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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE ECOLOGÍA ECOLOGÍA Diversidad de las comunidades bacterianas asociadas a los estanques de cultivo de camarón blanco; Litopenaeus vannamei del Pacífico noroeste mexicano y su relación con la identificación de enterotoxinas TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PRESENTA: Biol. Alan Enrique Heres Rojas TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: Dra. Valeria Francisca Eugenia Leopoldina de María de Guadalupe de Souza Saldívar, Instituto de Ecología, UNAM COMITÉ TUTOR: Dra. María del Rosario Morales Espinosa Posgrado en Ciencias Biológicas Dr. Luis David Alcaraz Peraza Instituto de Ecología, UNAM CDMX. NOVIEMBRE 2019 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 3 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE ECOLOGÍA ECOLOGÍA Diversidad de las comunidades bacterianas asociadas a los estanques de cultivo de camarón blanco; Litopenaeus vannamei del Pacífico noroeste mexicano y su relación con la identificación de enterotoxinas TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PRESENTA: Biol. Alan Enrique Heres Rojas TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: Dra. Valeria Francisca Eugenia Leopoldina de María de Guadalupe de Souza Saldívar, Instituto de Ecología, UNAM COMITÉ TUTOR: Dra. María del Rosario Morales Espinosa Dr. Luis David Alcaraz Peraza MÉXICO, CDMX. NOVIEMBRE 2019 4 OFICIO CPCB/1021/2019 Asunto: Oficio de Jurado para Examen de grado M en C. Ivonne Ramírez Wence Directora General de Administarción Escolar , UNAM Presente Me permito informar a usted, que el consejo de Biología Experimental y Biomedicina, en su sesión ordinaria del día 26 de julio de 2019, aprobó el jurado para la presentacion del examen para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS BIOLOGICAS, al alumno HERES ROJAS ALAN ENRIQUE con número de cuenta: 303058030 con la tesis titulada: “DIVERSIDAD DE LAS COMUNIDADES BACTERIANAS ASOCIADAS A LOS ESTANQUES DE CULTIVO DE CAMARÓN BLANCO; Litopenaeus vannamei DEL PACÍFICO NOROESTE MEXICANO Y SU RELACIÓN CON LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROTOXINAS”, bajo la direccion de la DRA. VALERIA FRANCISCA EUGENIA LEOPOLDINA DE MARIA DE GUADALUPE SOUZA SALDIVAR: Presidente: DR. FERNANDO ÁLVAREZ NOGUERA Vocal: DR. MIGUEL ÁNGEL CEVALLOS GAOS Secretario: DR. LUIS DAVID ALCARAZ PERAZA Suplente: DRA. ERIA REBOLLAR CAUDILLO Suplnete: ARTURO CARLOS II BECERRA BRACHO Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. 5 Agradecimientos Académicos Al Posgrado en Ciencias Biológicas por la oportunidad que me ha brindado para continuar con mis estudios y desarrollo personal Al CONACyT por el apoyo económico a través de la beca 632164 A mi tutora la Dra. Valeria Souza A la Dr. María del Rosario Morales Espinosa por formar parte de mi comité tutor Al Dr. Luis David Alcaraz Peraza por formar parte de mi comité tutor 6 Agradecimientos Personales A la Universidad Nacional Autónoma de México, mi segunda casa A la Dra. Valeria Souza por las enseñanzas, el apoyo y buen trato que siempre me dio, por la paciencia que siempre me tubo y por despertar en mí el interés de saber más acerca del gran mundo bacteriano y anarquista por aquella clase magistral de interacciones donde se habló entre otras de Piort Kropotkin. Al Dr. Luis David por las enseñanzas, el apoyo, la confianza y motivación que me brindo. Esto último de gran valor para mí ya que me ayudo a concluir este trabajo Al Instituto de Ecología por permitirme trabajar en sus instalaciones y permitirme conocer a otras personas que me han ayudado ampliar mis horizontes. A Erika Rodríguez como su representante ante nosotros, siempre un buen trato, gracias Erika A Doña Silvia, Manuel Rosas, Laura Espinosa-Asuar y Erika Aguirre por el apoyo técnico brindado durante el proyecto, en especial a Manuel por su consejos y enseñanzas A los miembros del Laboratorio de Evolución Molecular y Experimental que me ayudaron y dieron su apoyo en especial a Valerie, Gabriel, Enrique y Memo por compartir sus experiencias y conocimientos y a los demás miembros por brindarme su amistad y experiencias de vida A mi compañera de viaje Karen Carrasco por su amor incondicional, por todo el apoyo que me ha brindado todos los años que me ha acompañado en este viaje y por las aportaciones en el desarrollo de esta tesis, sin las cuales, no hubiera podido darle el sentido que quería darle a mi trabajo, besos para ella. A mi hijo por ser un buen niño, el cual espero se convierta en una buena persona, besos también para el A mis suegros por todo el apoyo que me han brindado estos años, sin el cual no habría podido llegar hasta donde estoy actualmente A mis padres por permitirme estar aquí en este mundo maravilloso a pesar de los pesares, y a mis hermanos por su cariño y admiración 7 Índice general Índice de Figuras ................................................................................................................... 10 Índice de Tablas .................................................................................................................... 12 Resumen ............................................................................................................................... 13 Abstract ................................................................................................................................ 14 1. Introducción ...................................................................................................................... 15 1.1 El cultivo de camarón y los microorganismos asociados a éste ............................ 15 1.1.1 Camarones Peneidos y la camaronicultura. ................................................... 15 1.1.2 Vibrio y la acuacultura .................................................................................... 21 1.1.3 Principales causas de las epizootias ..................................................................... 24 1.1.4 Un ejemplo: Sistemas de co-cultivo con microorganismos Bio-floc .................... 27 1.1.5 El rol de los microorganismos en la acuacultura ................................................. 28 1.1.6 Principales funciones de las bacterias benéficas ................................................. 29 1.2 Métodos de estudio de la diversidad bacteriana .......................................................35 2. Antecedentes .................................................................................................................... 39 2.1 Parámetros fisicoquímicos asociados a la calidad del agua en los estanques de cultivo de camarón ........................................................................................................... 39 2.2 Uso de comunidades bacterianas y componentes genéticos como indicadores biológicos .......................................................................................................................... 42 2.2.1 Comunidades bacterianas asociadas a fluctuaciones estacionales de carbono orgánico ......................................................................................................................... 44 2.2.2 Comunidades bacterianas y variables fisicoquímicas asociadas a poblaciones de camarón enfermas y sanas ............................................................................................ 44 2.2.4 Comunidades bacterianas asociadas al agua, sedimento y hepatopáncreas- intestino en cultivos de camarón .................................................................................. 46 2.2.5 Análisis de genes bacterianos como indicadores del estado de contaminación en estanques de cultivo de camarón ................................................................................. 48 3. Hipótesis ........................................................................................................................... 53 4. Objetivos ........................................................................................................................... 53 4.1 Objetivo General .................................................................................................... 53 4.2 Objetivos particulares………………………………………………………………………………………53 8 5. Material y Métodos .......................................................................................................... 54 5.1 Caracterización las comunidades microbianas de agua y sedimento, asociadas a los estanques de cultivo de camarón mediante técnicas independientes de cultivo ........... 54 5.1.1 Sitios de colecta .................................................................................................... 54 5.1.2 Colecta de muestras ............................................................................................. 55 5.1.3 Procesamiento de las muestras ........................................................................... 55 5.1.4 Extracción de DNA ................................................................................................ 56 5.1.5 Secuenciación del gen 16S rRNA con Ilumina MiSeqSystem ............................... 56 5.2 Análisis bioinformático de las muestras de agua y sedimento asociadas a los estanques de cultivo de camarón ..................................................................................... 57 5.2.1 De-multiplex, filtrado y análisis de quimeras ....................................................... 57 5.2.2 Asignación de OTUs .............................................................................................. 