadas se mantuvieron a 30ºC por 24 horas 
para evaluar su esterilidad. 
6.4.2 Preparación de sobrecapa BHI-A. 
 
El uso de una sobrecapa semisólida es para que el compuesto a estudiar se 
pueda difundir con más facilidad. Para la preparación de la sobrecapa se 
mezclaron los componentes en un matraz Erlenmeyer según lo describe la Tabla 
5. Se homogenizó el medio con agitación hasta la ebullición, se vertieron 10 mL 
del medio en tubos de ensaye con tapón de rosca y se esterilizaron a 121º C 
durante 15 min, se mantuvieron a 30ºC por 24 horas para asegurar su esterilidad. 
Los medios y los reactivos se muestran en el Anexo A. 
 
 
 
 
38 
6.5 Preparación de cepas patógenas y de descomposición. 
 
Las cepas se reactivaron en 5 mL de medio BHI un día antes de realizar la 
prueba. Se utilizó un inoculo de 50 µL del cultivo congelado en 5mL medio BHI 
y se incubaron a 37°C durante 24 horas Tabla 8. 
 
 
Tabla 8. Condiciones de trabajo de bacterias patógenas y de descomposición 
presentes en alimentos y bacterias patógenas de cavidad oral. 
 
 
Microorganismo 
indicador 
 
Inóculo 
µL 
 
Tiempo de 
incubación al 
reactivar (h) 
 
Dilución para 
realizar la 
prueba 
 
Inóculo en 
sobrecapa 
µL 
 
Tiempo de 
incubación de 
la prueba (h) 
Enterococcus 
faecalis 
50 24 10-3 40 18-24 
Staphylococcus 
aureus 
50 24 10-3 40 18-24 
Escherichia coli 
0157H10 
50 24 10-3 40 18-24 
Salmonella 
Typhimurium 
50 24 10-3 40 18-24 
Bacillus cereus 50 24 10-3 40 18.24 
Pseudomonas 
aeruginosa 
50 24 10-3 40 18-24 
Listeria 
monocytogenes 
50 24 10-2 40 18-24 
Streptococcus 
oralis 
50 72 - 40 18-24 
Streptococcus 
mutans 
50 24 10-2 40 18-24 
Streptococcus 
sanguinis 
50 24 10-1 100 18-24 
Tabla tomada y modificada de (Llanos, 2015) 
 
 
 
 
39 
6.6 Método de difusión en agar. 
 
Para el método de difusión en agar se utilizaron torres de vidrio para hacer los 
pozos en el medio de cultivo. Primero se colocaron las torres en el medio 
tamponado, posteriormente se fundió la sobrecapa y se inoculó con 40 µL 0 100 
µL, de la dilución correspondiente, según el microorganismo como se muestra 
en la Tabla 8. La sobrecapa ya inoculada se vertió sobre la placa de medio 
tamponado, cuidando de no derramar el medio de cultivo en el centro de las 
torres, para asegurar que los pozos queden bien definidos. Una vez que la 
sobrecapa se enfría y solidifica, se procedió a retirar las torres. Una vez que se 
retiraron las torres, se colocó en cada pozo 80 µL del sobrenadante de cada cepa 
de BAL que se prepararon previamente, después de 24 h de incubación a 37ºC 
se reportó el radio de los halos de inhibición Figura 8.
 
 40 
 
 
 
.
 
Reactivación de 
Patógeno 50 µL 
en 5 mL de caldo 
BHI, 24 h, 37°C 
 
Patógeno con 24 h 
de crecimiento 
 
 6-24h, 37°C 
Pase de 50 µL en 
5 mL de caldo BHI 
estéril 
 
Patógeno 
reactivado 
 
10 mL de sobrecapa BHI 
tamponado o sin tamponar 
según el ensayo realizar 
Vortex 
Verter sobrecapa 
 
Placa de BHI tamponado 
 
Remover 
torres de vidrio 
 
 
 
 
Sobrenadante sin tratamiento, con 
tratamiento según el ensayo. 
Incubar 37°C 
18-24 h 
 
Control (-) H2O 
destilada estéril 
Figura 8. Esquema de la metodología empleada para realizar el ensayo de difusión en agar utilizando los sobrenadantes neutralizados y tratados 
térmicamente (NTT) o Concentrados Neutralizados y Tratados Térmicamente CNTT), empleando las cepas seleccionadas como patógeno indicador. 
 
 
41 
6.7 Tratamiento de los sobrenadantes y ensayo de actividad 
antimicrobiana. 
 
6.7.1 Neutralización de los sobrenadantes y tratamiento térmico. 
 
Solo los sobrenadantes de las cepas que presentaron actividad antimicrobiana, 
se neutralizaron ajustando el pH con NaOH 1M con un potenciómetro (Oakton 
pH700) a un valor de pH de 6.5-7.0 y se les dio un tratamiento térmico de 100-
105°C por 10 minutos. Los sobrenadantes se conservaron en refrigeración a 5°C. 
Después de los tratamientos se realizaron ensayos de actividad antimicrobiana 
mediante el método de difusión en agar, se reportó el radio de los halos de 
inhibición. 
6.7.2 Neutralización, tratamiento térmico y concentración. 
 
