Estudio-del-consumo-y-produccion-de-metabolitos-de-celulas-cho-s-en-cultivos-sincronizados

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
ESTUDIO DEL CONSUMO Y PRODUCCIÓN DE METABOLITOS DE CÉLULAS 
CHO-S EN CULTIVOS SINCRONIZADOS 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 
 
 
PRESENTA 
FRANCISCO JAVIER GARCIA MONROY 
 
 MÉXICO, D.F. 2015 
 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: MARCO ANTONIO ORTIZ JIMENEZ 
VOCAL: Profesor: JOSE GUILLERMO JESUS AGUILAR OSORIO 
SECRETARIO: Profesor: JOSE ANTONIO SERRATO PEREZ 
1er. SUPLENTE: Profesor: NORMA ANGELICA CAMACHO DE LA ROSA 
2° SUPLENTE: Profesor: VERONICA DOMINGUEZ VALDEZ 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES 
RESPIRATORIAS ISMAEL COSÍO VILLEGAS 
 
 ASESOR DEL TEMA 
 
_________________________ 
DR. EN C. JOSÉ ANTONIO SERRATO PÉREZ 
 
SUSTENTANTE 
 
________________________________ 
FRANCISCO JAVIER GARCÍA MONROY 
 
 
 
 
 
 
CONTENIDO 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
ÍNDICE DE TABLAS 
ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS 
1. RESUMEN 
2. INTRODUCCIÓN 
3. ANTECEDENTES 
3.1 CICLO CELULAR Y SINCRONIZACIÓN 
3.1.1 EL CICLO CELULAR 
3.1.2 SINCRONIZACIÓN CELULAR. DEFINICIÓN Y MÉTODOS 
3.1.3 LA ELUTRIACIÓN CENTRÍFUGA COMO MÉTODO DE 
 SINCRONIZACIÓN 
3.2 CULTIVOS SINCRONIZADOS EN BIOTECNOLOGÍA FARMACÉUTICA 
3.3 EL CONSUMO Y PRODUCCIÓN DE METABOLITOS EN LA 
 OPTIMIZACIÓN DE LOS PROCESOS DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS 
 RECOMBINANTES 
3.3.1 GLUCOSA 
3.3.2 GLUTAMINA 
3.3.3 LACTATO 
4. JUSTIFICACIÓN 
5. OBJETIVOS 
6. HIPÓTESIS 
7. MATERIALES Y MÉTODOS 
7.1 MODELO BIOLÓGICO 
7.2 REACTIVOS Y SOLUCIONES 
7.2.1 AZUL TRIPANO 0.2 % 
7.2.2 BICARBONATO DE SODIO 7.5% 
 
 
I 
II 
III 
1 
3 
4 
4 
4 
5 
 
7 
9 
 
 
12 
13 
14 
14 
16 
17 
17 
18 
18 
18 
18 
18 
 
 
 
 
7.2.3 L-GLUTAMINA 200 MM 
7.2.4 IODURO DE PROPIDIO 1 MG/ML 
7.2.5 RNASA 10 MG/ML 
7.2.6 SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATOS (PBS) 1X 
7.2.7 SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATOS DE DULBECCO 
 (DPBS) 1X 
7.3 MEDIOS DE CULTIVO 
7.4 MANTENIMIENTO CELULAR 
7.4.1 CONGELAMIENTO Y CRIOPRESERVACIÓN CELULAR 
7.4.2 DESCONGELAMIENTO Y PROPAGACIÓN CELULAR 
7.5 CULTIVO CELULAR 
7.5.1 CULTIVO EN FRASCOS SPINNER 
7.5.2 CULTIVO EN BIORREACTOR 
7.5.2.1 PREPARACIÓN DEL BIORREACTOR 
7.5.2.1.1 CALIBRACIÓN DEL ELECTRODO DE PH 
7.5.2.1.2 LAVADO Y ESTERILIZACIÓN DEL 
 BIORREACTOR 
7.5.2.1.3 CALIBRACIÓN DEL ELECTRODO DE 
 OXÍGENO DISUELTO 
7.5.2.2 INOCULACIÓN DEL BIORREACTOR 
7.5.2.3 CONTROL DE LAS CONDICIONES DEL 
 CULTIVO 
7.5.2.4 MUESTREO 
7.6 CINÉTICAS DE CRECIMIENTO 
7.7 SINCRONIZACIÓN CELULAR 
7.7.1 SISTEMA DE SINCRONIZACIÓN CELULAR 
7.7.2 ELUTRIACIÓN CENTRÍFUGA DE LAS POBLACIONES 
 CELULARES 
18 
18 
19 
19 
19 
 
20 
20 
20 
20 
21 
21 
21 
21 
21 
 
22 
 
22 
22 
 
22 
23 
23 
23 
23 
 
25 
 
 
 
 
7.7.2.1 CONDICIONES DE ELUTRIACIÓN 
7.7.2.2 PREPARACIÓN Y SANITIZACIÓN DEL SISTEMA 
 DE ELUTRIACIÓN 
7.7.2.3 CALIBRACIÓN DE LA BOMBA PERISTÁLTICA 
7.7.2.4 DETERMINACIÓN DE LOS FLUJOS DE INTERÉS 
7.7.2.5 PRETRATAMIENTO CELULAR CON TRIPSINA 
7.7.2.6 INYECCIÓN DE LA POBLACIÓN CELULAR NO 
 SINCRONIZADA 
7.7.2.7 RECOLECCIÓN DE LAS FRACCIONES DE 
 INTERÉS 
7.7.3 BARRIDO CELULAR 
7.7.4 OBTENCIÓN DE POBLACIONES CELULARES SINCRONIZADAS 
 EN LA FASE G1 DEL CICLO CELULAR 
7.8 CULTIVO SINCRONIZADO DE CÉLULAS 
7.9 DETERMINACIONES ANALÍTICAS 
7.9.1 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y VIABILIDAD 
 CELULAR 
7.9.2 DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO CELULAR 
7.9.3 ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR POR CONTENIDO DE ADN 
 MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO 
7.9.4 CUANTIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE LOS 
 METABOLITOS: GLUCOSA, GLUTAMINA Y LACTATO. 
7.10 CONSIDERACIONES MATEMÁTICAS 
7.10.1 VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO Y TIEMPO DE 
 DUPLICACIÓN 
7.10.2 VELOCIDADES ESPECÍFICAS DE CONSUMO/PRODUCCIÓN 
 DE METABOLITOS 
7.11 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS 
25 
 
25 
25 
25 
26 
 
26 
 
26 
27 
 
27 
27 
28 
 
28 
28 
 
28 
 
29 
30 
 
30 
 
30 
31 
 
 
 
 
 
8. RESULTADOS Y DISCUSIONES 
8.1 CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DEL CRECIMIENTO Y PERFIL DE 
 METABOLITOS DE CULTIVOS NO SINCRONIZADOS DE CÉLULAS CHO-S 
 EN BIORREACTOR 
8.2 SINCRONIZACIÓN DE CÉLULAS CHO-S POR EL MÉTODO DE ELUTRIACIÓN 
 CENTRÍFUGA 
8.2.1 DISTRIBUCIÓN DE TAMAÑO DE LA POBLACIÓN HETEROGÉNEA Y 
 CÁLCULO DE LOS FLUJOS DE ELUTRIACIÓN 
8.2.2 OBTENCIÓN DE POBLACIONES CELULARES SINCRONIZADAS EN 
 LA FASE G1 DEL CICLO CELULAR 
8.3 CULTIVOS SINCRONIZADOS DE CÉLULAS CHO-S 
8.3.1 PERFIL CINÉTICO DE CRECIMIENTO SINCRONIZADO 
8.3.2 ESTUDIO DEL CONSUMO Y PRODUCCIÓN DE METABOLITOS 
8.3.3 ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR 
9. CONCLUSIONES 
10. ANEXOS 
10.1 DEDUCCIÓN DE LA ECUACIÓN SIMPLIFICADA DE LA LEY DE STOKES 
 PARA EL CÁLCULO DE LOS FLUJOS DE ELUTRIACIÓN 
10.2 ELUTRIACIONES DE CÉLULAS CHO-S 
10.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS Y 
 ESTEQUIOMÉTRICOS ENTRE CULTIVOS SINCRONIZADOS Y NO 
 SINCRONIZADOS 
11. BIBLIOGRAFÍA 
 
 
32 
 
 
32 
 
40 
 
40 
 
42 
49 
52 
53 
59 
62 
63 
 
63 
65 
 
 
67 
72 
 
 
 
 
 
 
I 
 
INDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Análisis del ciclo celular de una población heterogénea mediante 
tinción del ADN con ioduro de propidio medida por citometría de flujo. 
Figura 2. Esquema general del sistema de elutriación centrífuga. 
Figura 3. Esquema del sistema de sincronización y cultivo de células 
sincronizadas. 
Figura 4. Caracterización cinética de células CHO-S en biorreactor. 
Figura 5. Crecimiento de células CHO-S cultivadas en biorreactor durante unciclo de duplicación en la fase de crecimiento exponencial. 
Figura 6. Distribución de tamaño de las células CHO-S durante un cultivo típico 
en fase exponencial. 
Figura 7. Análisis de ciclo celular de una población heterogénea de células 
CHO-S sincronizada en las diferentes fases del ciclo celular. 
Figura 8. Obtención de subpoblaciones sincronizadas de células CHO-S en la 
fase G1 del ciclo celular. 
Figura 9. Cultivos control no sincronizados de células CHO-S cultivadas en 
frascos Spinner. 
Figura 10. Cultivos sincronizados de células CHO-S cultivadas en frascos 
Spinner. 
Figura 11. Análisis del ciclo celular mediante contenido de ADN durante un cultivo 
sincronizado de células CHO-S. 
 