57 5.3 Análisis de la diversidad y estructura de las comunidades bacterianas asociadas a la columna de agua y sedimento en estanques de cultivo de camarón .............................. 57 5.3.1 Diversidad α ......................................................................................................... 58 5.3.2 Diversidad β .......................................................................................................... 60 5.4 Caracterización del nivel de contaminación de los estanques de cultivo mediante el uso de indicadores biológicos (genes de enterotoxinas). ................................................ 60 5.4.1 Índice de contaminación ...................................................................................... 61 5.5 Análisis estadísticos .................................................................................................... 62 5.5.1 Pruebas de normalidad y de diferencias significativas ........................................ 62 5.5.2 Asociación entre las comunidades bacterianas y los niveles de contaminación . 62 6. Resultados……………………………………………………………………………………………………………………64 6.1 Diversidad y estructura de las comunidades bacterianas asociadas a las muestras de agua y sedimento de los estanques de cultivo de camarón en los Estados de Nayarit, Sinaloa y Sonora. ............................................................................................................... 64 6.1.1 Diversidad de las comunidades bacterianas asociadas a las muestras de agua ....................................................................................................................................... 65 6.1.2 Estructura de las comunidades bacterianas asociadas a las muestras de agua: diversidad β ................................................................................................................... 66 9 6.1.3 Diversidad de las comunidades bacterianas asociadas a las muestras de sedimento ......................................................................................................................... 70 6.1.4 Estructura de las comunidades bacterianas asociadas a las muestras de sedimento: diversidad β ................................................................................................ 71 6.2 Muestras de agua de acuerdo con su nivel de contaminación .................................. 74 6.2.1 Diversidad de las comunidades bacterianas asociadas a las muestras de agua de acuerdo con su nivel de contaminación .................................................................. 75 6.2.2 Estructura de las comunidades bacterianas asociadas a las muestras de agua de acuerdo a su nivel de contaminación: diversidad β ...................................................... 76 7. Discusión ........................................................................................................................... 80 7.1 Diversidad bacteriana del ambiente acuático en el cultivo de camarón ................... 80 7.2 Diversidad bacteriana de sedimentos en los estanques de cultivo de camarón ....... 83 7.3 Diversidad bacteriana de las muestras de agua en estanques de cultivo de acuerdo con su nivel de contaminación ......................................................................................... 85 8. Conclusiones……………………………………………………………………………………………………………….95 9. Perspectivas ...................................................................................................................... 96 11. Bibliografía ...................................................................................................................... 97 10. Anexos .......................................................................................................................... 107 11.-Abreviaturas ................................................................................................................. 125 10 Índice de Figuras Figura 1. Ciclo de vida de camarones Peneidos ................................................................... 16 Figura 2. Métodos moleculares de caracterización independiente de cultivo .................... 36 Figura 3. Gen 16S rRNA ........................................................................................................ 36 Figura 4. Indicadores bacterianos; grupos bacterianos asociados a poblaciones de camarón sano y enfermos .................................................................................................... 45 Figura 5. Muestreo de las granjas camaroneras a lo largo de la costa del Pacífico noroeste mexicano...............................................................................................................................54 Figura 6. Muestras de la columna de agua de los estanques de cultivo de camarón blanco: Litopenaeus vannamei .......................................................................................................... 55 Figura 7. Sistema de filtración por vacio .............................................................................. 56 Figura 8. Índices de diversidad α (a nivel de familia) de las muestras de agua asociados a los estanques de cultivo de camarón ................................................................................... 65 Figura 9. Escalamiento Métrico Multidimensional (MDS) derivado del coeficiente Bray- Curtis de las comunidades bacterianas (a nivel de familia) de las muestras de agua asociadas a los estanques de cultivo de camarón ................................................................ 67 Figura 10. Abundancia relativa a nivel de filo de los grupos bacterianos en las muestras de agua asociadas a los estanques de cultivo de camarón, en los Estados de Nayarit, Sinaloa y Sonora ................................................................................................................................... 68 Figura 11. Abundancia relativa a nivel de familia de los grupos bacterianos en las muestras de agua asociadas a los estanques de cultivo de camarón, en los Estados de Nayarit, Sinaloa y Sonora ................................................................................................................... 69 Figura 12. Biomarcadores bacterianos a nivel de familia obtenidos con LEfSe de las muestras de agua asociadas a los estanques de cultivo de camarón por Estado ............... 70 Figura 13. Índices de diversidad α (a nivel de familia) de las muestras de sedimento asociados a los estanques de cultivo de camarón ............................................................... 71 Figura 14. Escalamiento Métrico Multidimensional (MDS) derivado del coeficiente Bray- Curtis de las comunidades bacterianas (a nivel de familia) de las muestras de sedimento asociadas a los estanques de cultivo de camarón ................................................................ 72 Figura 15. Abundancia relativa a nivel de filo de los grupos bacterianos en las muestras de sedimento asociadas a los estanques de cultivo de camarón ............................................. 73 Figura 16. Abundancia relativa a nivel de familia de los grupos bacterianos en las muestras de sedimento asociadas a los estanques de cultivo de camarón ........................................ 74 Figura 17. Mapa de calor (heat map) de la distribución de toxinas pertencientes a diferentes grupos enteropatogénicos detectados en el microarreglo presentes en el agua de los estanques de cultivo de camarón muestreados ........................................................ 75 Figura 18. Índices de diversidad α de las muestras de agua asociados a los estanques de cultivo de camarón de acuerdo con los niveles de contaminación ..................................... 76 11 Figura 19. Escalamiento Métrico Multidime nsional (MDS) derivado del coeficiente Bray- Curtis de las comunidades bacterianas de las muestras de agua de acuerdo con el nivel de contaminación ...................................................................................................................... 77 Figura 20. Abundancia relativa a nivel de filo de los grupos bacterianos en las muestras de agua de acuerdo con su nivel de contaminación ................................................................. 78 Figura 21. Abundancia relativa a nivel de familia de los grupos bacterianos en las muestras de agua asociadas a los estanques de cultivo de camarón de acuerdo con su nivel de contaminación ...................................................................................................................... 79 Figura 22. Biomarcadores bacterianos a nivel de familia obtenidos con LEfSe de las muestras de agua de acuerdo con el nivel de contaminación ............................................. 79 12 Índice de Tablas Tabla 1. Sistemas e índices de los diferentes niveles tecnológicos utilizados en México para el cultivo de camarón ........................................................................................................... 18 Tabla 2. Cantidad de materia orgánica, nitrógeno y fósforo de descarga a través de los efluentes de granjas camaroneras por cada tonelada de camarón producida en relación al factor de conversión alimenticia .......................................................................................... 25 Tabla 3. Algunas herramientas bioinformáticas para el estudio en ecología microbiana ... 38 Tabla 4. Efectos del pH en el cultivo de camarón ................................................................ 