Comparacion-y-evaluacion-del-uso-de-dos-diluyentes-como-preservador-de-semen-de-la-especie-Pituophis-deppei-deppei-obtenido-mediante-coleccion-manual

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Biológicas / Saúde

Aprendiendo Medicina

1/8/2022

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Medicina

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y
ZOOTECNIA

COMPARACIÓN Y EVALUACIÓN DEL USO DE DOS
DILUYENTES COMO PRESERVADOR DE SEMEN
DE LA ESPECIE Pituophis deppei deppei, OBTENIDO
MEDIANTE COLECCIÓN MANUAL.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

PRESENTA
RICARDO YAVE ESCAMILLA CASILLAS

Asesores:
M en C José Antonio Sandoval Zárate
M en C Felipe Correa Sánchez
Biól. Juan Alfonso Delgadillo Espinoza

Ciudad Universitaria, CD. MX. 2018

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

DEDICATORIA

A mi madre que me ha apoyado siempre para realizar mis metas y a
mis hermanos por su apoyo.
A Ana C. Mendoza por su cariño y apoyo incondicional.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Nacional Autónoma de México por darme la oportunidad de
estudiar la mejor profesión.
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia por la formación que recibí y los
amigos que me dejó.
Al M en C José Antonio Sandoval Zárate por darme la oportunidad de aprender y
trabajar a su lado y por todo el apoyo incondicional que me brindó.

A los biólogos Juan Alfonso Delgadillo Espinoza y Felipe Correa Sánchez por su
apoyo y confianza.

A mi apreciable jurado que me ha apoyado inmensamente.

A la Dirección General de Zoológicos y Vida Silvestre de la CDMX y todos los que
ahí laboran, gracias por todo el apoyo proporcionado para realizar este trabajo.

A la bióloga Beatriz Rubio por su apoyo y confianza.

Al laboratorio de herpetología de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala por
las facilidades otorgadas.

Al Dr José Enrique Javier Olloqui Pang por ser un gran amigo y siempre
apoyarme.

A las MVZs Josefina Rosales Castillo y Margarita Morales Vázquez por todo el
apoyo.

A Carlos y Manuel Esquer por su amistad y apoyo de toda la vida.

A todas las personas, amigos y familiares que siempre me han dado su apoyo en
las buenas y en las malas.

III
4

CONTENIDO

Página
1.- RESUMEN 6

2.- INTRODUCCIÓN 7

3.- ANTECEDENTES 9

3.1.- Taxonomía y características de la familia Colubridae. 9

3.2.- Pituophis deppei deppei. 9

3.2.1.- Aspectos reproductivos de Pituophis deppei deppei en vida
libre y cautiverio.
11

3.2.2.- Cortejo. 12

3.3.- Antecedentes reproductivos en serpientes. 12

3.3.1.- Aspectos anatómicos de serpientes macho 15

3.3.2.- Principales diluyentes utilizados en semen de serpientes. 17

3.4.- Usos y características del agua de coco como diluyente. 18

4.- OBJETIVO 21

5.- HIPÓTESIS 21

6.- MATERIAL Y MÉTODOS 22

6.1.- Ejemplares. 22

6.2.- Condiciones de alojamiento y medioambientales de los
ejemplares.
22

6.3.- Extracción de semen. 22
IV
5

6.4.- Diseño experimental. 24

6.4.1.- Determinación de volumen y evaluación de la movilidad
espermática.
24

6.4.2.- Concentración espermática y morfología. 25

6.4.3- Análisis estadístico. 25

7.- RESULTADOS 26

8.- DISCUSIÓN 39

9.- CONCLUSIONES 43

10.- REFERENCIAS 44

RESUMEN

ESCAMILLA CASILLAS RICARDO YAVE. Comparación y evaluación del uso de
dos diluyentes como preservador de semen de la especie Pituophis deppei deppei,
obtenido mediante colección manual (bajo la dirección de: M en C José Antonio
Sandoval Zárate, M en C Felipe Correa Sánchez y el Biól. Juan Alfonso Delgadillo
Espinoza.
El presente trabajo tuvo como objetivo comparar y evaluar 2 diluyentes para
determinar cuál ofrece mayor tiempo de viabilidad del semen de serpientes cincuate
(Pituophis deppei deppei) en condiciones de refrigeración (4°C), asimismo
determinar el volumen, concentración espermática y las anormalidades totales de
las muestras seminales de la especie. Para este estudio se utilizaron 8 ejemplares
de Pituophis d. deppei albergados en el laboratorio de herpetología de la Facultad
de Estudios Superiores Iztacala, UNAM en la Ciudad de México. La obtención de
las muestras se realizó dando masaje en la zona ventral del cincuate. Cada uno de
los ejemplares fue colectado en cuatro ocasiones, dos en primavera y dos en
verano, del total de colectas realizadas se obtuvieron 18 muestras con
espermatozoides viables, las cuales fueron diluidas individualmente en agua de
coco y solución salina fisiológica (SSF) en una proporción 1:20, para posteriormente
ser almacenadas en refrigeración a fin de evaluar su movilidad cada 24 hrs, dicho
parámetro fue utilizado para determinar la viabilidad de los gametos. Los resultados
mostraron que los espermatozoides mantenidos en agua de coco tuvieron una
movilidad de hasta 2 días, en tanto, los conservados en SSF registraron un mayor
tiempo de movilidad de hasta 7 días, en donde también se observó un menor
porcentaje de anormalidades al final de cada una de las observaciones.

2. INTRODUCCIÓN

La serpiente de la especie Pituophis deppei deppei, conocida como culebra
sorda mexicana o cincuate, es un reptil endémico de México (CONABIO, 2009)
considerado por la NOM-059-SEMARNAT-2010 como especie amenazada. Con
el paso del tiempo, el número de especies en esta categoría o en peligro de
extinción se han incrementado debido a la fragmentación de sus poblaciones y
a los efectos asociados de la consanguinidad, producto de la reducción de
poblaciones de serpientes. En el caso de los ejemplares en cautiverio, las
principales causas asociadas a la baja en el número de individuos son debido a
problemas relacionados con el apareamiento y la eclosión, poniendo en
evidencia la necesidad de desarrollar técnicas de reproducción asistida que
permitan incrementar las colonias en cautiverio (Zacariotti et al., 2012).
Dentro de las biotecnologías que pueden ser utilizadas para la preservación de
especies se encuentra la congelación de semen y la inseminación artificial, con
lo que se contribuye a los esfuerzos en pro de la conservación (Zacariotti et al.,
2012), estas técnicas son dos de las más utilizadas en mamíferos. Debido a que
en la congelación de semen se utilizan diluyentes que contienen crioprotectores,
el más usado ha sido el glicerol, cuyo uso tiene como finalidad reducir la
cristalización intracelular (Yang et al., 2016), sin embargo, la inclusión del mismo
en muestras de semen de serpientes, ha ocasionado efectos negativos,
provocando la muerte de los espermatozoides (Mengden et al., 1980), por lo que
hasta el momento los protocolos han sido poco eficientes al momento de realizar
la evaluación, refrigeración y congelación del semen de ofidios (Zacariotti et al.,
2012). Esta problemática genera la necesidad de contar con diluyentes que
puedan prolongar la viabilidad y movilidad del eyaculado previo a la adición de
crioprotectores.
Mengden et al en 1980, documentaron por primera vez el desarrollo exitoso de
inseminaciones artificiales en serpientes de la especie Python anchietae, para lo
cual diluyeron el semen en solución salinafisiológica. Actualmente, las
evaluaciones y el manejo del semen de ofidios, han sido principalmente
utilizando medios y diluyentes comerciales de mamíferos como Ham-F10,
Tyrode, Brackett, Beltsville Thawing Solution BTS, entre otros, los cuales han
tenido la finalidad de prolongar la vida de los espermatozoides, obteniendo un
máximo de viabilidad de 6 horas (Zacariotti et al., 2012. Fuentes Mascorro et al.,
2014. Silva et al., 2017).
8

Por lo descrito anteriormente, resulta de suma importancia contar con un medio
que brinde las condiciones adecuadas para el manejo del semen de serpientes,
principalmente de las especies que se encuentran en mayor riesgo. Esto
permitirá un avance cualitativo y cuantitativo de las biotécnicas reproductivas
que se han venido implementado desde 1908 y que manifiestan la voluntad del
hombre por desarrollarlas para garantizar el manejo de genes a favor de la
producción y la sanidad de los animales domésticos, y de aquellos en vías de
extinción, con el fin de ampliar la gama de conocimientos, que tienden a mejorar
la calidad de vida de los seres que residimos en este sitio al que llamamos Tierra.
(Ugalde, 2014).