 
 
 
 
II 
 
INDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1. Parámetros cinéticos de diferentes tipos de líneas celulares CHO. 
Tabla 2. Flujos de elutriación y diámetros calculados para sincronizar células 
CHO-S mediante el método de elutriación centrífuga a contracorriente 
Tabla 3. Flujos de elutriación utilizados para sincronizar células CHO-S en la 
fase G1 del ciclo celular y porcentaje relativo de células en cada fase del ciclo 
celular. 
Tabla 4. Parámetros cinéticos y estequiométricos en cultivos sincronizados vs 
cultivos no sincronizados de células CHO-S cultivadas en frascos Spinner 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
III 
 
ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS 
A Área de la sección transversal 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
Ca2+ Ión Calcio 
ºC Grados Celsius 
cel. Células 
CO2 Dióxido de carbono 
d Diámetro de partícula 
DHFR Enzima dehidrofolato reductasa 
DMSO Dimetilsulfóxido 
DPBS Solución amortiguadora de fosfatos de Dulbecco 
F Fuerza / Flujo de elutriación 
FSC Dispersión de luz frontal 
g gramo 
HCl Ácido clorhídrico 
KCL Cloruro de potasio 
KH2PO4 Fosfato de potasio monobásico 
L Litro 
ln Logaritmo natural 
µm micrómetro 
µL microlitro 
Mg2+ Ión Magnesio 
mg miligramo 
mL mililitro 
mM milimolar 
min Minuto 
N Normal 
NaCl Cloruro de sodio 
Na2HPO4 Fosfato di-básico de sodio 
 
 
IV 
 
NaOH Hidróxido de sodio 
OD Oxígeno disuelto 
PBS Solución amortiguadora de fosfatos 
pmol Picomolar 
qS Velocidad específica de consumo/producción de metabolitos 
qGlc Velocidad específica de consumo de glucosa 
qGln Velocidad específica de consumo de glutamina 
qLac Velocidad específica de producción de lactato 
r Radio de partícula 
RPM revoluciones por minuto 
SSC Dispersión de luz lateral 
[S]i Concentración de metabolito al tiempo inicial 
[S]f Concentración de metabolito al tiempo final 
t Tiempo 
td Tiempo de duplicación 
tpA Activador plasminógeno de tejidos 
Viab. Viabilidad 
Vs Velocidad de sedimentación 
Xv Concentración de células viables 
Xo Concentración de células viables al tiempo cero 
Xvi Concentración de células viables al tiempo inicial 
Xvf Concentración de células viables al tiempo final 
Xt Concentración de células totales 
YLac/Glc Rendimiento Lactato/Glucosa 
µ Velocidad específica de crecimiento 
η Viscosidad de fluido 
ρm Densidad de fluido 
ρp Densidad de partícula 
ω Velocidad angular
 
 
1 
 
1. RESUMEN 
En el presente trabajo se estudió el perfil de crecimiento y el consumo/producción 
de metabolitos en cultivos sincronizados de células CHO-S. Las poblaciones 
heterogéneas de la línea celular fueron sincronizadas mediante el método de 
elutriación centrífuga a partir de 3.5x108 células no sincronizadas. Con el fin de 
obtener subpoblaciones sincronizadas en la fase G1 del ciclo celular con un alto 
grado de pureza se realizó un pretratamiento celular con tripsina para facilitar la 
sincronización de las células. Dicho pretratamiento permitió obtener subpoblaciones 
con alto grado de pureza (>85%) sin comprometer la viabilidad ni el crecimiento de 
las células. 
Se realizó la caracterización cinética del crecimiento no sincronizado de la línea 
celular mediante cultivos en biorreactor bajo condiciones de cultivo controladas. Se 
determinó una velocidad específica de crecimiento de 0.0331 horas-1 equivalente a 
un tiempo de duplicación de 20.91 horas y velocidades específicas de 
consumo/producción de metabolitos de: qGlc: 0.212 pmol/cel*h, qGln: 0.038 
pmol/cel*h y qLac: 0.226 pmol/cel*h. Durante un ciclo de duplicación en fase 
exponencial, los porcentajes relativos de células en cada fase del ciclo celular fueron 
%G1: 33.16 ± 2.62, %S: 48.22 ± 2.44 y %G2/M: 16.42 ± 1.82. 
Los cultivos sincronizados fueron realizados en frascos Spinner a partir de 
subpoblaciones celulares sincronizadas en la fase G1 del ciclo celular. A la par se 
realizaron cultivos no sincronizados bajo las mismas condiciones de cultivo con el 
fin de identificar diferencias en el perfil de crecimiento y en el perfil de 
consumo/producción de metabolitos entre ambos tipos de cultivo. 
Los cultivos sincronizados mostraron un perfil de crecimiento escalonado que indicó 
la progresión en sincronía por las diferentes fases del ciclo celular en comparación 
con el típico perfil de crecimiento exponencial de los cultivos no sincronizados. 
Con respecto al consumo y producción de los metabolitos glucosa, glutamina y 
lactato, el consumo global de glucosa y glutamina fue comparable entre cultivos 
sincronizados y cultivos no sincronizados, sin embargo, los cultivos sincronizados 
 
 
2 
 
presentaron menores niveles de producción de lactato en comparación con los 
cultivos no sincronizados. Las velocidades específicas de consumo/producción en 
los cultivos sincronizados determinadas a las 22 horas de cultivo (de acuerdo al 
tiempo de duplicación de la línea celular calculada en Spinner) fueron qGlc: 
0.250±0.052 pmol/cel*h, qGln: 0.101±0.037 pmol/cel*h y qLac: 0.335±0.052 
pmol/cel*h y en los cultivos no sincronizados fueron qGlc: 0.183±0.008 pmol/cel*h, 
qGln: 0.070±0.009 pmol/cel*h y qLac: 0.347±0.034 pmol/cel*h. De acuerdo al 
análisis estadístico realizado, existe diferencia significativa solo en la velocidad 
específica de consumo de glucosa siendo mayor en los cultivos sincronizados, esto 
podría indicar un metabolismo más acelerado pero más eficiente en virtud de que la 
producción de lactato es menor con respecto a los cultivos no sincronizados. El 
rendimiento Lactato/Glucosa presentado en los cultivos sincronizados fue inferior al 
determinado para los cultivos no sincronizados lo cual reafirma una menor 
producción de lactato en cultivos donde las células son cultivadas de manera 
sincronizada. 
A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo, el cultivo de células 
sincronizadas podría representar una alternativa para limitar la producción de 
lactato en los cultivos celulares y de esta manera optimizar el metabolismo celular 
lo cual podría tener un efecto en la productividad de los cultivos para la obtención 
de proteínas recombinantes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
2. INTRODUCCIÓN 
El cultivo de células de mamífero se ha posicionado en la industria farmacéutica 
biotecnológica como la principal alternativa para la producción de proteínas 
recombinantes terapéuticas debido a las ventajas que este sistema de expresión 
ofrece comparado con otros sistemas biológicos. El correcto plegamiento de las 
proteínas así como la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales 
convierten a las células de mamífero en el sistema de expresión ideal. Entre las 
líneas celulares, las células de ovario de hámster chino (células CHO por sus siglas 
en inglés) han sido ampliamente utilizadas como sistema de expresión en la 
producción de diversas proteínas recombinantes (Demain y Vaishnav, 2009). 
El comportamiento de los cultivos celulares está determinado por los múltiples 
mecanismos de regulación de todas las células, por su interacción con elresto de 
la población y con su medioambiente de cultivo (Alberts et al., 2008). La dinámica 
causada por la diversidad y heterogeneidad en la población celular no es 
usualmente considerada en los procesos de cultivo celular (Jandt et al., 2014). Dicha 
heterogeneidad es producida principalmente por la transición de las células a lo 
largo del ciclo celular, lo cual impide el estudio detallado de la contribución de las 
diferentes fases del ciclo celular en los múltiples procesos fisiológicos y metabólicos 
implicados en la producción de proteínas recombinantes cuando se utilizan cultivos 
celulares convencionales de células no sincronizadas. 
El cultivo de células sincronizadas representa una novedosa estrategia de cultivo 
para evaluar detalladamente la contribución de los procesos celulares implicados 
en la producción de proteínas recombinantes durante las diferentes fases del ciclo 
celular, lo cual puede arrojar información relevante para la optimización y 
mejoramiento de los procesos de producción de proteínas recombinantes 
terapéuticas. 
 
 
 
 
 
4 
 
3. ANTECEDENTES 
 
3.1 Ciclo celular y sincronización 
 
3.1.1 Ciclo celular 
El ciclo celular está constituido por una serie ordenada de acontecimientos 
macromoleculares que conducen a la división celular y a la producción de dos 
células hijas (Lodish et al., 2009). En las células eucarióticas el ciclo celular está 
compuesto por cuatro fases bien caracterizadas: la fase G1 es el periodo entre la 
mitosis y la replicación del ADN; durante esta fase se lleva a cabo una intensa 
síntesis de proteínas y de crecimiento celular así como la preparación de la célula 
para progresar a la fase S, en la cual se duplica el ADN y se sintetizan proteínas, 
como las histonas, encargadas de estructurar a la cromatina. Una vez que se ha 
replicado el ADN correctamente la célula entra en una fase previa a la división 
celular conocida como fase G2 donde se prepara para llevar a cabo la mitosis o fase 
M, que corresponde a la última fase del ciclo celular, en la cual se reparte el material 
genético en dos células hijas y se lleva a cabo la división del citoplasma o citocinesis, 
dotando a cada célula hija con la misma información genética y cantidad de 
organelos. Si las condiciones ambientales no son apropiadas las células no 
progresan de la fase G1 a la fase S y entran en una fase de reposo, conocida como 
fase G0, solo frente a las condiciones o estímulos apropiados, las células pueden 
superar está fase, replicar su ADN y posteriormente dividirse. 
Existen diversos métodos para analizar el ciclo celular de una población siendo los 
más utilizados los que dan seguimiento al ciclo analizando el contenido de ADN de 
las células. A medida que progresa el ciclo celular, a partir de la fase G1, la célula 
aumenta su tamaño y el contenido de ADN es mayor, siendo prácticamente el doble 
en la fase G2, de este modo utilizando análogos de las bases nitrogenadas que se 
incorporan al ADN durante la replicación celular, como la bromodeoxiuridina, o 
agentes que se intercalan al ADN, como el ioduro de propidio o la 7-
aminoactinomicina-D, es posible monitorear el ciclo celular. Estos agentes pueden 
 
 
5 
 
posteriormente ser analizados mediante técnicas como la citometría de flujo. Con 
respecto al ioduro de propidio, al analizar el ciclo celular de una población en un 
cultivo heterogéneo, se obtienen perfiles como el mostrado en la Figura 1, donde 
las células con un contenido menor de ADN muestran una menor intensidad de 
fluorescencia correspondiendo a la fase G1 y las células que contienen el doble de 
ADN muestran el doble de intensidad de fluorescencia y corresponden a la fase G2 
(Lloyd y Al-Rubeai, 2002). 
 