41 Tabla 5. Indicadores bacterianos asociados a diferentes hábitats y estatus de salud en el camarón de cultivo ............................................................................................................... 49 Tabla 6. Diseño de amplicones ............................................................................................. 57 Tabla 7. Cepas y genes de diarreas incluidos en la macromembrana ................................. 60 Tabla 8. Valores promedio de los índices de diversidad alfa (a nivel de familia) de las muestras de agua de los tres Estados .................................................................................. 66 Tabla 9. Valores promedio de los índices de diversidad alfa (a nivel de familia) de las muestras de sedimento de los tres Estados ......................................................................... 71 Tabla 10. Número de muestras por Estado de acuerdo a su nivel de contaminación ........ 74 Tabla 11. Valores promedio de los índices de diversidad alfa de las muestras de agua de acuerdo a su nivel de contaminación ................................................................................... 76 13 Resumen Existe evidencia sólida de que la incidencia de enfermedades en el camarón de cultivo como la enfermedad de la necrosis aguda del hepatopáncreas se encuentra relacionada con cambios en la diversidad y en la estructura de las comunidades bacterianas que coexisten en los sistemas de cultivo de camarón. Así mismo, estas comunidades bacterianas pueden actuar como bioindicadoras del estatus de salud o el nivel de contaminación (eutrofización) del sistema en su conjunto, dadas las condiciones ambientales (i.e., manejo) y los diferentes factores bióticos (i.e. comunidades bacterianas) y abióticos (i.e., pH, temperatura, etc.). Para probar esta hipótesis, en este trabajo se caracterizaron las comunidades bacterianas de la columna de agua y sedimentos, así como las condiciones de cultivo en estanques productivos de camarón en granjas de tres de los principales Estados productores: Nayarit, Sinaloa y Sonora. Mediante la secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA, la evaluación de las condiciones de contaminación bacteriana de las granjas camaroneras mediante la identificación diagnóstica de bacterias entéricas y los niveles de eutrofización asociados. En este trabajo, clasificamos la eutrofización en índices consolidados del nivel de contaminación: bajo, medio y alto. Los resultados mostraron que las comunidades bacterianas del hábitat acuático difirieron entre los Estados al igual que las comunidades de los sedimentos. Determinamos que existen mayores similitudes entre las comunidades bacterianas de Nayarit y Sinaloa. También, se observaron diferencias en cuanto a la estructura y composición de las comunidades bacterianas asociadas a las muestras de agua de acuerdo con su nivel de contaminación, así como, la asociación de grupos bacterianos cuya identidad ecológica está estrechamente relacionada con las condiciones decultivo de los camarones (niveles de contaminación, microbiana). En particular, se identificaron diferentes grupos bacterianos (a nivel de familia) asociados significativamente al hábitat acuático y 14 sedimentario, así como, a las muestras de agua de acuerdo con su nivel de contaminación. Estos resultados sugieren que las comunidades bacterianas podrían ser indicadoras de las condiciones de cultivo de los camarones, en este caso, asociadas a procesos posiblemente de contaminación-eutrofización derivados de los residuos urbano-agro-indusriales. Abstract There is substancial evidence that the incidence of diseases in farmed shrimp such as the acute necrosis disease of the hepatopancreas is closely related to changes in the diversity and structure of the bacterial communities that coexist in shrimp farming systems. Likewise, these bacterial communities can act as bioindicators of the health status or level of contamination (eutrophication) of the system given the environmental conditions (i.e., management) and the different biotic factors (i.e., bacterial communities) and abiotic (i.e., pH, temperature, etc.). To test this hypothesis, we characterized the bacterial communities of the water column and sediments, and the culture conditions in productive shrimp ponds in farms of three of the main producing states: Nayarit, Sinaloa and Sonora, from the sequencing of amplicons of the 16S rRNA gene and of the culture conditions in function of the eutrophication indirectly measured by the diagnostic identification of enteric bacteria; pollution levels: low, medium and high respectively. The results showed that the bacterial communities of the aquatic habitat differed between the States as well as the communities of the sediments, there being greater similarities between the bacterial communities of Nayarit and Sinaloa, also, we observed differences regarding the structure and composition of the bacterial communities associated with water samples according to their level of contamination, as well as, the association of bacterial groups whose ecological identity is closely related to the culture conditions (pollution levels, in this case).These results suggest that the bacterial communities could be indicative of the culture conditions, in this case, associated with possibly eutrophication-contamination processes derived from urban-agro-industrial waste. 15 1. Introducción 1.1 El cultivo de camarón y los microorganismos asociados a éste 1.1.1 Camarones Peneidos y la camaronicultura. Los crustáceos pertenecientes al filo de los artrópodos representan el segundo mayor subfilo de la Tierra; este incluye, a los, cangrejos, a las langostas, al krill y a los camarones. Estos últimos son uno de los grupos de animales acuáticos más ampliamente cultivados alrededor del mundo. De acuerdo con la FAO (FAO, 2017), el rango de producción mundial de camarón durante el período de 2008-2013 fue de 3400-4450 Kton, y fue Litopenaeus vannamei comúnmente conocido como “camarón blanco del Pacífico”, una de las especies más ampliamente cultivadas (>70%). El cultivo de camarón ha contribuido de manera importante al crecimiento económico de diferentes zonas litorales, particularmente de países asiáticos y americanos, por ejemplo, China, Vietnam, India, Indonesia, Tailandia, Ecuador, Perú, México y EEUU (Cornejo-Granados et al., 2017; D. Hou et al., 2018; Huang, Li, Wang, & Shao, 2014). Los camarones, pertenecen a la familia Penaeidae, del orden de los decápodos (diez patas), éstos presentan 5 fases de desarrollo durante su ciclo de vida: huevo, larva con 3 estadios: nauplio, protozoea y mysis, post-larva, juvenil y adulto (Zheng et al., 2016). En el mar y en las aguas continentales, la reproducción y la maduración se llevan a cabo en zonas profundas de entre 15 y 60 m generalmente. En el caso de los grupos marinos (ver Figura 1), las larvas se desarrollan en mar abierto hasta poco antes del estadio juvenil (Fast & Lester, 1992; Fenucci, 1988). Posteriormente, en el estadio post-larva-juvenil, los camarones entran a esteros, mangles y lagunas litorales al iniciar la primavera o en los primeros meses del estío, durante esta fase de desarrollo los camarones se alimentan 16 activamente, lo que favorece su maduración y crecimiento (alrededor de 2 cm por mes), y pueden alcanzar una talla de hasta 15-20cm de largo (Fast & Lester, 1992; Fenucci, 1988). Llegar a la etapa juvenil es crucial, ya que durante los estadios de protozoea a post-larva, los camarones carecen de células especializadas del sistema inmune para contender ante una infección severa (Rowley & Powell, 2014; Thompson, Iida, & Swings, 2004). Figura 1. Ciclo de vida de camarones Peneidos (tomado de López-Martínez, Vazquez, Valdivia, Romero, & Chávez, 2010) Una vez dentro de esteros, mangles y lagunas, los camarones juveniles habitan en el fondo blando de estos sitios, los cuales están constituidos por distintas proporciones de arena, limo, arcilla y detritus (materia orgánica). Los fondos blandos fungen como sitio de alimentación y refugio, ya que les permite enterrarse fácilmente para escapar de sus depredadores. La conducta de enterrarse parece estar regulada por distintos factores ambientales como la luz, la temperatura, la concentración de oxígeno, entre otros. Este último factor es de gran importancia en cultivos de camarón ya que concentraciones de oxígeno menores a 2 ppm, provocan cambios en los hábitos y conductas de enterramiento, lo que incrementa la tasa de mortalidad por depredación (Fast & Lester, 1992; Fenucci, 1988) 17 Por otro lado, cada etapa de desarrollo del camarón tiene características morfológicas determinadas y diferentes requerimientos nutricionales. En los estadios larvales; nauplio, zoea, misis y en las primeras etapas de post-larva, presentan hábitos planctónicos, alimentándose de fito-zooplancton de los alrededores mediante filtración. En etapas juveniles y adultas su alimentación es omnívora (hábitos bentónicos), es decir que además del fitoplancton y zooplancton, se pueden alimentar de restos vegetales, algas, pequeños peces y crustáceos, restos de animales, carroña, excrementos de peces, detritus, etcétera (Fast & Lester, 1992; Fenucci, 1988). Los camarones de los géneros Artemesia, Fenneropenaeus, Marsupenaeus, Litopenaeus, Farfantepenaeus y Penaeus pertenecientes a la familia Penaeidae, se cultivan ampliamente a nivel mundial; de éstos existen 60 especies, de las cuales, más de 50 se han utilizado para propósitos de cultivo en diferentes zonas litorales, principalmente en países de Asia y América Latina (Arredondo-Figueroa, 