3. ANTECEDENTES

3.1. Taxonomía y características de la familia Colubridae.
La clasificación taxonómica de los grupos mayores de reptiles ha causado diversos
debates, debido a esto se ha propuesto no asignarles categoría linneana, por lo
tanto, los grupos que se reconocen son Testudines o Chelonia (tortugas),
Lepidosauria (tuataras, anfisbenias, lagartijas, serpientes), Archosauria (cocodrilos,
aves y otros grupos fósiles) (Flores Villela et al., 2013).
México es uno de los países más diversos en reptiles, hasta octubre de 2013,
existían 864 especies descritas en 159 géneros y 40 familias; éstas representan el
8.7% de los reptiles del mundo. De las 864 especies en México, 417 son lagartijas,
393 serpientes, 48 tortugas, 3 anfisbénidos (culebrillas ciegas) y 3 cocodrilos. El
estado de Oaxaca es el más diverso ya que cuenta con 262 especies de reptiles,
seguido de Chiapas con 220 y Veracruz con 200 (Flores Villela et al., 2013).
Existen 15 familias de serpientes reconocidas, con aproximadamente 450 géneros
(Powell, 2016), se encuentran en casi todos los hábitats y continentes excepto la
Antártida, con aproximadamente 3,150 especies y forman un grupo monofilético
(Burbrink et al., 2011).
Las serpientes presentan fenotípicamente una forma alargada, esto gracias al
número de vertebras, las cuales pueden ir de 120 a 500, al igual que los lagartos
cuentan con escamas ventrales que van desde la cabeza hasta la punta de la cola,
los machos cuentan con genitales simples o bilobulados, estos últimos
denominados hemipenes (Burbrink et al., 2011).
Dentro de los grupos de serpientes, la familia Colubridae es la más rica y abundante
en especies, en ellas se incluye a la serpiente Pituophis deppei deppei. Los
integrantes de esta familia se caracterizan por poseer adaptaciones avanzadas en
el techo de la boca para retener a su presa, la ausencia de la arteria carótida
derecha y un patrón único en las arterias intercostales (Scanlon et al., 2011).

3.2. Pituophis deppei deppei.
Las serpientes del género Pituophis se componen por cuatro especies: Pituophis
catenifer, Pituophis deppei, Pituophis melanolecus, y Pituophis lineaticollis
(CONABIO, 2013). De igual forma Pituophis deppei se compone por dos
10

subespecies, Pituophis deppei jani (Cope, 1860) y Pituophis deppei deppei (Figura
1). La ubicación taxonómica de Pituophis deppei deppei es la siguiente:
Reino: ANIMALIA
Phylum: CHORDATA

Clase: REPTILIA
Orden: SERPENTES
Familia: COLUBRIDAE
Género: Pituophis
Epíteto específico: deppei
Nombre científico: Pituophis deppei
(Duméril, 1853).

Figura 1 Pituophis deppei deppei macho.
La especie Cincuate (Pituophis deppei) es endémica de México por lo que se puede
encontrar dentro de los estados de Aguascalientes, Chihuahua, Coahuila, Ciudad
de México, Durango, Guanajuato, Hidalgo, Jalisco, México, Michoacán, Nuevo
León, Oaxaca, Puebla, San Luis Potosí, Querétaro, Veracruz, y Zacatecas, esta
distribución comprende a las serranías de la parte centro norte del país de 1,524 a
2,438.4 msnm (Ramírez y Hernández, 2004), donde predominan ecosistemas
correspondientes a bosques de pino y desierto alto, de forma esporádica se ha
encontrado en el valle de la ciudad de México y en zonas agrícolas dedicadas al
cultivo del maíz (Reyes y Rubio, 2009). Se sabe que llegan a vivir de 13 a 20 años
11

(Reyes y Rubio, 2009) y su alimentación se basa principalmente en roedores, crías
de conejos, aves, y lagartijas (Ramírez y Hernández, 2004).
El cincuate se encuentra catalogado como especie amenazada, según la NOM-059-
SEMARNAT-2010, debido a la destrucción del hábitat, principalmente por
deforestación, urbanización creciente, cambio de uso de suelo por actividades
agrícolas y ganaderas en sus áreas de distribución. Asimismo, la especie se
encuentra involucrada en comercio ilegal como mascota, para su uso con fines
medicinales o de rituales, aunado a esto es perseguida y aniquilada debido a que
se le atribuyen cualidades míticas y por ser considerada como amenaza para aves
de corral (Ramírez y Hernández, 2004).
Morfológicamente Pituophis deppei se caracteriza por una cabeza semipuntiaguda,
robusta y relativamente grande con una longitud hocico a cloaca de 936.6 ± 161.0
mm y una longitud caudal promedio de 143.2 ± 23.6 mm (1,079mm de longitud total
promedio), las hembras son aproximadamente del mismo tamaño que los machos,
por lo que el dimorfismo sexual es muy subjetivo, ambos poseen una coloración
dorsal amarillo pálido con manchas que van de café a negro, las escamas de la
cabeza son grandes y lisas, están dispuestas dos prefrontales y ocho supra labiales
con la cuarta y quinta dentro de la órbita. En el cuerpo presentan escamas quilladas,
las escamas laterales son lisas y se ordenan en hileras longitudinales paralelas,
tienen 27 en la región anterior, 29 en la región media y 21 en la preanal. En la parte
ventral presentan un número de escamas que va de 211 a 226, las escamas
subcaudales son 60 en promedio (Ramírez y Hernández, 2004).
3.2.1. Aspectos reproductivos de Pituophis deppei deppei en vida libre y
cautiverio.
Pituophis deppei deppei es una especie ovípara, se sabe que en vida libre las
hembras ponen sus huevos en verano (junio-agosto), efectuando la incubación
durante el otoño (septiembre- noviembre). En vida libre los tamaños de puesta son
en promedio de 18 huevos y son ovipositados durante la estación reproductiva que
va de julio a septiembre (Ramírez y Hernández, 2004). Por otra parte, Reyes y Rubio
en el 2009, informaron que en cautiverio las serpientes Pituophis d. deppei iniciaron
su actividad reproductiva a finales del invierno, observando un pico en el mes de
marzo, para posteriormente disminuir durante el mes de abril, esta actividad no tuvo
correlación con la temperatura ni con la humedad y solo se observaron cópulas en
marzo, de las cuales se obtuvieron 2 puestas una en dicho mes y otra en mayo, en
el segundo caso fueron huevos infértiles, asimismo mencionaron un periodo de
incubación aproximado de 3 meses con una puesta promedio de 7.5 huevos y un
peso promedio de 19.63 gr por huevo.
12

3.2.2 Cortejo
El cortejo en cautiverio inicia cuando el macho comienza a perseguir a la hembra
alrededor de todo el encierro, posteriormente comienza a reptar por encima del
cuerpo de la hembra con movimientos lentos al principio, siguiéndola y llegando a
realizar movimientos bruscos, esto va acompañado por pequeños golpes con la
barbilla a lo largo de su cuerpo, tratando de llegar a la cabeza, ocasionalmente el
macho levanta la cola mostrando los hemipenes para tratar de introducirlos en la
cloaca de la hembra (Reyes y Rubio, 2009b).

3.3.Antecedentes reproductivos en serpientes.
El epitelio seminífero de las serpientes ha sido estudiado ultraestructuralmente en
múltiples ocasiones, tal es el caso del trabajo publicado por Hondo et al. en 1997,
en el cual describen el epitelio de la serpiente japonesa Elaphe climacophora
mediante el uso de un microscopio electrónico, para ello realizaron una perfusión
post mortem en la aorta abdominal con solución salina fisiológica y 4% de
paraformaldehido en PBS con un pH de 7.4, esto para obtener los testículos; dicho
estudio comprendió un año, en el cual la mayor actividad espermatogénica se
observó en los meses de agosto, septiembre y octubre. En otro estudio realizado
sobre el epitelio seminífero de las serpientes fue posible observar las células de
Leydig, estas muestran un ciclo de acumulación de lípidos que ha sido descrito en
algunas serpientes de climas templados, este ciclo consiste en la acumulación de
lípidos en el citoplasma de las células durante los periodos de espermatogénesis
inactiva y por el contrario en los periodos de espermatogénesis activa dichas
inclusiones lipídicas se encuentran ausentes y aparecen en forma granular, esto
indica que estas células utilizan los lípidos conforme la espermatogénesis progresa,
esto posiblemente para la síntesis de esteroides que se requieren para la
espermatogénesis de los reptiles (Gribbins y Rheubert., 2011).
El proceso de espermatogénesis en serpientes ha sido descrito en múltiples
ocasiones, comenzando en 1922 con el trabajo realizado por Thatcher en la especie
Thamnophis butleri, en el cual utilizó como fijador de los testículos soluciones de
Flemming con urea mezclando por 24 horas a temperatura ambiente y en
refrigeración, posteriormente seccionó el material con cortes de 6 micras, utilizando
la tinción hematoxilina férrica de Heidenhain, en dicho estudio encontró 37
cromosomas en la placa ecuatorial de las espermatogonias. En 1944 Volsoe
describe con mayor detalle el ciclo completo de espermatogénesis en Vipera berus
y realiza la primera descripción anatómica completa de los órganos reproductivos
13

de una serpiente (Göran, 2011). La espermatogénesis en las serpientes es
altamente estacional, existen dos tipos de ciclos, en el primero se producen
espermatozoides después del apareamiento (postnupcial) y en el segundo se
producen antes de este (prenupcial). No está claro si las células germinales entran
en el ciclo celular espermatogénico continuamente durante la etapa reproductiva
como en mamíferos y aves o si la espermatogénesis es solo un episodio como en
los anamniotas (Gribbins y Rheubert., 2011. Licht, 1984).
En la siguiente imagen (Figura 2) se muestran los diferentes tipos celulares
encontrados en el epitelio seminífero de una serpiente (Seminatrix pygaea) durante
todos los meses del año.