 
Figura 1. Análisis del ciclo celular de una población heterogénea mediante tinción del ADN con 
ioduro de propidio medida por citometría de flujo. Se distinguen las tres poblaciones celulares (G1, 
S y G2) donde la intensidad de fluorescencia es directamente proporcional al contenido de ADN. 
(Tomado y modificado de Lloyd y Al-Rubeai, 2002) 
3.1.2 Sincronización celular. Definición y métodos 
La sincronización celular puede definirse como el enriquecimiento celular en cierta 
fase del ciclo celular (Banfalvi, 2011). Es una estrategia que permite analizar los 
eventos que tienen lugar en las células a través del ciclo celular permitiendo el 
análisis de las fases individuales que lo conforman. Durante el proceso de 
sincronización celular las células son seleccionadas y separadas con respecto al 
ciclo celular obteniendo distintas subpoblaciones celulares que representan las 
diferentes fases o etapas del ciclo, las cuales son usadas para estudiar aspectos 
 
 
6 
 
específicos en cada fase como la biosíntesis de macromoléculas, la expresión de 
genes, la fosforilación de proteínas o bien, los mecanismos que regulan el ciclo 
celular. 
Un método óptimo de sincronización debe ser capaz de generar poblaciones 
celulares homogéneas en la misma fase del ciclo celular con células de tamaño 
similar sin alterar o perturbar el crecimiento o fisiología de las mismas (Cooper, 
2003). 
Existen dos grupos de métodos que nos permiten sincronizar una población celular: 
los métodos de sincronización químicos y los métodos de sincronización físicos. 
Los métodos de sincronización químicos se basan en el arresto celular en 
determinada fase del ciclo deteniendo el progreso del mismo. Estos métodos 
bloquean reversiblemente el ciclo celular en una fase por privación de un 
componente del medio o por adición de un agente químico. De este modo, las 
células son sincronizadas en la fase G1 mediante la privación de suero o de algunos 
aminoácidos o por la adición de DMSO o lovastatina; en la fase S mediante el uso 
de agentes que inhiban la replicación del ADN como el metotrexato, hidroxiurea, 
timidina o afidicolina y en la fase G2/M mediante el uso de nocodazol, colchicina o 
colcemida (Fox, 2004; Jandt et al., 2014; Merril, 1998; Uzbekov, 2004). Estos 
métodos presentan la ventaja de ser fácilmente aplicables y de bajo costo, sin 
embargo, suelen alterar el crecimiento y perturbar la fisiología y metabolismo 
celular. Se considera que las poblaciones obtenidas no reflejan el tamaño o 
composición del genoma de la fase que representan en un ciclo celular normal 
(Cooper, 2004). 
Los métodos de sincronización físicos se basan en la separación de las células en 
las diferentes fases del ciclo celular aprovechando sus propiedades físicas como 
tamaño, densidad, velocidad de sedimentación o fluorescencia celular. En este 
grupo de métodos encontramos la centrifugación por gradiente, la elución por 
membrana, la elutriación centrífuga a contracorriente y la separación por citometría 
de flujo (Banfalvi, 2008; Lee et al., 2014; Uzbekov, 2004). A diferencia de los 
métodos químicos, los métodos de sincronización físicos poseen la ventaja de no 
 
 
7 
 
alterar el metabolismo o la fisiología celular y no afectar el crecimiento de las células 
sincronizadas, los rendimientos obtenidos son mejores y el grado de sincronía 
alcanzada es mayor (Banfalvi, 2008). 
3.1.3 La elutriación centrífuga como método de sincronización 
La elutriación centrífuga a contracorriente es una técnica de separación de 
poblaciones celulares con diferencias en su densidad y tamaño de partícula, por 
ejemplo, células en proliferación que progresan a través de las diferentes fases del 
ciclo celular. Las células son separadas de acuerdo a sus propiedades de 
sedimentación con una mínima perturbación de sus funciones metabólicas. Durante 
el proceso de elutriación, células de diferentes tamaños suspendidas en un medio 
líquido son introducidas en una cámara de separación adaptada a un rotor 
localizado en una centrifuga (Figura 2). Dos fuerzas opuestas actúan sobre las 
células en la cámara: la fuerza centrífuga en un sentido y la velocidad de flujode 
fluido en sentido contrario, así se genera un gradiente de velocidad de 
sedimentación que es balanceado por ambas fuerzas, manteniendo las células 
flotando dentro de la cámara y separadas de acuerdo a su densidad y tamaño. Las 
células se posicionan dentro de la cámara de acuerdo a su velocidad de 
sedimentación alcanzando el equilibrio. Las células con menor tamaño y menor 
velocidad de sedimentación se posicionan cerca de la frontera de elutriación, es 
decir a la salida de cámara, mientras que las de mayor tamaño y mayor velocidad 
de sedimentación se posicionan a la entrada de la cámara de elutriación. Al 
incrementar la velocidad de flujo de fluido, el equilibrio es perturbado y las células 
abandonan la cámara de elutriación en tamaño creciente. Las células en la fase G1 
presentan aproximadamente la mitad del tamaño de las células en la fase G2, 
mientras que las células en fase S exhiben un tamaño intermedio (Davis et al., 
2001), por lo tanto, las células en la fase G1 son las primeras en salir de la cámara, 
seguidas de las células en la fase S y al final las células en la fase G2. 
 
 
8 
 
 
Figura 2. Esquema general del sistema de elutriación centrífuga. (Tomada y modificada de Amon, 
2002) 
El principio matemático de la separación mediante elutriación centrifuga a 
contracorriente está regido por la ley de Stokes, que describe la velocidad de 
sedimentación de una partícula esférica a través de un fluido viscoso. Para ello, en 
la elutriación centrifuga a contracorriente se asume que las células son esféricas, el 
flujo del fluido es laminar y la interacción entre las partículas es ignorada (Banfalvi, 
2008). La ley de Stokes indica la fuerza de arrastre (F) que se necesita para mover 
una pequeña esfera a través de un fluido continuo a una determinada velocidad de 
sedimentación (Vs), basada en el radio de la esfera (r) y la viscosidad del fluido (η), 
de acuerdo a la siguiente ecuación: 
 
 
A partir de la ecuación (1), y tras una serie de consideraciones matemáticas (anexo 
10.1), se obtiene la ecuación (2), que relaciona los flujos necesarios para obtener 
las diferentes subpoblaciones de acuerdo al tamaño de las células. 
(1) 
 
 
9 
 
 
 
De acuerdo a la ecuación (2), el flujo necesario (F) en mL/min para obtener una 
partícula está determinado por la relación entre el diámetro (d) de la partícula, la 
velocidad de la fuerza centrífuga (RPM) y una constante X específica para cada 
sistema la cual depende de la viscosidad del medio de fluido, la densidad del medio 
de fluido y el radio de la frontera de elutriación. 
3.2 Cultivos sincronizados en biotecnología farmacéutica 
Los cultivos celulares que se realizan para la optimización de los procesos de 
producción de proteínas recombinantes en la industria biotecnológica farmacéutica 
operan bajo cierta heterogeneidad producida por la transición de las células a lo 
largo del ciclo celular, lo cual impide el estudio de los procesos bioquímicos y 
fisiológicos que acontecen en las diferentes etapas del ciclo celular. La 
sincronización de líneas celulares de importancia industrial, principalmente células 
de mamífero, y su posterior cultivo sincronizado, representan una alternativa para 
el estudio de la relación entre el ciclo celular y la producción de proteínas 
recombinantes (Rosas, 2013). 
Un cultivo sincronizado puede definirse como aquel donde se consigue que una 
población celular homogénea, con células de parámetros similares (tamaño, 
contenido de ADN, etc.), transite de manera uniforme a través de las diferentes 
fases del ciclo celular y se divida al mismo tiempo (Cooper, 2003). Existen una serie 
de puntos que debe cumplir un cultivo para considerarse sincronizado, para ello se 
parte de la comparación entre un cultivo heterogéneo o no sincronizado y un cultivo 
sincronizado, y entonces se define que: a) En un cultivo sincronizado cada 
parámetro celular debe ser similar al de una célula en cada fase correspondiente 
del ciclo celular de un cultivo no sincronizado, b) el crecimiento celular no debe 
afectarse después de la sincronización y por lo tanto, la cinética de crecimiento debe 
ser comparable en ambos cultivos, c) en un cultivo sincronizado no debe haber un 
crecimiento significativo durante la fase de interdivisión o interfase y d) la 
(2) 
 
 
10 
 
distribución de ADN y tamaño debe ser comparable en ambos cultivos (Cooper y 
Sheaden, 2003; Jandt et al., 2014). 
El cultivo de células sincronizadas permite realizar un análisis detallado de las 
implicaciones del ciclo celular en los procesos celulares involucrados en la 
producción de proteínas recombinantes, así como determinar el impacto del ciclo 
celular en parámetros de calidad de las proteínas producidas como los perfiles de 
glicosilación y otras modificaciones postraduccionales; en el aumento en la 
productividad de los cultivos o en la optimización del metabolismo celular basada 
en el ciclo celular, sin embargo, muy pocos estudios existen al respecto. 
La dependencia entre la expresión de genes y las fases del ciclo celular ha sido 
usada cuantitativamente en la optimización de cultivos a gran escala (Gu et al., 
1993). Se sabe que hay ciertas proteínas nativas cuya producción es regulada por 
el mismo ciclo celular, por ejemplo las histonas o las cinasas dependientes de 
ciclinas (Lodish et al., 2009), sin embargo, con respecto a las proteínas 
recombinantes, a pesar de que se ha observado que su síntesis puede estar 
influenciada por el ciclo celular, los resultados obtenidos no han sido consistentes, 
pues en algunos casos la producción ha estado relacionada a diferentes fases del 
ciclo celular y en otros no se ha observado ninguna relación especifica (Lloyd et al., 
1999). 
Hasta el momento, se han realizado estudios para mejorar la producción de 
proteínas recombinantes en células de mamífero a través de la manipulación del 
ciclo celular utilizando métodos de arresto celular con el fin de aumentar la expresión 
de proteínas (Sunley y Butler, 2010). En células CHO se ha observado una estrecha 
relación entre el arresto del ciclo celular en la fase G1 del ciclo celular y un aumento 
en la producción de proteínas recombinantes (Kumar et al., 2007). Se ha logrado 
incrementar la expresión de proteínas recombinantes por adición de agentes 
químicos como el DMSO (Li et al., 2006; Ma et al., 2008) o el butirato de sodio 
(Hendrick et al., 2001), por ingeniería genética mediante la sobreexpresión de 
proteínas inhibitorias del ciclo celular o a través del control de las condiciones 
ambientales del cultivo, como la reducción de la temperatura (Kaufmann et al., 1999; 
 
