Identificacion-y-analisis-del-cluster-nmpABCDEF-responsable-de-la-va-degradativa-de-n-metilpirrolidona-en-Alicycliphilus-sp -BQ1

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
 
IDENTIFICACIÓN Y ANÁLISIS DEL CLUSTER nmpABCDEF, RESPONSABLE DE 
LA VÍA DEGRADATIVA DE N-METILPIRROLIDONA EN ALICYCLIPHILUS SP. 
BQ1 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
 
Doctor en Ciencias 
 
 
 
PRESENTA: 
 
M. en C. Claudia Julieta Solís González 
 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
Dra. Herminia de Jesús Loza Tavera 
Facultad de Química, UNAM 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
Dr. Guillermo Gosset Lagarda 
Instituto de Biotecnología, UNAM 
Dr. Juan Enrique Morett Sánchez 
Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
Ciudad de México. Agosto, 2018 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
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Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
If you wish success in life, 
make perseverance your bosom friend, 
experience your wise counselor, 
caution your elder brother 
and hope your guardian genius. 
 
― Joseph AddisonJoseph AddisonJoseph AddisonJoseph Addison 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A Gustavo, mi amado esposo, mi mejor amigo y mi sabio 
consejero. Por tu gran amor incondicional, tu infinito apoyo 
a cada instante y tu inquebrantable fe en mí, 
 MUCHAS GRACIAS. 
 
Eres mi ángel guardián materializado en la Tierra. 
 
IDENTIFICACIÓN Y ANÁLISIS DEL CLUSTER nmpABCDEF, RESPONSABLE DE 
LA VÍA DEGRADATIVA DE N-METILPIRROLIDONA EN ALICYCLIPHILUS SP. 
BQ1 
 
RECONOCIMIENTOS 
 
Esta tesis de Doctorado se realizó bajo la dirección de la Dra. Herminia Loza Tavera 
en el laboratorio 105 del Departamento de Bioquímica, en el conjunto E de la Facultad 
de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
El Comité Tutoral que asesoró el desarrollo de esta tesis estuvo formado por: 
Dra. Herminia Loza Tavera Facultad de Química, UNAM 
Dr. Guillermo Gosset Lagarda Instituto de Biotecnología, UNAM 
Dr. Enrique Morett Sánchez Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
Se reconoce la participación de los Dres. Martín Vargas S. y Lilianha Domínguez M. y 
de la M. en C. Itzel Gaytan E., cuyo trabajo formó parte de los experimentos de RT-
PCR, mutagénesis en E. coli y análisis de NMP por CG-EM, respectivamente. 
También se agradece la colaboración del Dr. Javier Cruz G. del Departamento de 
Ingeniería de la Facultad de Química, en cuyo laboratorio se llevó a cabo la 
cuantificación del consumo de NMP por CG-EM. 
 
Se reconoce la colaboración de los Dres. Miguel Ángel Cevallos y Luis Lozano del 
Centro de Ciencias Genómicas, quienes realizaron el ensamble del genoma de 
Alicycliphilus sp. BQ1 y la de los Dres. Jesús Campos G. de la Universidad 
Michoacana de San Nicolás de Hidalgo y Alberto Hernández E. del Instituto de 
Biotecnología cuyos trabajos sentaron las bases preliminares para desarrollar la 
estrategia de mutagénesis en Alicycliphilus sp. BQ1. 
 
El proyecto contó con los financiamientos DGAPA-PAPIIT-UNAM IN222811, 
IN217114, IN223317 y PAIP-FQ-UNAM 5000-9117. Durante mis estudios de 
doctorado gocé de una beca otorgada por CONACYT (No. CVU 268810) y con el 
apoyo económico por parte del Programa de Apoyo a los Estudios del Posgrado 
(PAEP) para la asistencia a congresos nacionales e internacionales. 
 
Esta tesis fue defendida en examen presentado el día ………………………………… 
 
El Jurado de Examen de Doctorado estuvo constituido por: 
 
Presidente Dra. Maricarmen Quirasco Baruch Facultad de Química, UNAM 
Vocal Dr. Dimitris Georgellis Instituto de Fisiología Celular, UNAM 
Vocal Dr. Miguel Ángel Cevallos Gaos Instituto de Ciencias Genómicas, UNAM 
Vocal Dr. Sergio Sánchez Esquivel Instituto de Investigaciones Biomédicas, 
 UNAM 
Secretario Dra. Rosa Laura Camarena Mejía Instituto de Investigaciones Biomédicas, 
 UNAM
AGRADECIMIENTOS 
 
A mis padres, Sara y Emilio, por ese inmenso amor siempre dispuesto, por 
motivarme a continuar ante las adversidades y por ser mi luz en los momentos más 
oscuros. 
A mis hermanos de sangre, Joaquín y Luis, y los de acción, Paulette y Edwin, por su 
cariño, sus palabras de aliento y por siempre estar dispuestos a escucharme, a pesar 
de no entender la mitad de lo que digo. 
A mis suegros, Maridol y Melitón y a la familia Cruz-Contreras, por su cariño y apoyo 
incondicional en cada momento. 
A mi tutora, la Dra. Herminia Loza T., por su confianza y guía, por su cariño, apoyo y 
consejos durante estos más de diez años. Gracias por el tiempo y compromiso 
dedicados a mi formación académica. 
A los miembros de mi Comité Tutoral, los Dres. Guillermo Gosset L. y Enrique Morett 
S., cuyos consejos y críticas contribuyeron al desarrollo del proyecto y, sin duda, 
también a mi desarrollo académico y personal. 
Finalmente, a mis compañeros y amigos del lab 105, porque hicieron más fáciles y 
divertidas las horas de trabajo. 
 
 
1 
 
ÍNDICE 
ABREVIATURAS 4 
1. RESUMEN 5 
ABSTRACT 7 
2. INTRODUCCIÓN 9 
2.1 Alicycliphilus y su habilidad para degradar compuestos xenobióticos 9 
2.2 Alicycliphilus sp. BQ1 10 
2.3 NMP: aplicaciones y riesgos 11 
2.4 Biodegradación de NMP 12 
3. OBJETIVOS 14 
4. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 15 
5. METODOLOGÍA 16 
5.1 Cepas y condiciones de cultivo 16 
5.2 Construcción y escrutinio de una biblioteca de mutantes de 
 Alicycliphilus sp. BQ1 17 
5.3 Identificación del sitio de inserción de mini-Tn5::Km 17 
5.4 Análisis transcripcional por RT-PCR 18 
5.5 Complementación genética 20 
5.6 Cuantificación de SSA y GABA intracelular 21 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 22 
6.1 Alicycliphilus sp. BQ1, pero no otros miembros del género 
 Alicycliphilus, es capaz de utilizar NMP como fuente de carbono 22 
6.2 El gen interrumpido en la mutante NMP¯ A.IV.74 forma parte de un 
 arreglo ausente en los genomas de las cepas Alicycliphilus 
 denitrificans BC y K601 23 
6.3 El arreglo nmpABCDEF es expresado como un mRNA policistrónico 24 
6.4 nmpB codifica una proteína involucrada en el consumo de NMP como 
 fuente de carbono 24 
6.5 Vía degradativa de NMP en Alicycliphilus sp. BQ1 26 
6.6 AAOs catalizan la desmetilación y desaminación del ácido γ-N- 
 metilaminobutírico 27 
6.7 Se detecta SSA pero no GABA en extractos celulares de Alicycliphilus 
sp. BQ1 cultivada en MM-NMP. 28 
6.8 Escherichia coli adquirió la habilidad de degradar NMP tras serle 
transferidos los genes nmpABCD 28 
6.9 E. coli transformada con pBBR1::PAnmpABCD degrada NMP aun 
cuando los genes que codifican GABA-AT fueron mutados, indicando 
que GABA-AT no participa en la vía degradativa de NMP 29 
6.10 Alicycliphilus sp. BQ1 no utiliza NMP como fuente de nitrógeno 30 
6.11 Crecimiento de Alicycliphilus sp. BQ1 en distintas concentraciones de 
 LB 33 
6.12 Consideración sobre la redundancia funcional de la SSDH en 
 Alicycliphilus sp. BQ1 34 
6.13 Posible función de nmpD y nmpE en el metabolismo de NMP 35 
6.14 A. denitrificans es incapaz de crecer en MM-NMP a pesar de tener 
 los genes nmpABCD 37 
2 
 
7. CONCLUSIONES 39 
8. PERSPECTIVAS 40 
9. REFERENCIAS 41 
ANEXOS 47 
 
 
3 
 
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS 
Figuras 
Figura 1 Vía degradativa de NMP propuesta en Paracoccus sp. NMD-4. 13 
Figura 2 Crecimiento de Alicycliphilussp. BQ1 en distintas concentraciones de 
NMP. 32 
Figura 3 Crecimiento de Alicycliphilus sp BQ1 en medio LB con distintas 
concentraciones. 34 
Figura 4 Crecimiento en MM-NMP/LB30 de A. denitrificans BC complementada 
con pBBR1MCS (círculos), pBBR1::PAnmpAB (triángulos) y 
pBBR1::PAnmpABCD (cuadrados). 38 
 
Tablas 
Tabla 1 Oligonucleótidos empleados en este trabajo. 19 
Tabla 2 Comparación entre las SSDHs de Alicycliphilus sp. BQ1 con NMPF y 
GabD en E. coli. 35 
Tabla 3 Comparación entre las SSDHs de A. denitrificans BC con NMPF en BQ1 
y con GabD en E. coli (% identidad). 38 
 
 
4 
 
ABREVIATURAS 
 
AAO aminoácido oxidasa 
AO amino oxidasa 
AFE Aceptor final de electrones 
Ap Ampicilina 
CG-EM Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas 
DNAg DNA genómico 
EOS Etanolamina-O-sulfato 
FTIR Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier 
GABA Ácido γ-aminobutírico 
GABA-AT GABA aminotransferasa 
Gm Gentamicina 
Km Kanamicina 
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas 
LB Medio Luria Bertani 
MA Metilamina 
MABO γ-N-metilaminobutirato oxidasa 
MaDH MA deshidrogenasa 
MM-NMP Medio mínimo con NMP 
MM-NMP/LB30 Medio mínimo con NMP adicionado con 30% de LB 
MM-PUh Medio mínimo con PU (Hydroform®) 
Nal Ácido nalidíxico 
NMHase N-metilhidantoina amidohidrolasa 
NMG N- metilglutamato 
NMP N-metilpirrolidona 
PU Poliuretano 
SSA Succinato semialdehído 
SSDH Succinato semialdehído deshidrogenasa 
 