Figura 2 Tipos celulares en el epitelio seminífero de Seminatrix pygaea en el transcurso del año.
Espermatogonias tipo A (SpA) espermatogonias tipo B (SpB), espermatocitos preleptotenos (PL),
espermatocitos leptotenos (LP), espermatocitos zigoteno (ZY), espermatocitos paquiteno (PA),
espermatocito diploteno (DI), meiosis 1 (M1), espermatocitos secundarios (SS), meiosis 2 (M2),
espermátide etapa 1 (S1), espermátide etapa 2 (S2), espermátide etapa 3 (S3), (flecha negra dentro
de la célula: Gránulo acrosomal), espermátide etapa 4 (S4) (flecha negra dentro de la célula: gránulo
acrsomal), espermátide etapa 5 (S5), espermátide etapa 6 (S6) (punta de flecha negra: extensión
apical con acrosoma), espermátide etapa 7 (S7), espermatozoides maduros (MS) Tomado de:
Gribbins y Rheubert,. 2011.

Furieri en 1965 describe por primera vez las características ultraestructurales de un
espermatozoide de ofidio (Vipera aspis) de la familia Viperidae. A partir de este
estudio se han descrito morfológicamente los espermatozoides de las familias
Colubridae, Elapidae, Boidae, Leptotyphlopidae, Typhlopidae y Anomalepididae
(Gribbins y Rheubert., 2011). En 2008 Tavares publicó un artículo en el cual
describe detalladamente las ultraestructuras de espermatozoides de tres tipos de
boas, obteniendo los testículos y los
epidídimos post mortem; en dicho
estudio se muestra que los gametos
masculinos de las tres especies son
filiformes y cuentan con 3 regiones,
cabeza (con núcleo y complejo del
acrosoma), pieza intermedia y cola
(subdividida en dos), además
observaron diferentes membaras
multilaminares y microtubulos
extracelulares cerca de la membrana
plasmática de los espermatozoides, en
este estudio sugieren una gran
concordancia entre la ultraestructura y
los caracteres anatómicos
macroscópicos de los
espermatozoides. (Tavares et al.,
2008).
Los espermatozoides de las serpientes
son filiformes, la vesícula acrosómica
colapsada cubre un espacio
subacrosómico cónico e invierte el
ápice nuclear cónico, la pieza media
tiene una vaina fibrosa y cuerpos
densos dentro de sus capas
mitocondriales concéntricas (Figura
3). Complejo del acrosoma: Es una
estructura alargada que posee las
proteínas y enzimas necesarias para la degradación de las capas extracelulares del
ovocito durante la fertilización, tiene forma de cono en la parte apical de los
espermatozoides. La vesícula acrosómica forma parte de este complejo del
acrosoma, se localiza sobre el cono subacrosomal y es una vaina que se estrecha
progresivamente alrededor de dicho cono y puede dividirse en una corteza estrecha
y una medula ancha (Figura 3). (Simon et al., 1996).
Figura 3. Estructura de espermatozoide de reptil
(Pogona barbata). Adaptado de: Simon et al,
1996.

A pesar de los estudios realizados sobre las estructuras de los espermatozoides de
serpientes, en la actualidad existen pocos trabajos sobre criopreservación y no hay
protocolos eficientes para la evaluación del semen, refrigeración o congelación
(Zacarotti et al., 2012), sin embargo, en 1980 Mengden et al publicaron un trabajo
en el cual describen una técnica de inseminación artificial en serpientes, detallando
el modo de obtención de las muestras de semen por masaje, así como el
procedimiento completo desde la limpieza hasta la inseminación. En dicho estudio
se obtuvieron eclosiones, resultado de la inseminación artificial utilizando solución
salina fisiológica como diluyente. Este trabajo fue muy importante ya que
implementaron un método eficiente para la obtención de los espermatozoides de
ofidios antemortem.
Otros métodos de obtención de muestras seminales han sido realizados post
mortem en épocas recientes, por ejemplo, en 2009 Tourmente et al. evaluaron la
relación de la competencia espermática con el tamaño de las estructuras de los
espermatozoides de diferentes serpientes obteniendo las muestras post mortem de
los conductos deferentes y por medio de cirugía, en este trabajo concluyen que
dicha competencia espermática difiere entre taxones ya que los aumentos en el
tamaño de la pieza intermedia de los espermatozoides darían como resultado más
energía, así como una mayor fuerza de propulsión.

3.3.1 Aspectos anatómicos de serpientes macho
Testículos de serpientes:
A diferencia de la mayoría de mamíferos, anatómicamente los testículos de las
serpientes y otros reptiles son intraabdominales, éstos se desarrollan
embriológicamente en estrecha relación con los riñones, son alargados y cilíndricos.
Cada testículo está cubierto por una fina túnica albugínea fibrosa y se mantienen
unidos a la pared del cuerpo, la túnica tiene una anchura aproximada de 3-10 µm y
debido a esto el testículo es frágil y suave al tacto. En los meses con mayor
espermatogénesis, los testículos pueden duplicar fácilmente su tamaño,
desencadenando un efecto intratesticular que empuja la túnica albugínea y produce
mayor firmeza. Los túbulos seminíferos de las serpientes se localizan por debajo de
la capa de tejido conectivo; éstos forman una masa apretada rodeada por una túnica
albugínea, estos túbulos continúan conlos conductos anteriores y los
espermatozoides maduros son vaciados desde los túbulos seminíferos hasta los
ductos eferentes y posteriormente son drenados hacia los epidídimos donde
residirán hasta la eyaculación (Figuras 4 y 5) (Gribbins y Rheubert., 2011).
16

Figura 4. Disposición anatómica de una serpiente macho. (Tomado de Gribbins y Rheubert, 2011).

Figura 5. Túbulos seminíferos de serpiente (ST). A= testículo de serpiente. B= Imagen amplificada
(Tomado de Gribbins y Rheubert, 2011).

3.3.2 Principales diluyentes utilizados en semen de serpientes
En la actualidad existe poca información sobre los métodos de recolección de
semen, evaluación espermática e inseminación artificial en serpientes. (Silva et al.,
2017) De igual forma existe escasa información sobre los diluyentes de semen de
serpientes que puedan resultar idóneos, a pesar de esto, se han probado diferentes
medios y sustancias en diferentes trabajos, algunos de ellos se mencionan a
continuación:
En 2012, Zacarotti et al. describieron protocolos de congelación en los que
emplearon diferentes técnicas, las muestras las obtuvieron mediante masaje ventral
y utilizaron como diluyente Ham-F10 para evaluar la movilidad inicial y post
descongelamiento, se utilizó una escala de 1-5 siendo 5 el más alto, una parte de
las muestras fueron diluidas adicionalmente utilizando Lake con 2 o 4% de sulfóxido
de dimetilo y la otra parte con prolongador Test- Yolk con glicerol al 4%, 8% y 10%
antes de enfriar a 4°C. Las muestras congeladas con el extensor de Lake no
presentaron movilidad post congelación independientemente de la concentración de
dimetilsulfóxido, el semen congelado con Test- Yolk y glicerol al 8% presentó la
mayor movilidad post descongelación (Zacarotti et al., 2012).
También en el 2011, Tourmente et al utilizaron solución salina tamponada con
fosfato como diluyente de semen de dos tipos de serpientes (Boa constrictor
occidentalis y Waglerophis merremi) para analizar el efecto de diferentes
temperaturas (25, 30 y 37°C) en los espermatozoides, demostrando que, a pesar
de tener un impacto negativo al aumentar las temperaturas, existe una diferencia en
la sensibilidad de las dos especies debido a la diferencia que se presenta en sus
temporadas reproductivas.
Fuentes Mascorro et al., en 2014, realizaron diluciones de semen de serpientes del
genero Crotalus, como método de conservación a 28°C (temperatura cloacal), en
dicho estudio utilizaron diluyentes comerciales, Tyrode modificado, Tyrode®,
Magapor®, MRA® y Brackett, alcanzando un máximo de 6 horas con movilidad en
las muestras diluidas con Tyrode modificado.
Moshiri et al, (2014) realizaron la caracterización de serpientes macho adultas de la
especie Vipera albicornuta y evaluó parámetros reproductivos de muestras de
semen de 20 ejemplares, colectando las muestras en septiembre y octubre del año
2010. Las muestras fueron obtenidas de los conductos deferentes y los testículos
después de la eutanasia, sumergiendolos en 1ml de PBS (solución salina
tamponada con fosfato). La evaluación de la movilidad se realizó a una temperatura
de 26 a 27°C, alcanzando un tiempo de 6.00 ± 2.00 horas de viabilidad espermática.
18

Friesen et al 2014, analizaron la variación intrapoblacional y la calidad del eyaculado
de serpientes Thamnophis sirtalis parietalis, obteniendo los espermatozoides de los
tapones en la hembra después de la cópula, utilizando medio Ham F-10 modificado
como diluyente, en dicho estudio encontró que en copulas sucesivas el número de
espermatozoides disminuía, encontrando hasta 5.8 veces más espermatozoides en
promedio en la primer copula con relación a la segunda.
En 2017, Silva et al, obtuvieron semen de 6 serpientes de la especie Erythrolamprus
poecilogyrus mediante recuperación post mortem para describir su evaluación in
vitro, dicho semen fue diluido en 1ml de (BTS) Beltsville Thawing Solution,
encontrando una movilidad máxima de 90%, una mínima de 70% y una viabilidad
máxima y mínima de 92 y 67% respectivamente, además evaluó la integridad de las
membranas mediante pruebas de fluorescencia, refiriendo un promedio de 84% de
membranas intactas en los espermatozoides móviles y una concentración
espermática promedio de 330,000 células/ml.