 
11 
 
Sunley y Butler, 2010). Estos métodos de arresto suelen ser útiles, sin embargo, 
presentan desventajas importantes como la alteración del crecimiento y 
metabolismo celular sumado a que los resultados suelen ser producto de la 
detención del progreso del ciclo celular y no necesariamente son un reflejo de los 
procesos propios de cada fase en un ciclo de división normal. 
Con el uso de métodos de sincronización basados en las propiedades físicas de las 
células se ha estudiado la influencia del ciclo celular en la expresión de proteínas 
recombinantes y en la productividad de los cultivos de células de mamífero. Dutton 
et al. (2006), mediante separación por citometría de flujo, estudiaron la productividad 
dependiente del ciclo celular en células CHO produciendo activador plasminógeno 
de tejidos (tPA) recombinante encontrando una mayor expresión de tPA en la fase 
G1 del ciclo celular. Feder et al. (1989) utilizaron el método de elutriación centrífuga 
contracorriente para evaluar el patrón de expresión de la enzima dehidrofolato 
reductasa (DHFR) en cultivos de células CHO a lo largo del ciclo celular 
demostrando que la actividad y expresión de dicha enzima no cambia en las 
diferentes fases del ciclo celular. 
Esevidente que el ciclo celular juega un papel clave en la producción de proteínas 
recombinantes por lo cual es necesario implementar un sistema que permita realizar 
estudios detallados de la contribución del ciclo celular en los procesos de producción 
de proteínas recombinantes sin alteraciones en el crecimiento ni fisiología de las 
células, así, los cultivos sincronizados representan una estrategia novedosa para 
analizar a detalle la importancia y contribución del ciclo celular en los múltiples 
procesos fisiológicos y metabólicos involucrados en la producción de proteínas 
recombinantes. 
Actualmente muy pocas investigaciones han utilizado los cultivos sincronizados 
como una alternativa para evaluar la importancia de la heterogeneidad de los 
cultivos celulares en los procesos de producción de proteínas recombinantes en 
líneas celulares de importancia biotecnológica. 
Platas Barradas et al. (2014) realizaron cultivos sincronizados en biorreactor a dos 
líneas celulares de mamífero de importancia industrial (CHO-K1 y AGE1.HN) para 
 
 
12 
 
evaluar el impacto del ciclo celular en el comportamiento de los cultivos celulares y 
estudiar variaciones en diversos parámetros celulares con respecto al ciclo celular, 
como el tamaño celular o el consumo de metabolitos en cultivos sincronizados. 
En un trabajo previo del grupo de investigación, se implementó un sistema de 
sincronización celular mediante elutriación centrífuga acoplado a un sistema de 
cultivo de células sincronizadas en biorreactor bajo condiciones de cultivo 
controladas (Mendoza, 2014). Dicho sistema permite el cultivo de poblaciones 
celulares homogéneas, fisiológica y metabólicamente, lo cual permite llevar a cabo 
un análisis real (no aparente) de la contribución de los múltiples procesos celulares 
implicados en la producción de proteínas recombinantes durante las diferentes 
fases del ciclo celular. 
3.3 El consumo y producción de metabolitos en la optimización de los 
procesos de producción de proteínas recombinantes 
Con el fin de satisfacer la demanda de proteínas terapéuticas, las tecnologías de 
cultivo de células de mamífero han sido ampliamente estudiadas a tal grado que, 
hoy en día, juegan un papel clave en la industria farmacéutica biotecnológica para 
la producción de proteínas recombinantes a gran escala (Ozturk, 2006). 
Actualmente, los cultivos celulares para la obtención de proteínas recombinantes 
han sido optimizados, principalmente, mediante la manipulación y el control de las 
condiciones ambientales del cultivo, con el fin de conseguir altas densidades 
celulares y en consecuencia una alta productividad de los cultivos (Zhang, 2009). 
El metabolismo de las líneas celulares es un aspecto directamente relacionado con 
la viabilidad y el crecimiento celular por lo cual ha adquirido una notable importancia 
en los procesos de producción de proteínas recombinantes, específicamente, 
mediante la optimización del consumo de los sustratos utilizados como fuentes de 
energía, como la glucosa y los aminoácidos, y la disminución de la acumulación de 
metabolitos tóxicos, principalmente lactato y amonio (Altamirano et al., 2001). La 
regulación en el metabolismo y la fisiología celular también han sido utilizadas 
 
 
13 
 
recientemente para mejorar el crecimiento celular y la expresión de genes 
heterólogos (Zhang, 2009). 
El metabolismo de las líneas celulares de importancia industrial, específicamente 
células de mamífero, muestra un comportamiento caracterizado por el consumo de 
glucosa y glutamina como principales fuentes de energía y la secreción de lactato y 
amonio como principales productos de desecho (Dean y Reddy, 2013). Las 
concentraciones y los cambios en las cantidades de los metabolitos tienen un 
profundo significado en la predicción de la eficacia de los cultivos celulares 
(Dickson, 2014), así mismo su análisis nos da información acerca de los procesos 
celulares involucrados en la producción de proteínas recombinantes. 
En la manufactura de biotecnológicos, el monitoreo de la glucosa, la glutamina y el 
lactato suele ser una práctica de rutina debido que ofrecen un panorama general de 
la actividad metabólica del cultivo; actualmente su determinación es sencilla y dado 
que presentan una estabilidad química en el medio de cultivo su medición es precisa 
y exacta (Tsao et al., 2005). Por las razones anteriores y debido a su importancia 
en el control de los cultivos para la producción de proteínas recombinantes, en el 
presente trabajo se determinaron los metabolitos antes mencionados. Al respecto, 
escasas investigaciones han estudiado el consumo o la producción de estos 
metabolitos en cultivos sincronizados para evaluar si existen diferencias o 
variaciones en las velocidades de consumo y producción en las diferentes fases del 
ciclo celular (Platas Barradas et al., 2014). A continuación se mencionan aspectos 
generales sobre el metabolismo de los metabolitos analizados en este trabajo. 
3.3.1 Glucosa 
La glucosa es la mayor fuente de carbono y energía en los cultivos de células de 
mamífero (Tsao et al., 2005). La glucosa es metabolizada, ya sea a través de la vía 
de las pentosas-fosfato para la producción de nucleótidos y de poder reductor 
necesario para la biosíntesis de macromoléculas, o por la vía glicolítica y posterior 
ciclo de Krebs para proveer a la célula de energía e intermediarios metabólicos 
necesarios para su crecimiento y supervivencia (Zhang, 2009). No obstante, las 
moléculas de piruvato formadas a partir de la glicólisis pueden ser reducidas a 
 
 
14 
 
lactato. Cuando el flujo de conversión de glucosa a piruvato es alto y el acoplamiento 
entre la glicólisis y el ciclo de Krebs no es eficiente, la acumulación de lactato tiende 
a ocurrir en los cultivos celulares (Tsao et al., 2005). En los medios de cultivo, la 
glucosa suele estar presente a una concentración de 10 a 25 milimoles por litro 
(Pörtner, 2009), aunque esto suele depender de las necesidades nutricionales de 
cada línea celular. El control de la concentración de los niveles de glucosa en el 
medio para limitar la producción de lactato es crítica para alcanzar altas densidades 
celulares y buenos rendimientos (Zhang, 2009). 
3.3.2 Glutamina 
La glutamina representa una de las mayores fuentes de energía y de carbono en 
los cultivos in vitro de células de mamífero, así como la principal fuente de nitrógeno 
indispensable para la síntesis de purinas, pirimidinas y otros aminoácidos. La 
cantidad de glutamina presente en los medios de cultivo es variable, alcanzando los 
8 mM por litro, está cantidad es significativamente mayor comparada con otros 
aminoácidos, ya que la glutamina provee a las células del 30 al 65 % de energía 
necesaria para el crecimiento y la síntesis de proteínas (Zhang, 2009). La glutamina, 
al ser un aminoácido, es incorporada por las células mediante los sistemas de 
transporte de aminoácidos y convertida a glutamato o aspartato, aunque también 
puede incorporarse al ciclo de Krebs para la producción de energía (Pörtner, 2009). 
El principal metabolito que se origina debido al metabolismo de la glutamina es el 
amonio, el cual ha sido identificado como una de las principales sustancias 
inhibidoras del crecimiento celular pues a altas concentraciones disminuye la 
velocidad especifica de crecimiento de las células y altera la glicosilación de las 
proteínas (Zhang, 2009). 
3.3.3 Lactato 
El lactato es un metabolito que se genera principalmente a través de la glicólisis, 
mediante la reducción de piruvato a lactato, aunque cerca del 15% de la glutamina 
presente en el medio es metabolizada a lactato (Zhang, 2009). Aunque el lactato 
es un metabolito producido bajo condiciones anaeróbicas, en los cultivos celulares 
el rápido aumento en el crecimiento celular provoca un consumo de altas cantidades 
 
 
15 
 
de glucosa, la cual es metabolizadaprincipalmente a lactato debido a la saturación 
de las enzimas del ciclo de Krebs que no pueden incorporar eficientemente las 
moléculas de piruvato producidas a partir de la glicólisis (Zagari, 2012), así la 
acumulación de piruvato en el citosol induce la formación de lactato. 
La producción de lactato es monitoreada en los procesos industriales como un 
metabolito crucial en los cultivos de células de mamífero (Zagari et al., 2013) ya que 
su acumulación conduce a la acidificación de los cultivos (Tsao et al., 2010). La 
acumulación de lactato suele ser un factor limitante en los procesos de producción 
de proteínas al incrementar la presión osmótica del medio del cultivo e inhibir el 
crecimiento celular, especialmente cuando las densidades celulares son altas, por 
lo cual suele ser utilizado como un indicador del nivel de deterioro de los cultivos 
celulares (Zhang, 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
4. JUSTIFICACION 
 
La investigación en el mejoramiento de los procesos de producción de proteínas 
recombinantes se ha centrado principalmente en el estudio y modificación de la 
fisiología y metabolismo celular así como el desarrollo de novedosas estrategias de 
control de proceso. Sin embargo, los estudios realizados al respecto se han llevado 
a cabo en cultivos que por su modo de operación no permiten evaluar el impacto de 
la heterogeneidad de la población (con respecto al ciclo celular) en la dinámica de 
los bioprocesos. El cultivo de líneas celulares de manera sincronizada permite 
estudiar la relación entre el ciclo celular y aspectos celulares implicados en la 
producción de proteínas recombinantes. El estudio de la actividad metabólica en las 
diferentes fases del ciclo del celular, mediante el análisis del consumo y producción 
de diversos metabolitos de interés en una línea celular de importancia industrial 
puede contribuir al mejoramiento de las tecnologías de cultivo celular para la 
producción de proteínas recombinantes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
5. OBJETIVOS 
Objetivo general 
 Estudiar el comportamiento cinético del crecimiento y perfil de consumo y 
producción de metabolitos (glucosa, glutamina y lactato) de células CHO-S 
en cultivos sincronizados. 
 