 
5 
 
1. RESUMEN 
La amida cíclica N-metilpirrolidona (NMP) es un solvente polar aprótico, utilizado 
ampliamente en industrias petroquímicas, de polímeros y farmacéuticas. Si bien la 
NMP presenta baja toxicidad aguda, puede producir irritación en piel y en mucosas y 
exhibe efectos teratogénicos en ratas. La biodegradación de NMP se ha estudiado 
en sistemas de cultivo estáticos y semicontinuos con lodos activos, así como en 
cultivos axénicos de Paracoccus sp. NMD-4. Sin embargo, los mecanismos 
moleculares implicados en la degradación de NMP permanecen sin caracterizar. 
Alicycliphilus sp. BQ1 es una bacteria capaz de consumir la NMP presente en un 
medio mínimo como única fuente de carbono (MM-NMP), a diferencia de 
Alicycliphilus denitrificans cepas K601 y BC, cepas cercanas filogenéticamente. 
Con el objetivo de identificar los genes responsables de la habilidad de BQ1 para 
degradar NMP, una cepa mutante incapaz de crecer en MM-NMP (NMPA.IV.74) se 
generó mediante mutagénesis por transposición con miniTn5. El gen mutado (nmpB) 
forma parte de un grupo de seis genes (nmpABCDEF), ausente en los genomas de 
A. denitrificans BC y K601. No obstante, arreglos similares al cluster nmpABCDEF se 
identificaron en los genomas de Thauera sp. SWB20, Paracoccus pantotrophus 
DSM11073 y Burkholderia contaminans LMG23361. El análisis transcripcional por 
RT-PCR reveló que los genes nmpABCDEF se expresan como un mRNA 
policistrónico. Además, la habilidad para degradar NMP se restituyó en NMPA.IV.74 
mediante complementación con los genes silvestres nmpABCD. 
Con base en las proteínas codificadas por los genes nmpABC y F, en este trabajo 
se propone una nueva vía degradativa de NMP en la que la enzima N-metilhidantoina 
amidohidrolasa (NMPA/NMPB) hidroliza NMP a ácido γ-N-metilaminobutírico. Este 
compuesto podría ser desaminado formando succinato semialdehído (SSA) o 
desmetilado produciéndose ácido γ-aminobutírico (GABA) a través de la acción de 
una aminoácido oxidasa (AAO) (NMPC). Si el GABA se produjera, tendría que ser 
transformado por la enzima GABA aminotransferasa (GABA-AT) a SSA. Finalmente, 
el SSA sería convertido a succinato por la enzima succinato semialdehído 
deshidrogenasa (SSDH) (NMPF). 
6 
 
La demostración de que esta vía es responsable de metabolizar NMP se logró 
cuando Escherichia coli MG1655, teniendo dos GABA-AT y dos SSDH pero siendo 
incapaz de crecer en MM-NMP, adquirió la habilidad de degradar NMP tras la 
complementación funcional con los genes nmpABCD de Alicycliphilus sp. BQ1. Esta 
ganancia metabólica no se afectó tras eliminar los dos genes codificantes de la 
actividad GABA-AT de E. coli. Adicional a esto, los cultivos de BQ1 en MM-NMP 
exhibieron niveles intracelulares más altos de SSA, pero no de GABA, que los 
cultivos realizados en LB. Estos resultados evidencian que la NMP se degrada por 
las enzimas codificadas en los genes nmpABCDEF y que, en esta vía, la AAO 
desamina al ácido γ-N-metilaminobutírico para producir SSA. 
 
7 
 
ABSTRACT 
 
The cyclic amide N-methylpyrrolidone (NMP) is a polar aprotic solvent widely used 
in petrochemical, polymers and pharmaceutical industries. Although NMP exhibits low 
acute toxicity, it produces skin and mucosal irritation and teratogenic effects in rats. 
NMP biodegradation has been studied in static die-away and in semi-continuous 
activated sludge systems, and in axenic cultures of Paracoccus sp. NMD-4. However, 
the molecular mechanisms involved in NMP degradation remain uncharacterized. 
Alicycliphilus sp. BQ1 is able to consume the NMP present in a minimal medium 
(MM-NMP) as the sole carbon source, in contrast to A. denitrificans K601 and BC 
strains that are closed phylogenetic related strains. 
 To identify the genes responsible for BQ1 ability to degrade NMP, a mutant clone 
unable to grow in MM-NMP (NMPA.IV.74) was generated by miniTn5 insertional 
mutagenesis. The affected gene (nmpB) is part of a six-gene cluster (nmpABCDEF) 
absent in A. denitrificans BC and K601 genomes, but with high identity to similar 
arrangements in Thauera sp. SWB20, Paracoccus pantotrophus DSM11073 and 
Burkholderia contaminans LMG23361 genomes. RT-PCR analysis showed that 
nmpABCDEF genes are expressed as a polycistronic mRNA. Moreover, the ability to 
degraded NMP was restored in NMPA.IV.74 by complementation with the wild type 
nmpABCD genes. 
 Based on the proteins encoded by nmpABC and F genes, we propose a novel 
NMP degradative pathway where a putative N-methylhydantoinase (NMPA/NMPB) 
hydrolyzes NMP to γ-N-methylaminobutyric acid. This compound could be either 
deaminated to form succinate-semialdehyde (SSA) or demethylated to produce γ-
aminobutyric acid (GABA) by a putative aminoacid oxidase (AAO) (NMPC). If GABA 
was produced it has to be transformed to SSA by a GABA aminotransferase activity 
(GABA-AT). Finally, SSA is converted to succinate by a putative succinic 
semialdehyde dehydrogenase (SSDH) (NMPF). 
Demonstration that this pathway is responsible to metabolize NMP was obtained 
when E. coli MG1655, bearing two GABA-ATs and two SSDHs but unable to grow in 
MM-NMP, acquired the ability to degrade NMP after functional complementation with 
8 
 
Alicycliphilus sp. BQ1 nmpABCD genes. This metabolic gain of function was not 
affected after deleting the two GABA-AT genes of E. coli. In addition, BQ1 cultures 
growing in MM-NMP exhibited higher intracellular levels of SSA, but not of GABA, 
than cultures in LB. These results provide evidence that the enzymes encoded by the 
nmpABCDEF genes are responsible for NMP degradation, and that in this pathway 
the γ-N-methylaminobutyric acid is deaminated by the AAO to produce SSA. 
 
9 
 
2. INTRODUCCION 
 
2.1 Alicycliphilus y su habilidad para degradar compuestos xenobióticos 
Alicycliphilus, miembro de la familia Comamonadaceae en la subclase β de las 
protobacterias, es una bacteria ambiental, aislada a partir de entornos naturales y 
artificiales como lo son los vertederos, las plantas de tratamientos de aguas 
residuales, los suelos contaminados y los lodos activos. Cepas puras de este género 
exhiben un metabolismo versátil y son capaces de degradar hidrocarburos 
aromáticos como el benceno y el tolueno (Weelink et al., 2008) y los solventes 
industriales ciclohexanol (Mechichi et al., 2003) y acetona (Dullius et al., 2011). Las 
comunidades bacterianas,donde Alicycliphilus es un miembro predominante, se han 
asociado a la degradación de indol (Hong et al. 2010), de quinolina (Zhang et al., 
2017), de tetraciclina (Taşkan et al., 2016) y los disruptores endócrinos nonilfenol 
(Bai et al., 2017) y triclosan (Lee et al., 2014). Adicional al oxígeno, algunas cepas de 
Alicycliphilus pueden emplear nitrato y clorato como aceptores finales de electrones 
(AFE), promoviendo la degradación de xenobióticos en condiciones aeróbicas y 
anóxicas (Oosterkamp et al., 2013). Recientemente, se describió una cepa de 
Alicycliphilus capaz de producir compuestos de la familia de las N-acilhomoserin 
lactona; los cuales fungen como moléculas señal en el sistema de comunicación por 
percepción del quórum, regulando la expresión de exoenzimas posiblemente 
implicadas en los sistemas de tratamiento de aguas residuales (Morohoshi et al., 
2016). Estas características hacen de Alicycliphilus, una bacteria capaz de adaptarse 
metabólicamente a entornos desafiantes, un candidato prometedor para el desarrollo 
de nuevas biotecnologías aplicadas a la degradación de xenobióticos. 
 
De los miembros reportados para el género Alicycliphilus, las cepas K601 y BC de 
A. denitrificans son las mejor descritas hasta la fecha. Ambas cepas muestran las 
características comunes propias de su género y especie, pero existen importantes 
diferencias entre ellas en cuanto a la capacidad para emplear ciertos sustratos como 
fuentes de carbono. La cepa K601 puede degradar ciclohexanol en presencia de 
oxígeno y nitrato como AFEs (Mechichi et al., 2003). Por su parte, la cepa BC 
10 
 
degrada benceno y tolueno con clorato como AFE, pero es incapaz de consumir 
ciclohexanol (Weelink et al., 2008). Los genomas completos de ambas cepas se han 
depositado en la base de datos del National Center for Biotechnological Information 
con los números de acceso CP002657 y CP002449 para K601 y BC, 
respectivamente (Oosterkamp et al., 2011). El genoma de la cepa Alicycliphilus sp. 
B1 también se encuentra disponible con el número de acceso NZ_BBSJ01000052, 
sin embargo, su nivel de ensamble es en 59 contigs (Okutsu et al., 2015). 
 
2.2 Alicycliphilus sp. BQ1 
Nuestro laboratorio aisló a la cepa Alicycliphilus sp. BQ1 a partir de espumas de 
poliuretano (PU) deterioradas, colectadas en varios sitios del basurero Bordo de 
Xochiaca (Netzahualcóyotl, Estado de México). Similar a otros miembros descritos de 
este género, la cepa BQ1 se crece en valores de pH neutro y en un intervalo de 
temperatura entre 30 y 37°C. Alicycliphilus sp. BQ1 se ha cultivado aeróbicamente 
pero no bajo condiciones anóxicas. En medio Luria-Bertani (LB) sólido, forma 
colonias pequeñas (1-2 mm), rosadas, convexas con bordes regulares tras 48 h de 
incubación. En cultivos líquidos, exhibe un crecimiento planctónico durante las 
primeras horas de incubación pero crece en agregados y forma biopelículas al llegar 
a la fase exponencial tardía. 
La importancia de la cepa BQ1 radica en su habilidad de crecer en un medio 
mínimo que contiene al barniz de PU comercial, Hydroform®, como única fuente de 
carbono (MM-PUh). La habilidad de esta cepa para atacar el PU se demostró por la 
pérdida de los enlaces éster y el aumento de la señal correspondiente al grupo 
funcional carbonilo, observada por espectroscopía infrarroja con transformada de 
Fourier (FTIR) y por la formación de orificios en laminillas de Hydroform® 
polimerizado, detectados por microscopía electrónica de barrido. Además, 
concordando con los resultados del análisis FTIR, una actividad de esterasa 
extracelular fue detectada en el sobrenadante de cultivos MM-PUh inoculados con la 
cepas BQ1 (Oceguera-Cervantes et al., 2007). 
En este trabajo, también se analizó el barniz Hydroform® por cromatografía de 
gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Los resultados mostraron que 
11 
 
el compuesto N-metilpirrolidona (NMP) es uno de los componentes del barniz. El 
97% de la concentración inicial de NMP en el MM-PUh se consumió tras 12 h de 
cultivo con Alicycliphilus sp. BQ1. Más aún, la cepa BQ1 fue capaz de sostener su 
crecimiento en un medio mínimo con NMP como única fuente de carbono (MM-NMP) 
(Oceguera-Cervantes et al., 2007). 
 