Las cepas que conservaron su actividad antimicrobiana se concentraron hasta 
un 50 %, en un rotavapor (BUCHI) con bomba de vacío (BUCHI), la 
concentración se realizó a 55ºC, 80 rpm, 65 mbar por 1.5 h. Estos sobrenadantes 
también fueron neutralizados y tratados térmicamente, los concentrados se 
guardaron en congelación a -4°C Después de los tratamientos se realizaron 
ensayos de actividad antimicrobiana mediante el método de difusión en agar, se 
reportaron los radios de los halos de inhibición. 
6.7.3 Determinación de la naturaleza proteica de las sustancias similares a 
bacteriocinas producidas BAL. 
 
Solo las cepas que fueron capaces de mantener su actividad después de ser 
concentradas se sometieron a un tratamiento enzimático con una proteasa de 
Bacillus licheniformis (las características de la proteasa se muestran en el Anexo 
B), para comprobar su naturaleza proteica, las condiciones se describen en la 
Tabla 9, dichas condiciones fueron las mismas para cada sobrenadante de las 3 
cepas seleccionadas. Después de los tratamientos se realizaron ensayos de 
actividad antimicrobiana mediante el método de difusión en agar, se reportaron 
los radios de los halos de inhibición, Figura 9. 
 
 
42 
 
Tabla 9. Condiciones del ensayo enzimático de los sobrenadantes de BAL 
productoras de posibles bacteriocinas. 
 
Enzima Tiempo de 
incubación 
Agitación Temperatura 
de 
incubación 
Relación de 
volumen 
Proteasa 2 h 
 
300 rpm 37ºC 0.5 mL 
SNTT/0.5 mL 
solución de 
proteasa 1 
mg/mL 
 
 
 
 
 
 43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SNTT 
(5 mL) Buffer Glicina-NaOH 
pH9 + 5 mg de proteasa. 
 
 
5 mL de 
proteasa 
1 mg/mL 
Microtubo con 0.5 ml 
de CNTT o SNTT 
Incubar 2 h a300 rpm, 
37°C 
Ensayo de difusión 
en agar 
80 µL 
 
 
80µL de 
SCNTB o 
SNTB sin 
tratamiento 
enzimático 
Sobre capa de BHI 
con bacteria patógena 
de ensayo 
Figura 9. Esquema utilizado para realizar el ensayo enzimático utilizando los sobrenadantes Neutralizados y Tratados Térmicamente (NTT) o 
concentrados neutralizados y tratados térmicamente (CNTT). 
0.5ml de 
solución de 
proteasa 
1mg/mL 
 
 
44 
6.8 Identificación de bacterias ácido lácticas por comparación de 
secuencias del gen rRNA 16S. 
 
 
6.8.1 Extracción y purificación del ADN. 
 
Las cepas aisladas de bacterias ácido lácticas provenientes del pozol y del atole 
agrio se reactivaron de la misma manera que se muestra en la sección 5.2. 
Después de 24 h de crecimiento se tomaron 1.5 mL del cultivo en microtubos del 
kit de extracción de Fast ID, se centrifugaron a 8000 rpm por 15 minutos a 10ºC, 
se retira el sobrenadante y se lava el pellet con solución salina estéril al 0.85%, 
el proceso se realiza dos veces y el pellet se utiliza para la extracción del ADN 
utilizando el kit de extracción de Fast ID como se describe en Anexo B.5. 
 
6.8.2 Amplificación mediante PCR de la región V1 del gen rRNA 16S. 
 
Para la amplificación mediante PCR se realizó el siguiente procedimiento: 
Se preparó una mezcla de reacción en microtubos como se muestra en la Tabla 
11. En la Tabla 12 se indican los cebadores utilizados, la reacción se llevó a 
cabo en un termociclador (Biometra® Tpersonal). En la Tabla 13 se muestran 
las condiciones para la amplificación. 
 
 
Tabla 11. Reactivos para la mezcla de reacción para la amplificación por PCR de la 
región V1 del gen rRNA 16S. 
 
Reactivo Volumen (µL) 
Buffer [10x] 5 
MgCl2 [25mM] 5 
dNTPs [10mM] 1 
Primer pA [20ng/ µL] 0.5 
Primer 3 [20ng/ µL] 0.5 
Taq polimerasa [1u/ µL] 1 
Templado [10ng/ µL] 10 
Agua destilada estéril 27 
Total 50 
 
 
 
 
45 
 
Tabla 12. Cebadores utilizados para la amplificación por PCR de la región V1 del 
gen rRNA 16S 
 
Cebador Secuencia 5’- 3’ Posición Orientación 
pA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 9-28 Reversa 
3 GTTGCGCTCGTTGCGGGACT 1109-1090 Hacia adelante 
Gamma* ACTGCTGCCTCCCGTAGGAG 358-339 Hacia adelante 
*Se utiliza solo en la secuenciación del fragmento 
 
 
 
 
 
Tabla 13. Condiciones de PCR para amplificar la región V1 del gen rRNA 
16S. 
 
 Temperatura (ºC) Tiempo (min) Ciclos 
Desnaturalización inicial 94 3 1 
Desnaturalización 94 1 34 
Alineamiento 65 1.5 34 
Extensión 72 2 34 
Extensión final 72 15 2 
 
 
Después de la reacción de PCR se realizó una electroforesis en gel de agarosa 
al 2% a 70 volts por 60 min. De inmediato, al término de la electroforesis se revelo 
el gel en una solución de bromuro de etidio al 3% por 15 min. El gel se observó 
a través del equipo (Chemidoc TM MP Imaging System) y se utilizó el programa