3.4. Usos y características del agua de coco como diluyente
El agua de coco (Cocos nucifera L) es la fracción liquida del endospermo de esta
semilla, ha sido utilizado como una bebida a lo largo del tiempo por su contenido
nutricional, el cual consta de 2 a 5% de materia seca que comprende principalmente
a azúcares y minerales. Los principales criterios de calidad para su cultivo son el
porcentaje de agua, los sólidos totales solubles y los azúcares totales por semilla.
Con base en estos criterios las variedades enanas son las preferidas para su cultivo.
No debe confundirse al agua de coco con la leche de coco ya que esta última es el
líquido aceitoso extraído del coco fresco rallado (Prades et al., 2012).
La semilla de coco tarda entre 11 y 12 meses para alcanzar su madurez (Figura 6),
existen 3 variedades, alto (allogamous), enano (autogamous) e híbrido (Prades et
al., 2012).

Figura 6. Etapas de crecimiento de un coco (Cocos nucifera L) de 3 a 13 meses. (Tomado de: Prades
et al., 2012).
19

La osmolaridad del agua de coco es de 300 mOsm/L aproximadamente y tiene un
pH de 5.1 a 6.1. Los principales nutrientes que componen el agua de coco son:
sacarosa, azúcares reducidos, glucosa, fructosa, proteínas, grasas, potasio, cloro,
azufre, calcio, sodio, magnesio, fósforo, manganeso, aluminio, cinc, hierro, cobre,
vitaminas del complejo B y vitamina C. Los azúcares son la fracción principal de los
sólidos presentes. En el agua de coco maduro se encuentran en mayor cantidad,
sacarosa, sorbitol, glucosa y fructosa, seguido por azúcares menores, incluyendo
galactosa, xilosa y manosa (Prades et al., 2012).
Algunas de las diferencias entre los minerales de un coco maduro y uno inmaduro,
se deben a la proporción existente de potasio, cloro, hierro, cobre, sodio y azufre,
no obstante, la principal diferencia es el porcentaje de agua, ya que a medida que
el coco madura hay un aumento en la retención de agua, hasta que el núcleo
comienza a formar una jalea dentro de la cavidad, luego el volumen de agua decrece
a medida que se utiliza por el grano para formar el núcleo (Prades et al., 2012).
Se estima que el 40% de la investigación del agua de coco se centra en técnicas de
preservación de semen. Al ser un líquido estéril y gracias a sus propiedades, fue
utilizada en la segunda guerra mundial como terapia de líquidos endovenosos. En
la actualidad, entre otras cosas, se utiliza como medio de cultivo de bacterias y
plantas (Prades et al., 2012). Otro uso que se ha dado al agua de coco es en
medicina veterinaria como diluyente de semen de diferentes especies,
principalmente en ovinos (Cano y Cuéllar, 2014; Gutiérrez et al., 2006), perros
(Uchoa et al., 2012), conejos (Trejo et al., 2013), cerdos (Josie, 2016) e incluso en
abejas (Rosana y Ademilson, 2002). No obstante, estudios utilizando agua de coco
como diluyente, no han sido reportados en serpientes u otros reptiles.
En 2014 Cano y Cuéllar, realizaron un estudio en el que utilizaron 50% de agua de
coco maduro con 50% de citrato de sodio al 2.5% como diluyente, con el objetivo
de encontrar una técnica de inseminación artificial en ovinos que aportara altos
porcentajes de fertilidad y que fuera económica y práctica. En este estudio
obtuvieron porcentajes de fertilidad de 25% y 63% con las técnicas de inseminación
vía transcervical e intrauterina respectivamente, utilizando el agua de coco como un
diluyente habitual.
Trejo et al, en 2013, compararon el uso de agua de coco como diluyente de semen
de conejos y el medio Brackett-Oliphant (MBO), haciendo diluciones 1:1, con la
finalidad de evaluar el efecto que tuvieron en la movilidad y la viabilidadespermática. Una vez obtenido y diluido el semen lo resguardaron a 4°C para su
posterior evaluación, estos autores obtuvieron como resultado una fertilidad de 88%
con agua de coco (8.89 gazapos obtenidos), mientras que con MBO obtuvieron 80%
(7.44 gazapos).
20

Como se mencionó con anterioridad el agua de coco ha sido utilizada como
diluyente de semen en abejas, en dicho estudio se utilizó agua de coco inmaduro
mezclada con el antibiótico dihidroestreptomicina y un medio de cultivo comercial,
en el estudio analizaron la movilidad espermática después de 1, 2, 5, 10, 15, 30, 50,
80 y 120 días, obteniendo como resultado espermatozoides vivos hasta el día 80,
además realizaron inseminaciones artificiales, reportando crías viables con semen
almacenado hasta 15 días (Rosana y Ademilson, 2002).

4. OBJETIVO
Comparar el uso de agua de coco con solución salina fisiológica y determinar si
mejora las condiciones como diluyente de semen refrigerado de la especie Pituophis
deppei deppei.

5. HIPÓTESIS
El uso de agua de coco como diluyente de semen de serpientes de la especie
Pituophis deppei deppei brinda un medio que puede mantener la viabilidad
espermática en condiciones de refrigeración.

6. MATERIAL Y MÉTODOS

6.1. Ejemplares.
Para este trabajo se emplearon 8 ejemplares de la especie Pituophis deppei deppei
a resguardo del Laboratorio de Herpetología de la Facultad de Estudios Superiores
Iztacala, UNAM en la Ciudad de México.
Los ejemplares muestreados se encontraban en edad reproductiva, además de
presentar buen estado de salud al momento del examen físico general y la revisión
de su historial clínico. El uso de los mismos fue aprobado por el Comité Interno para
el Cuidado y Uso de los Animales (CICUA) de la Facultad de Medicina Veterinaria
y Zootecnia de la UNAM.
De las serpientes muestreadas se obtuvieron las siguientes morfometrías una vez,
previo al primer muestreo: peso (gr), longitud total (mm), alto cloacal (mm), ancho
cloacal (mm), alto y ancho en la región media (mm). Lo anterior con la finalidad de
corroborar una correlación con la edad reproductiva reportada por otros autores.

6.2. Condiciones de alojamiento y medioambientales de los ejemplares.
En el laboratorio de herpetología de la FES Iztacala los ejemplares se encontraban
alojados por separado en cajas de policarbonato con las siguientes medidas: Alto
41cm, ancho 37cm y largo 57cm. Cada recipiente se encontraba identificado con el
número de ejemplar.
Los ejemplares eran alimentados con crías de ratón una vez a la semana,
ofreciendo a cada uno el 10% de su peso.
Se realizó el registro de la temperatura ambiental, utilizando un termómetro de
mercurio previo a cada muestreo, asimismo se registró la humedad relativa en el
laboratorio de herpetología utilizando un higrómetro.

6.3. Extracción de semen.
Se realizaron 4 colectas en las siguientes fechas: 18/03/2016 (muestreo 1),
08/04/2016 (muestreo 2), 26/07/2016 (muestreo 3) y 12/08/2016 (muestreo 4), con
la finalidad de obtener información correspondiente a las estaciones de primavera
(marzo y abril) y verano (julio y agosto).
23

La extracción de semen se realizó tomando como base la técnica de masaje descrita
por Mengden G. A et al., en 1980, la cual consiste en realizar ligeros movimientos
con los pulgares en la región ventral a la altura de los epidídimos cerca de la cloaca,
en dirección de craneal a caudal a ésta, como se muestra en la siguiente imagen
(Figura 7) y sin necesidad de evertir los hemipenes para la obtención. Durante la
contención física de los ejemplares se introdujo la porción rostral de las serpientes
en un tubo de acrílico para facilitar el manejo.

Figura 7. Masaje ventral y colecta de semen con micropipeta. En la imagen se muestra el masaje
ventral realizado en el presente trabajo para la obtención de semen en Pituophis deppei deppei
basado en la técnica descrita por Mengden et al., 1980.
La modificación de dicha técnica consistió en usar micropipetas Eppendorf® de 10
µl para la colecta y cuantificación de la muestra obtenida (Figura 7), esto se realizó
depositando las fracciones del eyaculado en cuadros de Parafilm® para
homogenizar la muestra y evitar pérdidas en el volumen del eyaculado (Figura 8),
dado que la porosidad de otros materiales, podrían disminuir el volumen de muestra.
Otra modificación fue la ausencia de un lavado de la cloaca con solución salina,
para no afectar el volumen y movilidad de los espermatozoides de la muestra
obtenida, en cambio se realizó una ligera limpieza con una gasa estéril en la parte
externa de la cloaca.

