Suplementação de Ácidos Graxos Ômega-3 em Pacientes com Distrofia Muscular

•

Biológicas / Saúde

Estudiando Medicina

27/7/2022

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE MEDICINA
BIOMEDICINA

EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS OMEGA - 3 SOBRE EL
ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE/BECKER

TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
PRESENTA:
ALMEIDA BECERRIL TOMÁS

TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. MARICELA RODRÍGUEZ CRUZ
CENTRO MÉDICO NACIONAL SIGLO XXI, IMSS
COMITÉ TUTOR: DR. RENÉ DE JESÚS CÁRDENAS VÁZQUEZ
FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM
DR. FAUSTO SÁNCHEZ MUÑOZ
INSTITUTO NACIONAL DE CARDIOLOGÍA “IGNACIO CHÁVEZ”

MÉXICO, CD. MX., DICIEMBRE, 2016

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE MEDICINA
BIOMEDICINA

EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS OMEGA - 3 SOBRE EL
ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE/BECKER

TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
PRESENTA:
ALMEIDA BECERRIL TOMÁS

MÉXICO, CD. MX., DICIEMBRE, 2016

UN~ POSGR DO
• Ciencias Biológicas
Lic. Ivonna Ramírez Wence
Directora General de Administración Escolar, UNAM
Presente
COORDINACIÓN
Me permito informar a usted que el Subcomité de Biologia Experimental y Biomedicina del
Posgrado en Ciencias Biológicas, en su sesión ordinaria del día 19 de septiembre de 2016, aprobó
el jurado para la presentación del examen para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS
BIOLÓGICAS del alumno ALMEIDA BECERRIL TOMÁS con número de cuenta 307102908, con
la tesis titulada " EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS OMEGA - 3
SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNElBECKER" , realizada bajo la dirección de la DRA, MARICELA RODRIGUEZ CRUZ:
Presidente:
Vocal:
Secretario:
Suplente:
Suplente:
DR. JOSÉ PEDRAZA CHAVERRI
DR. RICARDO MEJIA ZEPEDA
DR. FAUSTO SÁNCHEZ Mu liloz
DRA. ANA LlLIA GARCIA HERNÁNDEZ
DR. RENÉ DE JESÚS CÁRDENAS VÁZOUEZ
Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo.
ATENTAMENTE
" POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU"
Cd. Universitlria, Cd, Mx., a 03 de noviembre de 2016
/I'M~~'
DRA. MARíA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA
COORDINADORA DEL PROGRAMA COORDINACiÓN
Unidad de Posgrado ' Coordinación del Posgrado en Ciencias Biológicas Edificio D, ler. Piso, Circuito de Posgrado Cd. Universitaria
Delegación Coyoacan C.P. 04510 Méxic~ D.F. Tel. 5623 7002 hup:llpcbiol.posgrado.unam.mx

AGRADECIMIENTOS

Al Posgrado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de México por
fortalecer mi formación académica.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada durante mis estudios
de posgrado.

Este proyecto recibió financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(SALUD-2012-01-180058).

A los miembros del Comité Tutor, Dr. René de Jesús Cárdenas Vázquez y Dr. Fausto
Sánchez Muñoz por sus oportunas recomendaciones a este proyecto de investigación.

AGRADECIMIENTOS A TÍTULO PERSONAL
A la Universidad Nacional Autónoma de México por la formación académica de calidad
que me ha brindado por 10 años.
A la Dra. Maricela Rodríguez Cruz por su admirable labor como tutora e investigadora.
Al laboratorio de Nutrición Molecular de la Unidad de Investigación Médica en Nutrición
(UIMN) por ser el medio para seguir aprendiendo a trabajar en equipo y hacerme partícipe
de un grupo multidisciplinario que me forma cada día.
Al equipo de trabajo de Distrofia Muscular de Duchenne de la UIMN que ha sido mi guía
para comprender el proyecto de investigación desde el punto de vista químico, genético,
nutricio y clínico; además de colaborar activamente en el proyecto.
A mis papás por dejarme crecer libremente y hacer del hogar un refugio de serenidad.

DEDICATORIA

A Francisco Peláez Maciel.

ÍNDICE

Lista de figuras y tablas…………….…………………………………………………....i

Resumen………………………………………………………………………………....1

Abstract…………………………………………………………………….....................3

Introducción…………………………………………………………………..................5

Objetivos…………………………………………………………………....…………..17

Antecedentes…………………………………………………………………………...18

Metodología……………………………………………………………………………..21

Resultados…………………………………………………………………..................43

Discusión………………………………………………………………………………..63

Conclusiones…………………………………………………………….……………..72

Literatura citada………………………………………………………………………...73

LISTA DE FIGURAS Y TABLAS

FIGURAS
Fig. 1. Tipos de mutaciones presentes en la DMD y la DMB..……………………………..5
Fig. 2. Complejo distrofina glicoproteína………………………………………………………7
Fig. 3. Fisiopatología de la DMD/DMB mediada por estrés oxidativo………..…………....12
Fig. 4. Características clínicas generales de la Distrofia Muscular
de Duchenne…………………………………….………….………………….……...13
Fig. 5. Diagnóstico molecular de DMD/DMB de 3 pacientes con diagnóstico clínico........43
Fig. 6. Concentración de NO total µM en plasma sanguíneo de pacientes con DMD/
DMB en estado ambulatorio (n = 20) y no ambulatorio (n = 7)……………….……..45
Fig. 7. Concentración de peróxido de hidrógeno pmol/mL en plasma sanguíneo
de pacientes con DMD/DMB en estado ambulatorio (n = 20) y no ambulatorio
(n = 6)…………………………………………………………….……………………...46
Fig. 8. Concentración de MDA µM en plasma sanguíneo de pacientes
con DMD/DMB en estado ambulatorio (n = 29) y no ambulatorio
(n = 10).…………………………………………………………………………….......47
Fig. 9. Concentración de tiol mM en plasma sanguíneo de pacientes con
DMD/DMB en estado ambulatorio (n = 20) y no ambulatorio
(n = 7)……………………………………………………………………..…………….48
Fig. 10. Porcentaje de atrapamiento del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
(DPPH) en plasma sanguíneo de pacientes con DMD/DMB en
estado ambulatorio (n = 29 y no ambulatorio
(n = 10)………………………………………………………………...……………….49
Fig. 11. Expresión del mRNA de NFKB subunidad p65 en leucocitos de pacientes con
DMD/DMB en estado ambulatorio (n = 12) y no ambulatorio
(n = 6)..………………………..…………………………………………………..........50Fig. 12. Análisis de correlación entre los niveles de NO total en plasma sanguíneo
de pacientes con DMD/DMB y la expresión de mRNA de NFKB subunidad
p65 (n=18). ……………………………………………………………………..…….51

Fig. 13. Expresión del mRNA de NRF2 en leucocitos de pacientes con
DMD/DMB suplementados con placebo (n = 9) o AGPI omega - 3 (n = 10)
durante 6 meses ………..………………………………………………………..…..55
Fig. 14. Expresión del mRNA de NFKB subunidad p65 en leucocitos de pacientes
con DMD/DMB suplementados con placebo (n = 9) o AGPI omega - 3
(n = 11) durante 6 meses…………………………………………………………….56
Fig. 15. Delta (Δ) Tiol (mM) en plasma sanguíneo de pacientes con
DMD/DMB suplementados con placebo (n = 9) o AGPI omega - 3 (n = 11)
durante 6 meses ………………………………………………………………….….57
Fig. 16. Delta (Δ) atrapamiento de DPPH (%) en plasma sanguíneo de pacientes
con DMD/DMB suplementados con placebo (n = 13) o AGPI omega - 3
(n = 14) durante 6 meses…………………………………………………………….58
Fig. 17. Delta (Δ) NO total (µM) en plasma de pacientes con DMD/DMB
suplementados con placebo (n = 9) o AGPI omega - 3 (n = 11)
durante 6 meses………….………………………………………………………...…59
Fig. 18. Delta (Δ) Peróxido de Hidrógeno (pmol/mL) en plasma sanguíneo de
pacientes con DMD/DMB suplementados con placebo (n = 8) o AGPI
omega - 3 (n = 11) durante 6 meses………………………………….…………….60
Fig. 19. Delta (Δ) MDA (µM) en plasma sanguíneo de pacientes con
DMD/DMB suplementados con placebo (n = 13) o AGPI omega - 3
(n = 14) durante 6 meses ……………………………………………………………61
Fig. 20. Delta (Δ) Proteína carbonilada nmol/mL en plasma sanguíneo de pacientes
con DMD/DMB suplementados con placebo (n = 5) o AGPI omega - 3
(n = 3) durante 6 meses…………………………………………….……........……..62
Fig. 21. Resumen de resultados de la suplementación con AGPI omega -3 a pacientes
con DMD/DMB…………………………………………………………………………………71

iii

TABLAS
Tabla. 1. Lista de primers diseñados para la cuantificación de mRNA………………..…40
Tabla. 2. Características generales de los pacientes con DMD/DMB en
estado ambulatorio y no ambulatorio…………………….……………………….44
Tabla. 3. Características generales de los pacientes con DMD/DMB suplementados
con placebo o AGPI omega - 3 por 6 meses……………………………………52
Tabla 4. Porcentaje de cambio de EPA en membrana de eritrocitos de pacientes
con DMD/DMB suplementados con placebo o AGPI omega - 3
por 6 meses.………………………………………………………………………….53
Tabla 5. Porcentaje de cambio de DHA en membrana de eritrocitos de pacientes
con DMD/DMB suplementados con placebo o AGPI omega - 3
por 6 meses.……………………………………………………………………..…..54