2.3 NMP: aplicaciones y riesgos 
La amida cíclica (γ-lactama) NMP (CAS No. 872-50-4) es un líquido higroscópico, 
ligeramente amarillo con olor característico a amina. Este compuesto exhibe un 
carácter básico y polar con alta estabilidad, sólo ligeramente susceptible a la 
oxidación por el aire. La NMP es miscible en agua, altamente soluble en alcoholes y 
cetonas de bajo peso molecular como lo son el éter, el acetato de etilo, el cloroformo 
y el benceno y, moderadamente soluble en hidrocarburos alifáticos (Åkesson, 2001). 
La gran estabilidad química provista por su estructura cíclica, su poderosa 
capacidad de solvatación y su alto punto de ebullición (>200°C) hacen de la NMP un 
compuesto inerte, muy útil en diversas reacciones químicas. No obstante, la NMP 
también tiene un papel activo en algunas reacciones de hidrólisis y polimerización 
(Gontrani y Caminiti, 2012). 
Dadas sus propiedades y, en general, su baja toxicidad en comparación con otros 
solventes como el diclorometano, la NMP se utiliza ampliamente en distintos 
procesos tecnológicos. En la industria petroquímica, se emplea para la extracción de 
hidrocarburos aromáticos gracias a la alta solubilidad de éstos en mezclas de NMP 
con dioles como el etilenglicol (Grishchenko et al., 1974). Por otro lado, 
combinaciones de NMP con pequeñas cantidades de etilendiamina y morfolina se 
emplean en la organodesulfuración del coque de petróleo, un subproducto sólido del 
refinamiento del crudo, utilizado como combustible (Agarwal y Sharma, 2011). 
La NMP también es un solvente de polímeros naturales (derivados de celulosa) y 
sintéticos (acrilatos, pinturas y resinas epóxicas) y un catalizador en numerosas 
reacciones de polimerización (Norisuye et al., 1997). Por otro lado, se emplea en la 
síntesis de pigmentos, productos de uso cosmético y agroquímicos como 
insecticidas, fungicidas y herbicidas (Wu et al., 2001). Otras aplicaciones son la 
12 
 
remoción de pinturas y de grafitis (Anundi et al., 2000), la eliminación de aceite y 
residuos grasos de superficies metálicas, por lo general motores, y la limpieza de 
componentes electrónicos con NMP de alta pureza (Beaulie, 1990). En la industria 
farmacéutica, la NMP es uno de los principales cosolventes utilizado como excipiente 
de medicamentos parenterales y orales (Strickley, 2004), así como un poderoso 
solvente para la extracción, purificación y cristalización de distintos compuestos (Xu 
et al., 2007). Finalmente, gracias a su rápida absorción a través de la piel, la NMP 
también se utiliza para potenciar la penetración de fármacos administrados por vía 
transdérmica (Babu y Chen, 2015). 
En general, la NMP exhibe baja toxicidad aguda aunque puede causar irritación en 
ojos, piel, mucosas y vías aéreas superiores en individuos expuestos (Bader et al., 
2006). Estudios en ratas preñadas expuestas han mostrado que la NMP cruza la 
barrera placentaria, estableciéndose un equilibrio entre el contenido en sangre 
materna y fetal (Ravn-Jonsen et al., 1992) y que ésta produce malformaciones 
viscerales y esqueléticas en los fetos (Saillenfait et al., 2002), por lo que se ha 
clasificado como embriotóxica (Flick et al., 2009). Por estas razones, el uso de NMP 
se ha restringido en la Unión Europea y la concentración máxima permitida en 
formulaciones y productos de consumo es del 5% (Schindler et al., 2012). La 
Sociedad Japonesa de Salud Ocupacional ha limitado su uso a 1 ppm (Kubota et al., 
2007). Además todos los productos con NMP deberán presentar en su etiqueta la 
leyenda “genotóxica” de acuerdo con la Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (Schindler et al., 2012).2.4 Biodegradación de NMP 
Dada sus diversas aplicaciones y su amplia utilización, la NMP está presente en 
suelos contaminados y aguas residuales de distintas industrias, por lo que los 
microorganismos que habitan estos ecosistemas contaminados han de estar sujetos 
a procesos selectivo-adaptativos que les conferirán nuevas habilidades para la 
asimilación de este compuesto como una nueva fuente de carbono y nitrógeno. La 
degradación de NMP por microorganismos, no obstante, se ha estudiado poco y sólo 
existen algunos reportes al respecto. 
13 
 
Una degradación de NMP del 95% se observó en un sistema de cultivo estático y 
semicontinuo con lodos activos; el análisis por FTIR del sobrenadante proveniente 
del cultivo estático reveló un cambio en la banda correspondiente a la molécula de 
NMP, sugiriendo la ruptura del enlace C-N entre el átomo de nitrógeno y el grupo 
carbonilo de la NMP. No obstante, los microorganismos presentes en los lodos 
activos no se identificaron (Chow y Ng, 1983). 
Por otro lado, cepas pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Acinetobacter y 
Cupriavidus fueron capaces de degradar más del 99.5% del NMP presente como 
única fuente de carbono (1 mM) en un medio mineral, tras tres días de cultivo. Dichas 
cepas fueron aisladas a partir de un cultivo enriquecido, inoculado con muestras de 
suelos contaminados con petróleo, pesticidas e insecticidas (Lee et al., 2010). 
En un estudio reciente, se reportó que la cepa NMD-4 de Paracoccus sp., era 
capaz de utilizar NMP (5 mM) como única fuente de carbono y nitrógeno. En dicho 
trabajo también se detectaron los compuestos 1-metil-2,5-pirrolidinediona y ácido 
succínico en el sobrenadante de cultivos incubados por 12 y 24 h. Con base en estos 
resultados, se propuso que la molécula de NMP podría oxidadarse a 1-metil-2,5-
pirrolidinediona, seguida por una doble ruptura de los enlaces C-N produciendo 
succinaldehído, el cual, sería posteriormente oxidado a succinato para entrar, 
finalmente, al ciclo de Krebs (Figura 1) (Cai et al., 2014). Sin embargo, las enzimas 
responsables de catalizar dichas reacciones permanecen desconocidas. 
 
 
 
 
Figura 1. Vía degradativa de NMP propuesta en Paracoccus sp. NMD-4 (Tomado 
de Cai et al., 2014) 
14 
 
3. OBJETIVOS 
 
General 
Identificar los genes (y las enzimas) responsables de la actividad biodegradativa 
de Alicycliphilus sp. BQ1 sobre N-metilpirrolidona. 
 
Particulares 
1. Demostrar la degradación de NMP y su uso como fuente de carbono por 
Alicycliphilus sp. BQ1 
2. Evaluar la degradación de NMP en otros miembros del género Alicycliphilus. 
3. Generar clonas mutantes de la cepa BQ1, incapaces de crecer en MM-NMP, 
mediante la implementación de un sistema de mutagénesis al azar, utilizando el 
transposon miniTn5::km. 
4. Implementar un sistema para introducir DNA exógeno en Alicycliphilus sp. BQ1 y 
confirmar la participación del(os) gen(es) mutado(s) en la degradación de NMP, a 
través de la complementación de la(s) mutante(s) NMP¯ . 
5. Analizar la organización estructural y las relaciones funcionales que guarda el(los) 
gen(es) mutado(s) con su contexto genómico mediante análisis transcripcional 
(RT-PCR) y ensayos de complementación funcional heteróloga. 
6. Proponer la vía degradativa de NMP en Alicycliphilus sp. BQ1. 
 
15 
 
4. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 
 
 
 
 
 
 
I Alicycliphilus sp. BQ1 I 
¡ 
Caracterización de la degradación de Identificación de genes involucrados en 
NMP la degradación de NMP 
¡ 
Cultivoen Cultivoen Construcción de una biblioteca de 
MM-NMP MM-NMPILB~ mutantescon pUl (miniln5:: Krn) 
¡ 
D~I~iúll y ¡j11¡¡li~i~~ 
clonas NMP-
Sobrenadante ¡ medición de consurm 
de NMP por CG.MS 
ldentilicacióndel gen 
mutado por miniln5:: Krn 
¡ 
Extracción de RNA 
Análisis in silico: 
I Paquete celular I Análisis transcripcimal 
-contexto genómico, • -predicción de promotores y terminadores 
j 
por Rl·PCR -Iunciónde proteínas putativas 
Detección de Amplilicaciónde 
metabolitos genes wty clonación 
intracelulares enpBBR1MCS-Gm 
¡ 
Complementación Complementación 
de mutantes NMP- heteróloga en E. coli 
Cultivasen 1-MM-NMPILB30 
Propuesta de la vía degradativa de 
NMPen Alicycliphilus sp. BQ1 
16 
 
5. METODOLOGÍA 
 
La metodología empleada en este estudio se encuentra descrita a detalle en el 
artículo: 
Solís-González, C.J., Dominguez-Malfavon, L., Vargas-Suárez, M., Gaytán, I., 
Cevallos, M.A., Lozano, L., Cruz-Gómez, M.J. and Loza-Tavera, H. (2018) Novel 
metabolic pathway for N-Methylpyrrolidone degradation in Alicycliphilus sp. 
strain BQ1. Appl Environ Microbiol 84:1 e02136-17 (Anexo III). 
 
Los principales métodos se describen brevemente a continuación. 
 
5.1 Cepas y condiciones de cultivo 
Las cepas y plásmidos utilizados en este estudio, así como sus principales 
características, se describen en la Tabla 1 del artículo referido. 
Los medios de cultivo fueron LB o medio mínimo con NMP (25 mM) (MM-NMP), o 
malato (10 mM) como fuente de carbono. El medio MM-NMP (25 mM) adicionado 
con 30% de LB (MM-NMP/LB30) también se empleó durante los ensayos de 
complementación. Los medios sólidos se prepararon añadiendo 1.5% de agar. A 
menos que se indique lo contrario, las condiciones de incubación fueron 37 °C por 
48h para los cultivos sólidos mientras que los cultivos líquidos se incubaron a 37 °C 
con agitación a 200 rpm durante el tiempo requerido en cada experimento. 
Cuando fue necesario, los antibióticos kanamicina (Km) (30 µg/mL), gentamicina 
(Gm) (20 µg/mL), ampicilina (Ap) (100 µg/ml) o ácido nalidíxico (Nal) (20 µg/mL) se 
añadieron a los medios de cultivo. 
El crecimiento de las cepas se monitoreó mediante lecturas de densidad óptica a 
660 nm (DO660) usando un espectrofotómetro UV/visible (Ultrospec 2000, Pharmacia 
Biotech). 
Para los ensayos drop test en placas de MM-NMP y MM-malato, cultivos ON de 
las cepas a analizar se ajustaron a una D.O.660 = 1.5 (10
0). Posteriores diluciones 
seriadas (10-4-10-7) se preparaton con MgSO4 (10 mM) y alícuotas (10 µL) de cada 
dilución se depositaron en el medio correspondiente. Tras la incubación, el 
crecimiento se registró fotográficamente. 
17 
 
5.2 Construcción y escrutinio de una biblioteca de mutantes de Alicycliphilus 
sp. BQ1 
Se implementó una estrategia de mutagénesis por transposición en Alicycliphilus 
sp. BQ1: el plásmido suicida pUT, que poseé el transposón mini-Tn5::Km (Herrero et 
al., 1990), se movilizó por conjugación triparental desde E. coli S17-1 hacia un 
derivado nalidíxico resistente (NalR) de la cepa parental Alicycliphilus sp. BQ1. Se 
emplearon cultivos ON (5 mL de LB) de las cepas E. coli S17-1, Alicycliphilus sp. 
BQ1 NalR y la cepa auxiliar E. coli HB101 que contiene el plásmido auto-transmisible 
pRK2013, para inocular (0.5 mL) matraces independientes con 24.5 mL de LB fresco. 
Los cultivos se incubaron nuevamente hasta una D.O.660nm = 1.0 y las células 
posteriormente se cosecharon por centrifugación (10,000 x g durante 10 min). Tras 
lavar dos veces los paquetes celulares, éstos fueron resuspendidos en 1 mL de 
MgSO4 (10 mM). Alícuotas (100 µL) de cada cepa se mezclaron en una proporción 1: 
1: 3, donadora: auxiliar: receptora, y se plaquearon sobre agar LB sin antibiótico. 
Tras la incubación de las placas por 24 h a 30 °C, las mezclas se recogieron con 1 
mL de MgSO4 y alícuotas de 300 µL se esparcieron en placas de agar LB Nal km. 
Este procedimiento se repitió en distintas ocasiones y en total se obtuvo 7,132 clonas 
transconjugantes KmR NalR que se probaron en MM-NMP y MM-malato y se 
almacenaron a -70 °C con 30% de glicerol. 
 