2002). En México, existen al menos 8 especies con características adecuadas para su cultivo, 4 de ellas pertenecientes al género Farfantepenaeus, y 4 de Litopeneaus, (Arredondo-Figueroa, 2002). Las especies que destacan para su manejo en sistemas de cultivo son: el camarón blanco: Litopenaeus vannamei (>70% a nivel mundial), el camarón azul: Litopenaeus stylirostri, los camarones cafés: Farfantepenaeus californiensis y Farfantepenaeus aztecus y el camarón rosado Farfantepenaeus duorarum (Arredondo-Figueroa, 2002). La captura de camarones Peneidos en México comenzó en la década de los treinta cuando se detectaron importantes poblaciones en aguas protegidas del Pacífico mexicano, esta actividad extractiva predominó a lo largo de las décadas de los 30 y los 50. Sin embargo, se considera que la camaronicultura en México inicia desde la época prehispánica, cuando los indígenas de Sinaloa y Nayarit hacían “encierros” para impedir que las crías de camarón (juveniles) salieran de las lagunas costeras de estas regiones, “capturándolas” hasta que alcanzaran la fase adulta. Esta práctica continuaría hasta la década de los 70 18 (además de la capturaen mar abierto), aunque la camaronicultura propiamente dicha; en granjas de camarón, inició en la década de los 90, a partir de la cual, la industria camaronera mexicana se consolida de manera oficial debido al cambio en la legislación de la política macroeconómica de México (Bortolini-Rosales J. L., 2004; González de la Rocha, 1999; Páez-Osuna, 2001). En la actualidad, un gran porcentaje de las granjas camaroneras se localizan en las costas de Sinaloa, Nayarit, Sonora, Tamaulipas y Baja California, cuyas entidades en conjunto, concentran el 92.9% de la producción nacional (CONAPESCA, 2016; González de la Rocha, 1999; Páez-Osuna, 2001; SAGARPA-SIAP, 2016). En dichas entidades, las granjas camaroneras practican diferentes sistemas de cultivo, estos se clasifican de acuerdo con el manejo e intensidad tecnológica en cuatro tipos principales (ver Tabla 1): extensivo, semi- intensivo, intensivo e hiperintensivo, cuya diferencia radica en la densidad de organismos, la modalidad y porcentaje de recambio de agua, el tipo alimentación, tamaño del área productiva y los rendimientos acuícolas obtenidos (Arredondo-Figueroa, 2002). Tabla 1. Sistemas e índices de los diferentes niveles tecnológicos utilizados en México para el cultivo de camarón (tomado y modificado de Arredondo-Figueroa, 2002). Indicador Extensivo Semi-intensivo ddddssssSSemi-intensivo Intensivo Hiperintensivo Densidad org./ha 1,000-2,000 20,000-50,000 50,000-250,000 2,000,000-6,000,00 Modalidad de recambio Marea + Bombeo Marea + Bombeo Marea + Bombeo + Aireación Bombeo + Aireación % de recambio al día 0.1-5 5-10 50 300 Alimento Fertilización natural (ocasionalmente balanceado) Fertilización (integrando alimento fresco o artificial) *Balanceado *Balanceado Área productiva (ha) 1.5 a 300 5 a 100 0.3 a 5 0.1 a0.3 Producción kg/ha/año 80-400 400-5,000 5,000-10,000 10,000-30,000 56,000-112,000 *Alimento balanceado: es un alimento cuya composición es conocida y se fabrica teniendo en cuenta criterios de equilibrio, en términos de los ingredientes nutricionales necesarios para cada especie animal y su correspondiente raza, edad, peso, estado fisiológico, etc. Así mismo, desde un punto de vista técnico, un alimento balanceado es aquella mezcla de ingredientes cuya composición nutricional permite aportar la cantidad de nutrientes biodisponibles necesarios para cubrir los requerimientos metabólicos de un animal, en función de los factores antes mencionados, especie animal, edad, peso, etc. 19 El desarrollo de sistemas de cultivo de alta densidad, sistemas de recirculación y otras implementaciones tecnológicas han permitido que las industrias camaroneras experimenten un acelerado crecimiento (Arredondo-Figueroa, 2002). En México, por ejemplo, durante el año 2005 se produjeron poco más de 90 mil toneladas de camarón en peso vivo y para el 2011 experimentaría un incremento en el volumen de producción del 18% (109,815 toneladas) (Soto-Rodriguez, Gomez-Gil, Lozano-Olvera, Betancourt-Lozano, & Morales-Covarrubias, 2015). Así mismo, desde el 2013 hasta el cierre del 2017, la producción de camarón en el país aumentó 65.5% (en volumen de producción). En el 2016, por ejemplo, la camaronicultura aportó 127,814 toneladas de producto, con un valor de 10,768 millones de pesos (CONAPESCA, 2016; SAGARPA-SIAP, 2016; Soto-Rodriguez et al., 2015). Sin embargo, el rápido crecimiento de la industria camaronera se asocia a un incremento en el número de epizootias (epidemias) ocurridas, con pérdidas significativas en la producción de camarón. A nivel mundial las mayores pérdidas por enfermedades infecciosas están asociadas a virus y bacterias (Soto-Rodriguez et al., 2015). Dentro de la camaronicultura mexicana, los principales patógenos que han generado mayores pérdidas son: • El síndrome de la mancha blanca o White Spot Syndrome Virus (WSSV). Este virus se detectó en América durante 1999 y ha impactado en algunas zonas de esta región con pérdidas de hasta el 100% de la producción. Es considerado el patógeno número uno del camarón debido a la severidad de la infección, la cual provoca mortalidades masivas dentro de 7-10 días después de infectar el cultivo. Dicho virus se favorece cuando hay cambios ambientales repentinos. Este patógeno ha tenido presencia en la industria mexicana, desde el año 2000, provocando mortalidades masivas (superiores al 60%) en los años 2005 y 2010 (Cuahtémoc, 2015; Martínez-Córdova, Porchas, & Cortés-Jacinto, 2009; Sánchez-Martínez, Aguirre-Guzmán, & Mejía-Ruíz, 2007). 20 • El síndrome del virus de Taura (TSV), detectado por primera vez en 1992 en granjas ubicadas cerca del Río Taura en el Golfo de Guayaquil, Ecuador. Este virus puede generar mortalidades masivas del 70-90% en la fase aguda de la infección. En México, ocasionó diversas epizootias entre los años 1995-1997, con persistencia en los ciclos productivos 2004-2005 y 2006-2007 (Cuahtémoc, 2015; Martínez- Córdova et al., 2009; Pinheiro et al., 2007) • El virus de la infección hematopoyética necrotizante (IHHNV), detectado en 1990 en la camaronicultura mexicana en la especie de camarón L. stylirostris, fue causante de mortalidades masivas en los ciclos productivos de 1991-1994 y de 1998-1999, propiciando que los acuicultores mexicanos cambiaran a L. vannamei como especie de cultivo predominante debido a la resistencia a este virus (Martínez-Córdova et al., 2009). Sin embargo, dicho virus también se detectó en distintos ciclos productivos de L. vannamei desde el año 2000, incrementando su presencia en los cultivos a partir del año 2004 a la fecha (Cuahtémoc, 2015; Martínez-Córdova et al., 2009). • El virus de la cabeza amarilla (YHV), principalmente asociado a la camaronicultura asiática y de reciente aparición en América (Martínez-Córdova et al., 2009). • Bacterias pertenecientes la familia Holosporaceae, las cuales, se han asociado a un tipo de hepatopancreatitis necrotizante (NHP) del camarón, (Martínez-Córdova et al., 2009; Vincent & Lotz, 2007), esto a partir de una relación simbiótica que mantiene con paramecios y amibas de vida libre que a su vez son parásitos epicomensales de camarones, estos últimos, encontrados principalmente sobre cutículas, branquias y apéndices de camarones (Vincent & Lotz, 2007). Algunos de los miembros de la familia Holosporaceae, pueden causar mortalidades masivas de hasta 95% una vez que infectaron el cultivo. Dichos organismos han causado pérdidas en la camaronicultura mexicana desde el año 2002 a la fecha (Cuahtémoc, 2015; Martínez-Córdova et al., 2009; Vincent & Lotz, 2007). • Bacterias del género Vibrio. Miembros de este género (particularmente V. parahaemolyticus), están asociados a la enfermedad del camarón conocida como 21 necrosis aguda del hepatopáncreas (otro tipo de enfermedad del hepatopáncreas), generando en años recientes; 2009-2013-actual, pérdidas significativas en diferentes regiones del mundo (Martínez-Córdova et al., 2009), por lo que su identificación ha cobrado gran relevancia. 1.1.2 Vibrio y la acuacultura La familia Vibrionaceae pertenece al filo Proteobacteria, la cual, está compuesta por bacterias Gram-negativas, halófilas, mesófilas, quimioorganótrofas y bioluminiscentes, generalmente asociados a algunos eucariontes. Algunas de las especies aisladas, provienen de ambientes acuáticos marinos como estuarios, lagunas costeras, mangles y mar abierto (Ceccarelli et al., 2013). Se reconocen siete géneros para esta familia: Aliivibrio, Echinimonas, Enterovibrio, Grimontia, Photobacterium, Salinivibrio y Vibrio, con 142 especies descritas (Sawabe et al., 2013). La mayor parte de los miembros de la familia Vibronaceae contienen un genoma con dos cromosomas circulares y cantidades variables de plásmidos (Ceccarelli, Colwell, & Zehr, 2014; Dryselius, Kurokawa, & Iida, 2007; Lukjancenko,Ussery, Colwell, & Klotz, 2014). Los miembros de distintas especies del género Vibrio (p. ej., V. cholera) contienen elementos genéticos que sirven para la adquisición, acumulación y expresión de nuevos genes, llamados integrones o superintegrones. Estos elementos genéticos aceleran los procesos de recombinación y transferencia horizontal de genes, dándoles a los organismos la capacidad, por ejemplo, de adquirir genes de enterotoxinas como la toxina colérica (CT), la hemolisina termoestable directa (TDH) o la hemolisina termoestable relacionada (TRH), generando un mayor dinamismo ecológico y evolutivo. Estos elementos genéticos explica en parte, porqué este grupo bacteriano es tan exitoso, dado que son muy abundantes y diversos sobre todo en el mar, especializándose en diferentes nichos y adaptándose a nuevos hospederos ya sea como simbiontes o parásitos (Boucher et al., 2011; Sánchez- Martínez et al., 2007). 