1. RESUMEN
Las distrofias musculares de Duchenne y Becker (DMD/DMB) son causadas por
mutaciones en el gen DMD que codifica para la distrofina, lo que resulta en la
degeneración del músculo esquelético.
El estrés oxidativo y la inflamación son los principales mecanismos implicados en la
fisiopatología del proceso distrófico; por tal razón, es necesario buscar terapias que
reduzcan el estrés oxidativo y la inflamación en la DMD/DMB.
En este estudio nos hemos centrado en el estrés oxidativo de la DMD/DMB con diferente
estado funcional muscular (ambulatorio y no ambulatorio). Además, con base en las
propiedades antiinflamatorias y antioxidantes de los ácidos grasos poliinsaturados omega
- 3 (AGPI omega - 3), se investigó el efecto de la suplementación con ácido
eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA) sobre marcadores de estrés
oxidativo sistémico de pacientes con DMD/DMB.
Se realizó el diagnóstico molecular de la DMD/DMB en los pacientes. Aquellos que
tuvieron al menos una eliminación de exón en gen DMD se clasificaron como
ambulatorios y no ambulatorios. Posteriormente, se suplementaron durante seis meses
con 2.9 g de placebo (n = 14) o AGPI omega - 3 (n = 13).
Se midió en el mes basal, en los meses 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de suplementación, la
concentración de óxido nítrico total (NO), de peróxido de hidrógeno (H2O2), de
malondialdehído (MDA), de tiol y de proteínas carboniladas; además del porcentaje (%)
de atrapamiento de 1, 1-Difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) en el plasma. La expresión del
mRNA del factor nuclear kappa B (NFKB, por sus siglas en inglés) subunidad p65 y del
factor nuclear eritroide 2 (NRF2) se midió en los leucocitos. El daño muscular se evaluó
mediante la escala funcional de Vignos. Al inicio, los pacientes se clasificaron como
ambulatorios y no ambulatorios.
Los resultados mostraron que el NO, el MDA, y el mRNA de NFKB subunidad p65 están
incrementados en los niños no ambulatorios (p < 0.05). La concentración de tiol se
encuentra disminuida en los pacientes no ambulatorios (p < 0.05).

No se encontró relación entre estos marcadores y la escala Vignos. Se encontró una
correlación positiva entre el NO total y el mRNA de NFKB subunidad p65 (r = 0.538, p =
0.02).
Por otro lado la suplementación con AGPI omega - 3 disminuyó el mRNA de NFKB
subunidad p65, aumentó el mRNA de NRF2 y aumentó la concentración de grupos tiol (p
< 0.05).
En conclusión, nuestro estudio demuestra que el daño oxidativo es mayor en los
pacientes que se encuentran en estado no ambulatorio. No se encontró relación entre el
daño oxidativo y la función muscular en la DMD/DMB. Los resultados sugieren un efecto
benéfico sobre el daño oxidativo en los pacientes con DMD/DMB por la suplementación
con AGPI omega - 3.
Palabras clave: Distrofia muscular, estrés oxidativo, ambulatorio, no ambulatorio, AGPI
omega - 3, NFKB subunidad p65, NRF2.

2. ABSTRACT
Duchenne and Becker muscular dystrophies (DMD/BMD) are caused by mutations in
DMD gene that codes for dystrophin leading to skeletal muscle degeneration.
Oxidative stress and inflammation are the main mechanisms involved in the
physiopathology of the dystrophic process and for that reason, it is necessary to look for
therapies that reduce oxidative stress and inflammation in DMD/BMD.
In this study, we evaluated the oxidative stress of DMD/BMD with different functional state
of muscle (ambulatory and non-ambulatory). Also, based on the anti-inflammatory and
antioxidant properties of omega - 3 polyunsaturated fatty acids (omega - 3 PUFAs), we
investigated the effect of eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA)
supplementation on systemic oxidative stress markers of DMD/BMD patients.
Molecular diagnosis of DMD/BMD was carried out. Patients with a deletion in the DMD
gen were classified as ambulatory and non-ambulatory. Next, they were supplemented
for six months with 2.9 g of placebo (n = 14) or omega - 3 PUFAs (n = 13).
At baseline, and 1, 2, 3, 4, 5 and 6 months of supplementation, plasma concentration of
total nitric oxide (NO), hydrogen peroxide (H2O2), malondialdehyde (MDA), thiol, and
protein carbonyl were determined; also DPPH scavenging % in plasma, NFKB p65
subunit and NRF2 mRNA in leukocytes were measured. Muscle damage was evaluated
by Vignos functional rating scale. Also, previous the supplementation patients.
The findings showed that NO, MDA, and NFKB p65 subunit mRNA are increased in non
- ambulatory boys (p < 0.05). Thiol concentration is decreased in non-ambulatory patients
(p < 0.05). No relation was found between measured markers and muscle function in
DMD/BMD. A correlation between total NO and of NFKB p65 subunit mRNA was found (r
= 0.538, p = 0.02).
On the other hand, supplementation with omega - 3 PUFAs decreased NFκB p65 subunit
mRNA and increased NRF2 mRNA and thiolgroups concentration (p < 0.05).

In conclusion, our study shows that oxidative damage is higher in non - ambulatory
patients. There is no relation between oxidative damage and muscle function in
DMD/DMB. Our results suggest a beneficial effect on oxidative damage in patients with
DMD/DMB by omega - 3 PUFAs supplementation.
Key words: Muscular dystrophy, oxidative stress, ambulatory, non-ambulatory, omega -
3 PUFAs. NFKB p65 subunit, NRF2.

3. INTRODUCCIÓN

3.1. Etiología
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia muscular de Becker (DMB) son
enfermedades hereditarias musculares causadas por mutaciones en el gen de la
distrofina (DMD) que se encuentra en el locus 21.2 en el brazo corto del cromosoma X.
Dicho gen es susceptible a mutaciones ya que es el gen más grande en el humano; con
un tamaño de 2.6 Mb, contiene 79 exones, codifica un mRNA de 14 kb y se traduce a
una proteína de 427 kDa (Nowak y Davies, 2004; Singh et al., 2006; Kim et al., 2013).
Las mutaciones asociadas a la DMD/DMB pueden ser eliminaciones, duplicaciones o
mutaciones puntuales y generan un fenotipo carente de la proteína distrofina. En la DMD
la distrofina tiene una ausencia casi total (>97%); mientras que en la DMB, la ausencia
de la proteína es parcial (60-90%) (Hoffman et al., 1987; Nicholson et al., 1990; Emery,
1998; Singh et al., 2006; Grounds et al., 2008; Kim et al., 2013).
Las eliminaciones son la causa más frecuente de daño al gen de la distrofina con 60 y
85% de los casos de DMD y DMB respectivamente, las duplicaciones representan el 5 y
el 10% de los casos de la DMD y de la DMB correspondientemente, y las mutaciones
puntuales representan del 25-30% y del 5-10% en la DMD y DMB respectivamente
(Fig.1).

Fig. 1. Tipos de mutaciones presentes en la DMD y la DMB.
DMD DMB

En ambas distrofias, hay dos regiones llamadas “hot spots” en las cuales las
eliminaciones y las duplicaciones son altamente susceptibles de presentarse. El “hot
spot” menor comprende a los exones 2-20 (30% de los casos) y el mayor a los exones
44-53 (70% de los casos) del gen DMD (Forrest et al., 1988; den Dunnen et al., 1989;
Koenig et al., 1989; Hu et al., 1990).
El tamaño de la eliminación no siempre está asociado a la severidad de la enfermedad.
Con base en la regla del marco de lectura, pacientes con DMB con eliminaciones grandes
pueden producir mRNA de distrofina que dará lugar a una proteína trunca semifuncional
(Monaco et al., 1988).
Por otro lado, eliminaciones cortas en pacientes con DMD agruparía exones que posterior
al splicing pueden cambiar el marco de lectura de traducción en el mRNA formando un
codón de paro prematuro. Esta regla predice que los pacientes con DMB generan una
proteína más pequeña semifuncional, mientras que los pacientes con DMD producen una
forma ausente de la región C-terminal o no sintetizan la proteína (Monaco et al., 1988).
La DMD y la DMB son las distrofias musculares más comunes, la primera con una
incidencia de 1 en 3,600-6,000 varones recién nacidos con esperanza de vida de hasta
30 años, y la segunda con una incidencia de 1 en 18,500 con esperanza de vida de hasta
60 años (Drousiotou et al., 1998; Emery, 1998; Bushby et al., 1991; Hwa et al., 2007).

3.2. Fisiopatología
La proteína distrofina se localiza debajo del sarcolema, hacia la cara citoplasmática de la
célula muscular y es parte del complejo distrofina-glicoproteína (CDG). El CDG es una
estructura que proporciona estabilidad mecánica al sarcolema del músculo estriado
durante la contracción y la relajación ya que forma una conexión directa entre las
miofibrillas (maquinaria contráctil), el sarcolema y la matriz extracelular (Hoffman et al.,
1987; Grounds et al., 2005; Kosek y Bamman, 2008; Prins et al., 2009; Shin et al., 2013).
Por tanto, la distrofina mantiene la fuerza, flexibilidad y estabilidad de las fibras
musculares (Davies y Nowak, 2006).

Sincoilina

Para su estudio, el CDG se ha dividido en tres subcomplejos: el subcomplejo
distroglicano, formado por α- y β-distroglicanos. β-Distroglicano es una proteína integral
de membrana que interactúa con la distrofina en el citoplasma y con α-distroglicano en la
matriz extracelular conectando con la laminina 2 en la lámina basal (Koh, 2008).
El subcomplejo sarcoglicano-sarcospan está compuesto por α-, β-, γ-, δ- sarcoglicanos y
sarcospan. La función más importante de este subcomplejo es dar estabilidad a la
subunidad α- distroglicano en el sarcolema (Crosbie et al., 1999). Por otro lado, asociada
a α- distroglicano, se encuentra la proteína biglicano que también puede unirse a α- y γ-
sarcoglicanos (Rafii et al., 2006).
El último subcomplejo es el de proteínas asociadas a distrofina (CPAD) que incluye a
proteínas como α- distrobrevina, sintrofina (α-, β1- y β2-), sintasa de óxido nítrico neuronal
(nNOS) y sincoilina (Nowak y Davies, 2004; Koh, 2008) (Fig. 2).