Figura 8. Colecta de las muestras en cuadros de Parafilm®. En la imagen se aprecia la colecta de
las muestras para determinar el volumen de las mismas y continuar con las diluciones.
6.4. Diseño experimental
Para evaluar la movilidad y alteraciones morfológicas se empleó un diseño de
bloques al azar, donde el bloque fue el individuo y los tratamientos fueron agua de
coco maduro filtrada y como grupo control solución salina fisiológica inyectable al
0.9%.
6.4.1 Determinación de volumen y evaluación de la movilidad espermática.
Una vez obtenida y homogenizada la muestra en los cuadros de Parafilm® se hizo
la determinación del volumen, fraccionando el eyaculado en cantidades de 3 a 5 µl
y de ser necesario se ajustó a menor volumen la micropipeta para determinar con
mayor exactitud el volumen obtenido.
Luego de cuantificar el volumen de la muestra obtenida, se realizó la evaluación de
la movilidad espermática tomado 1 µl de cada muestra y colocándola en laminillas
con un cubreobjetos. Las muestras fueron evaluadas en una escala de 0 a 100% de
movilidad y se determinó la progresividad (no progresiva, progresiva lenta y
progresiva rápida) de las mismas; lo anterior con base en una visualización subjetiva
y se determinó en algunos casos la ausencia de espermatozoides en la muestra
obtenida.
Del total de cada muestra obtenida y cuantificada se tomaron 2.5 µl de semen y
47.5 µl del diluyente correspondiente para realizar una dilución 1:20, esto debido al
bajo volumen obtenido en un eyaculado y para garantizar que la muestra fuera
suficiente para realizar las evaluaciones posteriores. En algunos casos el volumen
25

de las muestras obtenidas fue muy bajo y se utilizaron cantidades de semen
menores, manteniendo diluciones de 1:20.
El agua de coco fue obtenida directamente de los cocos refrigerados y
posteriormente filtrada utilizando microfiltros Acrodisc® de 25mm (w/0.2µm HT
Truffryn®) para evitar contaminación; esto se realizó previo a cada muestreo.
6.4.2 Concentración espermática y morfología.
Luego de realizar las diluciones se hizo la evaluación morfológica inicial de las
muestras, colocando en una laminilla 5 µl de la dilución de cada muestra y se realizó
una tinción eosina-nigrosina de cada dilución para posteriormente observar y
cuantificar las anormalidades totales y la madurez espermática; esta última de
manera indirecta a través de visualizar la presencia de gotas citoplasmáticas,
finalmente determinar el porcentaje de viabilidad de cada muestra con base en el
manual de laboratorio para la evaluación y procesamiento de semen humano (WHO,
2010).
Luego de la obtención, dilución y evaluación de las muestras obtenidas, estas fueron
llevadas al refrigerador (4°C) en sus respectivos microtubos de 1.5ml cada uno.
Una vez obtenidas, diluidas y refrigeradas las muestras, se hizo el conteo
espermático con una cámara de Neubauer, con base en el manual de laboratorio
(WHO, 2010).
Con la finalidad de determinar la viabilidad de los espermatozoides con el paso del
tiempo, las muestras refrigeradas fueron evaluadas cada 24 horas, tomando 5µl y
siguiendo la misma metodología empleada en la evaluación de movilidad inicial
tomando las siguientes consideraciones, las laminillas y cubre objetos eran
atemperados a 4°C, durante unperiodo de 10 minutos previo a la evaluación,
además de realizar una homogenización de la muestra con ayuda de una
micropipeta, una vez colocada la muestra en las laminillas éstas fueron llevadas en
un lapso de 5 min a la temperatura ambiente del laboratorio (18 °C) previo a cada
evaluación.. Una vez que las muestras mostraron ausencia de movilidad estas
fueron teñidas para evaluar la morfología final, siguiendo la misma metodología que
en la evaluación morfológica inicial.
6.4.3 Análisis estadístico.
Análisis exploratorio de datos: en este análisis se obtuvo el promedio de los datos
de la morfometría, de los ejemplares, así como su desviación estándar. Se obtuvo
el promedio del volumen de las muestras de cada día de colecta. Para la
concentración espermática y las anormalidades totales se realizó un promedio de
cada muestreo y de la época con su respectiva desviación estándar.
26

Con el promedio de la movilidad se elaboraron gráficas para observar las tendencias
que hay después de la dilución y por época del año.
Para evaluar las diferencias en el efecto de los tratamientos con agua de coco y
solución salina fisiológica sobre la movilidad, se utilizó la prueba no paramétrica U
de Mann-Whitney.
27

7. RESULTADOS.
7.1. Morfometría de los ejemplares y condiciones de alojamiento.
El peso promedio de los ocho ejemplares del presente trabajo fue de 691.8g,
siendo1,146g el peso más alto registrado y 434g el menor (Cuadro 1).
La longitud total promedio de los ejemplares fue de 153.8cm, el ejemplar con mayor
longitud total fue de 197cm y el de menor fue de 131cm.
El promedio de la altura y ancho en la región cloacal fue de 16.55mm y 13.81mm
respectivamente, el ejemplar con mayor altura cloacal fue de 19.4mm mientras que
el menor fue de 14mm, el mayor ancho de dicha región fue de 17.1mm y el menor
fue de 10.8mm.
La altura en la región media fue en promedio de 31mm, registrándose 35.4mm como
máximo y 26.3mm como mínimo. El ancho de la región media fue en promedio de
29.2mm, con 32.6 como máximo y 21.2mm como mínimo.
La humedad promedio en el laboratorio de herpetología fue la siguiente para cada
mes: marzo 58%, abril 49%, julio 70% y agosto 67%.
La temperatura promedio para cada mes en el laboratorio fue la siguiente: marzo
32°C, abril 28°C, julio 27°C y agosto 26°C.
Cuadro 1. MORFOMETRÍA DE LOS EJEMPLARES DEL PRESENTE
TRABAJO.

ID de
Ejemplar

Peso
(g)

Longitud
total (cm)
Altura de
la región
cloacal
(mm)
Ancho de
la región
cloacal
(mm)
Altura de
la región
media
(mm)
Ancho de
la región
media
(mm)
1 434 134 15 11.4 31 31.8
2 823 170 16.4 13.8 31.2 31.7
3 600 136 14 12.6 26.3 21.2
4 628 142 18.5 17.1 30.9 31.9
5 706 157 16.5 15.4 29.3 28.5
6 716 164 17.3 14.9 33 27.7
7 1146 197 19.4 14.5 35.4 32.6
8 482 131 13.5 11.2 23 23
± S 691.8 ± 208.3 153.8 ± 21.2 16.3 ± 1.9 13.8 ± 1.9 30.0 ± 3.6 28.5 ± 4.0
.

7.2. Volumen de las muestras obtenidas.
Se obtuvo un total de 18 muestras viables para el presente estudio. En el muestreo
1 realizado en marzo se obtuvo un total de 6 muestras de semen de diferentes
ejemplares con presencia de espermatozoides móviles, el volumen mínimo obtenido
en dicho muestreo fue de 6µl, mientras que el mayor fue de 25µl con un promedio
de 14.5µl (Cuadro 2).
En el muestreo 2 correspondiente al mes de abril se obtuvo un total de 5 muestras
de semen de diferentes ejemplares con presencia de espermatozoides móviles, el
volumen mínimo obtenido en dicho muestreo fue de 10µl, mientras que el mayor fue
de 25µl con un promedio de 17.6µl (Cuadro 2).
En el muestreo del mes de julio se obtuvo un total de 3 muestras de semen de
diferentes ejemplares con presencia de espermatozoides móviles, el volumen
mínimo obtenido en dicho muestreo fue de 6µl, mientras que el mayor fue de 14.5µl
con un promedio de 9.5µl (Cuadro 2).
En el muestreo realizado en agosto se obtuvo un total de 4 muestras de semen de
diferentes ejemplares con presencia de espermatozoides móviles, el volumen
mínimo obtenido en dicho muestreo fue de 2µl, mientras que el mayor fue de 9.5µl
con un promedio de 6.7µl (Cuadro 2).
Se registró un volumen total promedio de muestra obtenida en primavera (marzo y
abril) de 15.9µl, mientras que en verano (julio y agosto) se obtuvo un promedio de
7.9µl. El total de muestra con espermatozoides móviles obtenido en los cuatro
muestreos fue de 248.5µl, con un promedio por muestreo de 13µl.
Cuadro 2. VOLUMEN TOTAL DE SEMEN (µL) OBTENIDO POR EJEMPLAR EN
CADA MUESTREO (PRIMAVERA Y VERANO).