22 En la acuacultura, diversas especies y cepas de Vibrio sp., son patógenas o patógenas oportunistas, por ejemplo, V. anguillarum y V. salmonicida son patógenas de peces, V. harveyi es una de las principales bacterias patógenas de camarones como L. vannamei y Penaeus monodon. Su patogenia, esta favorecida por su capacidad para adherirse al exoesqueleto de quitina de los crustáceos o a las escamas de los peces. Esta capacidad de adherencia, incrementa también, la probabilidad de introducir y recibir DNA exógeno como el que codifica para ciertas toxinas, al ampliar la distribución de Vibrio sp. en el sistema (Thompson et al., 2004). A las enfermedades infecciosas causadas por bacterias asociadas al género Vibrio, se les conoce comúnmente como Vibriosis; éstas afectan principalmente a post-larvas (Cuéllar- Anjel, 2013), pudiendo provocar mortalidades masivas de camarón de hasta el 100%. La Vibriosis que afecta mayormente a la camaronicultura es la Enfermedad de la necrosis aguda del hepatopáncreas (AHPND), la cual, ha generado pérdidas significativas en la acuacultura de camarón a nivel mundial. El síndrome AHPND ha generado pérdidas económicas significativas entre los países asiáticos productores de camarón como China (2009), Vietnam (2010), Malasia (2011), Tailandia (2012); así como en países de América Latina (Cuéllar-Anjel, 2013; De Schryver & Vadstein, 2014). En México, existen reportes de su presencia desde el 2003 (Cuahtémoc, 2015). En el ciclo productivo del 2013, por ejemplo, el síndrome AHPND causo mortalidades masivas de camarón en los primeros días de cultivo. Las primeras granjas en sufrir afectaciones fueron las del Estado de Nayarit (marzo, 2013), las cuales, reportaron mortalidades atípicas en los primeros 30 días una vez iniciados los cultivos. Poco tiempo después (en abril de ese mismo año), los reportes se habían extendido a Sinaloa y Sonora, afectando la producción regional con una caída en el 70% de la producción, lo que generó una pérdida económica estimada en 3 mil millones de pesos para la industria (Cuahtémoc, 2015; Soto-Rodriguez et al., 2015). El agente causal de dicha epizootia fue aparentemente 23 una cepa patógena oportunista de Vibrio parahaemolyticus (Cuéllar-Anjel, 2013; Xiao et al., 2017). Cabe señalar, que algunas cepas de V. parahaemolyticus son también patógenas de humanos. Algunas investigaciones sugieren que los genes de las enterotoxinas causantes de esta patogénesis fueron adquiridos por transferencia horizontal (Thompson et al., 2004). La secuenciación del genoma de dichos organismos también reveló que poseen dos conjuntos de genes asociados al sistema de secreción tipo III (TTSSIII). El TTSSIII es uno de los principales sistemas de secreción de proteínas bacterianas típicamente asociados a la patogénesis de bacterias como Salmonella, Shigella y Yersinia. Sin embargo, este sistema no se encuentra en el genoma de V. cholera, por lo que se piensa, que V. parahaemolyticus los adquirió vía transferencia horizontal a partir de alguna especie de Salmonella, Shigella o de Yersinia (Thompson et al., 2004). Vibrio parahaemolyticus es una bacteria que habita de manera natural en distintos ambientes acuáticos marinos entre ellos los sistemas de cultivo de camarón. También, se puede encontrar en la hemolinfa o adherida al cuerpo de camarones y a otros organismos acuáticos o adheridas a detritos de origen orgánico que se denomina nieve marina y están constituidas por elementos como escamas de peces o mudas de crustáceos (Duchaud et al., 2003; Xiao et al., 2017). Los camarones adquieren, las cepas patógenas de V. parahaemolyticus por vía oral mediante la ingesta de los detritos que se encuentran en la columna de agua y en el fondo del estanque; V. parahaemolyticus coloniza el tracto digestivo donde secreta toxinas PirA-B, homólogas a las toxinas Pir de Photorhabdus. Este último, es un género de bacterias Gram-negativas, baciliares, bioluminiscentes y patógenas de diversos insectos, utilizadas como biopesticida en la agricultura orgánica y convencional ya que mantiene una interacción simbiótica con nemátodos entomopatógenos (p. ej., Heterorhabditidae) (Kondo, Van, Dang, & Hirono, 2015; Liu et al., 2015). Las toxinas PirA y PirB, actúan como proteínas binarias, su toxicidad da lugar a una hinchazón severa y lisis de las membranas de las células epiteliales del intestino 24 medio en insectos. Las toxinas implicadas en la vibriosis-AHPND de V. parahaemolyticus posiblemente se adquirieron mediante transferencia horizontal, provenientes de aquellas que posee Photorhabdus (Liu et al., 2015). Así mismo, investigaciones recientes han demostrado que existen al menos dos especies de Vibrio (V. owensii y V. harveyi) que contienen en plásmidos los genes homólogos de las toxinas Pir producidas por V. parahaemolyticus, aumentando con ello el riesgo potencial de una Vibriosis de mayor severidad (Kondo et al., 2015; Liu et al., 2015). 1.1.3 Principales causas de las epizootias En términos generales, las principales causas para la aparición de epizootias ya sea Vibriosis u otro tipo, están relacionadas con las malas prácticas de manejo, por ejemplo, la mala selección de los sitios para el establecimiento de las granjas, principalmente relacionado con el desconocimiento de la capacidad de carga de los cuerpos de agua para la toma y descarga de la misma. Muchas de las granjas utilizan el mismo cuerpo de agua para ambos propósitos, sin embargo, esta práctica favorece la recirculación de desechos y componentes con alto potencial patogénico, contribuye al impacto negativo en cuerpos de agua y playas adyacentes, y a la contaminación de fuentes de agua para consumo humano (Martínez-Córdova et al., 2009). La sobre alimentación, sobre fertilización, uso de alimentos inadecuados (con mayor cantidad de proteína de la necesaria o con baja digestibilidad) y la subutilización del alimento natural (fitoplancton y zooplancton), favorecen la eutrofización (sobre- enriquecimiento de ecosistemas acuáticos con nutrientes) de los sistemas productivos, así como, de los cuerpos de agua receptores. La eutrofización generalmente causa serios desequilibrios, por ejemplo, puede favorecer la proliferación (florecimientos o blooms) de fitoplancton, el cual en algunos casos, puede estar dominado por especies productoras de biotoxinas (Martínez-Córdova et al., 2009; Van Egmond, Apeldoorn, & Del, 2005). También, la eutrofización puede generar muerte por enterramiento de comunidades bentónicas y favorecer la proliferación y establecimiento de comunidades de organismos 25 patógenos y patógenos oportunistas (generalmente bacterias) (Martínez-Córdova et al., 2009). La magnitud del problema está relacionada con la intensificación del sistema de cultivo, la cantidad de alimento artificial, tipo de alimento empleado y las prácticas de manejo implementadas (Crab, Avnimelech, Defoirdt,Bossier, & Verstraete, 2007; L. Deutsch et al., 2007; Tacon & Forster, 2003). El manejo de la cantidad de alimento, por ejemplo, se lleva a cabo mediante la evaluación del factor de conversión alimenticia (FCA). Existen datos respecto al factor de conversión alimenticia para el caso del cultivo intensivo de P. monodon, en los cuales, se reportan valores del FCA cercanos a uno, cuando el manejo es muy eficiente y por cada tonelada de camarón producida se vierten al ambiente 500 Kg de materia orgánica, 26 Kg de nitrógeno y 13 Kg de fósforo. En contraste, si el manejo es poco eficiente el valor del FCA es de alrededor de 2.5, con una producción de materia orgánica de 1625 Kg, 117 Kg de nitrógeno y 38 Kg de fósforo por cada tonelada de camarón cosechado. Esto significa que factores de conversión alimenticia superiores a 2 representan un impacto significativo (negativo) al ambiente (Martínez-Córdova et al., 2009). En México, por ejemplo, bajo este escenario se estarían descargando al ambiente 130 mil toneladas de materia orgánica, 9360 toneladas de nitrógeno y 3040 toneladas de fósforo por cada ciclo de cultivo (Martínez-Córdova et al., 2009) (ver Tabla 2). Tabla 2. Cantidad de materia orgánica, nitrógeno y fósforo de descarga a través de los efluentes de granjas camaroneras por cada tonelada de camarón producida en relación al factor de conversión alimenticia (tomado y modificado de Martínez-Córdova et al., 2009) FCA Materia orgánica (kg) Nitrógeno (kg) Fósforo (kg) 1.0 500 26 13 1.5 875 56 21 2.0 1250 87 28 2.5 1625 117 38 Otros de los factores que favorecen la emergencia de epidemias se relacionan con altas tasas de recambio de agua, la falta de tratamiento de los estanques entre ciclos de cultivo, 26 la introducción y cultivo de especies exóticas y las prácticas inadecuadas de sanidad, por ejemplo, el uso inapropiado de antibióticos para el control de enfermedades, ya que en muchas de las granjas de cultivo, los utilizan de manera rutinaria, es decir, sin que haya brotes infecciosos aparentes (Zhou, Li, Jun, & Bo, 2009). Esto ha contribuido al deterioro de la calidad del agua y favorecido la resistencia en bacterias patógenas y patógenas oportunistas, provocando daño y desequilibrio (disbiosis) en la microbiota de los sistemas productivos y naturales (Zhang et al., 2014; Zhou et al., 2009). Además, los residuos de antibióticos acumulados en los animales de cultivo pueden ser perjudiciales para la salud humana, al desequilibrar la propia homeostasis de la microbiota de las personas que consumen dichos productos (Zhang et al., 2014; Zhou et al., 2009). Por estas y otras razones, una de las principales críticas de la que es objeto la industria camaronera, es el de ser una actividad poco sustentable (desde que se masificó la producción). Algunos ejemplos de los impactos asociados a dicha actividad son: • La destrucción de bosques de manglar y marismas; ecosistemas de enorme importancia que constituyen la fuente principal de materia orgánica de la zona costera y áreas de crianza de múltiples organismos de importancia ecológica y económica (Martínez-Córdova et al., 2009). • Modificación del paisaje y/o hábitat de organismos acuáticos y terrestres y modificación del patrón hidrológico (Martínez-Córdova et al., 2009). Afortunadamente, en los últimos años se han desarrollado diferentes estrategias encaminadas hacia una camaronicultura sustentable en términos del manejo adecuado de las granjas como: • Selección de los sitios en que serán ubicadas las granjas, para ello se toma en cuenta el tipo de terreno, tipo de suelo, cubierta vegetal, entre otros factores edáficos (Martínez-Córdova et al., 2009). • Evaluación precisa de la capacidad de carga de los cuerpos de agua (estanques de cultivo), así como, la toma y descarga de la misma (Martínez-Córdova et al., 2009). 