Objetivos específicos 
 Caracterizar el comportamiento cinético del crecimiento tradicional no 
sincronizado de la línea celular CHO-S mediante cultivo en biorreactor. 
 Establecer las condiciones óptimas de sincronización de poblaciones 
heterogéneas de células CHO-S mediante el método de elutriación centrífuga 
a contracorriente y obtener células en la fase G1 del ciclo celular con alto 
grado de sincronización. 
 Determinar si existen diferencias en los perfiles de consumo y producción de 
metabolitos (glucosa, glutamina y lactato) entre cultivos sincronizados y 
cultivos no sincronizados. 
 
 
6. HIPÓTESIS 
El perfil metabólico global de un cultivo sincronizado debe ser comparable con el de 
un cultivo no sincronizado, sin embargo, debe haber diferencias en las velocidades 
de consumo y producción de metabolitos a lo largo de las diferentes fases del ciclo 
celular. 
 
 
 
 
 
18 
 
7. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
7.1 Modelo biológico 
Se utilizó como modelo biológico a la línea celular CHO-S (Gibco, Catálogo A11364-
01). Esta línea celular está diseñada para la transfección, la expresión y producción 
de proteínas recombinantes a gran escala. La clona utilizada no produce ninguna 
proteína recombinante. 
7.2 Reactivos y soluciones 
 
7.2.1 Azul tripano 0.2% 
Se pesaron 0.2 g de colorante azul tripano (Sigma Aldrich, Catálogo T07776) y se 
disolvieron en un volumen de 100 mL de PBS 1X. La solución se centrífugo a 1500 
rpm por 10 minutos y posteriormente se filtró con membrana de 0.22 micras. Se 
almacenó en tubos cónicos de 50 mL a temperatura ambiente. 
7.2.2 Bicarbonato de sodio 7.5% 
Se pesaron 7.5 g de bicarbonato de sodio (Sigma Aldrich, Catálogo S-6014) y se 
disolvieron en 100 mL de agua Milli-Q previamente esterilizada por calor. La 
solución fue filtrada posteriormente con membrana de 0.22 micras y almacenada a 
4 ºC. 
7.2.3 L-Glutamina 200 mM 
Se pesaron 2.99 g de L-Glutamina (Sigma Aldrich, Catálogo G8540), se disolvieron 
y aforaron a un volumen final de 100 mL con agua Milli-Q previamente esterilizada 
por calor. La solución fue filtrada posteriormente con membrana de 0.22 micras y 
almacenada en alícuotas de 10 mL en tubos cónicos estériles a -20 ºC. 
7.2.4 Ioduro de propidio 1mg/mL 
Se pesaron 0.010 g de ioduro de propidio (Sigma Aldrich, Catálogo P-4170) y se 
disolvieron en 10 mL de PBS 1X. La solución se almacenó en alícuotas de 1 mL a 
4 ºC protegida de la luz. 
 
 
19 
 
7.2.5 RNAsa A 10 mg/mL 
Un frasco con 50 mg de la enzima RNAsa liofilizada (Sigma Aldrich, Catálogo R-
6513) fue reconstituido con 5 mL de PBS 1X y almacenado en alícuotas de 1 mL a 
-20 ºC. 
7.2.6 Solución amortiguadora de fosfatos (PBS) 1X 
Las siguientes sales fueron pesadas para preparar una solución amortiguadora de 
fosfatos (PBS) a una concentración de 10 X: 87.2 g de NaCl, 2.0 g de KCl, 14.4 g 
de Na2HPO4 y 2.4 g de KH2PO4. Posteriormente se disolvieron y aforaron a un 
volumen de 1000 mL con agua Milli-Q previamente esterilizada por calor. Se midió 
y ajusto el pH a 7.2 con ayuda de HCL 1N y NaOH 1N. Finalmente la solución fue 
filtrada con membrana de 0.22 micras y almacenada a 4 ºC. 
Para preparar la solución de PBS 1X, se tomaron 100 mL de la solución PBS 10X 
y se aforaron a un volumen de 1000 mL con agua Milli-Q previamente esterilizada 
por calor. La solución se filtró con membrana de 0.22 micras y se almacenó a 4 
ºC. 
7.2.7 Solución amortiguadora de fosfatos de Dulbecco (DPBS) 1X 
Se pesaron las siguientes sales para preparar una solución de DPBS a una 
concentración de 10X: 80.1 g de NaCl, 2.01 g de de KCl, 11.5 g de de Na2HPO4, 
2.0 g de KH2PO4 y 0.374 g de EDTA, y se disolvieron en 1000 mL de agua Milli-Q 
previamente esterilizada por calor. Se midió y se ajustó el pH a 7.2 con ayuda de 
HCl 1N y NaOH 1N. La solución fue filtrada con membrana de 0.22 micras y 
almacenada a 4 ºC. 
Para preparar la solución DPBS 1X, se tomaron 100 mL de la solución DPBS 10X y 
se aforaron a un volumen de 1000 mL con agua Milli-Q previamente esterilizada por 
calor. La solución se suplemento con 2 mM de L-Glutamina y 11mM de D-Glucosa. 
La solución fue filtrada con membrana de 0.22 micras y almacenada a 4 ºC. 
 
 
 
 
20 
 
7.3 Medios de cultivo 
El medio utilizado para el mantenimiento, propagación y realización de todos los 
cultivos de la línea celular fue el medio químicamente definido Cell Vento CHO-100 
(Merck, Catálogo 1.00899). Este medio está especialmente diseñado para el 
crecimiento y cultivo de la línea celular CHO-S. El medio fue suplementado con 2 
g/L de bicarbonato de sodio, Glutamina 8 mM y Antibiótico-Antimicótico 1X (Gibco, 
Catálogo 15240-062). 
7.4 Mantenimiento celular 
 
7.4.1 Congelación y criopreservación celular 
Se realizó un banco celular de 20 crioviales con 5 a 10 millones de células por mL. 
Para ello se preparó un cultivo celular y se propagó hasta alcanzar la densidad 
celular requerida. Las células fueron centrifugadas a 800 rpm por 10 minutos y 
resuspendidas con 9 mL de sobrenadante. Posteriormente fueron colocadas en un 
baño de hielo y se les adicionó una mezcla, previamente preparada, de 9 mL de 
medio de cultivo y 2 mL de DMSO. Se dispensó un mL de la suspensión celular por 
cada criovial y se congelaron de manera progresiva a -30 ºC, -70 °C y finalmente 
en nitrógeno líquido. 
7.4.2 Descongelamiento y propagación celular 
A partir del banco celular preparado, se tomó un criovial, se descongelaron las 
células y se suspendieron en 4 mL de medio de cultivo. Posteriormente se 
centrifugaron a 800 rpm durante 10 minutos y el botón celular fue resuspendido en 
5 mL de medio de cultivo.Las células fueron cultivadas y propagadas en un frasco 
T-75 con 15 mL de volumen final y se incubaron a 37 ºC, 5 % de CO2 y humedad a 
saturación. 
 
 
 
 
 
21 
 
7.5 Cultivo celular 
 
7.5.1 Cultivo en frascos Spinner 
Las células fueron cultivadas en frascos tipo Spinner con agitación a 180 rpm en 
volúmenes de 20 mL y 50 mL. Las condiciones de incubación fueron: 37 ºC, 5 % de 
CO2 y humedad a saturación. Los cultivos en Spinner fueron utilizados para 
mantenimiento, propagación celular, preparación de inóculos para cultivos en 
biorreactor y cultivos de células sincronizadas. 
7.5.2 Cultivo en Biorreactor 
Se realizaron cultivos en biorreactores de 500 mL de volumen nominal, con 
volúmenes de 200 a 300 mL de trabajo para realizar la caracterización cinética de 
la línea celular. Así mismo, cultivos en biorreactor fueron utilizados para obtener las 
densidades celulares necesarias para llevar a cabo las separaciones celulares. 
El control de los parámetros del cultivo se llevó a cabo mediante el software 
myControl el cual regula el pH, oxígeno disuelto, agitación y temperatura de acuerdo 
valores predeterminados. El monitoreo de las condiciones de cultivo así como el 
despliegue y la adquisición de datos se realizó mediante el software BioXpert V.2, 
el cual esta acoplado al software myControl y grafica en tiempo real los parámetro 
de cultivo y sus controles. 
 
7.5.2.1 Preparación del Biorreactor 
7.5.2.1.1 Calibración del electrodo de pH 
A través del software my-Control, se calibró el electrodo de pH, previo a la 
esterilización del biorreactor. Para ello, se conectó el electrodo de pH a la unidad de 
control y se calibró a dos valores de pH a temperatura constante, con ayuda de 
buffers de pH 7 y pH 4, de acuerdo a lo establecido en el manual. 
 