5.3 Identificación del sitio de inserción de mini-Tn5::Km 
El DNA genómico (DNAg) de la mutante se purificó y digirió con la endonucleasa 
PstI. Posteriormente, una alícuota de los fragmentos PstI (50 ng) se autoligaron con 
2 U de la enzima T4 DNA ligasa (Thermo Scientific) en unareacción de 20 µl 
incubada toda la noche a 16 °C. Los fragmentos re-circularizados (25 ng) se 
emplearon como templado en una amplificación por PCR inverso con Taq DNA 
polymerase (Thermo Scientific) y los oligonucleótidos específicos Tn50 y Tn51 (de 
Lorenzo et al., 1990) (Tabla 1). La reacción se realizó en un termociclador VeritiTM 
de 96 pozos (Applied Biosystems) con una desnaturalización inicial a 95 °C por 1 
minuto; 35 ciclos con desnaturalización a 95 °C por 30 s, alineación a 60 °C por 30 s 
y extensión a 72 °C por 1 min; y una extensión final a 72 °C por 7 minutos. El 
18 
 
amplicón generado se purificó con el GeneJet gel extraction kit (Thermo Scientific) y 
se secuenció en la Unidad de Síntesis y Secuenciación del DNA (IBT-UNAM), 
empleando el oligo Tn51. La secuencia adyacente al transposón se identificó en el 
genoma de Alicycliphilus sp. BQ1 (GenBank accession number 
NZ_NKDB00000000.1). 
 
5.4 Análisis transcripcional por RT-PCR 
El RNA total se purificó a partir de cultivos en fase logarítmica de BQ1 en MM-
NMP, usando RNAzol® RT (Sigma-Aldrich), y tratado con DNasa I libre de RNasa 
(Thermo Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Previo a la 
síntesis de cDNA, se verificó la ausencia de DNA contaminante en las preparaciones 
de RNA tratado mediante PCR, utilizando los oligos para el gen que codifica la DNA 
girasa, gyrAF y gyrAR (Tabla 1), los cuales se emplearon previamente para 
amplificar un fragmento de 106 pb utilizando DNAg como molde y con ello confirmar 
su amplificación específica. 
El cDNA se sintetizo con el estuche cDNA RevertAid First Strand kit (Thermo 
Scientific) utilizando 2 µg de RNA total (tratado con DNAsa) y una combinación de los 
oligos reversos HydAR, NMHydR, AaOXiR, CupR, PucR, SSDHR, específicos para 
los genes que integran el arreglo nmpABCDEF y gyrAR (20 pmol en total) (Tabla 1). 
Distintas reacciones de PCR y RT-PCR se realizaron con Taq DNA polymerasa y 
distintos pares de oligos (Tabla 1) para amplificar regiones intragénicas e 
intergénicas a lo largo del arreglo nmpABCDEF. Las condiciones de amplificación 
fueron: desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 min; 35 ciclos de desnaturalización 
a 95 °C por 30 s, alineación a 62 °C por 30 s y extensión a 72 °C por 1 min; y una 
extensión final a 72 °C durante 7 min. 
19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 1. Oligonucleótidos empleados en este trabajo 
 
Oligo Secuencia (5’… 3’ ) 
Tn50 GGCCGCACTTGTGTATAAG 
Tn51 GGCCAGATCTGATCAAGAG 
Tn50 rev CTTATACACAAGTGCGGCC 
Tn51 rev CTCTTGATCAGATCTGGCC 
gyrAF CTGAGCCATACGGGCTACAT 
gyrAR TCCAGTCGTCTTCCTTGGTC 
HydAF CCGATCTGGACAGGATCAAC 
HydAR CGGATCAATTCGATCTCGTT 
NMHydF GGTGAAAAAGGCCATGAAGA 
NMHydR CCATCGGTATCGGCATAGTC 
AaOXiF GGCACGCCAACATTCTCTAT 
AaOXiR ACTGGGTCCATTCATCCTTG 
CupF CCTCAGGCCGAATACAGCTA 
CupR GCGGCAAAGTAAATGGAGTC 
PucF GAACACCGATATTCCCCAGA 
PucR ATGGAAACGGCAAAGACATC 
SSDHF TTCTTCGAGCCCACCATACT 
SSDHR AATCCGTATTCCGTGTCGTT 
NMHbF CCCAAGCTTATTCCATGGATTGGCTATGC 
NMHaR ATTTCTAGAATGGTCTTTCGGCGTATGAG 
AaOXR ATTTCTAGAGAATCGGCGTGTCTATGGAT 
nmpABR GAACGTGATGGGATCGATGT 
nmpBCF CCTGGACGAGTACATCAGCA 
nmpBCR ACTGGATCGTTCCGATCTTC 
nmpCDR GACATGCCATTCCCCTTG 
nmpEFF GGCGCACACCAAGGATATT 
nmpEFR TGTAGGCATGCTGCTTGAAC 
nmpDER AGTTCTGGCATCTGGGTGAT 
pukmF GGGCGTTTAATTTCCGATTAACCGTGAAGAGTCAAAAGGTG
TGAAACATGTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCG 
pukmR AGCGCATCAGACATTATTGCGTTGGGCTATTAATCGCTCAG
CGCATCCTGTCCCGGCGGATTTGTCCTAC 
gtkmF CTTAGAAATCAAATATATGTGCATCGGTCTTTAACTGGAGA
ATGCGAATGTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCG 
gtkmR GCAGCGTCGCCTCCGGCATAGGAGCGGCGCTACTGCTTCGC
CTCATCAAATCCCGGCGGATTTGTCCTAC 
gtchkF TCGGGTCTGGGTCGTGAAG 
gtchkBR TGTGTCACTTGGGAGAGCG 
puchkF GTGTGCCGTTTACCGCGATG 
puchkR CAGACATTATTGCGTTGGGC 
20 
 
5. 5. Complementación genética 
Se generaron dos construcciones que portan los genes wild type (wt) nmpAB y 
nmpABCD y la posible región promotora PA empleando el vector movilizable 
pBBR1MCS-5 GmR (Kovach et al., 1995). Los insertos PA nmpAB de 4.1 kb y 
PAnmpABCD de 5.6 kb fueron amplificados por PCR, utilizando el DNAg de 
Alicycliphilus sp. BQ1 como templado, los pares de oligos NMHbF/NMHaR y 
NMHbF/AaOXR que poseen los sitios de restricción HindIII y XbaI en sus extremos 5’ 
(Tabla 1), respectivamente, y la enzima Phusion High-Fidelity DNA polymerase 
(Thermo Scientific). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 
desnaturalización inicial a 98 °C por 30 s; 40 ciclos de desnaturalización a: 98 °C por 
10 s, alineación a 60 °C por 20 s, y extensión a 72 °C por 3 min; y una extensión final 
a 72 °C durante 5 min. Ambos fragmentos se purificaron utilizando el GeneJet gel 
extraction kit (Thermo Scientific) y clonados en el vector pBBR1MCS-5 GmR. Con 
esto se obtuvo las construcciones pBBR1::PAnmpAB y pBBR1::PAnmpABCD. Las 
construcciones se transformaron en células competentes de E. coli DH5α por choque 
térmico, se purificaron con GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) y se 
verificaron por análisis de restricción y secuenciación. Tras confirmar la ausencia de 
mutaciones, ambas construcciones se transformaron en E. coli S17-1 y se 
transferieron por conjugación a la mutante NMP‾A.IV.74, siguiendo el protocolo 
descrito previamente. El crecimiento en MM-NMP y MM-NMP/LB30, así como el 
consumo de NMP en ambos medios fueron evaluados en la mutante albergando el 
vector vacío pBBR1MCS-5 o las construcciones pBBR1::PAnmpAB y 
pBBR1::PAnmpABCD. Para mayores detalles ver artículo Solís González et al., 2018. 
Adicionalmente, se realizó la complementación heteróloga de E. coli K-12 MG1655 
con pBBR1MCS-5, pBBR1::PAnmpAB y pBBR1::PAnmpABCD, para determinar si las 
proteínas codificadas por los genes en dichas construcciones, eran suficientes para 
conferir la habilidad de degradar NMP. Asimismo, E. coli K-12 DY329 wt y las 
mutantes en los genes que codifican a la GABA transaminasa de E. coli (puuE y 
gabT), ∆puuE::KanR, ∆gabT::KanR y la doble mutante ∆puuE/∆gabT::KanR, también 
se transformaron con estas construcciones para determinar si una actividad GABA-
AT estaba involucrada en el metabolismo de NMP. 
21 
 
 
5.6 Cuantificación de SSA y GABA intracelular 
La concentración intracelular de GABA y SSA se determinó en células de 
Alicycliphilus sp. BQ1 cultivada en MM-NMP y LB, implementando un ensayo 
enzimático con la preparación comercial GABase (Sigma-Aldrich). En este ensayo, la 
enzima GABA-AT transforma el GABA presente en los extractos celulares en SSA 
mientras que la enzima SSDH cataliza la conversión de SSA en succinato acoplada a 
la reducción de NADP+ en NADPH. Los niveles de NADPH se cuantifican por 
absorción a 340 nm y, dada la estequiometria 1:1 de la reacción, la cantidad de 
NADPH refleja los niveles de GABA presentes en las células. Adicionalmente, a 
través de un ensayo paralelo que utiliza el inhibidor de GABA-AT, etanolamina-O-
sulfato (EOS) (60 mM), se logra discernir entre el SSA derivado de GABA y el 
formado en otras reacciones del metabolismo central. 
Para preparar el lisado celular, 1 mL de cultivo de Alicycliphilus sp. BQ1 en MM-
NMP o LB con una D.O. 660 = 1.5, fue centrifugado a 10000 x g durante 10 min. El 
paquete celular se resuspendió en 1 mL de agua y llevado a ebullición por 10 min. 
Posteriormente, esta preparación se centrifugó a 12000 x g por 10 min y el extracto 
libre de células analizado. Adicionalmente, se prepararon estándares de GABA en 
agua, para construir una curva patrón. Una alícuota del lisado celular (40 µL) o del 
estándar (10 µL) se añadió al pozo de una placa de microtitulación conteniendo 60 
µL de una preparación con buffer Tris (pH 9) (80 mM), Na2SO4 (750 mM), ditiotreitol 
(10 mM), NADP+ (1.4 mM), α-cetoglutarato (2 mM) y 0.03 U GABase. Finalmente, la 
placa con las muestras y estándares se incubó durante 60 minutos a 37 °C y, 
posteriormente se analizó en el lector de microplacasEpoch (BIOTEK), midiendo la 
absorbancia en los pozos a 340 nm. Se analizaron tres réplicas biológicas. 
 