Citoplasma
Sarcolema
Matriz extracelular
Colágena
Sincoilina

Laminina 2
α2
β1 γ1
βDG
αDG
Sarcospan
δS γS βS αS
Biglicano
nNOS α
β2
β1
αD
Sintrofinas

Filamento
de actina

Distrofina

Fig. 2. Complejo distrofina glicoproteína (Chamberlain, 2002; Nowak y Davies, 2004;
Fairclough et al., 2013) Modificado por el autor. α- y β-Distroglicano (αDG y βDG), α-, β-, γ-, δ-
sarcoglicanos (αS, βS, γS, δS), sintasa de óxido nítrico neuronal (nNOS), α- distrobrevina (αD).

Si la distrofina es parcial o totalmente ausente a consecuencia de las mutaciones del gen
DMD en la DMD/DMB, la miofibrilla se vuelve frágil y el sarcolema se rompe fácilmente a
consecuencia del estrés mecánico, particularmente, después de contracciones
sostenidas (Grounds et al., 2005; Deconinck y Dan, 2007). Con base en lo anterior, se
considera que dicha ruptura del sarcolema es el evento primario que desregula el
metabolismo celular en la DMD y la DMB (Grounds et al., 2008).
La ausencia de distrofina y la ruptura del sarcolema provoca desorganización de la matriz
extracelular, la entrada descontrolada de calcio a la célula muscular, la salida de creatina
cinasa (CK), ausencia de sitios de anclaje para nNOS, generación de especies reactivas
de oxígeno e incremento en la respuesta inflamatoria (Andrews, 2005; Deconinck y Dan,
2007; Han, 2011; Shin et al., 2013).
Lo anterior desencadena dos procesos claves en la fisiopatología de ambas distrofias,
estrés oxidativo e inflamación, los cuales originan ciclos repetidos de necrosis de tejido
muscular y regeneración muscular como mecanismo compensatorio. Sin embargo, con
el tiempo se presenta una depleción de células satélite y la capacidad regenerativa
disminuye severamente reemplazando al tejido muscular por tejido adiposo y conectivo
(Emery 1990; Grounds et al., 2008; Choi et al., 2015; Guiraud et al., 2015).

3.3. Estrés oxidativo
Las especies reactivas de oxígeno (ERO) son moléculas que en su estructura atómica
presentan un electrón desapareado o impar en el orbital externo, otorgándoles una
configuración altamente reactiva o inestable a las moléculas (Mayor, 2010).
Dichas ERO se forman durante una gran variedad de procesos metabólicos y son
necesarias para la señalización celular. Sin embargo, un exceso en la producción de ERO
es dañino para los componentes biológicos, principalmente para las macromoléculas
(Terrill et al., 2013).

Cuando las ERO aumentan ocasionan un desbalance en relación con las moléculas
antioxidantes y se presenta un proceso bioquímico conocido como estrés oxidativo (EO)
(kim et al., 2013), condición que se ha observado tanto en el ratón mdx (modelo animal
de la DMD) (Kaczor et al., 2007; Hauser et al., 1995; Ragusa et al., 1997), como en
pacientes con DMD/DMB (Haycock etal., 1996; Rodriguez y Tarnopolsky, 2003).
Debido a lo anterior, la deficiencia de distrofina está relacionada con el incremento del
daño oxidativo de macromoléculas. Por ejemplo, se ha observado un incremento de
peroxidación lipídica, oxidación de proteínas y DNA oxidado en pacientes con DMD y en
el ratón mdx (Kim et al., 2013), lo que conduce hacia un estado de debilidad muscular
(Terril et al., 2013).
Dentro de las moléculas blanco más empleadas para evaluar el estrés oxidativo en
individuos sanos, pacientes con DMD/DMB y ratones mdx se encuentra el NO,
malondialdehído y peróxido de hidrógeno (estos dos últimos, indicadores de oxidación
lipídica); proteínas carboniladas y proteínas tiol (indicadoras del estado redox de las
proteínas).
A partir de la deficiencia de la distrofina en la DMD/DMB se presenta diversos eventos
que directa o indirectamente contribuyen a la exacerbación de la generación de estrés
oxidativo en el músculo esquelético y que se revisan a continuación.

3.3.1. Sintasa de óxido nítrico neuronal (nNOS)
La sintasa de óxido nítrico neuronal (nNOS) forma parte del CDG, anclándose
directamente a este complejo, particularmente a dominios de la distrofina; por lo cual, en
ausencia de ésta última, la nNOS esta deslocalizada del CDG y bajo esta condición, la
concentración de nNOS en músculo es <20% comparada con músculo sano; lo cual
marca el inicio de la generación de EO (Brenman et al., 1995; Chang et al., 1996).

Como consecuencia de la deslocalización de la nNOS, la producción de óxido nítrico (NO)
está reducida, lo cual conduce a un aumento de superóxido ya que el NO inhibe la
actividad de la NADPH oxidasa (NOX2); entonces, a bajas concentraciones de NO, se
reduce la inhibición enzimática, provocando la generación constante de superóxido
(Chang et al., 1996; Cave et al., 2005).

3.3.2. Superóxido dismutasa
La enzima superóxido dismutasa incluye a tres variedades; superóxido dismutasa 1
(SOD1) que se localiza en citoplasma, superóxido dismutasa 2 (SOD2) que se localiza
en mitocondria y superóxido dismutasa 3 (SOD3) que es extracelular (Cristiana et al.,
2014). Se ha observado que una baja actividad muscular incrementa la actividad de la
superóxido dismutasa que convierte al superóxido en peróxido de hidrógeno, que está
asociado con peroxidación lipídica, agravando el daño a las membranas de células
musculares exacerbando la fisiopatología de la DMD (Tidball y Wehling-Henricks, 2007;
Lawler et al., 2003; Rando et al., 1998).

3.3.3. Calcio intracelular
Como se mencionó anteriormente la ausencia de la distrofina conduce a un rompimiento
del sarcolema, lo cual incrementa el flujo de calcio hacia dentro de la célula (Rando,
2002). Asociado a esto, se ha descrito que elevadas concentraciones de calcio en el
citoplasma incrementan el calcio mitocondrial. Aunque el mecanismo exacto por el cual
el Ca2+ estimula la producción de especies reactivas de oxígeno dentro de la mitocondria
permanece sin conocerse bien. Se han propuesto varios mecanismos posible; por
ejemplo que el Ca2+ estimula la tasa metabólica, activándose la producción de óxido
nítrico y su efecto sobre los complejos respiratorios, que induce la disociación de
citocromo C generando lipoperoxidación de cardiolipina, dando como resultado un
incremento en permeabilidad mitocondrial, permitiendo la liberación de citocromo C, de
GSH y de enzimas antioxidantes dependientes de NADPH (Peng y Jou et al., 2010).

3.4. Inflamación
El estrés oxidativo es un regulador importante de la fisiopatología de la enfermedad ya
que éste mantiene activa la respuesta inflamatoria establecida desde etapas tempranas
de la enfermedad, además, participa en el proceso de la regeneración muscular (Haycock
et al., 1996; Rando et al., 1998; Terrill et al., 2013).
El daño muscular en la DMD/DMB causa la liberación de citocinas como el factor de
necrosis tumoral (TNF-α). Interferón γ (IFN- γ), Interleucina -1 (IL-1) e Interleucina-4 (IL-
4) (Porter et al., 2002; Villalta et al., 2011). Dichas interleucinas promueven la activación
de macrófagos M1 (proinflamatorios) y suprime la activación de macrófagos M2
(antinflamatorios), provocando una inflamación persistente. Sin embargo, el incremento
de niveles de citocinas antiinflamatorias como Interleucina-10 (IL-10) desactiva a los
macrófagos M1 y promueven su transición a macrófagos M2 promoviendo la reparación
tisular. Aunque como el daño muscular es constante, se favorece la respuesta
proinflamatoria y la necrosis, ocasionando un reemplazo de músculo por tejido fibroso y
adiposo (Villalta et al., 2011).
A su vez, la inflamación también genera más estrés oxidativo, ya que células del sistema
inmune como macrófagos generan ERO para promover la fagocitosis (Tidball, 2005). El
proceso inflamatorio también es regulado por otras moléculas como el factor de
transcripción maestro NF-κB que induce expresión de genes involucrados en la respuesta
inflamatoria como los que codifican para las citocinas (Moylan y Reid, 2007). Con base
en lo anterior, se genera un “círculo vicioso” entre la inflamación y el estrés oxidativo,
aumentando el daño muscular, reflejado en el debilitamiento de dicho tejido (Bowie y
O´Neill, 2000; Tidball y Wehling-Henricks, 2007) (Fig. 3).

3.5. Características clínicas
Los niños recién nacidos con DMD son regularmente asintomáticos, los primeros
síntomas empiezan a partir de los dos años de edad y consisten en problemas en la forma
de caminar (pasos cortos con movimientos suaves de lado a lado, la forma de caminar
es en puntas y posición lordótica), pseudohipertrofia en pantorrillas, signo de Gowers
(deben usar las manos para levantar los muslos e incorporarse en una posición vertical),
caídas frecuentes y dificultad para subir las escaleras (Verma et al., 2010).
Entre los seis y ocho años, el deterioro muscular de los pacientes con esta distrofia se
vuelve más evidente y a los trece años empieza a presentarse escoliosis con pérdida de
ambulación (Wong y Christopher, 2002; Verma et al., 2010). El deceso se presenta por
insuficiencia respiratoria o cardiaca como consecuencia del debilitamiento de músculos
asociados a ambas funciones (Hwa et al., 2007; Verma et al., 2010) (Fig. 4).

Fig. 3. Fisiopatología de la DMD/DMB mediada por estrés oxidativo.

En contraste, los pacientes con DMB presentan un fenotipo menos severo, con una edad
de inicio de la enfermedad alrededor de los trece años y un avance clínico más lento
comparado con los pacientes con DMD (Nouri et al., 2014; Khordadpoor-Deilamani et al.,
2011); presentan los síntomas a edades más avanzadas; por ejemplo, la pérdida de
ambulación no se presenta antes de los 16 años (Aartsma et al., 2006).

Fig. 4. Características clínicas generales de la Distrofia Muscular de Duchenne
(Modificada y traducida de Verma et al., 2010).