27 • Tratamiento sanitario de los estanques entre ciclos de cultivo, por ejemplo, la remoción de la materia orgánica y sedimentos en exceso (Summerfelt & Penne, 2007). • Implementación de prácticas de bioseguridad, las cuales, pueden ayudar a reducir los brotes de enfermedades y los costos de operación, por ejemplo, mediante el uso de probióticos y bioindicadores (Zhang et al., 2014). • Cultivo de especies nativas sobre especies exóticas y de origen desconocido (Chopin et al., 2001). • Sistemas de cultivo integrados (FAO, 2004) • Prácticas de manejo orientadas a la acuicultura ecológica, en términos de: fertilización orgánica, alimentación natural, control biológico, policultivos o co- cultivos, etc. (FAO, 2004; Martínez-Córdova et al., 2009). 1.1.4 Un ejemplo: Sistemas de co-cultivo con microorganismos Bio-floc Una de las prácticas de acuicultura ecológica que se han desarrollado con gran éxito, es la técnica de bio-floc o flóculos bacterianos, los cuales son sistemas de co-cultivo de bacterias heterótrofas (generalmente), protozoos y microalgas (protistas) que proliferan de manera regulada en los estanques de cultivo. El sistema se desarrolló bajo el mismo principio empleado en las plantas de tratamiento de aguas residuales, el cual, está basado en la relación oxido-reducción del ciclo del nitrógeno (en el caso del cultivo de camarón). Dicho sistema de co-cultivo requiere una adecuada relación carbono-nitrógeno, para ello, los acuicultores suelen agregar diferentes fuentes de carbono como melaza o harina de yuca, mientras que la fuente de nitrógeno es proporcionado por las excretas de los animales de cultivo, también, requiere de poco o nulo recambio de agua y oxigenación continua (De Scchryver, Crab, Defoirdt, Boon, & Verstraete, 2008). Por otro lado, distintas investigaciones han demostrado que es posible la maternización y pre-cría de camarones peneidos a muy altas densidades (hasta 6000 indv/m2) utilizando flóculos bacterianos como fuente principal de alimentación, debido a la alta producción de 28 biomasa microbiana. Esto favorece el ahorro en alimentación artificial, además de mejorar sustancialmente la calidad del agua de cultivo, así como la de descarga (Ballester, Wasielesky, Cavalli, & Abreu, 2007; De Scchryver et al., 2008; Fernamdes Da Silva et al., 2008). En este sentido, el estudio de la microbiota asociada al camarón de cultivo, es de gran interés para la acuicultura, ya que en dicha microbiota existen diversas especies benéficas, las cuales, de manera natural contribuyen a mantener la estabilidad del ecosistema productivo (eubiosis), por ejemplo, al prevenir la colonización y establecimiento de otras especies patógenas o patógenas oportunistas, mediante procesos de autorregulación ecológica (Huang et al., 2014; Zhu et al., 2016). Actualmente, distintos microorganismos ya son implementados para promover el crecimiento, la digestión y absorción de nutrientes, favorecer la respuesta inmune, mejorar la calidad del agua y sedimentos en los sistemas de cultivo acuícolas, entre ellos los de camarón (Huang et al., 2014; Zhu et al., 2016). 1.1.5 El rol de los microorganismos en la acuacultura En los ecosistemas acuáticos, las comunidades de microorganismos están compuestas por: virus, bacterias, hongos, protistas (microalgas y protozoarios), metazoarios (rotíferos y nemátodos), estados larvales de: nidarios, poríferos, equinodermos, moluscos, peces y crustáceos, también existen formas adultas de pequeños crustáceos, por ejemplo, copépodos y cladóceros, entre otros (Moriarty, 1997). Las redes tróficas formadas por dichos microorganismos son clave para los ecosistemas acuáticos naturales y no naturales (p. ej., los sistemas de cultivo), particularmente en la producción primaria, el ciclaje de nutrientes, la nutrición de macroorganismos, la regulación de la calidad del agua y el control-regulación de enfermedades (Moriarty, 1997; Zhou et al., 2009). Las comunidades bacterianas de cianobacteriasjunto a las microalgas en los sistemas acuáticos son las principales fotosintetizadoras, absorben CO2 y liberan oxígeno al medio 29 (Zhou et al., 2009). La respiración y fermentación las llevan a cabo predominantemente bacterias, además de hongos, esta actividad metabólica incide en la regulación de factores abióticos, como el nivel de pH y la concentración de amonio (Moriarty, 1997). Las bacterias heterótrofas por su parte descomponen la materia orgánica (detritus) a formas más “simples”, favoreciendo el ciclado de carbono, nitrógeno, fosforo y otros elementos, contribuyendo así, a la producción primaria (Moriarty, 1997). Además, todas estas comunidades microbianas fungen como alimento para los diversos organismos que componen el zooplancton, los cuales, a su vez, serán alimento en otro nodo y/o nivel trófico (Moriarty, 1997). En los sistemas de cultivo acuáticos, la salud de los animales está favorecida por la presencia de especies microbianas benéficas, tanto a nivel intestinal como en el ambiente acuático de cultivo (eubiosis), ya que ambos ambientes están interrelacionados estrechamente (Zhou et al., 2009). Por otro lado, existe una gran diferencia entre un ecosistema acuático natural y uno artificial (hecho por el humano); los ecosistemas artificiales tienen una capacidad limitada para autorregularse (Zhou et al., 2009) y requieren de la tecnificación para ello, además es necesario introducir en ciertas etapas del cultivo, microorganismos benéficos (MBs), generalmente bacterias que actúan como probióticos para mejorar la calidad del agua, favorecer el equilibrio ecológico y reducir la probabilidad de brotes infecciosos debido a que estos forman poblaciones específicas que impiden el establecimiento, crecimiento y dominancia de microorganismos patógenos o patógenos oportunistas mediante procesos de autorregulación (p. ej., antagonismo y/o exclusión competitiva), generando un balance ecológico, y un estado de salud y crecimiento favorables (Huang et al., 2014; Zhou et al., 2009; Zhu et al., 2016). 1.1.6 Principales funciones de las bacterias benéficas En las granjas camaroneras existe una gran densidad de individuos que generan una sobre producción de diversos desechos metabólicos en el sistema de cultivo, por ejemplo, el amonio (NH4+) que en altas concentraciones resulta tóxico, además, promueve la 30 proliferación de organismos potencialmente patógenos (p. ej., Vibrio sp.) (Zhou et al., 2009). El amonio junto a otros desechos como materia orgánica en exceso favorecen una mayor actividad metabólica, lo cual provoca una disminución en el oxígeno disuelto que genera una condición de estrés permanente para los animales y el sistema en general (Zhou et al., 2009). Esto puede ser regulado mediante la aplicación como ya se mencionó, de microorganismos benéficos (MBs) como Bacillus, Bifidobacterium, Lactobacillus, entre otros. La aplicación de probióticos se puede hacer de tres maneras: en cepas sencillas, cepas múltiples y cepas compuestas con otras substancias u organismos, por ejemplo, Daphnia sp. (“pulgas” de agua) (Birtel & Matthews, 2016; Zhou et al., 2009). Estos deben cumplir al menos con dos aspectos funcionales básicos en el sistema: uno es regular la disbiosis para mantener la eubiosis (Iebba et al., 2016), y el otro es, la descomposición de la materia orgánica: heces, desechos y remanentes de comida, lo cual ayuda a mantener la dinámica ecológica entre los organismos que componen el ecosistema y el equilibrio microbiano en el agua y sedimentos, favoreciendo un mejor ambiente para los animales de cultivo (Zhou et al., 2009). Algunas funciones particulares de las bacterias benéficas en la microecología de los sistemas naturales y productivos son: 1) La producción de ácidos orgánicos a través de su metabolismo, por ejemplo, ácido láctico, ácido acético y ácido propiónico. Estos ácidos orgánicos contribuyen a regular el pH a nivel intestinal y en el ambiente de cultivo, lo que permite el establecimiento y dominancia de bacterias benéficas sobre otras potencialmente patógenas o patógenas oportunistas (Zhou et al., 2009). 