 
22 
 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
Los principales resultados de esta tesis doctoral así como su discusión se incluyen 
en el artículo: 
Solís-González, C.J., Dominguez-Malfavon, L., Vargas-Suárez, M., Gaytán, I., 
Cevallos, M.A., Lozano, L., Cruz-Gómez, M.J. and Loza-Tavera, H. (2018) Novel 
metabolic pathway for N-Methylpyrrolidone degradation in Alicycliphilus sp. 
strain BQ1. Appl Environ Microbiol 84:1 e02136-17 (Anexo III). 
A continuación se presenta un resumen de los resultados descritos en la 
publicación referida. 
 
6.1 Alicycliphilus sp. BQ1, pero no otros miembros del género Alicycliphilus, es 
capaz de utilizar NMP como fuente de carbono 
La habilidad de Alicycliphilus sp. BQ1 para crecer en MM-NMP (25 mM) se 
describió previamente (Oceguera-Cervantes et al., 2007). En este trabajo, se 
caracterizó su crecimiento y se determinó que la cepa BQ1 exhibe una fase lag más 
larga en MM-NMP (8 h) en comparación con la observada en el medio rico LB (4 h). 
No obstante, tanto la velocidad específica de crecimiento durante la fase exponencial 
como el crecimiento máximo fueron semejantes en ambos medios, µ= 0.44 h-1 y 
D.O.660nm = 3.24 ± 0.14 para LB y µ= 0.43 h
-1 y D.O.660nm =2.84 ±0.20 para MM-NMP, 
revelando que la NMP es una fuente de carbono y energía tan óptima como el medio 
rico LB (Figura 1A en Solís-González et al., 2018). 
La degradación de NMP por Alicycliphilus sp. BQ1 se demostró mediante la 
cuantificación del consumo de NMP por CG-EM, utilizando una curva estándar de 
NMP (2.5-30 mM). Los resultados mostraron que el 40% de NMP se consumió 
durante las primeras 12 h de cultivo, mientras que una degradación del 90% se logró 
tras 24 h de incubación con la cepa BQ1. Los análisis de CG-EM los llevó a cabo la 
M. en C. Itzel Gaytán Enríquez, estudiante de doctorado en nuestro grupo. 
Asimismo, la capacidad de crecer en NMP se evaluó en las cepas K601 y BC de 
A. denitrificans, que degradan ciclohexanol y benceno, respectivamente (Mechichi et 
al., 2003; Weelink et al., 2008) y en E. coli cepa K-12 MG1655, usada como control 
23 
 
negativo. Ninguna de estas cepas mostraron crecimiento en MM-NMP, indicando que 
los mecanismos involucrados en la degradación de este compuesto se encuentran 
en la cepa BQ1 pero no en las cepas probadas del género Alicycliphilus ni en E. coli 
(Figura 1A en Solís-González et al., 2018). 
 
6.2 El gen interrumpido en la mutante NMP¯ A.IV.74 forma parte de un arreglo 
ausente en los genomas de las cepas A. denitrificans BC y K601 
Con el objetivo de identificar los genes responsables de la degradación de NMP 
en Alicycliphilus sp. BQ1, se generó una biblioteca con 7,132 clonas mutantes 
empleando el transposón miniTn5::Km, albergado en el plásmido suicida pUT. Tras 
el escrutinio en placas de MM-NMP, se identificó la clona mutante NMP¯ A.IV.74. La 
ausencia de auxotrofías y la presencia de una sola inserción del transposón en el 
cromosoma de la mutante se confirmaron mediante su crecimiento en MM-malato y 
por Southern blot, respectivamente. El fenotipo mutante se confirmó con una curva 
de crecimiento en MM-NMP líquido totalmente abatida y un nulo consumo de NMP 
(Figuras 1B y 1C en Solís-González et al., 2018). 
El sitio de inserción del transposón se localizó en un marco de lectura abierta 
(ORF) de 1,776 bp, cuyo producto se predice como la subunidad α de la enzima N-
metilhidantoina amidohidrolasa (NMHase) (nmpB). Las regiones que flanquean a 
nmpB en el genoma de Alicycliphilus sp. BQ1 se analizaron y con ello se identificó un 
arreglo de seis ORFs (nmpABCDEF) que exhiben una misma orientación 
transcripcional y con un uso preferencial de codones y contenido de GC (61-66%) 
semejantes a los de otras regiones del genoma de la cepa BQ1. 
Genes homólogos a los genes que flanquean, pero no a los constituyen el arreglo 
nmpABCDEF, se localizaron en A. denitrificans BC y K601 y en otras cepas cercanas 
filogenéticamente. Por el contrario, el arreglo completo nmpABCDEF se localizó en 
Alicycliphilus sp. B1 y en otras proteobacterias como Thauera sp. SWB20, 
Burkholderia contaminans, Paracoccus pantotrophus y Paracoccus yeei (Figura 2A 
en Solís-González et al., 2018). 
Estas especies, aisladas principalmente de lodos activados y aguas residuales, 
destacan por su habilidad para degradar compuestos aromáticos (Song et al., 2001), 
24 
 
solventes clorados (Vandamme y Dawyndt, 2011) y otros compuestos recalcitrantes 
como acetona (Siller et al., 1996), metilamina y N,N-dimetilformamida (Urakami et al., 
1990). No obstante, con excepción de la cepa NMD-4 de Paracoccus sp. (Cai et al., 
2014), no existen reportes sobre cepas pertenecientes a dichos géneros, que sean 
capaces de utilizar NMP como fuente de carbono. 
 
6.3 El arreglo nmpABCDEF se expresa como un mRNA policistrónico 
Las cortas distancias intergénicas y la misma dirección transcripcional de los 
genes en el arreglo nmpABCDEF y en los arreglos homólogos de otras 
proteobacterias, sugirieron que su expresión fuera como un mensaje policistrónico. 
Sin embargo, el análisis in sílico reveló la presencia de posibles promotores σ70 y 
terminadores transcripcionales Rho-independientes a lo largo del arreglo 
nmpABCDEF, lo que sugirió la existencia de varias unidades transcripcionales 
(Figura 3A en Solís-González et al., 2018). Para determinar si la expresión de los 
genes es en uno o varios transcritos, la posible co-transcripción entre ellos se analizó 
mediante RT-PCR. Las reacciones de amplificación se hicieron con cDNA hecho a 
partir del RNA total aislado de cultivos de Alicycliphilus sp. BQ1 en MM-NMP y 
distintos pares de oligos localizados en la secuencia codificadora de cada gen 
(intragénicas) y flanqueando las regiones entre los genes a lo largo del arreglo 
(intergénicas). Todas las RT-PCRs, intragénicas e intergénicas, mostraron 
amplicones del tamaño esperado, confirmando que el arreglo completo nmpABCDEF 
se expresa como un mRNA policistrónico cuando Alicycliphilus sp. BQ1 se cultiva en 
MM-NMP (Figura 3B en Solís-González et al., 2018). 
 
6.4 nmpB codifica una proteína involucrada en el consumo de NMP como 
fuente de carbono 
Por otro lado, la participación del gen mutado nmpB en el metabolismo de NMP se 
demostró mediante la complementación por conjugación de la mutante NMP¯ A.IV.74 
con los genes silvestres nmpAB y nmpABCD, y su posible región regulatoria PA, 
albergados en el vector mobilizable pBBR1MCS-5. La mutante, con el vector vacío o 
con las construcciones pBBR1::PAnmpAB o pBBR1::PAnmpABCD, se probó en 
25 
 
placas de MM-NMP y se determinó que únicamente la construcción 
pBBR1::PAnmpABCD restituía el fenotipo silvestre (Figura 4A en Solís-González et 
al., 2018). No obstante, el crecimiento en MM-NMP líquido no se restauró, 
independientemente de la construcción presente en la mutante. Considerando que la 
mutante complementada pudiera requerir una fuente de carbono adicional con mayor 
disponibilidad, que facilitara su desarrollo en las primeras horas de cultivo y 
permitiera la síntesis posterior de las proteínas involucradas en la degradación de 
NMP, se probó su crecimiento en medio MM-NMP suplementado con 30% LB (MM-
NMP/LB30). En este medio, Alicycliphilus sp. BQ1 exhibe un comportamiento 
diaúxico, en el que la primera fase de crecimiento exponencial resulta del 
metabolismo de LB, mientras que la segunda fase, desarrollada tras 12 h de 
incubación, coincide con la degradación y consumo de NMP como fuente de carbono 
(Figura 4B en Solís-González et al., 2018). 
El cultivo en MM-NMP/LB30 de la mutante NMP¯ A.IV.74 conteniendo el vector 
vacío exhibió únicamente la primera fase de crecimiento sin cambios en la 
concentración de NMP en el medio (Figura 4B en Solís-González et al., 2018). La 
mutante complementada con la construcciónpBBR1::PAnmpAB tampoco mostró la 
segunda fase de crecimiento pero, contrario a lo esperado, la NMP se consumió 
totalmente tras 16 h de incubación (Figura 4C en Solís-González et al., 2018). Este 
resultado se puede explicar si se considera que la actividad enzimática reconstituida 
por la construcción pBBR1::PAnmpAB es responsable de la primera reacción en el 
metabolismo de la molécula de NMP, es decir, la reacción que utiliza al NMP como 
substrato, como se describe en el siguiente párrafo. No obstante, al no existir la 
siguiente actividad enzimática (NMPC), la NMP no puede canalizarse en la vía para 
ser utilizada como fuente de carbono, por lo que la mutante complementada no crece 
en NMP pero si es capaz de degradarlo. Por su parte, la mutante que porta la 
construcción pBBR1::PAnmpABCD presentó ambas fases de crecimiento y un 
consumo total de NMP tras 24 h de incubación; lo que concuerda con los resultados 
en MM-NMP sólido (Figura 4C en Solís-González et al., 2018). Estos datos indican 
que, además del gen nmpB, los genes downstream nmpC y nmpD también están 
involucrados en el metabolismo de NMP. Sin embargo, de acuerdo al análisis de RT-
26 
 
PCR, la expresión de los genes nmpABCDEF es en un mRNA policistrónico, por lo 
que la restitución del fenotipo wt en la mutante NMP¯ A.IV.74 complementada con los 
genes nmpABCD, resulta contradictoria. Posibles explicaciones serían que no solo 
PA controla la expresión de los genes en el arreglo nmpABCDEF, sino que alguno de 
los otros promotores detectados bioinformáticamente (Figura 3A en Solís-González 
et al., 2018), PD, PF, u otros no identificados, podrían controlar la expresión de los 
genes subsecuentes a nmpD, o que existen proteínas redundantes que suplen la 
actividad de las proteínas codificadas en nmpE y nmpF. 
 