3.6. Tratamiento
El tratamiento integral de los pacientes diagnosticados con DMD incluye glucocorticoides,
rehabilitación cardiaca, respiratoria y ortopédica mejorando la calidad de vida, salud y
longevidad (Bushby et al., 2009). Los glucocorticoides más comúnmente utilizados son
prednisolona y una combinación de éste fármaco con Deflazacort, los cuales representan
la única intervención farmacológica usada para disminuir la progresión del debilitamiento
muscular, escoliosis, insuficiencia respiratoria, el proceso inflamatorio y conservar la
ambulación (Ricotti et al., 2013; Bushby et al., 2009).
El mecanismo principal de los glucocorticoides se basa en su acción anti-inflamatoria ya
que inhiben la función de NF-κB, aunque no tienen un efecto directo sobre el estrés
oxidativo (Du et al., 2000).
Sin embargo, los glucocorticoidesson inhibidores altamente inespecíficos; por lo cual, se
asocian a varios efectos secundarios adversos (Malik et al., 2013) como desarrollo de
obesidad (Bonifati et al., 2000), desmineralización ósea (Khalid, 2011), retardo en el
crecimiento (Foster et al., 2004), cambios en el comportamiento (Stuart et al., 2005),
hipertensión (Balaban et al., 2005), intolerancia a la glucosa, gastritis, reflujo
gastroesofágico (Bushby et al., 2009), úlcera peptídica (Brunton et al., 2005) y
mioglobinuria (Garrood et al., 2008).
Debido a los efectos adversos de los glucocorticoides, ha surgido la necesidad de buscar
tratamientos alternativos sin o con menores efectos secundarios adversos, que
disminuyan el proceso inflamatorio y el estrés oxidativo. En varios estudios se ha
demostrado que la suplementación con antioxidantes en el ratón mdx (modelo de la DMD)
previenen el daño muscular al disminuir el estrés oxidativo y al inhibir la acción de NF-κB
(Carlson et al., 2005; Messina et al., 2006; Kim et al., 2013). Entre las posibles alternativas
podría ser el uso de ácidos grasos poliinsaturados omega - 3 debido a su acción
antioxidante (Giordano y Visioli, 2014).

3.7. Ácidos grasos poliinsaturados omega - 3
Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos de cadena hidrocarbonada con grupos
funcionales carboxilo y metilo en los extremos. De acuerdo al número de dobles enlaces
en la cadena hidrocarbonada, los ácidos grasos se clasifican en: ácidos grasos saturados
(sin dobles enlaces entre los carbonos), monoinsaturados (un doble enlace) y
poliinsaturados (más de un doble enlace) (Yates et al., 2014).
Dichas biomoléculas tienen nombres sistemáticos y comunes; aunque también son
descritos por una nomenclatura que describe el número de átomos de carbono en la
cadena, el número de dobles enlaces y la posición del primer doble enlace a partir del
grupo metilo terminal, conocido como el carbono “n” u “ω”. Esta última nomenclatura
permite la identificación de dos familias diferentes de ácidos grasos poliinsaturados
(AGPI): las familias ω-3 y ω-6 (Yates et al., 2014; Ratnayake y Galli, 2009).
Los ácidos grasos esenciales son AGPI con todos los dobles enlaces en posición cis y
no pueden ser sintetizados por los mamíferos, incluido el humano, por lo que es necesario
consumirlos directamente en la dieta (Pinazo-Duran y Boscá-Gomar, 2012; Simopoulos,
2001).
Los AGPI ω-3 y ω-6 son esenciales porque nuestro organismo no puede introducir dobles
enlaces en carbonos antes del carbono 9 (contando a partir del grupo metilo) en ácidos
grasos saturados. Así que, la introducción de dos carbonos en los ω-3 y ω-6 origina AGPI
de cadena más larga a partir del ácido linoleíco (18:2) y linolénico (18:3). La capacidad
que tienen los mamíferos de introducir dobles enlaces y de elongar la cadena
hidrocarbonada de ácidos grasos ω-3 y ω-6, es el mecanismo por el cual el ácido
linolénico es precursor de AGPI de cadena larga con más de 20 átomos de carbono
(Pinazo-Duran y Boscá-Gomar, 2012).
El ácido linolénico es precursor principalmente del ácido eicosapentaenoico (20:5 n-3,
EPA) y del ácido docosahexaenoico (22:6 n-3, DHA) (Pinazo-Duran y Boscá-Gomar,
2012; Alessandri et al., 2009; Innis, 2003).

La síntesis de EPA y DHA requiere de procesos de desaturación y elongación llevados a
cabo por desaturasas y elongasas, respectivamente (Innis, 2003). La delta-6-desaturasa
introduce un doble enlace en C18 y la delta-5-desaturasa lo introduce en C20. La
elongasa que participa en el paso de C20 a C22 es poco efectiva, y es por esta razón
que la síntesis es insuficiente y a pesar de existir aporte suficiente de linolénico, el DHA
puede no alcanzar la concentración necesaria para realizar de forma conveniente todas
sus funciones en las células (Lord y Bralley, 2002; Pinazo-Duran y Boscá-Gomar, 2012).
En resumen, la DMD y DMB son enfermedades de carácter genético, lo cual lleva a que
la terapia para combatirla desde su origen sea extremadamente compleja de llevar a cabo
en la práctica clínica. Sin embargo, se puede retrasar su avance interviniendo en las
manifestaciones secundarias a través de fármacos.
La terapia farmacológica más utilizada consiste en la administración de antiinflamatorios
del tipo glucocorticoides; pero sus múltiples efectos secundarios fomentan la búsqueda
de otras terapias alternativas.
Como ya fue descrito anteriormente, el estrés oxidativo es un factor importante que
modula el avance de la enfermedad; por lo que es necesaria la búsqueda de tratamientos
antioxidantes que neutralicen el efecto de las especies reactivas de oxígeno.
Los ácidos grasos poliinsaturados omega - 3 EPA y DHA han sido probados en diferentes
estudios para disminuir las ERO bajo diferente condiciones, sobre todo en adultos;
aunque hasta la fecha, no se han realizado ensayos clínicos para evaluar el efecto de los
ácidos grasos omega - 3 (EPA/DHA) sobre el estrés oxidativo en pacientes con
DMD/DMB. Debido a lo anterior, es necesario evaluar este tipo de alternativas
terapéuticas para mejorar la calidad de vida de los pacientes son DMD/DMB.
Debido a los efectos positivos de la suplementación con ácidos grasos omega - 3 (EPA
y DHA) sobre el estrés oxidativo en sujetos sanos y en el modelo murino de la DMD
(ratones mdx), se espera que al suplementar con estos ácidos grasos a los pacientes con
DMD/DMB presenten un estrés oxidativo menor que los pacientes suplementados con
placebo.

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Evaluar el efecto de la suplementación de AGPI omega - 3 (EPA/DHA) sobre el
estrés oxidativo en pacientes con DMD/DMB.

4.2. Objetivos particulares
• Determinar el estado oxidativo de pacientes con DMD/DMB con diferente función
muscular: estado ambulatorio y no ambulatorio.

• Identificar el efecto del EPA y DHA sobre la concentración de NO plasmático en
pacientes con DMD/DMB.

• Identificar el efecto del EPA y DHA sobre la concentración de H2O2 plasmático en
pacientes con DMD/DMB.

• Determinar el efecto del EPA y DHA sobre el marcador plasmático de
lipoperoxidación MDA en pacientes con DMD/DMB.

• Determinar el efecto del EPA y DHA sobre el marcador plasmático de oxidación
proteica tiol y proteína carbonilada en pacientes con DMD/DMB.

• Identificar el efecto del EPA y DHA sobre la capacidad de atrapamiento del radical
DPPH en pacientes con DMD/DMB.

• Identificar el efecto del EPA y DHA sobre la expresión del gen del factor de
transcripción de respuesta antioxidante NRF2 y del factor de transcripción maestro
de inflamación NF-κB subunidad p65 en leucocitos de pacientes con DMD/DMB.

5. ANTECEDENTES

5.1. Estrés oxidativo en modelo mdx y pacientes con DMD/DMB
En el estudio realizado por Singh et al. (2009) se observó que en el diafragma de ratones
mdx de tres meses de edad se encuentra aumentada la expresión de NFKB (p65) en
comparación con el grupo de ratones no distróficos de la misma edad. Sin embargo, no
hay estudios que evalúen la expresión de p65 en el estado no ambulatorio y ambulatorio
de la DMD/DMB. De tal manera que en el presente estudio se evaluó encontrando una
mayor expresión de NFκB (p65) en el estado no ambulatorio de los pacientes.
Gücüyener et al. (2000) midieron los niveles séricos de NO en 26 pacientes con DMD de
4 a 11 años comparando con un grupo control de individuos sanos de 4 a 12 años y
encontraron que el NO sérico en pacientes con DMD era significativamente menor.
Por otro lado, Grosso et al. (2008) midieron las concentraciones de 8-isoprostano
(marcador de lipoperoxidación en plasma sanguíneo en un grupo de 17 paciente con
DMD (8.7 ± 4.3 años), un grupo de 24 pacientes con DMB (16 ± 9.6 años) y un grupo
control de 20 individuos sanos (14 ± 7 años). En este estudio se encontró que los
pacientes con distrofinopatías presentaron niveles más elevadosde 8-isoprostano en
comparación con el grupo control; sin embargo, no se encontraron diferencias cuando se
comparó al grupo de pacientes con DMD respecto al grupo con DMB. En esta
investigación se sugiere la realización de estudios en los que se evalúe la
lipoperoxidación de estos pacientes en el estado ambulatorio y no ambulatorio; incluso,
la información sobre el estado diferencial de estrés oxidativo en pacientes son DMD/DMB
es nula.