2) El balance en el microecosistema intestinal y el ambiente acuático de los alrededores (eubiosis), ayuda a establecer la dominancia de especies microbianas benéficas sobre especies patógenas o patógenas oportunistas. En condiciones normales los grupos bacterianos más abundantes en el intestino de la mayoría de 31 los animales acuáticos de cultivo son; Bacillus, Bifidobacterium y Lactobacillus, y hongos como los Saccharomycetes (Zhou et al., 2009). 3) La disminución de NH3 (amoniaco) y de iones NH4+ (amonio) en los intestinos de los animales (Zhou et al., 2009). 4) La degradación de la materia orgánica a través de amilasas, lipasas y proteinasas (Zhou et al., 2009). 5) El incremento en la actividad de las enzimas digestivas de los animales de cultivo (Zhou et al., 2009). Bo y colaboradores, mostraron que la ingestión de 200-300 mg de Bacillus licheniformis por kilogramo de dieta basal (alimento balanceado), incrementaron la tasa de la actividad metabólica y favorecieron el crecimiento en peces y otros animales acuáticos de cultivo (Bo, Wen-bin, & Tian, 2005). 6) La producción de vitaminas tipo B y ciertas substancias antibióticas que ayudan a mantener el equilibrio poblacional (Zhou et al., 2009). 7) La modulación no específica del sistema inmune del camarón en etapas tempranas de crecimiento, fortaleciéndolo a nivel de anticuerpos y en la actividad macrófaga (Zhou et al., 2009). 8) El mejoramiento de la calidad del agua del cultivo favoreciendo la resistencia a enfermedades. La aplicación de bacterias fotosintéticas (BFs; principalmente cianobacterias) incrementa el contenido de oxígeno disuelto, nitrato y fósforo biológicamente disponible, también pueden reducir el contenido de: amonio (NH4), amoníaco (NH3) y nitrito (NO2), estimulan el crecimiento del fitoplancton, incrementando la producción primaria; así mismo, el carbono es “recuperado” mediante su transformación en compuestos orgánicos intracelulares que posteriormente entraran en la red trófica (Zhou et al., 2009). Algunos ejemplos de grupos microbianos y sus funciones en el agua y sedimentos: 1) Las bacterias fotosintéticas, por ejemplo, las púrpuras no-sulfurosas (Rhodomicrobium y Rhodospirillum), utilizan luz solar como fuente de energía para separar hidrógeno a partir de hidrocarburos y sulfuro de hidrógeno, esto 32 promueve el aumento en el oxígeno disuelto, la remoción de iones de nitrógeno y metabolitos secundarios. Mantienen el agua clara favoreciendo la fotosíntesis, a partir de la cual, el CO2 atmosférico se integra en azúcares, aminoácidos, vitaminas y otros compuestos posteriormente biodisponibles. Por su parte, las cianobacterias (p. ej., Chroococcales, Nostocales y Oscillatoriales) son capaces de fijar nitrógeno atmosférico (N2) y convertirlo en amonio (NH4), el cual puede ser asimilado y utilizado posteriormente para formar aminoácidos, proteínas y otros compuestos nitrogenados, contribuyendo esencialmente a la circulación de nutrientes (producción primaria y redes tróficas) así como al balance entre la relación fósforo- nitrógeno en los sistemas acuáticos (Zhou et al., 2009). 2) Azotobacter. Es un género bacteriano con la capacidad de metabolizar nitrógeno. Utilizan fuentes de energía como la sacarina para fijar nitrógeno, parte del cual, es aprovechado por el fitoplancton, y el resto es utilizado por las mismas bacterias para formar estructuras como los heterocistos para la fijación de nitrógeno (Zhou et al., 2009). 3) Bacillus gemma, Bacillus toyoi y Bacillus subtilis, son microorganismos que reducen el NH3 (amoníaco) y el NO2 (nitrito) en criaderos de organismos acuáticos. Otros dos aspectos funcionales de dichas bacterias son: la dominanciasobre especies patógenas a nivel intestinal y en la superficie del cuerpo de camarones y la producción de proteinasas, lipasas y amilasas (Zhou et al., 2009). 4) Nitrobacter. Es un género de bacterias heterotróficas principalmente aeróbicas, las cuales, pueden dividirse a su vez en dos subgrupos: bacterias del nitrito y bacterias del nitrato. Las primeras pueden oxidar el NH3 a NO2, el cual es oxidado a su vez a NO3 (nitrato), reduciendo la toxicidad del nitrito y el nitrógeno amoniacal en el agua y sedimentos (Zhou et al., 2009). 33 5) Bdellovibrio. Son un grupo de bacterias parasíticas que atacan a otras bacterias de manera similar a los bacteriófagos. Principalmente actúan sobre especies de Vibrio y Aeromonas. Se han identificado algunas especies como: B. bacteriovorus, B. stolpii y B. starri, las cuales, pueden prevenir o reducir enfermedades en camarones peneidos, al limitar su propagación y fortalecerlo a nivel de sistema inmune (Zhou et al., 2009). 6) Bifidobacterium. Este grupo de bacterias se han utilizado exitosamente en crías de camarón, favorecen el sistema inmune de post-larvas y otros estadios del desarrollo. Promueven la metamorfosis e incrementan la tasa de supervivencia de nauplios en un 55-60% (Zhou et al., 2009). 7) Actinobacteria. Son un grupo diverso de bacterias Gram-positivas, filamentosas o en forma de bacilos ramificados, el género más común de este grupo es Nocardia. Estas bacterias pueden aumentar de número al utilizar como sustrato el nitrógeno fijado por otros grupos bacterianos. Tienen una gran capacidad para degradar materia orgánica y resistir altas temperaturas (55-65°C). Fortalecen el sistema inmune de los animales acuáticos de cultivo dándoles resistencia a diversas enfermedades (Zhou et al., 2009). 8) Lactobacillus. Uno de los organismos más empleados de este grupo es Lactobacillus acidophilus. Son capaces de metabolizar lignina y celulosa, además de fermentar (metabolizar) materia orgánica difícil de degradar, facilitando con ello la biodisponibilidad de nutrientes. Se han utilizado como probióticos para el cultivo de camarón tigre, Penaeus monodon (Zhou et al., 2009). 9) Vibrio. Este grupo de organismos tienen un rol importante en el ciclaje de nutrientes en ambientes acuáticos. Son los principales degradadores de quitina (polisacárido que forma parte de la pared celular de hongos y del exoesqueleto de artrópodos), la cual es metabolizada a homopolímeros de N-Acetilglucosamina. La 34 N-acetil-β-D-glucosamina, es uno de los amino-azúcares más abundantes en los océanos. También, fungen como proveedores de ácidos grasos poliinsaturados esenciales. Algunas especies de este género son capaces de degradar hidrocarburos aromáticos policíclicos de los sedimentos marinos contaminados con estos. Por otro lado, son importantes productores de antibióticos y compuestos inhibidores del crecimiento para alfaproteobacterias y miembros del género Alteromonas(Thompson et al., 2004). 10) Hongos. Aspergillus niger y ciertas levaduras son empleadas en los sistemas de cultivo, que, junto con las bacterias, son los principales descomponedores de materia orgánica. Algunos de estos hongos son productores de ciertos antibióticos β-lactámicos como penicilinas y cefalosporinas, contribuyendo al balance poblacional (Zhou et al., 2009). Por otro lado, ciertas especies de levaduras son promotoras bioactivas de la división celular en bacterias. Pueden metabolizar rápidamente diferentes tipos de azúcares como la sacarina, lo cual, reduce el consumo de oxígeno en el sistema dado por otros procesos metabólicos. Además, las células de levaduras muertas son una gran fuente de proteínas y nutrientes como: vitamina B y diversos aminoácidos. También, se ha observado que las levaduras pueden producir altas concentraciones de proteínas resistentes al estrés por calor (heat shock proteins: HSP; por sus siglas en inglés), en intestinos de peces y otros organismos acuáticos (Zhou et al., 2009). 11) Microalgas. Las microalgas afectan directamente el crecimiento de camarones peneidos. Las diatomeas son siempre “dominantes” en pozas con un estado de salud favorables, los grupos más representativos son: Pyrrophyta y Cryptophyta (Zhou et al., 2009). Algunas diatomeas pertenecientes a estos grupos, por ejemplo, Chaetoceros, secretan substancias antimicrobianas, fungen como alimento para post-larvas de camarones y mantienen la calidad del agua en las pozas de cultivo al reducir rápidamente el nitrógeno amoniacal (Zhou et al., 2009). Se ha reportado 35 que la microalga Tetraselmis suecica es capaz de inhibir el crecimiento de bacterias patógenas como: Aeromonas hydrophila, A. salmonicida y Yersinia ruckeri tipo I, cuando estas son usadas como suplemento alimenticio. También, reducen la mortalidad debida a Serratia liquefaciens, Vibrio anguillarum y Vibrio salmonicida (Austin, Baudet, & Stobie, 1992; Zhou et al., 2009). 1.2 Métodos de estudio de la diversidad bacteriana Tradicionalmente, el estudio de la diversidad y estructura de las comunidades bacterianas se había centrado en especies obtenidas a partir de métodos dependientes de cultivo, lo cual, representa alrededor del 1-10% del total de la diversidad presente en un ambiente dado (Ravin, Mardanova, & Skryabin, 2015; Torsvik, Daae, Sandaa, & Ovreås, 1998). Sin embargo, en las últimas décadas se han desarrollado diferentes estrategias de caracterización de las comunidades bacterianas, basadas en técnicas moleculares independientes de cultivo (ver Figura 2). Una de estas técnicas, consiste en la identificación de los fosfolípidos que componen a las membranas celulares bacterianas; PLFA: phospholipid fatty acid analysis (análisis de fosfolípidos de ácidos grasos). Los fosfolípidos de las membranas son indicadores de la biomasa microbiana activa, y se ha implementado un análisis que permite determinar la diversidad y la abundancia de las comunidades microbianas en diferentes matrices ambientales, que se basa en la existencia de lípidos únicos en gremios bacterianos específicos (Bossio, Scow, Gunapala, & Graham, 1998; Widmer, Fließbach, Laczkó, Schulze-Aurich, & Zeyer, 2001; Willers, Jansen van Rensburg, & Claassens, 2015). 