ID de ejemplar
Primavera
marzo abril
µl µl
Verano
julio agosto
µl µl
1 20 10 -- --
2 25 -- 14.5 2
3 6 -- -- --
4 -- -- -- --
5 14 19 -- --
6 12 25 6 7
7 -- 24 8 8.5
8 10 10 -- 9.5
Total de muestras obtenidas 6 5 3 4
Total de muestras obtenidas por época 11 7

7.3. Movilidad espermática en solución salina fisiológica (SSF) y en agua de
coco (ACOC).
En el muestreo realizado en marzo se colectaron muestras de 6 ejemplares, las
cuales se diluyeron con SSF y ACOC, una de las muestras fue insuficiente por lo
que solo se diluyó con SSF.
El semen diluido en SSF correspondiente al primer muestreo (marzo) presentó una
movilidad inicial promedio de 63.3%, la muestra con mayor porcentaje de movilidad
inicial fue de 90% mientras que la menor fue de 40%. El mayor tiempo de movilidad
registrado en el primer muestreo con SSF como diluyente fue de 5 días,
presentando 1% de movilidad en una muestra hasta el día 6 (Gráfico 1).
Las muestras que fueron diluidas con agua de coco (ACOC) en el mismo muestreo
(marzo), presentaron una movilidad inicial promedio de 61.2%, la movilidad inicial
máxima fue de 95% mientras que la menor fue de 1%. Dos de las muestras diluidas
con ACOC tuvieron un tiempo máximo de movilidad de 2 días. (Gráfico 2).

Gráfico 1. Movilidad espermática en los ejemplares del primer muestreo con SSF como diluyente.

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50
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100
Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6
%
d
e
M
o
vi
lid
ad
Movilidad en el muestreo 1 (marzo) con SSF
Ejemplar 1
Ejemplar 2
Ejemplar 3
Ejemplar 5
Ejemplar 6
Ejemplar 8
30

Gráfico 2. Movilidad espermática en los ejemplares del primer muestreo con ACOC como diluyente.

En el segundo muestreo (abril) se obtuvieron seis muestras con presencia de
espermatozoides.
En las muestras de abril diluidas con SSF se obtuvo una movilidad inicial promedio
de 66%, la movilidad inicial más alta registrada con SSF fue de 85% y la más baja
fue de 20%. Una de las muestras diluidas con SSF tuvo una movilidad máxima de
7 días (Gráfico 3).
Las muestras diluidas con ACOC del mes de abril presentaron una movilidad inicial
promedio de 58.2%, la movilidad más alta de dichas muestras fue de 70% mientras
que la más baja fue de 20% (Gráfico 4).

0
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Día 0 Día 1 Día 2 Día 3
%
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vi
lid
ad
Movilidad en el muestreo 1 (marzo) con Agua de coco
Ejemplar 1
Ejemplar 2
Ejemplar 5
Ejemplar 6
Ejemplar 8
31

Gráfico 3. Movilidad espermática en los ejemplares del segundo muestreo con SSF como diluyente.

Gráfico 4. Movilidad espermática en los ejemplares del segundo muestreo con ACOC como
diluyente.

Del muestreo realizado en julio se obtuvieron 3 muestras viables. Las muestras
diluidas en SSF de dicho mes registraron una movilidad inicial promedio de 76.6%
0
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Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
%
d
e
M
o
vi
lid
ad
Movilidad en el segundo muestreo (abril) con SSF
Ejemplar 1
Ejemplar 5
Ejemplar 6
Ejemplar 7
Ejemplar 8
0
10
20
30
40
50
60
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Día 0 Día 1 Día 2 Día 3
%
d
e
M
o
vi
lid
ad
Movilidad en el segundo muestreo (abril) muestreo con
Agua de coco
Ejemplar 1
Ejemplar 5
Ejemplar 6
Ejemplar 7
Ejemplar 8
32

con una movilidad inicial máximade 80% y una mínima de 70%. Una de las
muestras se mantuvo móvil hasta el día 4 con una movilidad de 4%(Gráfico 5).
En el mismo muestreo (julio), con la dilución en ACOC, las muestras tuvieron una
movilidad inicial promedio igual a las que fueron diluidas con SSF (76.6%), así como
la movilidad inicial máxima y mínima, que fue la misma registrada para las 2
diluciones, a diferencia de las muestras diluidas con SSF, el máximo de movilidad
alcanzada con ACOC fue de 2 días (Gráfico 6).

Gráfico 5. Movilidad espermática en los ejemplares del tercer muestreo con SSF como diluyente.

Gráfico 6. Movilidad espermática en los ejemplares del tercer muestreo con ACOC como diluyente.
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Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4
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ad
Movilidad en el tercer muestreo (julio) con SSF
Ejemplar 2
Ejemplar 6
Ejemplar 7
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Día 0 Día 1 Día 2
%
d
e
M
o
vi
lid
ad
Movilidad en el tercer muestreo (julio) con Agua de coco
Ejemplar 2
Ejemplar 6
Ejemplar 7
33

En el cuarto muestreo correspondiente al mes de agosto, se obtuvieron 4 muestras
viables, la muestra del ejemplar 2 fue insuficiente para diluir en ACOC por lo que
solo se realizó la dilución en SSF (Gráfico 7 y 8).
Las muestras diluidas en SSF del mes de agosto tuvieron una movilidad inicial
promedio de 63.7%, con una movilidad inicial máxima de 90% y una mínima de
40%, en una de dichas muestras la movilidad alcanzó 5 días de movilidad (Gráfico
7).
En las muestras diluidas con ACOC la movilidad inicial promedio fue de 68.3% con
una movilidad inicial máxima de 90% y una mínima de 40%. Las muestras con
ACOC de este muestreo registraron movilidad únicamente el día de la colecta
(Gráfico 8).

Gráfico 7. Movilidad espermática en los ejemplares del cuarto muestreo con SSF como diluyente.

0
10
20
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50
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100
Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5
%
d
e
M
o
vi
lid
ad
Movilidad en el cuarto muestreo (agosto) con SSF
Ejemplar 2
Ejemplar 6
Ejemplar 7
Ejemplar 8
34

Gráfico 8. Movilidad espermática en los ejemplares del cuarto muestreo con ACOC como diluyente.
En el Gráfico 9 se pueden observar el promedio de movilidad espermática
alcanzado cada día de revisión, comparando los dos diluyentes utilizados (SSF y
ACOC). Se alcanzó un total de 7 días con movilidad utilizando SSF y un máximo de
2 con ACOC (Gráfico 10).

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Día 0 Día 1
%
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e
M
o
vi
lid
ad

Movilidad en el cuarto muestreo (agosto) con Agua de
coco
Ejemplar 6
Ejemplar 7
Ejemplar 8
35

Gráfico 9. Promedio total por día de movilidad espermática de cada muestreo con los 2 tratamientos.
Del lado derecho se pueden observar los diluyentes utilizados con cada número de muestreo. En la
parte inferior se pueden ver los días de observación de las muestras desde el inicial hasta el día 7.

Gráfico 10. Movilidad promedio alcanzada con cada diluyente por día en todos los muestreos. Del
lado derecho se pueden observar los diluyentes utilizados y en la parte inferior los días de
observación de las muestras desde el inicial hasta el día 7.
0
10
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30
40
50
60
70
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90
inicial 1 2 3 4 5 6 7
%
d
e
M
o
vi
lid
ad
Días
Movilidad espermática promedio/día de cada Muestreo y
diluyente
SSF 1
SSF 2
SSF 3
SSF 4
ACC1
ACC2
ACC3
ACC4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
inicial 1 2 3 4 5 6 7
%
M
o
vi
lid
ad
Días
Movilidad promedio de cada diluyente
SSF
ACC
36

En el Cuadro 3 se puede observar el número de ejemplares que presentaban
movilidad espermática en cada día de revisión de las muestras, así como el
diluyente empleado en cada uno.

Cuadro 3 MOVILIDAD ESPERMÁTICA PROMEDIO CON SOLUCIÓN SALINA
FISIOLÓGICA (SSF) Y AGUA DE COCO (ACOC).
Días de revisión
Inicial 1 2 3 4 5 6 7
Muestreo/Diluyente n % n % n % n % n % n % n % n %
1 SSF 6 63 6 55 6 41 6 27 3 11 2 13 1 1 - -
2 SSF 5 66 5 54 5 47 4 50 3 19 2 17 2 5 1 5
3 SSF 3 77 3 55 3 35 1 36 1 4 - - - - - -
4 SSF 4 64 4 39 3 32 2 37 2 8 1 2 - - - -
1 ACOC 5 61 2 4 2 2 - - - - - - - - - -
2 ACOC 5 58 4 14 4 7 - - - - - - - - - -
3 ACOC 3 77 3 12 2 3 - - - - - - - - - -
4 ACOC 3 68 - - - - - - - - - - - - - -
Número de ejemplares con movilidad espermática (n). Porcentaje de movilidad (%)

7.4. Prueba estadística.
Se realizó la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney para la comparación de la
variable de movilidad. En el cuadro 4 se puede observar que existe una diferencia
entre la significancia de las muestras del día inicial y los consecutivos. En el cuadro
4 se puede observar que al momento de hacer la dilución no se observaron
diferencias en la movilidad entre los tratamientos en ninguna de las épocas. Pero a
las 24 horas y 48 horas se observaron diferencias entre los dos tratamientos (P<
0.10). En las muestras diluidas con agua de coco el porcentaje descendió mucho
(hasta 68% en el primer día). De modo que a partir del tercer día ya no hubo
movilidad espermática en ninguna de las muestras con agua de coco. En el
muestreo hecho en julio, las movilidades descendieron, pero no presentaron
diferencias significativas (P=0.10), mientras que para el mes de agosto, no se pudo
hacer la comparación debido a que no se observaron movilidades al día 1 en las
muestras diluidas con coco.