6.5 Vía degradativa de NMP en Alicycliphilus sp. BQ1 
En cuanto a la función de las proteínas codificadas en el arreglo nmpABCDEF, 
tras la comparación con la base de datos, se determinó que los genes nmpA y nmpB 
codifican las subunidades β y α, respectivamente, de la enzima NMHase; nmpC 
codifica la enzima AAO FAD-dependiente; nmpD codifica una proteína hipotética con 
un dominio de plegamiento tipo cupina; el producto del gen nmpE es un regulador 
transcripcional de tipo PucR y, finalmente, nmpF codifica la enzima SSDH. 
Actividades semejantes a la NMHase y AAO catalizan la conversión de N-
metilhidantoina, amida cíclica estructuralmente similar a la NMP, en el aminoácido 
glicina, como parte del metabolismo de la creatinina en Pseudomonas putida 77 
(Yamada et al., 1985). En función de esto y como resultado de la integración de las 
actividades enzimáticas codificadas por los genes nmpA/nmpB, nmpC y nmpF se 
propuso una nueva vía degradativa para NMP en Alicycliphilus sp. BQ1. 
Inicialmente, la NMP sufre la ruptura hidrolítica del anillo mediante la enzima 
NMHase (nmpA/nmpB), formando ácido γ-N-metilaminobutírico. El segundo paso 
involucra la acción de la enzima AAO (nmpC) la cual podría catalizar una 
desmetilación oxidativa del ácido γ-N-metilaminobutírico formando GABA o bien, una 
desaminación oxidativa produciendo metilamina (MA) y SSA. Si la reacción de 
desmetilación fuera llevada a cabo y GABA producido, la acción de una actividad 
GABA-AT, responsable de la conversión de GABA en SSA, sería requerida. El gen 
codificante de dicha actividad está ausente en el arreglo nmpABCDEF aunque genes 
codificando aminotransferasas de clase III se localizaron en otras regiones del 
27 
 
genoma de Alicycliphilus sp. BQ1. Por el contrario, si la enzima codificada por nmpC 
catalizara la reacción de desaminación, SSA sería producido directamente sin 
requerirse una actividad GABA-AT en el metabolismo de NMP. 
Finalmente, la enzima SSDH (nmpF) metaboliza el SSA produciendo succinato, un 
intermediario del ciclo de Krebs. La detección de succinato tras la completa 
degradación de NMP por Paracoccus sp NMD-4 (Cai et al., 2014), apoya la reacción 
final en la vía propuesta para Alicycliphilus sp. BQ1 (Figura 5 en Solís-González et 
al., 2018). 
 
6.6 AAOs catalizan la desmetilación y desaminación del ácido γγγγ-N-
metilaminobutírico 
Tanto la desmetilación como la desaminación del ácido γ-N-metilaminobutírico son 
llevadas a cabo por AAOs distintas en el metabolismo de nicotina por Arthrobacter 
nicotinovorans pAO1. En dicho organismo, el ácido γ-N-metilaminobutírico formado a 
partir del anillo de pirrolidina del alcaloide, es desmetilado por la enzima γ-N-
metilaminobutirato oxidasa (MABO), rindiendo GABA (Chiribau et al., 2004) o 
desaminado por la enzima amino oxidasa (AO), formando SSA y MA (Chiribau et al., 
2006). Se desconoce la forma en la que ambas actividades enzimáticas son 
reguladas; ensayos in vitro sugieren que la actividad de MABO predomina sobre la 
de AO, sin embargo, [14C]metilamina se detectó en cultivos de A. nicotinovorans 
pAO1 con [14C]nicotina indicando que, in vivo, la desaminación es activa (Chiribau et 
al., 2006). La identidad entre la enzima AAO de Alicycliphilus sp. BQ1 con las de A. 
nicotinovorans pAO1 es baja, quizás un poco mayor con AO (19%) que con MABO 
(14%), por lo que no fue posible establecer una función clara para la AAO codificada 
por nmpC. Interesantemente, el gen contiguo al de la enzima AO en A. 
nicotinovorans pAO1 codifica una enzima con actividad SSDH, la cual tiene una 
identidad del 44% con la SSDH codificada por nmpF. 
 
 
 
28 
 
6.7 Se detecta SSA pero no GABA en extractos celulares de Alicycliphilus sp. 
BQ1 cultivada en MM-NMP 
Para aportar evidencias de si la actividad de la AAO sobre el γ-N-
metilaminobutírico es una desmetilación o una desaminación, los niveles 
intracelulares de GABA, el producto generado por la probable desmetilación del γ-N-
metilaminobutírico, y SSA se cuantificaron en extractos celulares de Alicycliphilus sp. 
BQ1 cultivada en MM-NMP y LB. Para ello, se utilizó la preparación comercial 
GABase que contiene las enzimas GABA-AT y SSDH, las cuales son capaces de 
transformar el GABA presente en los extractos celulares en SSA y éste en succinato, 
en una reacción acoplada a la reducción de NADP+ en NADPH, respectivamente. 
Los niveles de NADPH se cuantificaron por absorción a 340 nm y, dada la 
estequiometria 1:1 de la reacción, la cantidad de NADPH refleja los niveles iniciales 
de GABA en los extractos celulares. Adicionalmente, a través de un ensayo paralelo 
utilizando el inhibidor EOS, se logra discernir entre el SSA derivado de GABA y el 
presente en los extractos celulares. Los resultados mostraron cantidades similares 
de NADPH en ausencia y presencia de EOS, 1.72 ± 0.22 y 1.91 ± 0.18 µmol/unidad 
D.O.660, respectivamente, para las células cultivadas en MM-NMP y 0.71 ± 0.13 y 
0.79 ± 0.11 µmol/unidad D.O.660, respectivamente, para las células cultivadas en LB, 
indicando que SSA, pero no GABA, se sintetizó en ambos cultivos. Además, la 
concentración de SSA en las células cultivadas en MM-NMP (1.91 ±0.18 µmol/unidad 
D.O.660) fue más del doble que la de las células que crecieron en LB (0.79 ±0.11 
µmol/unidad D.O.660), indicando que SSA es producido al emplearse NMP como 
fuente de carbono. Estos resultados apoyan fuertemente que la actividad 
desaminasa propuesta para la AAO forma directamente SSA a partir del ácido γ-N-
metilaminobutírico, por lo que una actividad GABA-AT no es necesaria en la vía 
degradativa de NMP en Alicycliphilus sp. BQ1. 
 
6.8 Escherichia coli adquirió la habilidad de degradar NMP tras serle 
transferidos los genes nmpABCD 
Las actividades enzimáticas GABA-AT y SSDH, identificadas como participantes 
en el GABA shunt en E. coli K-12, se han caracterizado muy bien, sin embargo, el 
29 
 
análisis de los mapas metabólicos disponibles en la base de datos Kyoto 
Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG) reveló la ausencia de proteínas 
homólogas a NMHase y AAO, lo que explicaría la inhabilidadnatural de E. coli para 
crecer en MM-NMP. A fin de demostrar que todas las actividades propuestas son 
requeridas para el completo metabolismo de NMP, células competentes de E. coli 
MG1655, con una actividad nativa SSDH, se transformaron con las construcciones 
pBBR1::PAnmpAB y pBBR1::PAnmpABCD. Tras evaluar el crecimiento y consumo de 
NMP en el medio MM-NMP/LB30, se encontró que únicamente las células 
transformadas con los genes nmpABCD pudieron utilizar este compuesto como 
fuente de carbono (Figura 6 en Solís-González et al., 2018). 
Dado que los genes nmpA y nmpB, por sí solos, no son suficientes para conferir la 
capacidad de degradar NMP en E. coli, la participación de los productos de los genes 
nmpC y nmpD en la vía degradativa de NMP fue demostrada. 
 
6.9 E. coli transformada con pBBR1::PAnmpABCD degrada NMP aun cuando 
los genes que codifican GABA-AT fueron mutados, indicando que GABA-AT no 
participa en la vía degradativa de NMP 
La ausencia de GABA en las células de BQ1 cultivadas en MM-NMP indicaría que 
no se requiere una actividad GABA-AT en el metabolismo de NMP, concordando con 
la ausencia de un gen codificante para dicha enzima en el arreglo nmpABCDEF. 
Para demostrar que una actividad GABA-AT no participa en la degradación de NMP 
y, dada la falta de una técnica para generar mutantes sitio específicas en BQ1, las 
mutates de E. coli de la colección Keio (Baba et al., 2006), JW2637 y JW1295 
(donadas por el Dr. Adelfo Escalante del IBT, UNAM), con los genes gabT y puuE 
deletados respectivamente, se transformaron con la construcción 
pBBR1::PAnmpABCD, y cultivaron en MM-NMP/LB30. Ambas mutantes exhibieron 
un crecimiento diaúxico, indicando el consumo de NMP como fuente de carbono. 
Dada la redundancia en la actividad GABA-AT, la participación de dicha actividad 
en el metabolismo de NMP no pudo ser descartada. En función de esto, la Dra. 
Lilianha Domínguez Malfavón, posdoctorante de nuestro grupo, generó las mutantes 
sencillas ∆puuE y ∆gabT y la doble mutante ∆puuE ∆gabT empleando la cepa E. coli 
30 
 
DY329 (Figuras 7A y 7B en Solís-González et al., 2018). Las tres clonas mutantes se 
transformaron con el vector vacío pBBR1MCS y la construcción 
pBBR1::PAnmpABCD y su crecimiento en MM-NMP/LB30 se cuantificó. Las clonas 
transformadas con el vector vacío exhibieron únicamente la primera fase de 
crecimiento, derivada de la degradación de LB. Por el contrario, al ser transformadas 
con los genes nmpABCD, las tres clonas mutantes mostraron un crecimiento 
diaúxico, correspondiente con el uso de NMP como fuente de carbono (Figura 7C en 
Solís-González et al., 2018). 
La habilidad adquirida por E. coli para degradar NMP, a pesar de tener deletados 
ambos genes, puuE y gabT, confirma que una actividad GABA-AT no participa en la 
vía degradativa de NMP y apoya la idea de que la AAO codificada por nmpC lleva a 
cabo una desaminación del γ-N-metilaminobutírico y no una desmetilación. 
 