 
 
22 
 
7.5.2.1.2 Lavado y esterilización del biorreactor 
Antes de esterilizar el biorreactor, se realizó un lavado a la jarra y al sistema de 
conexiones con una solución de detergente Extran al 5% con un posterior enjuague 
exhaustivo con agua destilada y agua Milli-Q. Se colocaron 200 mL de agua Milli-Q 
a la jarra de cultivo y se instalaron los electrodos de pH y oxígeno disuelto. El filtro 
de la salida de gases del biorreactor se dejó abierto para evitar la presurización del 
sistema durante el proceso de esterilización. 
La esterilización del biorreactor se llevó a cabo por calor húmedo en autoclave a 
121 ºC durante 20 minutos. 
7.5.2.1.3 Calibración del electrodo de oxígeno disuelto 
Antes de la calibración, el electrodo de oxígeno disuelto (OD) se conectó a la unidad 
de control durante un periodo de 4 horas para polarizarlo. Una vez transcurrido el 
tiempo de polarización, se llevó a cabo la calibración del electrodo a la temperatura 
de trabajo (37 ºC), a dos porcentajes de oxígeno de disuelto de acuerdo a la 
saturación con aire: 100 % y 0 %. Para el primer punto, se inyectó aire al sistema 
hasta el punto de saturación, lo cual es interpretado por el software como 100% de 
OD. Para el segundo punto, se inyectó nitrógeno al sistema, hasta el punto de 
saturación, lo cual es interpretado por el software como 0% de OD. 
7.5.2.2 Inoculación del biorreactor 
Se introdujo el medio del cultivo al biorreactor y se activaron los controles de pH, 
OD y temperatura, previo a la inoculación de las células. El biorreactor fue inoculado 
a una densidad de 0.2x106 células/mL, a partir de cultivos en frascos Spinner en 
fase exponencial y con viabilidad mayor al 90 %. 
7.5.2.3 Control de las condiciones del cultivo 
Los cultivos en biorreactor fueron operados bajo las siguientes condiciones: pH 7.2, 
OD 50 %, temperatura 37 ºC y agitación a 200 rpm. Estos parámetros fueron 
controlados de manera automática a través de la unidad del control del sistema 
acoplada al software my-Control. El pH fue controlado mediante una bomba de 
 
 
23 
 
inyección manual de bicarbonato de sodio al 7.5 % y con inyección de CO2. El 
porcentaje de oxígeno disuelto se controló con inyección de N2 y O2. La temperatura 
fue controlada con ayuda de una manta de calentamiento. El sistema de agitación 
se llevó a cabo con un impulsor de paletas inclinadas específico para el cultivo de 
células de mamífero. La aeración del sistema se realizó por burbujeo a un flujo de 
gases máximo de 5 mL/min para evitar la generación de espuma en el cultivo. 
7.5.2.4 Muestreo 
Para el monitoreo de la concentración y viabilidad celular, se colectaron muestras 
de 0.5 mL a través del puerto de toma de muestra. Las muestras fueron tomadas 
en condiciones de esterilidad y con ayuda de vacío. 
7.6 Cinéticas de crecimiento 
Se realizaron cinéticas de crecimiento celular a partir de cultivos en biorreactor, los 
cuales fueron inoculados a 0.2 x 106 cel/mL y muestreados cada 24 horas hasta 
alcanzar una disminución de la viabilidad celular del 70%. En cada tiempo de 
muestreo se realizó la determinación de viabilidad y concentración celular por el 
método de exclusión con azul tripano en hematocitómetro y la determinación de las 
concentraciones de los metabolitos: glucosa, glutamina y lactato. 
7.7 Sincronización celular 
7.7.1 Sistema de sincronización celular 
Se realizaron separaciones celulares de poblaciones heterogéneas de la línea 
celular mediante el sistema de cultivo de células sincronizadas, implementado y 
descrito por Mendoza, 2014. Este sistema está compuesto por un sistema de cultivo 
de células en biorreactor acoplado a un sistema de elutriación centrífuga a 
contracorriente acoplado a su vez con un segundo biorreactor para el posterior 
cultivo de las células sincronizadas en las diferentes fases del ciclo celular (Figura 
3). 
El sistema de elutriación centrífuga a contracorriente que se utilizó está compuesto 
por un rotor JE-6B (Beckman Instruments) con cámara de elutriación estándar, una 
 
 
24 
 
ultracentrífuga J2-21 (Beckman Instruments) utilizada para otorgar la velocidad de 
fuerza centrífuga, una cámara de mezclado que evita la presurización del sistema 
por la entrada de burbujas de aire y una bomba peristáltica MiniPuls 3 (Gilson) que 
permite generar el flujo de fluido constante del medio de elutriación a través del 
sistema de elutriación, en sentido contrario a la velocidad de la fuerza centrífuga en 
el rotor. 
 
Figura 3. Esquema de sistema de sincronización y cultivo de células sincronizadas. 1) Cámara de 
elutriación estándar. 2) Ultracentrífuga J2-21 (Beckman Instruments). 3) Cámara de mezclado 4) 
Bomba peristáltica Minipuls 3 (Gilson). 5) Medio de elutriación. 6) Sistema de inyección de muestra 
del reactor hacia la cámara de elutriación (loop de inyección). 7) Minibiorreactor instrumentado de 
500 mL. 8) Minibiorreactor instrumentado de 250 mL. 9) Cosecha de células sincronizadas o desecho 
de poblaciones no deseadas (Tomado de Mendoza, 2014). 
En el presente trabajo se realizaron las siguientes modificaciones al sistema 
mostrado en la Figura 3: 1) la inyección de las células se realizó de modo manual 
y 2) el cultivo de células sincronizadas se realizó en frascos Spinner. 
 
 
 
 
 
25 
 
7.7.2 Elutriación centrífuga de las poblaciones celulares 
7.7.2.1 Condiciones de elutriación 
Se conectó y montó el sistema de elutriación (bomba peristáltica-rotor-
ultracentrífuga) y se ajustaron los parámetros de elutriación. La velocidad del rotor 
se ajustó a 2000 rpm y la velocidad del flujo de la bomba se estableció al flujo 
mínimo, es decir 2 mL/min. La presión interna del sistema se vigiló que no 
sobrepasará las 10 libras con el fin de evitar la presurización del sistema. 
7.7.2.2 Preparación y sanitización del sistema de elutriación 
Una vez conectado el sistema, se encendió la bomba al flujo de trabajo determinado 
y posteriormente se encendió el rotor a la velocidad de trabajo establecida. Con el 
sistema en funcionamiento, se pasó etanol al 70% durante 15 minutos con fin de 
lavary sanitizar el sistema. Posteriormente, se hizo fluir PBS 1X durante 15 minutos 
para lavar y eliminar los restos de etanol. Finalmente, se hizo circular al sistema 
DPBS 1X, el cual se utilizó como medio de elutriación, y se dejó en circulación hasta 
la recolección de las fracciones de interés. 
7.7.2.3 Calibración de la bomba peristáltica 
Previo a la recolección de las fracciones de interés, se realizó la calibración de la 
bomba peristáltica. Para ello, con el medio de elutriación en circulación, se tomaron 
cinco muestras a diferentes velocidades de la bomba peristáltica en tubos cónicos 
de 50 mL. A cada velocidad determinada, se recolectaron volúmenes del medio de 
elutriación durante un minuto, estos volúmenes corresponden a la velocidad de flujo 
(mL/min) para cada velocidad (rpm) de la bomba peristáltica. Con los valores 
obtenidos, se construyó una curva de calibración que relaciona la velocidad de la 
bomba necesaria para obtener cada flujo de interés. 
7.7.2.4 Determinación de los flujos de interés 
Con los datos de la distribución de tamaño de la población y con ayuda de la 
ecuación simplificada de la ley de Stokes, se determinaron los flujos necesarios para 
 
 
26 
 
obtener las diferentes subpoblaciones de interés, de acuerdo al tamaño de las 
células. 
7.7.2.5 Pretratamiento celular con tripsina 
A partir de los cultivos en biorreactor, se recolecto el volumen de células a inyectar 
a la cámara de elutriación y se les realizó un pretratamiento con una solución de 
tripsina 0.25 % - EDTA 0.02% (Invitro, Catálogo EN-003). Para ello, se añadió el 
volumen de tripsina necesario a las células (de acuerdo al volumen de células a 
inyectar) y se incubaron a 37 ºC, con agitación a 180 rpm, durante 15 minutos. 
Posteriormente, las células fueron centrifugadas a 800 rpm durante 10 minutos, con 
el fin de eliminar la tripsina, y resuspendidas en 5 mL de medio de elutriación (DPBS 
1X). 
7.7.2.6 Inyección de la población celular no sincronizada 
Se realizó la inyección de las células de modo manual a través de una válvula 
instalada en la cámara de mezclado. Con ayuda de una jeringa estéril, se tomó el 
volumen de las células a inyectar y se introdujeron al sistema con precaución de 
evitar que el flujo de inyección fuera mayor al flujo de recolección de las muestras. 
Una vez que se inyectaron las células al sistema, se incrementó lentamente la 
velocidad de la bomba peristáltica hasta alcanzar el flujo en el cual las células de 
menor tamaño se encontrarán en la frontera de elutriación. 
7.7.2.7 Recolección de las fracciones de interés 
Una vez alcanzado el flujo de interés, se recolectaron, en condiciones de esterilidad, 
las fracciones celulares aumentando la velocidad de la bomba a razón de que el 
flujo de fluido se incrementará 1-2 mL/min. Una vez colectadas las fracciones de 
interés, se aumentó la velocidad de la bomba peristáltica al máximo para desechar 
el resto de la población celular no sincronizada del sistema de elutriación. 
Finalmente, el sistema fue lavado e inundado con etanol al 70 %, y se desconectó 
la ultracentrífuga y la bomba peristáltica. 
 
 
 
27 
 
7.7.3 Barrido celular 
De acuerdo al procedimiento general de elutriación centrífuga, se realizó un barrido 
de la población celular no sincronizada para obtener subpoblaciones celulares en 
las diferentes fases del ciclo celular. Para ello se calcularon los flujos necesarios 
para obtener las fracciones que representarán las diferentes fases del ciclo celular, 
de acuerdo a la distribución del tamaño de las células. El barrido celular se realizó 
partiendo de 3.5x108 células no sincronizadas en crecimiento exponencial. A las 
fracciones colectadas, se les determinó la concentración celular y se realizó el 
análisis de ciclo celular en base a contenido de ADN. 
7.7.4 Obtención de poblaciones celulares sincronizadas en la fase G1 del ciclo 
celular 
A partir de los resultados del barrido celular, se identificaron las fracciones celulares 
en los cuales se obtuvo la subpoblación G1 con mayor pureza y en mayor 
concentración. Las elutriaciones celulares para obtención de la fase G1 del ciclo 
celular se realizaron también a partir de 3.5x108 células no sincronizadas. Se 
colectaron las fracciones en condiciones de esterilidad para el posterior cultivo de 
las células. A las fracciones de interés, se les determino concentración celular y 
viabilidad y se les realizó análisis de ciclo celular por contenido de ADN. 
7.8 Cultivo sincronizado de células 
Se realizaron cultivos a partir de las fracciones celulares sincronizadas en la fase 
G1 del ciclo celular, las cuales fueron centrifugadas a 800 rpm durante 10 minutos 
y resuspendidas en medio de cultivo Cell Vento CHO-100 suplementado con 8 mM 
de L-Glutamina inmediatamente después de su separación. Los cultivos fueron 
realizados en frascos Spinner con 20 mL de volumen de trabajo a concentraciones 
celulares iniciales de 1.5-2 x 106 células/mL e incubados a 37 ºC, 5 % de CO2, 
agitación a 180 rpm y humedad a saturación. Se realizó un muestreo cada dos horas 
para determinar concentración y viabilidad celular, concentración de los metabolitos 
(glucosa, glutamina y lactato) y análisis de ciclo celular, durante un periodo de 28 
horas. 
 