36 Figura 2. Métodos moleculares de caracterización independiente de cultivo (tomado y modificado de Rastogi & Sani, 2011). Otro método molecular implementado para la identificación de las comunidades bacterianas (microbiota) “no cultivables”, es la secuenciación del gen ribosomal 16S rRNA (rrs) (Birtel et al., 2015). Dicho gen tiene una longitud promedio de 1500 pares de bases (pb), y contiene 9 regiones hipervariables intercaladas entre regiones conservadas. Las regiones hipervariables (las cuales contiene secuencias únicas para cada grupo bacteriano) del gen 16S rRNA son, en la mayoría de los casos, el “blanco” para la determinación filogenética de la diversidad bacteriana (Birtel, Walser, Pichon, Bürgmann, & Matthews, 2015) (ver Figura 3). Figura 3. Gen 16S rRNA, en verde regiones conservadas y en gris regiones hipervariables 37 La caracterización de las comunidades bacterianas a través de la secuenciación del gen 16S rRNA, se ha vuelto un método estándar en ecología microbiana, y en las últimas tres décadas se ha incrementado el número de secuencias obtenidas a partir de este enfoque, las cuales, se han “depositado” y procesado en diversas bases de datos como RDP, Greengenes, SILVA, MG-RAST, etcétera (Birtel et al., 2015). Así mismo, un número creciente de métodos para el análisis de la diversidad bacteriana a partir de los datos obtenidos vía secuenciación masiva o de altos rendimientos, han facilitado el análisis de una mayor cantidad de secuencias (high-throughput DNA sequencing) (Birtel et al., 2015). El enfoque clásico de secuenciaciónen donde se elaboraban bancos o librerías de clonas (dependientes de vectores celulares) del gen 16S rRNA seguido por secuenciación tipo Sanger, se han remplazado por tecnologías de secuenciación de nueva generación; NGS: Next Generation Sequencing, las cuales, producen miles de secuencias en un tiempo relativamente corto y a un costo cada vez menor. Existen diferentes plataformas de las tecnologías NGS, por ejemplo, Illumina, Pacific Biosciences, Ion Torrent, SOLiD, entre otras, con metodologías de secuenciación distintas; secuenciación por capilaridad, pirosecuenciación, por síntesis química, por ligación, etc., con tiempos de corrida, rendimientos y tamaños de secuencias diferentes (Birtel et al., 2015). En todos los casos, el proceso de secuenciación genera un conjunto de secuencias llamadas lecturas y fragmentos de secuencias de DNA denominados amplicones. Los amplicones y/o lecturas son requeridos posteriormente, para reconstruir la secuencia original completa, del gen en estudio como el 16S rRNA (Mandal et al., 2015). En general, las tecnologías NGS se pueden utilizar bajo dos enfoques principales, los cuales son complementarios entre sí; 1) Análisis metagenómico. La metagenómica es el estudio del material genético total de una muestra ambiental, también es conocida como genómica ambiental, ecogenómica o genómica de la comunidad. Mediante este enfoque se puede 38 realizar el ensamblaje y reconstrucción de genomas (totalidad del material genético que posee un organismo o grupo de organismos), hacer anotación funcional, filogenias, predicción de secuencias que codifiquen proteínas de interés, etc. (Mandal et al., 2015). 2) Secuenciación de amplicones para determinar la diversidad taxonómica en una muestra ambiental. Este es un enfoque metagenómico sensu lato, ya que, a pesar de emplear en el análisis todo el material genético (DNA genómico de la comunidad) de un ambiente dado, la principal finalidad es caracterizar la diversidad taxonómica a partir de un gen o grupo de genes; por ejemplo, rrs (16S rRNA), nif, rpoB, gyrB, etc., es decir, la finalidad no es reconstruir todo el genoma o conjunto de ellos, sino tener una aproximación a partir de un grupo de genes o de uno solo (Mandal et al., 2015). Las secuencias obtenidas a partir de estos enfoques pueden ser procesadas mediante diferentes plataformas bioinformáticas. En el caso particular del análisis de amplicones, se realiza un filtrado por calidades y tamaños, posteriormente, se hace la detección y eliminación de secuencias quiméricas (secuencias unidas procedentes de dos organismos diferentes) y finalmente, se realiza la agrupación, asignamiento y clasificación taxonómica de OTUs (ver Tabla 3) (Mandal et al., 2015). Tabla 3. Algunas herramientas bioinformáticas para el estudio en ecología microbiana Herramientas bioinformáticas para el análisis de secuencias del gen 16s rRNA MLST http://www.mlst.net MOTHUR http://www.mothur.org EstimateS http://www.viceroy.eeb.uconn.edu/EstimateS/ QIIME http://www.qiime.org PHACCS http://www.phaccs.sourceforge.net UPARSE http://www.drive5.com/uparse/ http://www.mlst.net/ http://www.mothur.org/ http://www.viceroy.eeb.uconn.edu/EstimateS/ http://www.qiime.org/ http://www.phaccs.sourceforge.net/ http://www.drive5.com/uparse/ 39 Con los datos obtenidos a partir de estos dos enfoques, se pueden hacer diferentes análisis e inferencias ecológicas, por ejemplo: • Determinación de la diversidad, estructura (α, β, γ) y función ecológica de las comunidades • Exploración, caracterización y descripción de datos, por ejemplo, análisis de escalamiento u ordenamiento multidimensional (ej., NMDS por sus siglas en ingles); análisis de similitud (ej., ANOSIM); análisis de componentes principales (ej., PCoApor sus siglas en ingles); prueba de hipótesis, etc. (Mandal et al., 2015). 2. Antecedentes 2.1 Parámetros fisicoquímicos asociados a la calidad del agua en los estanques de cultivo de camarón El suelo y el agua son los factores que mayor influencia ejercen sobre el estatus de salud y desarrollo de los organismos acuáticos en cultivo (Boyd, 2000; Xiong, Dai, & Li, 2016). En este contexto, los principales indicadores de la calidad del agua y del sistema de cultivo en general, son los factores fisicoquímicos y biológicos. En el caso de los factores fisicoquímicos (abióticos) del agua, que se ha observado tienen una mayor influencia en el desarrollo y estatus de salud son: transparencia y/o turbidez (asociadas a la incidencia de luz), temperatura, oxígeno disuelto, conductividad (asociado a la salinidad del agua) y pH (acidez y alcalinidad) (Boyd, 2000; de Freitas, 2015). La entrada adecuada de luz en los sistemas de cultivo, en función de la calidad e intensidad de ésta, tiene un marcado efecto sobre la actividad biológica desarrollada en el cuerpo de agua. La luz favorece el establecimiento del fitoplancton y por consiguiente del zooplancton (producción primaria y secundaria respectivamente). La transparencia del agua indica la cantidad de fitoplancton, es decir, el nivel trófico primario en los sistemas acuáticos, los cuales, pueden ir de sistemas oligotróficos: aguas pobres en nutrientes, poco fitoplancton y alta transparencia, a sistemas eutrofizados: agua rica en nutrientes, 40 mucho fitoplancton y baja transparencia (de Freitas, 2015). Normalmente, la transparencia en la columna de agua en los sistemas de cultivo varía entre 20 y 70 cm (medida dada a partir del método del disco de Secchi), mayores profundidades significan que el agua es muy clara y por consiguiente con una producción primaria baja, y menores profundidades significan un exceso de nutrientes (eutrofización). La turbidez, por su parte, influye directamente en la entrada de luz a través de la columna de agua. Esta indica la cantidad de partículas en suspensión, las cuales pueden ser de origen biótico o abiótico, por ejemplo, arcilla, sedimentos, cieno, materia orgánica (detritus) y fitoplancton respectivamente. Se sabe, que los estanques de cultivo son más productivos cuando la turbidez por fitoplancton limita la visibilidad de 25-40 cm, dado que existe suficiente alimento natural y oxígeno disuelto en ellos (Boyd, 2000; de Freitas, 2015). La temperatura por otro lado influye en los procesos químicos y biológicos. Los procesos biológicos como crecimiento y respiración se duplican al aumentar la temperatura, generalmente cada 10°C. Esto quiere decir, por ejemplo, que los camarones crecen dos veces más rápido y consumen el doble de oxígeno a 30°C que a 20°C, por lo que el requerimiento de oxígeno disuelto es más crítico en temperaturas cálidas que en las frías. También, el crecimiento y respiración de otros organismos que cohabitan con los camarones, así como las reacciones químicas en agua y suelo (sedimentos), se incrementan conforme aumenta la temperatura (Boyd & Hanson, 2010). La conductividad (medida de la capacidad de un material o substancia para dejar pasar calor o corriente eléctrica) de los sistemas de cultivo, está dada en función de la concentración de iones disueltos en el agua como calcio, magnesio, sodio y potasio y esta tiende a aumentar con la temperatura. Altos valores de conductividad eléctrica pueden indicar una mayor mineralización mediante la actividad biológica de carbono o de nitrógeno proveniente de la materia orgánica, lo cual a su vez, se asocia a bajas concentraciones de oxígeno disuelto debido al incremento en la actividad biológica para la mineralización, generando estrés ambiental (de Freitas, 2015). 41 Otro factor abiótico de importancia es el pH (medida de la acidez o alcalinidad de una solución, relacionado con la concentración de iones hidrógeno [H+]). El pH puede ser modificado por distintos factores como la respiración, la fotosíntesis, el tipo de suelo de los
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