Resultados y discusión no incluidos en la publicación 
 
6.10 Alicycliphilus sp. BQ1 no utiliza NMP como fuente de nitrógeno 
De acuerdo a Cai y colaboradores (2014) la cepa NMD-4 de Paracoccus sp., 
aislada a partir de lodos activos provenientes de una planta de pesticidas, es capaz 
de degradar NMP (5 mM) y emplearlo como fuente de carbono y nitrógeno, por lo 
que la habilidad de Alicycliphilus sp. BQ1 para utilizar NMP como única fuente de 
nitrógeno también se evaluó. Para esto, se cuantificó el crecimiento de BQ1 en MM-
NMP (25 mM) eliminando la fuente de nitrógeno (NH4NO3) presente en el medio 
mínimo. 
Los resultados mostraron que al retirar la fuente de nitrógeno, la cepa BQ1 fue 
incapaz de crecer por arriba de una D.O.660=0.3. Con el objetivo de mantener el 
número de equivalentes de N aportados por el NH4NO3 (1.09 x 10
-4) la concentración 
de NMP en el medio se incrementó a 50 mM. Sin embargo, a esta nueva 
concentración, el crecimiento de la bacteria se observó totalmente abatido. 
Resultados similares se obtuvieron al emplearse concentraciones mayores de NMP 
(100, 150, 200 y 250 mM) en un MM sin NH4NO3 (Figura 2A). 
31 
 
El posible efecto tóxico sobre Alicycliphilus sp. BQ1 por concentraciones de NMP 
superiores a 25 mM se analizó cuantificando el crecimiento de la cepa BQ1 en MM 
con NH4NO3 y NMP a 25, 50, 100 y 250 mM, observando crecimiento con 50 y 100 
mM de NMP (Figura 2B). Resultó interesante, sin embargo, que el valor máximo de 
biomasa generada a las 48 h de cultivo en MM-NMP 50 y 100 mM fue similar al 
logrado con 25 mM de NMP, sugiriendo un efecto de inhibición por sustrato. Este 
efecto ya ha sido reportado en Paracoccus sp. NMD-4, donde una correlación 
negativa entre el crecimiento de la bacteria y la concentración de NMP (7.5, 10, 15 y 
20 mM) fue observada (Cai et al., 2014). Por otro lado, el crecimiento de 
Alicycliphilus sp. BQ1 en MM-NMP 250 mM, se abatió por completo, aún en 
presencia de NH4NO3 como fuente de nitrógeno, indicando que a esta concentración, 
la NMP ya es tóxica para la bacteria. 
Cabe mencionar que los datos descritos en esta sección son de una réplica 
biológica, por lo que se necesitan experimentos adicionales que son esenciales para 
confirmar la información. Estos resultados indican que la cepa BQ1 puede utilizar 
hasta 100 mM de NMP como fuente de carbono pero, a diferencia de Paracoccus sp. 
NMD-4, parece no emplear NMP como única fuente de nitrógeno. 
De acuerdo con las vías degradativas de NMP propuestas en Paracoccus sp. 
NMD-4 (Cai et al., 2014) y en Alicycliphilus sp. BQ1 (Solís-González et al., 2018), el 
átomo de nitrógeno de la NMP formaría parte de la molécula de MA, un subproducto 
de la degradación de NMP. La MA es un compuesto de un solo carbono (C1) 
derivado de la degradación de proteínas y algunos otros compuestos nitrogenados 
que puede ser empleada como fuente de carbono y nitrógeno por microorganismos 
metilótrofos, como Methylobacterium extorquens AM1 (Chistoserdov et al., 1994), y 
como fuente de nitrógeno por bacterias no metilótrofas como Agrobacterium 
tumefaciens y Mesorhizobium lotti (Chen et al., 2010) 
Existen dos rutas no ortólogas funcionalmente degeneradas para la oxidación de 
MA, la mediada por la enzima MA deshidrogenasa (MaDH) y la vía del N- 
metilglutamato (NMG). MaDH es una enzima periplásmica que cataliza la oxidación 
de MA en formaldehído y NH4
+ en un único paso. Por su parte, en la vía del NMG, 
llevada a cabo en el citoplasma, la oxidación de MA en formaldehído requiere ATP, 
 
involucra tres reacciones catalizadas por las enzimas NMG sintasa, NMG 
deshidrogenasa y γ-glutamilmetilamida sintetasa, y genera NADH y NH
Marx, 2015). La acción de MaDH, quien es pobremente regulada y energéticamente 
favorable, permite un rápido crecimiento con altas concentraciones de MA como 
fuente de carbono, mientras que la co
entornos donde < 1 mM de MA es empleada como 
et al., 2016). 
Ambos sistemas, MaDH y la vía NMG, se encuentran en 
pertenecientes al género Paracoccus
Paracoccus sp. NMD-4 no
codifican la vía NMG en esta cepa permitiría el metabolismo de MA y explicaría la 
habilidad de NMD-4 para usar NMP como 
sp. BQ1, sin embargo, se buscaron los genes que codifican estas actividades 
enzimáticas y ninguna de las vías de oxidación de MA fue identificada, 
explicaría la incapacidad de la cepa BQ1 para utilizar NMP como 
nitrógeno. La MA formada debe ser metabolizada por algún otro mecanismo no 
identificado. Estudios adicionales son necesarios para tener una mayor comprensión 
al respecto. 
 
 
Figura 2. Crecimiento de Alicycliphilus
NMP. Determinación por D.O.
cerrados) y sin NH4NO3 
concentraciones de NMP fueron 
(triángulos), 150 mM (asteriscos), 200 mM (cruces) y 250 mM (rombo
involucra tres reacciones catalizadas por las enzimas NMG sintasa, NMG 
glutamilmetilamida sintetasa, y genera NADH y NH
Marx, 2015). La acción de MaDH, quien es pobremente regulada y energéticamentefavorable, permite un rápido crecimiento con altas concentraciones de MA como 
fuente de carbono, mientras que la costosa ruta NMG potencia el crecimiento en 
1 mM de MA es empleada como única fuente de nitrógeno (Nayak 
Ambos sistemas, MaDH y la vía NMG, se encuentran en P. yeii y en otras cepas 
Paracoccus (Nayak y Marx, 2015). Si bien el genoma de 
4 no se ha secuenciado, la existencia de los genes que 
codifican la vía NMG en esta cepa permitiría el metabolismo de MA y explicaría la 
4 para usar NMP como única fuente de nitrógeno. En 
sp. BQ1, sin embargo, se buscaron los genes que codifican estas actividades 
enzimáticas y ninguna de las vías de oxidación de MA fue identificada, 
la incapacidad de la cepa BQ1 para utilizar NMP como única
La MA formada debe ser metabolizada por algún otro mecanismo no 
identificado. Estudios adicionales son necesarios para tener una mayor comprensión 
 
Alicycliphilus sp. BQ1 en distintas concentraciones de 
por D.O.660 (A) y peso seco (B), empleando MM con (símbolos 
 (símbolos abiertos), como fuente de nitrógeno. Las 
concentraciones de NMP fueron 25 mM (círculos), 50 mM (cuadrados
), 150 mM (asteriscos), 200 mM (cruces) y 250 mM (rombos). 
32 
involucra tres reacciones catalizadas por las enzimas NMG sintasa, NMG 
glutamilmetilamida sintetasa, y genera NADH y NH4
+ (Nayak y 
Marx, 2015). La acción de MaDH, quien es pobremente regulada y energéticamente 
favorable, permite un rápido crecimiento con altas concentraciones de MA como 
stosa ruta NMG potencia el crecimiento en 
fuente de nitrógeno (Nayak 
y en otras cepas 
y Marx, 2015). Si bien el genoma de 
ha secuenciado, la existencia de los genes que 
codifican la vía NMG en esta cepa permitiría el metabolismo de MA y explicaría la 
. En Alicycliphilus 
sp. BQ1, sin embargo, se buscaron los genes que codifican estas actividades 
enzimáticas y ninguna de las vías de oxidación de MA fue identificada, lo cual 
única fuente de 
La MA formada debe ser metabolizada por algún otro mecanismo no 
identificado. Estudios adicionales son necesarios para tener una mayor comprensión 
distintas concentraciones de 
, empleando MM con (símbolos 
(símbolos abiertos), como fuente de nitrógeno. Las 
s), 100 mM 
33 
 
6.11 Crecimiento de Alicycliphilus sp. BQ1 en distintas concentraciones de LB 
La falta de crecimiento en MM-NMP líquido de la mutante NMP¯ A.IV.74 
complementada con las construcciones pBBR1::PAnmpAB y pBBR1::PAnmpABCD, 
pudiera ser el resultado de una pobre adaptación de la mutante recién transformada 
al medio, durante las primeras horas de cultivo. Para facilitar el inicio del crecimiento 
de la mutante y la posterior expresión de los genes nmp conferidos en las 
construcciones, el medio MM-NMP se suplementó con LB como una fuente adicional 
de carbono más accesible para las células, las cuales, tras consumirla, expresarían 
los genes requeridos para la degradación del NMP presente en el medio. 
Para determinar la mínima concentración de LB necesaria para conseguir que las 
mutantes transformadas iniciaran su crecimiento y poder evaluar su fenotipo, fue 
necesario primero evaluar el crecimiento de Alicycliphilus sp. BQ1 en distintas 
diluciones de LB líquido. Las concentraciones que se probaron fueron 20, 30, 40, 60, 
80 y 100%. Los resultados mostraron que la cepa BQ1 comienza la fase de 
crecimiento exponencial a partir de las 3 h de incubación independientemente de la 
concentración de LB en el medio, sin embargo, la D.O.660 máxima alcanzada en la 
fase estacionaria, así como el tiempo que tarda la bacteria en llegar a ésta, decrecen 
a medida que el medio LB se encuentra más diluido (Figura 3). 
La dilución del 20% es la concentración mínima de LB en la que Alicycliphilus sp. 
BQ1 puede desarrollarse sin problema. Sin embargo, el crecimiento de la mutante 
NMP¯ A.IV.74 en esta concentración se abate totalmente al agregar Km al medio. La 
presencia del antibiótico, empleado como marcador de selección para asegurar la 
existencia de miniTn::Km en la mutante, podría estar generando un estrés adicional a 
las células cultivadas a esa baja concentración de nutrientes en el medio. En función 
de esto, se determinó utilizar MM-NMP con LB al 30% como fuente de carbono 
adicional, para evaluar el comportamiento de la cepa BQ1 y la mutante NMP¯ 
A.IV.74 conteniendo el vector vacío y las construcciones pBBR1::PAnmpAB y 
pBBR1::PAnmpABCD. 
 
34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6.12 Consideración sobre la redundancia funcional de la SSDH en 
Alicycliphilus sp. BQ1 
La redundancia en la función de las proteínas codificadas por los genes nmpE y 
nmpF es una explicación a la restitución del fenotipo wt en NMP¯ A.IV.74 
(pBBR1::PAnmpABCD), a pesar de la transcripción policistrónica del arreglo 
nmpABCDEF. Genes homólogos a nmpE no se encontraron en el genoma de 
Alicycliphilus sp. BQ1 pero sí se identificaron seis genes distintos a nmpF, cuyos 
productos son SSDHs putativas. Dos de las seis SSDHs, OYP23868.1 y 
OYP23002.1, mostraron una identidad del 68 y 79%, respectivamente, con NMPF y 
del 70 y 63%, respectivamente, con GabD, la SSDH de E. coli involucrada en la vía 
GABA shunt. Las cuatro SSDHs restantes exhibieron menores porcentajes de 
identidad con NMPF y GabD y, proteínas homólogas a tres de ellas, se identificaron 
en A. denitrificans BC (Tabla 2). Dada esta información, la idea de que otra SSDH, 
como OYP23868.1 u OYP23002.1, supla la función de NMPF en la mutante 
complementada con los genes nmpABCD pudiera ser viable. 
 