Cuadro 4. PRUEBA DE U DE MANN-WHITNEY PARA LA COMPARACIÓN DE MOVILIDAD
ESPERMÁTICA DE LA ESPECIE Pituophis deppei deppei EN MUESTRAS DILUIDAS CON
SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA Y AGUA DEN COCO.

Muestreo/Tratamiento
DÍA INICIAL DÍA 1 DÍA 2

N
Movilidad
promedio
(%)

Valor
de P

N
Movilidad
promedio
(%)

Valor
de P

N
Movilidad
promedio
(%)

Valor
de P

marzo
SSF

6 63
0.662
6 55
0.004
6 41
0.071 ACOC

5 61 2 4 2 2

abril
SSF

5 66
0.222
5 54
0.016
5 47
0.032 ACOC

5 58 4 14 4 7

julio
SSF

3 77
1.000
3 55
0.100
3 35
0.100 ACOC

3 77 3 12 2 3

agosto
SSF

4 64
1.000
4 39
N/C
3 32
N/C ACOC

3 68 - - - -
N/C= No calculable, ya que las muestras de uno de los tratamientos carecían de movilidad.

7.5. Concentración espermática.
En los conteos realizados con la cámara de Neubauer la concentración espermática
de cada muestreo fue la siguiente: En las muestras correspondientes al mes de
marzo la mayor concentración fue de 725 x 106 /ml, la concentración menor fue de
90 x 106 /ml y el promedio de las muestras de dicho mes fue 275.8 x 106 /ml.
En las muestras del mes de abril la mayor concentración espermática registrada fue
de 4890 x 106 /ml, la menor fue de 600 x 106 /ml y el promedio fue 1924.9 x 106 /ml.
En el mes de julio las muestras obtenidas presentaron una concentración máxima
de 39.2 x 106 /ml, la menor fue de 12.8 x 106 /ml y el promedio de las muestras de
dicho mes fue 27.6 x 106 /ml.
Por último, en las muestras obtenidas en el mes de agosto la concentración más
alta fue de 54.9 x 106 /ml, la más baja fue de 1.9 x 106 /ml y el promedio fue de 24.1
x 106 /ml (Cuadro 5).
38

Cuadro 5. CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA MEDIA (X106) OBTENIDA POR
MUESTREO.

Época

Muestreo
Concentración
espermática media
x 106 ± S

Concentración
espermática media x 106
± S por época

Primavera 1 marzo 275.8 ± 226.9

1025.4 ± 1381.9
2 abril 1924.9 ± 1630

Verano
3 julio 27.6 ± 11.03 25.6 ± 17.54
4 agosto 24.1 ± 21.02

7.6. Anormalidades totales en el día de muestreo.
En los muestreos realizados en primavera (marzo y abril) el promedio de
anormalidades totales fue de 11.8±5.9% en SSF y 9.6±4.7% en ACOC, de las
muestras diluidas en SSF el mayor porcentaje de anormalidades totales fue 24.5%
y el menor fue de 5%, mientras que en las muestras diluidas con ACOC el mayor
porcentaje fue de 22% y el menor fue de 3%.De los muestreos realizados en verano (julio y agosto) las muestras diluidas en SSF
presentaron un porcentaje promedio de anormalidades totales de 13±4.9%,
mientras que las muestras diluidas con ACOC tuvieron un promedio total de
anormalidades de 14±2.2%. El mayor porcentaje de anormalidades en las muestras
con SSF fue de 23.4% mientras que el menor fue de 9%. En las muestras con ACOC
el mayor porcentaje de anormalidades totales fue de 17% y el menor de 10%
(Cuadro 6).

Cuadro 6. PORCENTAJE PROMEDIO DE ANORMALIDADES TOTALES AL
INICIO Y POST PERDIDA DE MOVILIDAD POR EPOCA DEL AÑO.

TRATAMIENTO
PRIMAVERA (marzo-abril) VERANO (julio-agosto)
Inicio
( ± s)
Post movilidad
( ± s)
Inicio
( ± s)
Post movilidad
( ± s)
SSF 11.8 ± 5.9 24.7 ± 13 13 ± 4.9 29 ± 21.4
ACOC 9.6 ± 4.7 46.3 ± 11 14 ± 2.2 41.8 ± 7.9

7.7. Anormalidades totales Post- movilidad.
Las anormalidades espermáticas totales registradas una vez que las muestras
perdieron su movilidad se describen a continuación:
En los muestreos de primavera (marzo y abril) el promedio de anormalidades totales
en las muestras diluidas con SSF fue de 24.7±13%, en las muestras con ACOC el
promedio fue de 46.3±11% de anormalidades totales. El mayor porcentaje de
anormalidades totales con SSF en marzo y abril fue de 46.5% y el menor fue de
13%. En las muestras con ACOC el mayor porcentaje de fue de 70% mientras que
el menor fue de 13%.
En las muestras de verano (julio y agosto) el promedio de anormalidades totales en
SSF fue de 29±21.4% y el de las muestras diluidas con ACOC fue de 41.8±7.9%.
En las muestras con SSF el mayor porcentaje de anormalidades totales fue 41% y
el menor fue de 13%. Las muestras diluidas con ACOC tuvieron un porcentaje
máximo de 42% y un mínimo de 19% (Cuadro 6).

8. DISCUSIÓN
En el presente estudio se realizaron cuatro muestreos, los dos primeros se llevaron
a cabo en los meses de marzo y abril, mientras que los subsecuentes se efectuaron
en julio y agosto. En los dos muestreos iniciales, realizados en primavera, se
obtuvieron un mayor número de muestras (n=11), lo cual puede estar relacionado a
los periodos reproductivos y de copulas reportado para el cincuate por Ramírez y
Hernández en 2004 y Reyes y Rubio en 2009, así como la época de apareamiento
reportada para la especie Pituophis melanoleucus, la cual es una de las cuatro
especies de Pituophis (Burger y Zappalorti, 2011). Lo anterior, puede ser el
fundamento para que en los muestreos correspondientes a verano se obtuvieran un
menor número de muestras (n=7).
Cabe mencionar que los ejemplares destinados al presente trabajo se encontraron
en etapa adulta al momento de iniciar con los muestreos, esto de acuerdo a la
morfometría reportada por Ramírez y Hernández en 2004 y Reyes y Rubio en 2009,
lo que ayuda a disminuir el grado de error en el presente estudio, que pudiera estar
asociado a una etapa no reproductiva.
Los resultados obtenidos y analizados estadísticamente de la evaluación de la
movilidad, mostraron que el uso de SSF en las diluciones de semen de cincuate,
aportó un mayor tiempo de movilidad en los espermatozoides, ya que de las 18
muestras procesadas y diluidas con SSF, algunas mantuvieron movilidad por 5 y 6
días, e incluso una hasta por 7 días. Por el contrario, las muestras diluidas con agua
de coco (6 de las 18 muestras) solo alcanzaron movilidad por un periodo máximo
de 2 días y 7 del total perdieron toda movilidad a las 24 horas, mostrando diferencia
estadística en comparación con las diluidas en SSF. Esto indica una mayor
tolerancia de los espermatozoides de Pituophis deppei deppei a la SSF comparada
con el agua de coco. Por lo que estos resultados, superan por mucho a lo reportado
por otros autores, quienes han obtenido un tiempo máximo de 6 horas (Fuentes
Mascorro et al., en 2014), cabe mencionar las diferencias en la metodología
aplicada por Fuentes Mascorro G. et al, las cuales radican en los diluyentes (Tyrode
modificado, Tyrode®, Magapor®, MRA® y Brackett), la forma de obtención y el
manejo de las muestras. Fuentes Mascorro et al., 2014, realizaron un lavado en la
cloaca con el diluyente utilizado, colectando la muestra mediante improntas con
portaobjetos atemperados y posteriormente añadieron 10µl de los diluyentes para
recolectar la muestra; dicho procedimiento en comparación con el utilizado en el
presente trabajo, tiene el inconveniente de diluir la muestra en proporciones
inciertas debido a que no se cuantifica el volumen de la muestra obtenida previo a
la adición de un diluyente. A diferencia del trabajo realizado por Fuentes Mascorro
41