5.2. Actividad antioxidante y antiinflamatoria de EPA y DHA en cultivos
celulares, modelo mdx y humanos
En un estudio realizado por Saw et al. (2013), se observó que una baja concentración de
DHA (3.13 µM) o una elevada concentración de EPA (12.5 µM) en sinergismo con
astaxantina (12.5 µM) aumentaban el mRNA de NRF2 en cultivo de células HepG; sin
embargo, no se conoce el mecanismo por el cual los AGPI omega - 3 participan en el
incremento del transcrito de NRF2. El mecanismo de activación de NRF2 está mejor
descrito en la literatura y este es a través de la generación de 4 hidroxihexenal e
hidroxinonenal a partir de ambos AGPI omega - 3, que directamente activan a NRF2
promoviendo su translocación al núcleo (Gao et al., 2007).
Cabe mencionar que se ha observado que tanto el EPA como el DHA también tienen la
propiedad de disminuir la expresión del factor maestro de inflamación NF-κB así como
también su activación en algunos tipos celulares como osteoclastos en condiciones de
cultivo celular (Zwart et al., 2010).
Por otro lado, en estudios realizados en humanos, particularmente, se ha observado que
la suplementación (2.2 g/día) con EPA y DHA en sujetos sanos, reduce los niveles de la
proteína reactiva C (marcador de inflamación) después de realizar actividad física
intensa, comparado con el grupo que recibió como placebo aceite de soya. Sin embargo,
a pesar de esperar una respuesta positiva sobre más marcadores de estrés oxidativo,
ésta no se presenta, probablemente debido al período corto de la suplementación (6
semanas) (Bloomer et al., 2009).
Otro estudio sobre estrés oxidativo y suplementación con ácidos grasos omega 3, fue el
realizado por Kiecolt-Glacer et al. (2013). Los resultados revelaron una reducción de F2-
isoprostanos (marcador de lipoperoxidación) en suero de pacientes adultos sanos
suplementados por 4 meses con EPA/DHA (2.5/1.5 g/día), comparados con el grupo que
recibió como placebo una mezcla de aceite de palma, olivo, soya, canola y coco (2.5
g/día).

Igualmente, Mas et al. (2010) realizaron un trabajo sobre el efecto de EPA y DHA sobre
los niveles de F2-isoprotanos en plasma de hombres obesos. El estudio consistió en
suplementar con EPA a un grupo de 20 sujetos, con DHA a un grupo de 19 sujetos y un
grupo de 17 sujetos con aceite de oliva. Los hallazgos demostraron que los niveles de
F2-isoprostanos disminuyen en aquellos sujetos que fueron suplementados con 4 g de
EPA o 4 g de DHA.
Por otro lado, Atashak et al. (2013) suplementaron a atletas de 18 a 24 años. El primer
grupo de 10 sujetos fue suplementado con 3 g de EPA y DHA por 7 días y el segundo
grupo de 10 sujetos fue suplementado con placebo. Ambos grupos fueron sometidos a
actividad física excéntrica y se encontró que 24 horas después se redujo la concentración
de MDA en el plasma de los atletas suplementados con EPA y DHA.
Respecto a los estudios en animales, se ha observado que la suplementación con EPA
y DHA por 16 días a ratones mdx disminuye la necrosis muscular, los niveles de TNF-α,
4-hidroxinonenal (4-HNE, marcador de lipoperoxidación) la proteína reactiva C y la
enzima creatina cinasa; esta última, es utilizada como un marcador para el diagnóstico
clínico en la DMD/DMB. En dicho estudio, los ratones mdx se suplementaron con 0.003
g/día de EPA/DHA. El grupo control se suplementó con 0.003 g/día de aceite mineral
(Fogagnolo et al., 2013; Ventura et al., 2011).
En este sentido, Apolinário et al. (2015) realizaron un trabajo sobre el efecto de la terapia
a largo plazo con AGPI omega - 3 sobre la regeneración muscular en el ratón mdx. En
dicho estudio 8 ratones mdx fueron suplementados con 0.003 g EPA/DHA, 8 ratones mdx
suplementados con aceite mineral y 8 ratones sanos (control) suplementados con aceite
mineral. En su estudio, los autores observaron la disminución de NF-κB a nivel de
proteína en diafragma y cuádriceps de los ratones mdx suplementados con EPA/DHA.

6. METODOLOGÍA
Este estudio que evaluó el efecto de los AGPI omega - 3 (EPA y DHA) sobre el estrés
oxidativo en pacientes con DMD/DMB, forma parte de un proyecto integral en el que
también se estudió el efecto de dichos ácidos grasos sobre la composición corporal,
resistencia a la insulina, degeneración muscular y regeneración muscular en dichos
pacientes.

6.1. Características del estudio
El diseño del estudio fue un ensayo clínico, aleatorizado, controlado, doble ciego que se
llevó a cabo en la Unidad de Investigación Médica en Nutrición, ubicada en el Hospital de
Pediatría “Dr. Silvestre Frenk Freund” en Centro Médico Nacional Siglo XXI del Instituto
Mexicano del Seguro Social. Dicho estudio fue registrado en Clinical Trials
(NCT01826422).

6.2. Sujetos de estudio
Los pacientes con DMD/DMB que participaron en este estudio clínico fueron individuos
varones entre 3 y 13 años con diagnóstico clínico y molecular de DMD/DMB. Dichos
sujetos de estudio provenían del Instituto Nacional de Rehabilitación, Centro de
Rehabilitación Infantil Teletón Hidalgo, Hospital General “Dr. Gaudencio González Garza”
de Centro Médico Nacional La Raza y el Hospital de Pediatría “Dr. Silvestre Frenk Freund”
de Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS.

6.3. Criterios de inclusión
Los criterios de inclusión al estudio fueron: que los pacientes presenten un diagnóstico
positivo clínico y molecular de DMD/DMB, el consentimiento de participación firmado por
los padres; en el cual, se comunica por escrito la información necesaria respecto al
proyecto y el asentimiento de los pacientes.

6.4. Criterios de exclusión
Se consideró como criterios de exclusión que los pacientes hayan estado en tratamiento
con glucocorticoides, que consumieran suplementos alimenticios que contuvieran AGPI
omega - 3 o suplementos alimenticios ricos en antioxidantes y que el paciente presentara
alergia a la proteína del pescado.

6.5. Criterios de eliminación
Se consideraron como criterios de eliminación que los pacientes presentaran reacciones
alérgicas (enrojecimiento de la piel, comezón, vómito; hinchazón de cara, ojos, labios,
lengua o garganta) a los componentes proteicos de pescado que se pueden encontrar en
el suplemento, apego a la suplementación menor al 80%, abandono del estudio y el
desarrollo de alguna complicación propia de la enfermedad que impida su participación
en el proyecto.

6.6. Tamaño de muestra
Se tomó en cuenta un estudio previo realizado en la UIMN del Hospital de Pediatría de
CMN Siglo XXI, IMSS, en el que se suplementó a un grupo de niños obesos con 0.9 g/día
de EPA/DHA durante un mes.

En dicho estudio se determinó la resistencia a la insulina mediante el modelo
homeostático (índice HOMA, Homeostasis Model Assessment). La disminución del índice
HOMA fue de 15% con una desviación estándar de 28.78.
Tomando en cuenta un valor Z-alfa de 0.05, beta de 0.80 y utilizando la fórmula para
diferencia de medias se obtuvo un tamaño muestra de 29 sujetos por grupo:
Media = 15
DE = 28.78
α= 0.05
β= 0.20

N = 28.8 = 29 sujetos por grupo

Con base en la información anterior, se pretendió que el ensayo clínico se realizará en
un total de 58 individuos que se dividirían en dos grupos de 29 sujetos; el grupo
suplementado con AGPI omega - 3 y el grupo suplementado con el placebo. Sin
embargo, solo se incluyeron a los pacientes captadosde agosto de 2014 a mayo de
2016.

6.7. Diagnóstico molecular DMD/DMB
El diagnóstico molecular de los pacientes con diagnóstico clínico provenientes de las
Instituciones arriba mencionadas se realizó en una muestra de DNA genómico de
leucocitos de sangre periférica. La muestra de sangre se centrifugó a 3500 rpm para
separar la fase leucocitaria, posteriormente se utilizó una solución de lisis (Red blood
Cell Lysis, RBCL) para eliminar los eritrocitos y así obtener el paquete celular libre de
eritrocitos.
N = 2 (Zα + Zβ)2 = (28.78)2 (1.96 + 0.84)2 = (828)(7.84) = 6492
2 (15)2 225 225
N = 2 (Zα + Zβ)2 = (28.78)2 (1.96 + 0.84)2 = (828)(7.84) = 6492
2 (15)2 225 225

La muestra de DNA se extrajo mediante el kit QIAamp DNA Mini Kit (51306, QIAGEN).
Posteriormente, el DNA se cuantificó con un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 U.
V.-vis y se determinó su integridad sometiendo una muestra de éste a electroforesis
horizontal en gel de agarosa al 1.0% teñido con bromuro de etidio (0.5 ug/mL).
El diagnóstico consiste en la identificación de eliminaciones de exones del gen DMD (a
partir del DNA extraído) mediante el kit MPCR Kit for Human DMD/BMD Set I+II (MP-
70056, Maxim Biotech, Inc) que se basa en la reacción múltiple en cadena de la
polimerasa (MPCR, por sus siglas en inglés).
Los primers que integraban el SET I y el SET II se usaron para amplificar diferentes
exones del gen. El SET I amplifica los exones 4 (196 pb), 8 (360 pb), 12 (331 pb), 17
(416 pb), 19 (459 pb), 44 (268 pb), 45 (547 pb), 48 (506 pb) y 51 (388 pb). El SET II
amplifica los exones promotor (535 pb), 3 (410 pb), 6 (202 pb), 13 (238 pb), 43 (357 pb),
47 (181 pb), 50 (271 pb), 52 (113 pb) y 60 (139 pb).
El producto de la reacción se somete a electroforesis horizontal en un gel de agarosa al
2% teñido con 1.5 µL de bromuro de etidio para visualizar la amplificación de los exones
mediante un documentador AlphaimagerTM y detectar las eliminaciones comparando con
la muestra de un individuo varón sin DMD/DMB.

6.8. Aleatorización
Como se mencionó anteriormente, este fue un estudio doble ciego, por lo que durante
toda la fase de suplementación los tratamientos fueron designados como Tratamiento 1
y Tratamiento 2, donde cualquiera de ellos tenía la misma probabilidad de ser el
tratamiento de AGPI omega - 3 o el placebo.
Para la asignación de los Tratamientos 1 y 2, se llevó a cabo una aleatorización de los
pacientes por medio del programa Random Allocation Software (Saghaei, 2004).