 
Figura 3. Crecimiento de Alicycliphilus sp BQ1 en medio LB con distintas 
concentraciones. LB 100% (círculos) y diluído al 80% (asteriscos), 60% (cruces), 
40% (rombos), 30% (triángulos) y 20% (cuadrados). 
35 
 
Tabla 2. Comparación entre las SSDHs de Alicycliphilus sp. BQ1 
con NMPF y GabD en E. coli 
 
SSDH en 
BQ1 
Identidad (%) Homólogos en 
A. denitrificans BC NMPF GabD 
OYP26305.1 42 41 Alide_1110 
OYP26686.1 39 40 Alide_0272 
OYP26739.1 44 42 No 
OYP23815.1 53 54 Alide_2764 
OYP23868.1 68 70 No 
OYP23002.1 79 63 No 
OYP23031.1 
(NMPF) 100 72 No 
 
6.13 Posible función de nmpD y nmpE en el metabolismo de NMP 
La vía degradativa de NMP ha sido propuesta en Alicycliphilus sp. BQ1 de 
acuerdo con la función predicha para las proteínas codificadas por los genes 
nmpABC y nmpF. Sin embargo, no fue posible asignar una función definida para los 
productos de los genes nmpD y nmpE en la vía metabólica propuesta. 
nmpD codifica una pequeña proteína de 115 aminoácidos que exhibe un dominio 
conservado entre miembros de la superfamilia de proteínas tipo cupina. Esta 
superfamilia tiene una gran variación funcional y debe su nombre a la estructura 
conservada tipo barril β (cupa) exhibida por todos sus miembros. Las proteínas tipo 
cupina tienen baja identidad entre sus secuencias pero poseen un dominio 
característico conformado por dos motivos separados por una región con longitud 
variable. La secuencia conservada y característica en el motivo 1 es 
G(x)5HxH(x)3,4E(x)6G, mientras que para el motivo 2 es G(x)5PxG(x)2H(x)3N. Los 
dos residuos conservados de His y el de Glu en el motivo 1 junto con la His del 
motivo 2, son responsables de la unión al ión metálico en el sitio activo (Dunwell et 
al., 2003). Tras compararse la secuencia de NMPD con la de algunas de las cupinas 
típicas de archeas, bacterias, hongos y plantas (Khuri et al., 2001), no se encontraron 
los motivos característicos ni los residuos conservados del dominio cupina en NMPD. 
36 
 
Por otro lado, dada la gran versatilidad de las proteínas tipo cupina, no tenemos 
información suficiente para asociar alguna función a NMPD en relación con el 
metabolismo de NMP. 
En cuanto al gen nmpE, éste codifica una proteína de 517 aminoácidos, cuya 
región comprendida entre los aminoácidos Asp7 y Ala124 presenta un dominio 
conservado en los reguladores transcripcionales tipo PucR y,en el extremo carboxilo 
terminal, entre los aminoácidos Leu434 y Ala488, se observa el dominio de unión a 
DNA helix-turn-helix, encontrado en PucR y en la familia de reguladores 
transcripcionales tipo LysR. 
PucR regula la expresión de los operones puc y ureABC bajo condiciones 
limitantes de nitrógeno, en Bacillus subtilis. El operón puc, inducido por alantoína, 
ácido alantoico y ácido úrico, está integrado por 14 genes cuyos productos, junto con 
la enzima guanina desaminasa, conforman la vía catabólica de purinas (Schultz et 
al., 2001). Por su parte, el operón ureABC codifica la enzima ureasa, responsable de 
la conversión de urea en amonio y CO2 (Brandenburg et al., 2002). PucR regula su 
propia expresión aunque también es sujeto al control de TnrA, un regulador global 
del metabolismo de nitrógeno (Beier et al., 2002). Otros miembros caracterizados de 
la familia de reguladores tipo PucR, presentes también en B. subtilis, son los factores 
trascripcionales PutR/PrcR y adeR. PutR/PrcR activa el operon putCBP, responsable 
de la vía degradativa del aminoácido prolina para ser empleada como fuente de 
carbono y nitrógeno (Belitsky, 2011; Huang et al., 2011). adeR activa la expresión de 
la enzima L-alanina deshidrogenasa, encargada de la desaminación oxidativa 
dependiente de NAD de L-alanina, con la subsecuente formación de piruvato (Lin et 
al., 2012). 
Los tres reguladores reconocen compuestos nitrogenados como moléculas 
efectoras; más aún, entre las actividades enzimáticas dependientes del regulador 
PucR, se encuentran las enzimas alantoinasa (pucH) y ureasa (ureABC), ambas son 
amidohidrolasas cíclicas como la enzima NMHasa, codificada por nmpA y nmpB. En 
función de esto y, dada la existencia de dominios conservados tipo PucR en NMPE, 
es posible que dicha proteína sea el regulador de la vía degradativa de NMP en 
37 
 
Alicyclipilus sp. BQ1. Sin embargo, se necesitan más estudios para confirmar dicha 
información. 
 
6.14 A. denitrificans es incapaz de crecer en MM-NMP a pesar de tener los 
genes nmpABCD 
La vía degradativa de NMP propuesta en Alicycliphilus sp. BQ1 acopla las 
actividades enzimáticas NMHase y AAO, implicadas en el metabolismo de creatinina, 
con la actividad SSDH, que participa en el sistema GABA shunt. El análisis de los 
mapas metabólicos disponibles en la KEGG mostró que ninguna de las vías 
mencionadas están completas en A. denitrificans BC. En la vía degradativa de 
creatinina, únicamente se encontró el gen ALIDE_RS09255, cuyo producto es la 
subunidad α de la enzima N-metilhidantoinasa; sin embargo, este gen no es 
homólogo a nmpB y no parece estar asociado a ningún otro gen para generar una 
enzima oligomérica funcional. En cuanto a la SSDH, existen tres genes 
ALIDE_RS01355, ALIDE_RS05530, ALIDE_RS13720, codificando dicha actividad en 
A. denitrificans BC. 
La ausencia de las actividades NMHase y AAO en A. denitrificans BC explicaría la 
incapacidad natural de esta cepa para degradar NMP. En función de esto, A. 
denitrificans BC se complementó con las construcciones pBBR1::PAnmpAB y 
pBBR1::PAnmpABCD y se evaluó su crecimiento en MM-NMP/LB30. Los resultados 
mostraron que, a diferencia de la complementación heteróloga lograda en E. coli, A. 
denitrificans BC fue incapaz de utilizar NMP como fuente de carbono, aún en 
presencia de las actividades NMHase y AO de Alicycliphilus sp. BQ1 (Figura 4). Esta 
información indica que, si bien existen tres SSDHs putativas en A. denitrificans, 
ninguna de éstas parece estar involucrada en el metabolismo de NMP. El 
alineamiento global entre las secuencias de aminoácidos de las SSDH de A. 
denitrificans BC con NMPF y con GabD, la SSDH de E. coli que participa en el GABA 
shunt, exhibió una identidad menor al 72%, que es el valor entre NMPF y GabD 
(Tabla 3). Más aún, proteínas de BQ1 homólogas a las tres SSDH del genoma de BC 
fueron identificadas en Alicycliphilus sp. BQ1, pero ninguna fue homóloga a NMPF, 
confirmando que en A. denitrificans BC no existen genes homólogos a nmpF y que 
 
ninguna de las SSDH suplen la función de la NMPF, lo 
de esta cepa para degradar NMP a pesar de haber sido complementada con la 
construcción pBBR1::PAnmp
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SSDH de 
A. denitrificans
BC 
ALIDE_RS01355
ALIDE_RS05530
ALIDE_RS13720
Figura 4. Crecimiento en MM
con pBBR1MCS (círculos), 
pBBR1::PAnmpABCD (cuadrados).
estándar de tres experimentos independientes.
Tabla 3. Comparación entre las SSDHs de 
NMPF en BQ1 y con GabD en 
ninguna de las SSDH suplen la función de la NMPF, lo cual explicaría la incapacidad 
de esta cepa para degradar NMP a pesar de haber sido complementada con la 
nmpABCD. 
 
A. denitrificans 
Homólogo en 
BQ1 NMPF 
GabD 
(E. coli)
ALIDE_RS01355 96 37 39 
ALIDE_RS05530 99 42 41 
ALIDE_RS13720 98 52 54 
. Crecimiento en MM-NMP/LB30 de A. denitrificans BC complementada 
con pBBR1MCS (círculos), pBBR1::PAnmpAB (triángulos) y 
(cuadrados). Las barras de error indican la desviación 
estándar de tres experimentos independientes. 
Tabla 3. Comparación entre las SSDHs de A. denitrificans BC con 
PF en BQ1 y con GabD en E. coli (% identidad) 
38 
cual explicaría la incapacidad 
de esta cepa para degradar NMP a pesar de haber sido complementada con la 
 
E. coli) 
C complementada 
(triángulos) y 
Las barras de error indican la desviación 
BC con 
39 
 
7. CONCLUSIONES 
 
1. Alicycliphilus sp. BQ1 es capaz de degradar y utilizar NMP como fuente de 
carbono. Esta habilidad se encuentra ausente en las cepas BC y K601 de A. 
denitrificans. 
2. Un sistema estable de mutagénesis por transposición fue desarrollado en 
Alicycliphilus sp. BQ1, generándose una biblioteca con 7,132 clonas mutantes. La 
clona NMP‾A.IV.74, incapaz de crecer en MM-NMP fue identificada. 
3. El gen mutado en NMP‾A.IV.74 (nmpB) codifica la subunidad α de la enzima N-
metilhidantoin amidohidrolasa y forma parte del arreglo génico nmpABCDEF, 
ausente en A. denitrificans BC y K601. 
4. Alicycliphilus sp. BQ1 exhibe un crecimiento diaúxico cuando es cultivada en el 
medio MM-NMP/LB30. Consume el LB disponible durante la primera fase de 
crecimiento exponencial y utiliza NMP como segunda fuente de carbono durante la 
segunda fase. 
5. El cultivo en MM-NMP/LB30 fue empleado como sistema cuantitativo para evaluar 
la recuperación del fenotipo wt en la mutante NMP‾A.IV.74 complementada. 
6. Un sistema para transferir DNA exógeno mediante conjugación fue implementado, 
por primera vez, en Alicycliphilus sp. BQ1. 
7. La presencia de los genes nmpABCD restableció el fenotipo wt en la mutante 
NMP‾ A.IV.74 mientras que, en E. coli MG1655, dichos genes le otorgaron la 
capacidad de degradar y utilizar NMP como fuente de carbono. 
8. El intermediario SSA pero no GABA fue detectado en extractos citosólicos de BQ1 
cultivada en MM-NMP. 
9. La actividad GABA-AT no es requerida durante la degradación de NMP por E. coli 
DY329. 
10. La vía degradativa de NMP fue identificada en Alicycliphilus sp. BQ1. En dicha vía, 
la amida cíclica NMP es hidrolizada y desaminada formando succinato el cual, es 
finalmente incorporado al ciclo de Krebs. 
 
40 
 
8. PERSPECTIVAS 
Estudios posteriores son necesarios para comprobar y caracterizar las actividades 
enzimáticas propuestas para los productos de los genes nmpA/nmpB, nmpC y nmpF. 
Será necesario definir el papel del gen nmpD en el metabolismo de NMP. Un 
dominio estructural tipo cupina fue identificado en la proteína codificada por dicho 
gen. Sin embargo, dada la amplia diversidad funcional asociada a esta estructura, no 
se ha logrado proponer una función clara para NMPD en relación con la degradación 
de NMP en Alicycliphilus sp. BQ1. 
 En cuanto a la proteína codificada por nmpE, se identificó un dominio presente en 
la familia de reguladores tipo pucR, relacionados con el catabolismo de compuestos 
nitrogenados. En función de esto, es probable que nmpE