 
28 
 
A la par, se realizaron cultivos típicos no sincronizados (cultivos control), a partir de 
poblaciones celulares no sincronizadas, los cuales fueron cultivados bajo las 
mismas condiciones que los cultivos sincronizados y a los cuales se les realizaron 
las mismas determinaciones. 
7.9 Determinaciones analíticas 
7.9.1 Determinación de la concentración y viabilidad celular 
La concentración celular y viabilidad se determinó mediante el método de exclusión 
por azul tripano con ayuda de un hematocitómetro. La tinción con el colorante azul 
tripano es utilizada como un indicador de la integridad de la membrana, de manera 
que las células viables no permiten la difusión del colorante y se observan 
refringentes y las células no viables o muertas permiten la difusión de colorante y 
se observan teñidas de color azul. 
7.9.2 Determinación del tamaño celular 
El tamaño celular relativo de la población heterogénea de la línea celular se 
determinó a través de un contador electrónico Coulter Multisizer 3 con un tubo de 
apertura de 70 µm y utilizando solución salina como electrolito. La calibración del 
equipo se llevó a cabo con esferas de latéx de diámetro conocido. Una vez calibrado 
el equipo, se hace pasar la solución conteniendo las células a través de un orificio 
a la cual se le aplica un voltaje. Al fluir las partículas por el orificio se genera un 
pulso del voltaje o un pico, la altura del pico es medida y comparada con los datos 
obtenidos de una muestra de látex estándar. 
7.9.3 Análisis del ciclo celular por contenido de ADN mediante citometría de 
flujo 
Se realizó el análisis del ciclo celular de las fracciones celulares obtenidas por 
elutriación centrífuga para evaluar su pureza, así como de los cultivos sincronizados 
para evaluar su progresión a lo largo del ciclo celular. 
El análisis del ciclo celular se realizó mediante una tinción del ADN celular con el 
colorante fluorescente ioduro de propidio y su posterior análisis mediante citometría 
 
 
29 
 
de flujo. Se tomaron 1x106 células de las muestras a analizar y se fijaron en tubos 
para citómetro conteniendo 2 mL de etanol al 70 % previamente enfriado a -20 ºC, 
con agitación en vórtex y por goteo. Las células fijadas en etanol fueron colocados 
a -20 ºC durante un tiempo mínimo de 1 hora. Transcurrido el tiempo de fijación, las 
células fueron lavadas del etanol centrifugando a 1500 rpm durante 10 minutos, se 
decantó el etanol y el paquete celular fue resuspendido en 1 mL de PBS 1X frío, 
posteriormente se centrífugo nuevamente a 1500 rpm por 10 minutos y se eliminó 
el sobrenadante. Al pellet celular sele adicionaron en el orden mencionado: 10 µL 
de RNAsa (10 mg/mL), 40 µL de ioduro de propidio (1 mg/mL) y 950 µL de PBS 1X. 
Finalmente, se incubaron las células durante 20 minutos a 37 ºC en ausencia de 
luz. 
Las células teñidas fueron leídas en un citómetro de flujo Facs Calibur (Becton 
Dickinson) el cual cuenta con el software de análisis CellQuest. Las muestras fueron 
adquiridas a una velocidad de 12 µL por minuto y los gráficos se generaron a partir 
de un análisis de 10 000 eventos usando los detectores FSC (dispersión de luz 
frontal proporcional al tamaño celular), SSC (dispersión de la luz lateral proporcional 
a la complejidad celular), FL2-Area y FL2-Ancho (intensidad de fluorescencia 
proporcional al contenido de ADN celular), con un umbral de lectura en el detector 
FSC-H. 
7.9.4 Cuantificación de la concentración de metabolitos 
Se realizó la cuantificación de los metabolitos: glucosa, glutamina y lactato, en 
cultivos sincronizados y cultivos control no sincronizados. Las concentraciones de 
los metabolitos a cada tiempo de muestro se determinaron mediante el 
multianalizador enzimático YSI 2950 (Yellow Spring Instruments CO). El 
multianalizador YSI utiliza membranas con enzimas inmovilizadas de glucosa 
oxidasa para la determinación de glucosa, L-lactato oxidasa para la determinación 
de lactato y glutaminasa/L-glutamato oxidasa para la determinación de glutamina y 
glutamato. Dichas enzimas catalizan una reacción oxidativa entre el sustrato a 
determinar y el oxígeno, formando un derivado y peróxido de hidrógeno, este último 
es oxidado en el ánodo de platino de una sonda lo cual genera una corriente 
 
 
30 
 
eléctrica que es linealmente proporcional a la concentración de peróxido de 
hidrogeno. A su vez la concentración de peróxido de hidrógeno es linealmente 
proporcional a la concentración del metabolito. 
7.10 Consideraciones matemáticas 
7.10.1 Velocidad específica de crecimiento y tiempo de duplicación 
La velocidad específica de crecimiento (µ) de la línea celular se determinó por medio 
de la regresión lineal del gráfico de ln (X/Xo) vs tiempo, con los datos 
correspondientes a la fase exponencial de crecimiento, de acuerdo a la siguiente 
ecuación: 
dX/dt = µX (1) 
Integrando 
Ln (X/Xo) = µt (2) 
Donde X y Xo corresponden a la concentración de células viables al tiempo t y al 
inicio del cultivo. 
El tiempo de duplicación (td) se determinó a partir del valor de la velocidad específica 
de crecimiento de acuerdo a la siguiente ecuación. 
td = ln2 / µ (3) 
7.10.2 Velocidades específicas de consumo/producción de metabolitos 
Las velocidades específicas de consumo y producción de los metabolitos (qS) en 
los cultivos realizados en biorreactor se determinaron de acuerdo a la siguiente 
ecuación: 
𝑞𝑆 = (
[𝑆]𝑓 − [𝑆]𝑖
𝑋𝑣𝑓 − 𝑋𝑣𝑖
) 𝜇 
en donde [S] corresponde a la concentración del sustrato/producto a determinar al 
tiempo final e inicial del cultivo, Xv corresponde a la concentración de células viables 
 
 
31 
 
al tiempo final e inicial del cultivo y µ corresponde a la velocidad específica de 
crecimiento. 
En los cultivos sincronizados y no sincronizados realizados en frascos Spinner, las 
velocidades específicas de consumo y producción de metabolitos se determinaron 
de acuerdo a la siguiente ecuación: 
𝑞𝑆 = 
(
[𝑆]𝑓 − [𝑆]𝑖
𝑋𝑣𝑓 − 𝑋𝑣𝑖
)
𝑡
 
en donde [S] corresponde a la concentración del sustrato/producto a determinar al 
tiempo final e inicial del cultivo, Xv corresponde a la concentración de células viables 
al tiempo final e inicial del cultivo y t corresponde a la duración del cultivo. 
7.11 Análisis estadístico de los datos 
Los cultivos sincronizados y cultivos control no sincronizados en Spinner fueron 
realizados por triplicado. Los parámetros cinéticos y estequiométricos 
(concentración de células, velocidad específica de crecimiento, concentraciones de 
los metabolitos y velocidades específicas de consumo/producción de metabolitos) 
de ambos cultivos están expresados como la media ± desviación estándar del 
promedio de los cultivos analizados. 
Para determinar si existía diferencia significativa entre el consumo global de glucosa 
y glutamina, la producción de lactato y las velocidades específicas de 
consumo/producción de metabolitos en cultivos sincronizados vs cultivos no 
sincronizados se realizó una prueba t de Student para muestras independientes 
mediante el programa de análisis estadístico Prisma 6.0 a un nivel de significancia 
de 0.05 (95% de confianza). 
 
 
 
 
 
 
32 
 
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
8.1 Caracterización cinética del crecimiento y perfil de metabolitos de 
cultivos no sincronizados de células CHO-S en biorreactor 
Con el objetivo de caracterizar y estudiar el crecimiento y perfil de consumo y 
producción de metabolitos en cultivos típicos no sincronizados de células CHO-S, 
se realizaron cultivos en minibiorreactores a condiciones de cultivo controladas. En 
la Figura 4 se presenta el perfil de crecimiento, el perfil de consumo y producción 
de los metabolitos y el control de las condiciones de cultivo en biorreactor de un 
cultivo representativo. 
La concentración inicial del cultivo mostrado en la Figura 4 fue de 0.2x106 
células/mL. La duración de la cinética de crecimiento fue de 144 horas, tiempo en 
el cual las células se encontraron a una viabilidad de 30%. La concentración máxima 
de células viables fue de 4.4x106 células/mL alcanzada a las 120 horas de cultivo. 
La velocidad específica de crecimiento se determinó con los datos correspondientes 
a la fase de crecimiento exponencial, es decir, hasta las 96 horas de cultivo. A las 
condiciones de cultivo establecidas, se determinó una velocidad específica de 
crecimiento de 0.0331 horas-1 equivalente a un tiempo de duplicación de 20.94 
horas. 
El control del pH requirió la adición de una solución de bicarbonato de sodio al 7.5% 
aproximadamente a partir de las 72 horas de cultivo ya que se presentó una 
disminución drástica de pH probablemente causada por la acumulación de 
productos del metabolismo celular (Zhang, 2009). El control de oxígeno disuelto 
(OD) presento variaciones mínimas causadas por el burbujeo presente en el cultivo 
conforme se incrementaba la concentración celular, sin embargo, mediante la 
inyección de aire y N2 fue posible mantener un control adecuado. 
 