6.9. Suplementación
El grupo experimental fue suplementado con 10 cápsulas diarias Nordic NaturalsTM que
equivalen a una dosis de AGPI omega - 3 de 2.9 g/día (EPA 15.5%, DHA 77.6% y otros
6.9%), mientras que el grupo control (placebo) fue suplementado con 10 cápsulas diarias
Progela S.A de C.V que equivalen a una dosis de AG omega - 6 y 9 de 2.9 g/día (ácido
linoléico 55.6%, ácido oleico 31.1% y otros 13.3%).
La suplementación en ambos grupos fue durante 6 meses, iniciando el mismo día en que
se realiza la toma de la muestra basal de sangre.

6.10. Procedimientos
6.10.1. Características generales de los pacientes suplementados
Como parte de un proyecto que tiene diferentes objetivos, al inicio del estudio se
registraron los datos de edad (años), uso de silla de ruedas, peso corporal (Kg) (TANITA
escala digital BWB-700, Báscula silla SECA 954) y talla (cm) (Estadímetro de pared
marca SECA, medición de talla en posición decúbito supino) de los pacientes que
participan en el estudio. Con los datos anteriores, se calculó el índice de masa corporal
(IMC) y los datos se reportan en percentil del IMC de cada uno de los pacientes.

6.10.2. Cita mensual
6.10.2.1. Entrega de cápsulas
Se programó una cita mensual de los pacientes (en ayuno) durante los 6 meses del
período de suplementación y las cápsulas se entregaban cada mes al padre o tutor quien
supervisaba el consumo diario de las cápsulas por parte de los pacientes. En los frascos
entregados con los tratamientos cada mes, se incluía un 7% más de cápsulas para
reemplazar las extraviadas y evitar la suspensión o retraso en la ingestión de las mismas.

6.10.2.2. Muestra sanguínea
En cada cita mensual de los pacientes se obtuvo una muestra sanguínea venosa de 12
mL en tubos VacutainerTM con EDTA como anticoagulante. Se solicitó a los pacientes
evitar realizar actividad física intensa al menos por 48 horas previas a la toma de muestra
sanguínea.
Dichas muestras sanguíneas se centrifugaron a 3500 rpm (12 cm de radio del rotor) por
10 minutos a 5°C para la separación de eritrocitos y plasma sanguíneo. Los eritrocitos
se lavaron de 2 a 3 veces con solución salina al 0.9% y se almacenaron a -70º C hasta su
uso para la determinación del perfil de ácidos grasos, lo cual nos permitió evaluar el apego
al tratamiento.

El plasma sanguíneo se almacenó a -70°C hasta su uso para la medición de marcadores
sistémicos de estrés oxidativo y daño oxidativo.

6.10.2.3. Apego de los pacientes a la suplementación
El apego de los pacientes a la suplementación se evaluó por el incremento de la
proporción de EPA y DHA en las membranas de los eritrocitos, a partir de un perfil de
ácidos grasos obtenido por cromatografía de gases.
La incorporación de EPA y DHA en los eritrocitos es un indicador de la incorporación de
estos ácidos grasos en los tejidos. Si el paciente consume el suplemento que contiene
los AGPI omega - 3, habría un incremento en el porcentaje de EPA y DHA en los
eritrocitos. Por lo cual, para evaluar el apego de los pacientes a la suplementación se
determinó el % de cambio de los ácidos grasos EPA y DHA respecto al estado basal, en
eritrocitos durante los 6 meses de suplementación.
Para conocer el porcentaje de EPA y DHA se realizó un perfil de ácidos grasos de los
eritrocitos de cada muestra mensual de los pacientes por cromatografía de gases como
se describe a continuación:

6.10.2.3.1. Extracción de lípidos por el método de Folch modificado
El paquete eritrocitario que se obtuvo como se mencionó en el apartado 6.10.2.2 se lavó
tres veces con solución salina (0.9%). Se colocó 1 g de la muestra de los eritrocitos en
tubos de vidrio COREX, posteriormente, los tubos se pesaron y se agregó lentamente
10.5 mL de una solución isopropano/hexano (4.5:6.0). Para evitar que las células se
aglomeraran, las muestras se mantuvieron en agitación con vórtex. Después los tubos se
centrifugaron a 1200 rpm por 4 minutos y la mezcla de solventes se vertió en tubos
previamente pesados y se evaporó en una corriente de nitrógeno.
Posteriormente, los tubos se pesaron y se les agregó 900 µL de hexano para disolver la
grasa extraída y se incubo 5 minutos a temperatura ambiente. La solución de hexano se
pasó a tubos previamente pesados, se evaporó mediante una corriente de nitrógeno y
los tubos se pesaron nuevamente. Se cuantificó la grasa extraída por diferencia de pesos,
entre los tubos sin muestra y los tubos con la muestra evaporada.

6.10.2.3.2. Metilación de los ácidos grasos
Para facilitar el análisis cromatográfico, los ácidos grasos fueron transformados en
ésteres metílicos para volverlos volátiles, mediante un proceso conocido como cis-
esterificación. A la muestra de grasa extraída a partir de los eritrocitos se le agregó 1 mL
de metanol, 1 mL de HCl 3N y 500 µL de ácido margárico como estándar, y la mezcla se
incubó a 90° C por 60 minutos.
Terminado el calentamiento, los viales se enfriaron con agua corriente y se agregó 1 ml
de una solución de trifloruro de boro disuelto en metanol con una concentración al 14%,
esto se agitó durante 30 segundos y se colocó en el módulo de calentamiento en las
mismas condiciones del punto anterior. En seguida se enfrió y se agregó 1 mL de
isooctano y 4 mL de solución saturada de NaCl (130 g en 500mL de H2O), se agitó
durante 2 minutos y se centrifugó a 2500 rpm a 4°C durante 10 minutos. Finalmente, la
fase superior se transfirió a un vial ámbar previamente pesado, con tapa de rosca y se
evaporó el disolvente con corriente de nitrógeno.

El vial se volvió a pesar para calcular el peso y diluir la muestra hasta obtener una
concentración de 1 mg/uL e inyectarla en el cromatógrafo de gases.

6.10.2.3.3. Cromatografía de gases
Los metil esteres de ácidos grasos, se separaron y cuantificaron en un cromatógrafo de
gases con un auto inyector (Hewlett- PackardTM 5890 Series I, Palo Alto US) unido a una
columna capilar. Se utilizó una columna cromatográfica de sílica de 60 metros, con 0.25
mm de diámetro interno y 0.20 µm de grosor (J&W DB-225). El volumen de inyección fue
de 1 µL y se usó helio como gas acarreador con un flujo de 1.2 mL/min. La temperatura
del inyector fue de 240 °C, la del detector se ajustó a 270 °C y, el horno se programó
inicialmente a 70 °C, aumentando a 30 °C/min hasta alcanzar 175 °C y luego se
incrementó 1.2 °C/ min hasta llegar a 230 °C, una vez que se alcanzó la temperatura se
mantuvo así durante 5 minutos.

La identificación de los ácidos grasos de las muestras se realizó en base a su
comparación con el tiempo de retención de estándares de ácidos grasos purificados
comerciales (Supelco™ 37 Component FAME Mix). En las muestras se identificaron 13
ácidos grasos de entre 12 y 24 carbonos; posteriormente se integró su área para saber
el porcentaje de ácido graso presente en la muestra en base a la suma de las áreas de
todos los ácidos grasos identificados.

6.11. Marcador de daño celular
Para evaluar el daño celular muscular se midió la concentración de la enzima creatina
cinasa (CK) en suero solamente en las muestras basales de los pacientes ya que la
medición de esta molécula se empleó para establecer las características de la población
de estudio.

Además, la medición de CK nos permitió responder el objetivo particular de la
determinación del estado oxidativo de pacientes con DMD/DMB con diferente función
muscular: estado ambulatorio y no ambulatorio.
Las concentraciones de CK se midieron en una muestra de 40 µL de suero sanguíneo de
los pacientes en un autoanalizador automático para química clínica SPIN 120
(SPINREACT).
La prueba colorimétrica se basa en que la creatina cinasa cataliza la transferencia
reversible de un grupo fosfato de la fosfocreatina al ADP. Esta reacción se acopla con
otras catalizadas por la hexocinasa (HC) y por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6F-
DH):
𝐹𝑜𝑠𝑓𝑜𝑐𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛𝑎 + 𝐴𝐷𝑃
𝐶𝐾
→ 𝐶𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛𝑎 + 𝐴𝑇𝑃
𝐴𝑇𝑃 + 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
𝐻𝐶
→ 𝐴𝐷𝑃 + 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 − 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜
𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 − 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝑃+
𝐺6𝐹−𝐷𝐻
→ 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑜𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑛𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 + 𝐻+

La velocidad de formación de NADPH es proporcional a la concentración catalítica de CK
en las muestras.
Se lee la absorbancia inicial de la muestra y la absorbancia cada minuto durante tres
minutos. Posteriormente se calcula el promedio de la diferencia de absorbancia por
minuto (ΔA/min) y la concentración de CK se calcula con la siguiente fórmula:
𝐶𝐾 (
𝑈
𝐿
) = (ΔA/min)(4127)
La unidad internacional (UI) es la cantidad de enzima que convierte 1 µmol de sustrato
por minuto en condiciones estándar. La concentración se expresa en unidad por litro
(U/L).

6.12. Evaluación de la función muscular
La exploración sobre la función muscular en los pacientes con DMD/DMB se realizó
mediante la escala de Vignos en su primera cita (Basal). Dicha escala está integrada por
9 categorías diferentes que reflejan el nivel de función muscular de los pacientes. Las
categorías de la escala de Vignos se enlistan a continuación:
Categorías en la escala de Vignos
1. Camina y puede subir escaleras sin ayuda.
2. Camina y puede subir escaleras con ayuda de barandal.
3. Camina y puede subir escaleras lentamente con ayuda de barandal (más de 25
segundos en 8 escalones regulares).
4. Camina sin ayuda y puede levantarse de la silla pero no puede subir escaleras.
5. Camina sin ayuda pero no puede levantarse de una silla o subir escaleras.
6. Camina sólo con ayuda o camina de forma independiente con férulas largas
(aparato ortopédico) de piernas.
7. Camina con férulas largas pero requiere apoyo para el equilibrio.
8. Se levanta con ayuda de férulas pero no puede caminar aun con ayuda.
9. Confinado a una silla de ruedas.
10. Confinado a la cama.