et al., 2014, las muestras obtenidas en el presente trabajo fueron refrigeradas, lo
que podría influir en el mantenimiento de la viabilidad de los espermatozoides.
Cabe hacer mención que la movilidad espermática es un parámetro que hasta el
momento no ha sido reportado para Pituophis deppei deppei. Sin embargo, existen
reportes en otras especies de serpientes, a pesar de esto, se debe considerar la
metodología utilizada en publicaciones de otros autores, quienes han empleado
diferentes diluyentes, así como técnicas de obtención de las muestras (Friesen et
al., 2014 y Moshiri et al., 2014).
La movilidad espermática en semen de serpientes ha sido reportada comúnmente
con base en una escala de movilidad masal de 0 a 5 (Fuentes Mascorro et al., 2014).
Sin embargo, en el presente trabajo se realizó una evaluación en escala de 0 a
100%, con la finalidad de determinar el porcentaje de espermatozoides en la
muestra que se encontraban viables y en condiciones de ser utilizadas para una
posible inseminación artificial, asimismo se permite evaluar con mayor exactitud el
deterioro de las muestras con base en este parámetro a lo largo del tiempo. En el
presente trabajo se obtuvo un total de movilidad inicial promedio de 65.5 ± 22.04%,
mostrando movilidades iniciales de 80% o superiores en 7 de las 18 muestras
evaluadas, esto indica una diferencia considerable en comparación con los
resultados obtenidos por Moshiri et al, 2014 en la especie Vipera albicornuta, los
cuales indican una movilidad que va de 49 hasta un máximo de 55% en las muestras
obtenidas post mortem. Esta diferencia puede deberse en gran medida a la técnica
de obtención empleada por Moshiri et al, la cual, como se ha mencionado con
anterioridad, tiene el inconveniente de sumergir los testículos y epidídimos en
solución PBS, lo que podría afectar inicialmente las muestras alterando parámetros
como volumen, concentración y un posible cambio osmótico al no ser evaluados sin
diluirse.
La variación en el volumen del eyaculado puede estar asociada a la estacionalidad
reproductiva; esto con base en lo reportado por Gribbins y Rheubert (2011), quienes
observaron variaciones de tamaño y actividad encontradas en los diferentes
epitelios de los testículos y epidídimos de las serpientes. Sin embargo, se debe
considerar que, a pesar de esto, el volumen de los eyaculados obtenido pudo ser
determinado, mediante el método de extracción y recolección propuestos en el
presente trabajo, el cual es una modificación al procedimiento realizado por
Mengden et al en 1980. Los reportes donde se ha evaluado el volumen seminal en
ofidios presentan una metodología poco confiable para su determinación exacta, ya
que la forma de obtención se ha realizado en la mayoría de los casos mediante
recuperación post mortem de epidídimos y testículos, los cuales son sumergidos en
diluyentes impidiendo la determinación exacta del volumen del eyaculado (Moshiri
et al 2014, Silva et al., 2017). Uno de los pocos trabajos donde se ha utilizado el
42

protocolo descrito por Mengden, en el cual se obtuvo la muestra ante mortem, fue
el realizado por Mattson et al en 2007, en el cual registraron un volumen promedio
de 2-5µl de semen de 5 serpientes de la familia Colubridae (Elaphe guttata).Estos
resultados muestran una diferencia considerable con los datos obtenidos en el
presente trabajo, los cuales indican un volumen promedio de 12.8 ± 6.8µl, con un
rango de 2-25µl, estos resultados concuerdan más con lo reportado por Zacariotti
et al, quienes determinaron en el año 2007, un volumen de 18.52 ± 5.61µl con un
rango de 3-70µl en 28 serpientes de la especie Crotalus durissus terrificus,
obteniendo las muestras mediante un masaje ventral. Es posible que al haber
utilizado en el presente estudio una técnica similar a la reportada por Zacariotti et
al, la cuantificación en el volumen de las muestras haya sido mayor que en otros
estudios (Mattson et al., 2007).
De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo, la concentración
espermática máxima de las muestras obtenidas fue de 4,890×106/ml (muestreo de
agosto) y una mínima de 1.9 x 106 /ml (muestreo de abril), estos resultados muestran
diferencias marcadas con otros autores en otras especies, dado que actualmente
no existen trabajos que indiquen la concentración espermática de la serpiente
Pituophis deppei deppei. Moshiri et al (2014), determinaron la concentración
espermática de la serpiente Vipera albicornuta, haciendo una dilución 1:10 con PBS
y reportando una concentración de 0.47 ± 0.1 ×106/ml, por otro lado, en 2007
Zacariotti et al, reportaron una concentración de 1,380 ± 130 ×106/ml con un rango
mínimo de 940 y un máximo de 2,230×106/ml en la especie Crotalus durissus
terrificus, dichos trabajos muestran una diferencia considerable y al compararlos
con los resultados obtenidos en el presente trabajo se puede inferir que el haber
obtenido concentraciones más altas en éste y el realizado por Zacariotti et al 2007,
fue gracias, tanto a la técnica de obtención similar (Mengden et al.,1980) como a la
obtención del semen en épocas de apareamiento de las especies. Por el contrario,
la técnica utilizada por Moshiri et al, implicó diferencias considerables como la
disección post mortem al sumergir testículos y epidídimos en PBS en los meses de
septiembre y octubre. Los resultados anteriores sugieren una diferencia
considerable entre uno y otro, encontrando una mayor concentración en las
muestras obtenidas mediante masaje ventral (Mengden et al., 1980) como en el
presente trabajo y las obtenidas post mortem (Moshiri et al., 2014). En el presente
trabajo se observó una diferencia de la concentración espermática en las dos
épocas de muestreo 1 (primavera) y la 2 (verano), que puede atribuirse a la
estacionalidad reproductiva mencionada previamente (Reyes y Rubio, 2009;
Ramírez y Hernández., 2004). Cabe hacer mención que si la muestra sufre
contaminación de cualquier tipo, ya sea externa o del ejemplar (uratos), el volumen
y la concentración se verán afectados.
43

La viabilidad de los espermatozoides fue evaluada mediante la tinción eosina-
nigrosina, sin embargo, no es reportada en este trabajo, ya que los espermatozoides
de serpientes muestran diferencias considerables con otras especies en la
absorción de dicha tinción, lo que dificultó una evaluación objetiva al no poderse
distinguir los espermatozoides vivos de los muertos. En trabajos como el realizado
por Moshiri et al, en 2014, la viabilidad es evaluada con la ausencia de movilidad,
sin embargo, esto no indica la muerte de un espermatozoide ya que la falta de
movilidad puede deberse a otras causas. Silva et al, en 2017 reportaron la viabilidad
de espermatozoides de serpientes, evaluándola mediante técnicas de
fluorescencia. Como se mencionó anteriormente, en el presente trabajo se
encontraron variaciones en la coloración de los espermatozoides, mostrando en
repetidas veces porcentajes altos de espermatozoides supuestamente muertos en
muestras con movilidades altas y dadas estas variaciones no fue posible determinar
la veracidad de los resultados obtenidos.
Se puede observar una diferencia marcada del efecto de los dos diluyentes sobre
los espermatozoides una vez que éstos han perdido su movilidad; dicho efecto
puede verse reflejado en el incremento de las anormalidades totales. Se registró un
total de anormalidades mayor en las muestras diluidas con agua de coco
comparadas con las que fueron diluidas con solución salina fisiológica entre los dos
periodos de muestreo (Cuadro 5), esto podría estar relacionado con las propiedades
fisicoquímicas de los diluyentes que influyen en mayor o menor medida causando
alteraciones visibles en los espermatozoides (Prades et al., 2012).
Moshiri et al, reportaron en 2014 el porcentaje de espermatozoides con
anormalidades en serpientes de la especie Vipera albicornuta; éstos fueron de 38.28
± 5.3% (diluidos en PBS), dichos resultados son más altos que los promedios
iniciales reportados en el presente trabajo en dilución con agua de coco en
primavera (9.6 ± 4.7%) – verano (14 ± 2.2%) y solución salina fisiológica en los
mismos periodos (primavera 11.8 ± 5.9%, verano 13 ± 4.9%), esta diferencia podría
estar relacionada con la técnica de obtención, así como con los diluyentes
empleados en los diferentes estudios. Cabe mencionar que no se encontraron
trabajos en donde haya sido reportado el porcentaje de anormalidades post
movilidad en serpientes como en el presente trabajo.

9. CONCLUSIONES
Las muestras de semen de Pituophis deppei deppei diluidas en solución salina
fisiológica permitieron mantener la movilidad durante mayor tiempo en comparación
con las conservadas en agua de coco.
Adicionalmente este estudio permitió obtener información sobre las características
espermatobioscopicas de la especie cincuate, hecho que de acuerdo a las
revisiones bibliografías realizadas no se había documentado. Sin embargo, se
requieren estudios que profundicen sobre los procesos fisiológicos de los
espermatozoides de serpientes, así como la influencia de la estacionalidad
reproductiva sobre los ejemplares mantenidos en cautiverio y de los parámetros
espermatobioscopicos.
Finalmente, las adaptaciones realizadas en la metodología propuesta por Mengden
et al. 1980, permitieron obtener muestras de mejor calidad y ser menos invasivo con
los ejemplares.

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Portada
Contenido
1. Resumen
2. Introducción
3. Antecedentes
4. Objetivo 5. Hipótesis
6. Material y Métodos
7. Resultados
8. Discusión
9. Conclusiones
10. Referencias