 
 
 
 
33 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Caracterización cinética de células CHO-S en biorreactor. A) Control de las variables del 
cultivo en biorreactor (pH, temperatura y % de oxígeno disuelto) B) Perfil cinético de crecimiento 
celular, Xv: concentración de células viables; Xt: concentración de células totales; Viab.: % de 
Viabilidad. C) Perfil de metabolitos: glucosa, glutamina y lactato. 
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 24 48 72 96 120 144
G
lu
ta
m
in
a
 (
m
M
)
G
lu
c
o
s
a
/L
a
c
ta
to
 (
m
M
)
Tiempo (horas)
Glucosa
Lactato
Glutamina
0
20
40
60
80
100
0
1
2
3
4
5
6
7
V
ia
b
il
id
a
d
 (
%
)
C
o
n
c
e
n
tr
a
c
ió
n
 c
e
lu
la
r 
(c
é
lu
la
s
/m
L
 x
 1
0
6
)
Xv
Xt
Viab.
0
20
40
60
80
100
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
T
e
m
p
e
ra
tu
ra
 (
ºC
) 
/ 
%
 O
D
p
H
pH Temperatura (ºC) % OD
5
7 
0 
100 
 0 
40 
0 
8 
A 
B 
C 
 
 
34 
 
Durante el progreso de la cinética de crecimiento celular se llevó a cabo el muestreo 
de los metabolitos: glucosa, glutamina y lactato. Las concentraciones iniciales de 
glucosa y glutamina presentes en el medio de cultivo fueron 35 mM y 6.5 mM 
respectivamente. Dichos metabolitos son los principales componentes en el medio 
de cultivo ya que proveen los precursores necesarios para las vías biosínteticas y 
la producción de energía (Godiá y Cairó, 2006). 
A las 120 horas de cultivo se observó un agotamientode los niveles de glucosa y 
glutamina presentes en el medio de cultivo. La viabilidad de las células en la mayoría 
de las líneas celulares de mamífero suele declinar rápidamente una vez que se 
agotan los niveles de glucosa, sin embargo, algunas líneas celulares pueden crecer 
y adaptarse en condiciones de agotamiento de glutamina siempre y cuando existan 
aún niveles de glucosa presentes (Zhang, 2009). Para el caso de las células CHO-
S, el agotamiento de ambos metabolitos (glucosa/glutamina) sucede de manera 
simultánea, lo cual explica porque la viabilidad celular disminuye drásticamente al 
no haber sustratos disponibles que puedan incorporarse al metabolismo celular 
(Pörtner, 2009). 
Con respecto a la concentración de lactato, la mayor producción se observó a las 
96 horas de cultivo alcanzando una concentración máxima de 32 mM. La alta 
concentración de glucosa presente en el medio de cultivo puede explicar los altos 
niveles de producción de lactato ya que el flujo de conversión de glucosa a piruvato 
es alto y el acoplamiento entre la glicólisis y el ciclo de Krebs es deficiente (Tsao et 
al., 2005). La acumulación de lactato por encima de 26-60 mM puede ser esperada 
en cultivos con concentraciones iniciales de glucosa de 30 mM (Takagi et al, 2001). 
Estos altos niveles de lactato presentes en los tiempos finales del cultivo explican 
también la disminución en la viabilidad de las células. El lactato es un metabolito 
que presenta alta toxicidad celular incluso en cultivos que estén bajo el control del 
pH (Tsao et al, 2005). 
Las velocidades específicas de consumo y producción de metabolitos se 
determinaron a partir de los datos correspondientes a la fase exponencial de 
crecimiento ya que durante esta etapa no existe una limitación de nutrientes. Las 
 
 
35 
 
velocidades específicas de consumo de glucosa (qGlc) y glutamina (qGln) fueron 
0.212 pmol/cel*h y 0.038 pmol/cel*h respectivamente, mientras que la velocidad 
específica de producción de lactato (qLac) fue de 0.226 pmol/cel*h. 
En la Tabla 1 se resumen los parámetros cinéticos determinados en el presente 
trabajo para la línea celular utilizada y se comparan con datos existentes en la 
literatura para otras líneas celulares del mismo linaje. 
Morales (2015) realizó cultivos utilizando la misma línea celular utilizada en el 
presente trabajo en frascos Spinner y utilizando un medio de cultivo diferente 
(FreeStyle®). La velocidad específica de crecimiento y las velocidades específicas 
de consumo de glutamina y de producción de lactato fueron similares a las 
determinadas en el presente trabajo, sin embargo, la velocidad específica de 
consumo de glucosa obtenida en esté trabajo fue aproximadamente el doble a la 
reportada en su estudio. Lo anterior puede atribuirse a la diferencia en las 
condiciones medioambientales de cultivo pues se ha observado que los parámetros 
cinéticos y rendimientos varían significativamente bajo condiciones de cultivo 
diferentes (Xie y Shou, 2006; Pörtner, 2009), siendo influenciados principalmente 
por las concentraciones de los sustratos, la proporción entre la glucosa y glutamina, 
la velocidad específica de crecimiento, la concentración de oxígeno disuelto, el pH 
y la temperatura del cultivo (Häggstrom, 2003). El rendimiento lactato/glucosa 
determinado en su estudio fue el doble al determinado en el presente trabajo lo cual 
puede indicar un consumo de glucosa menos eficiente en la producción de energía 
y de intermediarios necesarios para el metabolismo. El lactato es producido 
usualmente en un rango de 1.1 a 1.7 moles de lactato por cada mol de glucosa 
(Pörtner, 2009). En general, se observa una mayor eficiencia en el metabolismo de 
las células cultivadas en biorreactor debido al control de las condiciones 
ambientales de cultivo. 
 
 
36 
 
 
 
Tabla 1. Parámetros cinéticos de diferentes tipos de líneas celulares CHO (tomado y modificado de Morales, 2015) 
Referencia Línea 
celular 
µ 
(hrs-1) 
Td 
(hrs) 
qGlc 
(pmol/cel*h) 
qGln 
(pmol/cel*h) 
qLac 
(pmol/cel*h) 
YLac/Glc 
Presente trabajo CHO-S 0.033 20.94 0.212 0.038 0.226 1.1 
Morales, 2015 CHO-S 0.037 19.02 0.119 0.045 0.282 2.4 
Barrios, 2014 
CHO 
DG44 0.025 27.73 0.131 0.041 0.169 1.2 
Ahn y 
Antoniewicz, 
2011 
CHO-K1 0.033 21.01 0.201 0.036 0.299 1.5 
 
 
37 
 
 
Con respecto al estudio de Barrios (2014) realizado en células CHO-DG44 
cultivadas bajo las mismas condiciones ambientales y en el mismo medio de cultivo 
utilizado en el presente trabajo, la velocidad específica de crecimiento, la velocidad 
específica de consumo de glucosa y la velocidad específica de producción de lactato 
fueron inferiores con respecto a las determinadas para las células CHO-S, sin 
embargo la velocidades específica de consumo de glutamina y el YLac/Gluc fueron 
comparables. En el estudio analizado para células CHO-K1 (Ahn y Antoniewicz, 
2011) se puede observar que los parámetros cinéticos son similares a los 
determinados en células CHO-S. 
Con el fin de evidenciar el crecimiento heterogéneo típico en un cultivo no 
sincronizado se determinó el perfil de crecimiento y el perfil del ciclo celular de las 
células CHO-S durante el tiempo correspondiente a un ciclo de duplicación en fase 
exponencial a partir de una de las cinéticas realizadas en biorreactor. Para ello, una 
vez que las células alcanzaron una concentración celular de 1x106 células/mL se 
tomaron muestras cada dos horas durante un periodo de 24 horas hasta alcanzar 
la duplicación celular. El perfil de crecimiento, el control de las condiciones de cultivo 
y el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular del cultivo analizado se 
presenta en la Figura 5. 
De acuerdo a lo esperado, el perfil cinético de crecimiento mostró un 
comportamiento exponencial alcanzando una concentración de 2.146x106 
células/mL después de 24 horas de monitoreo. Durante el periodo analizado se 
determinó una velocidad específica de crecimiento de 0.0343 horas-1 y un tiempo 
de duplicación de 20.21 horas, estos resultados concuerdan con los valores 
calculados a partir de la cinética de crecimiento mostrada en la Figura 4 (µ=0.0331 
horas-1 y td= 20.94 horas). 
 
 
 
 
38 
 
 
Figura 5. Crecimiento de células CHO-S cultivadas en biorreactor durante un ciclo de duplicación en 
la fase de crecimiento exponencial. A) Control de las variables de cultivo en biorreactor, B) Perfil 
cinético de crecimiento, Xv: concentración de células viables; Xt: concentración de células totales; 
%Viab.: % de Viabilidad. C) Porcentaje relativo de células en cada fase del ciclo celular durante un 
ciclo de duplicación de células CHO-S. 
A 1.5 
B 
e 
, 
• 
" • 
~ & 
, ~ 
o • 
<" 
o , .-" . -. 0 -· ' o . o o 
0-
U 
• • , 
, 
, 
,., 
>.> 
, 
.., 
, 
,., 
, 
" 
" 
·~ Ñ 40 ." " . .. ;:: JI) 
Ee> 
¡ lo 2il 
o 
" o • " , 
.Á 
~ 
- pH - Terrp. (OC) - % CD 
j .... 
- X< - x. 
_ %Viab 
~ ... 
"'- & 
____ " Gl - " __ " Gl 
o 2 4 6 8 10 12 14 16 1 ~ 2il 22 U 
Tiempo (horas) 
'" ., 
e ., e 
~ 
" " U L • 
" " , -.. • " • ., • , 
" • " 
" , 
'" ., ., 
" " • " " o • 
" > .. -., 
" 
" , 
 
 
39 
 
El análisis de ciclo celular en un ciclo de duplicación de un cultivo de células no 
sincronizadas mostró la heterogeneidad de la población provocada por la transición 
de las células a través del ciclo celular. Durante el ciclo de duplicación analizado las 
células se encontraron segregadas en las diferentes fases del ciclo celular 
aproximadamente en la misma proporción. En promedio, los porcentajes de células 
en cada fase del ciclo celular fueron: %G1: 33.16 ± 2.62, %S: 48.22 ± 2.44 y %G2/M: 
16.42 ± 1,82. 
Además de permitir la caracterización del comportamiento cinético de la línea celular 
en un sistema de cultivo bajo condiciones controladas, los cultivos en biorreactor 
fueron realizados con el fin de obtener densidades celulares suficientes para llevar