6.13. Marcadores de estrés oxidativo
6.13.1. Peróxido de hidrógeno
Para la determinación del peróxido de hidrógeno (H2O2) las muestras de plasma
sanguíneo de los pacientes fueron desproteinizadas mediante una columna de
centrifugación de 10 kD con filtro de polietersulfona (ab93349, Abcam), con capacidad de
500 µL a 12500 rpm (8.5 cm de radio de rotor) por 15 minutos. A partir de la muestra
obtenida en el tubo colector de la columna de centrifugación se realizó la determinación
de peróxido de hidrógeno con un volumen de 50 µL de plasma libre de proteína mediante
un kit colorimétrico (No. de catálogo ab102500, Abcam) que utiliza una curva estándar
para calcular la concentración de peróxido de hidrógeno (pmol) a partir de la medición de
la absorbancia de las muestras a 570 nm.
La técnica se basa en la reacción de la sonda OxiRed con el H2O2 en la muestra de
plasma, en presencia de la peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés)
generando un producto con color (λmáx = 570 nm).

𝑂𝑥𝑖𝑅𝑒𝑑 + 𝐻2𝑂2
𝑃𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑟á𝑏𝑎𝑛𝑜
→ 𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑟

Las concentraciones de peróxido de hidrógeno de cada muestra se calculan de la
siguiente forma:
a) Promediar y restar el valor de absorbancia del blanco (estándar 1) de todos los
estándares y las muestras, ésta es la absorbancia corregida.
b) Promediar y graficar las absorbancias corregidas de cada estándar en función de
las concentraciones finales de H2O2.
c) Establecer la ecuación de la recta a partir de la curva estándar graficada.
d) Extrapolar las lecturas de las muestras usando la siguiente ecuación:

𝐶𝑚 = (
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 − (𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑐𝑜𝑛 𝑌)
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
)

e) La concentración de las muestras es calculada como:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝐻2𝑂2 =
𝐶𝑚
𝑉𝑚

Donde:
𝐶𝑚 = 𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑢𝑟𝑣𝑎 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 (𝑝𝑚𝑜𝑙)
𝑉𝑚 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (µ𝐿)

6.13.2. NO total
Para la determinación de la concentración de óxido nítrico total las muestras de plasma
sanguíneo de los pacientes se desproteinizaron mediante una columna de centrifugación
de 10 kD con filtro de polietersulfona (ab93349, Abcam), con capacidad de 500 µL a 12
500 rpm (8.5 cm de radio de rotor) por 15 minutos.
A partir de 40 µL de la muestra obtenida en el tubo colector, se realizó la determinación
de óxido nítrico mediante un ensayo colorimétrico (No. de catálogo 780001, Cayman
Chemical Company) que utiliza una curva estándar para calcular la concentración de
nitrato + nitrito (µM) a partir de la medición de la absorbancia de las muestras a 545 nm.
La técnica se fundamenta en dos pasos, el primero consiste en la conversión de nitrato a
nitrito utilizando a la enzima nitrato reductasa. El segundo paso es la adición del reactivo
de Griess 1 (Sulfanilamida) y reactivo de Griess 2 (N-(1-naftil) etilendiamina), los cuales
convierten el nitrito a un compuesto azo púrpura obscuro.

𝟏) 𝑁𝑂3
𝑁𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑎𝑠𝑎
→ 𝑁𝑂2

𝟐) 𝑁𝑂2 + 𝑆𝑢𝑙𝑓𝑎𝑛𝑖𝑙𝑎𝑚𝑖𝑑𝑎 1 + N − (1 − naftil) etilendiamina → 𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 𝐴𝑧𝑜(𝑁 = 𝑁)

Las concentraciones de NO total de cada muestra se calculan de la siguiente forma:
a) Promediar y restar el valor de absorbancia del estándar A (0 µM) de todos los
estándares y las muestras.
b) Promediar y graficar las absorbancias corregidas de cada estándar en función de
las concentraciones finales de H2O2.
c) Graficar las absorbancia de cada estándar en función de las concentraciones de
nitrato.
d) Establecer la ecuación de la recta a partir de la curva estándar graficada.
e) La concentración de las muestras es calculada como:

𝑁𝑂 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (µ𝑀) = (
𝐴545 − 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑜𝑛 𝑌
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
) (
200µ𝐿
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑢𝑠𝑎𝑑𝑎 (µ𝐿)
)

6.14. Marcadores de daño oxidativo
Como marcadores de daño oxidativo se midió la oxidación lipídica y oxidación proteíca.

6.14.1. Marcador de lipoperoxidación
Como marcador de oxidación lipídica se midió la concentración de malondialdehido (MDA
por sus siglas en inglés) en plasma sanguíneo.

6.14.1.1. Malondialdehído
La determinación de la concentración de MDA en plasma sanguíneo no requiere de
preparación o purificación de la muestra y se realizó directamente sobre un volumen de
50 µL de muestra de plasma a través de un ensayo colorimétrico de sustancias reactivas

al ácido tiobarbitúrico (TBARS, por sus siglas en inglés) (No. de catálogo 700870,
Cayman Chemical Company) que utiliza una curva estándar para calcular la
concentración de MDA (µM) a partir de la medición de la absorbancia de las muestras a
535 nm. TBARS = Substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, TCA = Ácido
tricloroacético.
La técnica se basa en la reacción a temperatura elevada (90-100 °C) del malondialdehido
(MDA) y el ácido tiobarbitúrico (TBA, por sus siglas en inglés) que forman un aductor de
MDA-TBA.

𝑀𝐷𝐴 + 𝑇𝐵𝐴
90−100 °𝐶
→ 𝐴𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑀𝐷𝐴 − 𝑇𝐵𝐴 + 2𝐻2𝑂

Las concentraciones de MDA de cada muestra se calculan de la siguiente forma:
a) Promediar y restar el valor de la absorbancia del estándar A (0 µM) del resto de
los estándares y las muestras. Esta es la absorbancia corregida.
b) Promediar y graficar los valores de absorbancia corregida de cada estándar en
función de la concentración de MDA.
c) Establecer la ecuación de la recta a partir de la curva estándar graficada.
d) Calcular las concentraciones de MDA de cada muestra como se muestra a
continuación:

𝑀𝐷𝐴 (µ𝑀) = [
(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎) − (𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑜𝑛 𝑌)
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
]

6.14.2. Marcadores de oxidación proteica
Como marcadores de oxidación proteica se midieron proteínas carboniladas y grupos tiol.

6.14.2.1. Proteínas carboniladas
Las proteínas carboniladas se midieron en una submuestra de los pacientes, esto se
realizó con la finalidad de determinar si existen cambios en la concentración de este
marcador en pacientes con distrofia, ya que hasta nuestro conocimiento no existen
reportes de las proteínas carboniladas en pacientes con distrofia muscular.
La medición de la concentración de este marcador se realizó directamente en un volumen
total de 400 µL de plasma sanguíneo por muestra a través de un ensayo colorimétrico de
proteínas carboniladas (No. de catálogo 10005020, Cayman Chemical Company). Los
400 µL de muestra se dividieron en dos ya que se utilizaron 200 µL para la muestra
problema y 200 µL para la muestra control; en base a esta última se hace el cálculo de la
concentración de proteínas carboniladas (nmol/mL) a partir de la absorbancia medida en
las muestras a 370 nm.
Esta técnica se basa en la reacción entre 4,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) y las proteínas
carboniladas que al reaccionar producen hidrazona, cuyo color puede ser medido por
espectrofotometría. La reacción que describe a este ensayo se muestra a continuación:
Hidrazona

Para conocer las concentraciones de proteínas carboniladas de cada muestra se realizó
lo siguiente:
a) Restar las absorbancias de los controles de las muestras. Esta es la absorbancia
corregida.
b) Determinar las concentraciones como se indica a continuación:

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛𝑖𝑙𝑎𝑑𝑎𝑠 (
𝑛𝑚𝑜𝑙
𝑚𝐿
) = (
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎
0.011 µ𝑀−1
) (
500 µ𝐿
200 µ𝐿
)

6.14.2.2. Grupos tiol
Los grupos tiol fueron se midieron directamente en 15 µL de plasma sanguíneo a través
de un ensayo colorimétrico de cuantificación de tiol (No. de catálogo T-6060, Life
Technologies Corporation) que utiliza una curva estándar para calcular la concentración
de tioles (mM) a partir de la medición de la absorbancia de las muestras a 410 nm.
En este ensayo los grupos tiol reducen un disúlfido inhibido derivado de la papaína que
activa a dicha enzima (A). La actividad de la enzima es medida usando el sustrato
cromogénico de la papaína, N-benzoyl-L-arginina, p-nitroanilida (L-BAPNA) (B). Dicha
reacción permite detectar pequeñas concentraciones de hasta 0.2 µM (0.2 nanomoles en
1 mL de reacción).
Además, el kit incluye L-cisteína, reactivo de Ellman y cistamina. La L-cisteína sirve como
un estándar en la reacción y el reactivo de Ellman es usado para determinar con precisión
la concentración actual de tiol de las soluciones estándar de L-cisteína. La cistamina
permite la detección de tioles de difícil detección que tiene valores altos de pK. La
cistamina, un disúlfido, experimenta una reacción con las proteínas tiol, produciendo 2-
mercaptoetilamina (cisteamina) (C) la cual libera papaína activa. Las reacciones de este
ensayo se muestran a continuación:

Para conocer las concentraciones de tiol de cada muestra se realizó lo siguiente:
a) Calcular la absorbancia corregida restando el valor de la absorbancia de la
reacción control de los valores de absorbancia de los estándares y las muestras.
b) Graficar la curva de la absorbancia corregida a 410 nm de los estándares L-
cisteína vs el contenido de tiol.
c) Establecer la ecuación de la recta a partir de la curva estándar graficada.
d) Determinar las concentraciones como se indica a continuación:

𝑇𝑖𝑜𝑙 (𝑚𝑀) = [
(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎) − (𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑜𝑛 𝑌)
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
]

Inactiva
L-BAPNA
Activa
Compuesto de
color amarillo
Cisteamina Cistamina
Tiol

6.15. Capacidad de atrapamiento del radical DPPH
Para este ensayo se siguió la propuesta de Blois (1958) modificado por Koren et al.
(2010). La capacidad de atrapamiento del 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH, por sus
siglas en inglés) es indicador de capacidad antioxidante y se midió directamente en 30
µL de plasma sanguíneo a través de un ensayo colorimétrico que se basa en la reducción
del radical DPPH.
El DPPH es un radical estable de color violeta intenso que al reducirse forma un
compuesto de color amarillo llamado difenil picrilhidrazina en relación con el número de
electrones incorporado a su estructura, dicha reacción se presenta a continuación:

La absorbancia de la difenil picrilhidrazina se midió a 518 nm mediante un
espectrofotómetro Pharmacia Biotech Ultrospe 2000 UV/visible Spectrophotometry
utilizando celdas Eppendorf UVette ® (eppendorf).
La capacidad de atrapamiento del radical DPPH se expresa en % en base al siguiente
algoritmo:
% 𝑑𝑒 𝑎𝑡𝑟𝑎𝑝𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝐷𝑃𝑃𝐻 =
(𝐷𝑂 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐷𝑂 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)
𝐷𝑂 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
𝑥100
Todos los ensayos colorimétricos (exceptuando la capacidad de atrapamiento del radical
DPPH) se midieron en un espectrofotómetro para microplacas compacto Epoch2 (BioTek
Instruments, Inc.) y analizados con su software Gen5TM (BioTek Instruments, Inc.).

A) B)
DPPH radical DPPH no radical

6.16. Expresión relativa de NRF2 y NFKB subunidad p65
6.16.1.Extracción de RNA total
Se extrajo el RNA total de los leucocitos mediante el método de extracción fenólica con
TRIzol (Reagent InvitrogenTM Life Technologies) (Chomczynsky et al., 1987), dicho
método se basa en el uso de una solución monofásica de fenol e isotiocianato de
guanidina para lisis de las células, la cual separa a las muestras en dos fases (acuosa y
orgánica). Seguida de la extracción y precipitación de RNA total con cloroformo e
isopropanol respectivamente a partir de la fase acuosa.
Posteriormente el RNA total se cuantificó con un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000
y se determinó la integridad del RNA sometiendo una muestra de éste a electroforesis
horizontal en gel de agarosa al 1.0% teñido con bromuro de etidio (0.5 µg/mL).

6.16.2. Síntesis de cDNA
El cDNA se sintetizó a partir de 2 μg de RNA total utilizando la transcriptasa reversa
MMLV. El RNA total se pre-incubó con random primers y desoxirribonucleótidos trifosfato
(dNTPs) (100 mM) a 65°C por 5 minutos. Posteriormente el producto se incubó con una
solución amortiguadora de Tris-HCl (250 mM), KCl (375 mM), y MgCl2 (15 mM) y DTT
(0.1 M) a 37°C durante 2 minutos. Finalmente, la síntesis de cDNA se realizó con la
transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina Moloney (M-MLV, por sus siglas en
inglés) y agua grado biología molecular libre de RNAsas en un volumen final de 20 μL.
La síntesis se realizó a 25°C por 10 minutos seguida de una incubación a 37°C durante
50 minutos y finalmente a 70°C por 15 minutos.

6.16.3. PCR en tiempo real
La cuantificación del RNAm de NFκB (p65) y NRF2 se realizó mediante PCR en tiempo
real y se utilizaron a B2M como gen de normalización. El cDNA sintetizado se amplificó
mediante la enzima DNA polimerasa del kit LightCycler Fast Start DNA MasterPLUS SYBR
Green I (Roche, Indianapolis, IN) con los primers diseñados para NFKB (p65), NRF2 y
B2M (Tabla 1). Los primers fueron sintetizados por la empresa InvitrogenTM.

La reacción se llevó a cabo en un termociclador (Lightcycler Nano, Roche) para PCR en
tiempo real, que mide continuamente la amplificación de productos de PCR en cada ciclo,
usando primers comunes para PCR y el fluorocromo SYBR Green que se intercala en el
surco menor de las hebras de doble cadena de DNA, emitiendo fluorescencia.
La amplificación se realizó en un volumen total de 20 μL conteniendo 2 μL de cDNA, 40
pmol de cada primer y 4 μL de MasterPLUS SYBR Green que contiene la enzima
polimerasa Fast Start, amortiguador para PCR, SYBR Green y MgCl2 3.5 mM en
capilares de borosilicato de 20 μl. Durante la reacción, la polimerasa se activa y el cDNA
se desnaturaliza pre-incubando a 95°C durante 10 minutos. La amplificación se
desarrolló durante 35 ciclos a 95°C por 10 segundos y un alineamiento 60°C por 7
segundos. La adquisición de la fluorescencia se realizó al terminar este ciclo de PCR.
Gen Primers
NFKB subunidad p65 F- GATGATGAAGACCTGGGGGC
R- GGGTACTCCATCAGCATGGG
NRF2 F- TGGTTCCAAGTCCAGAAGCC
R- CACTGTCAACTGGTTGGGGT
B2M F- TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT
R- TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT
Tabla. 1. Lista de primers diseñados para la cuantificación del mRNA

Todas las reacciones se realizaron por duplicado. Para el análisis de la expresión se
determinó el ciclo donde inició el aumento de la fluorescencia, denominado punto de
corte (Cp, por las siglas en inglés de crossing point) o ciclo de umbral (Ct, por las siglas
en inglés de cycle threshold) se determinó el Ct del gen de normalización, y se calculó el
valor de ΔΔCt en unidades relativas y el resultado final se informa como 2- ΔΔCt.

6.17. Análisis estadístico
Los datos se analizaron con el programa SPSS v22.0. (IBM Corp. Released 2011).
Para todos los análisis estadísticos primeramente se exploró la distribución Gaussiana
de los datos mediante las pruebas de Shapiro-Wilk (N ≤ 30) y Kolmogorov-Smirnov (N >
30). Para las comparaciones de estado ambulatorio vs estado no ambulatorio, las
comparaciones de los datos poblacionales y las comparaciones mensuales entre
tratamiento de los pacientes suplementados con placebo vs AGPI omega - 3 se procedió
como se menciona a continuación.
Si los datos tenían distribución normal se presentaron como media ± la desviación
estándar y se utilizaron pruebas de T de Student, mientras que si los datos no tenían
distribución normal se presentaron como mediana, (valor mínimo, valor máximo) y se
utilizaron pruebas de U de Mann-Whitney. Se realizó una correlación de Spearman entre
los niveles de expresión de mRNA de NFKB (p65) y NO total.
Para todos los análisis se emplearon intervalos de confianza del 95% y se consideró un
valor alfa < 0.05.

6.18. Aspectos éticos y beneficios otorgados al paciente
El estudio fue registrado ante la Comisión Nacional de Investigación Científica del IMSS
(R-2012-785-066) y de acuerdo al Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de
Investigación para la Salud, Titulo segundo: De los aspectos éticos de la investigación en
Seres Humanos, Capítulo 1, Artículo 17, es una investigación en categoría de riesgo
mayor que el mínimo (Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de
Investigación para la Salud, en Línea).
A los padres o tutores de los pacientes se les explicaron los fundamentos, procedimientos
del estudio, los beneficios proporcionados al participar en el estudio, el derecho de
confiabilidad y de abandono del estudio. Además, se les informó verbalmente utilizando
un lenguaje comprensible para los padres, acerca de la inocuidad y los beneficios que
tienen los AGPI omega - 3 EPA y DHA en la salud.
Los beneficios que se otorgaron al paciente durante su participación en el estudio fueron:
a) Diagnóstico molecular.
b) Pruebas bioquímicas mensuales de concentraciones de glucosa,
triglicéridos, colesterol HDL, colesterol LDL, transaminasas y creatina
cinasa (CK) en suero, lo cual indica el estado de salud metabólico del
paciente.
c) Plan de nutrición personalizado.

7. RESULTADOS
7.1. Diagnóstico molecular DMD/DMB
El diagnóstico molecular de DMD/DMB fue un criterio de inclusión de los pacientes a esta
investigación. Se realizaron 34 diagnósticos moleculares de DMD/DMB por PCR
Multiplex a pacientes con diagnóstico clínico en un período de agosto de 2014 a diciembre
de 2015. Esta prueba sólo permite detectar las eliminaciones en los hot spots; es decir,
los 18 exones que son más susceptibles a eliminación y que se dividen en Set I y Set II
en el estuche comercial de la PCR Multiplex (Fig. 5 A y B).

A Sujeto
sano
Paciente
1
Paciente
2
Paciente
3
*
*
*
*
Marcador
pb
B Sujeto
sano
Paciente
1
Paciente
2
Paciente
3
*
*
*
Marcador
pb
Fig. 5. Diagnóstico
molecular de
DMD/DMB de 3
pacientes con
diagnóstico clínico. El
diagnóstico por PCR
multiplex permite la
identificación de
exones eliminados del
gen DMD. Se muestra
la comparación con un
sujeto sano. A)
Análisis de los exones
correspondientes al
SET I (exones 4, 8,
17,19, 44, 45, 48, 12 y
51. B) Análisis de los
exones
correspondientes al
SET II (exones
promotor, 3, 6, 13, 43,
47, 50, 52 y 60). Las
líneas rojas indican el
número de exón
amplificado del gen
DMD y los asteriscos
indican eliminación de
algún exón.

7.2. Daño oxidativo en pacientes con DMD/DMB en estado ambulatorio y no
ambulatorio antes de la suplementación
Primeramente es importante mencionar que los resultados de los diferentes grupos de
estudio tienen distinto número de sujetos. Esto se debe a varias razones; primero, la
medición de las moléculas fue utilizando un estuche comercial que requería completar
cierto número de muestras. Segundo, algunos de los sujetos no terminaron la
suplementación. Finalmente, el volumen de la muestra sanguínea