Determinar-la-expresion-de-CRBP-1-en-mujeres-mexicanas-con-cancer-de-mama

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COORDINACION DE UNIDADES MÉDICAS DE ALTA ESPECIALIDAD 
UMAE HOSPITAL DE ONCOLOGÍA 
CENTRO MÉDICO NACIONAL SIGLO XXI 
DIRECCION DE INVESTIGACION EN SALUD 
SERVICIO DE ONCOLOGÍA QUIRÚRGICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
TITULO: 
 
DETERMINAR LA EXPRESION DE CRBP-1 EN MUJERES 
MEXICANAS CON CANCER DE MAMA 
 
 
 
T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE ESPECIALISTA EN 
ONCOLOGÍA QUIRÚRGICA PRESENTA: 
 
DR. DAVID ISRAEL GARCÍA RUÍZ 
 
 
 
 
 
INVESTIGADOR RESPONSABLE Y ASESOR: 
DR. MAURICIO SALCEDO VARGAS 
 DR. EN CIENCIAS 
 
 
 
 
 
México D.F, Abril 2012 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE MEDICINA 
DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO 
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL 
DIRECCIÓN DE PRESTACIONES MÉDICAS 
UNIDAD DE ATENCIÓN MÉDICA 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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(:ni~pas 
GlJerrero 
Morelos 
Querétaro 
3 SuroGsto del O F. 
4 S"IO."'. dol D. F. 
ti] 
INSVTI1ID MEXICANO OA SEGI1RQ SOCIAl 
DIRECCiÓN REGIONAL SIGLO XXI 
DELEGACiÓN NO. 3 SUROESTE DEL DISTRITO FEDERAL 
HOSPITAL DE ONCOLOGIA CENTRO MEDICO NACIONAL SIGLO XXI 
DlVISIOU DE EDUCACION E INVESTIG .... CION MEDICA 
MÉXICO DF. A 28 DE MAYO DE 2004 
DR MAURICIO SAU..'EDO VARGAS 
INVESTIGADOR RESPONSABLE DEL PROTOCOLO TITULADO: 
"DETERMll.:(ACION DE ALTERACIONES CROMOSOMICAS PRESENTE3 EN MUJERES JOVENES 
~XICANAS CON CANCERDE MAMA" ,CON NUMERO DE REGISTRO 38H004. 
ilJ SESION EXTRAORDINARIA SE REVISO SU PROTOCOLO DE INVESTIGACION, DETERMINANDO 
APROBARLO, POR LO QUE FJNIA.f'< SU REGISTRO . 
... .: 
ATIlITÁMElITE 
 2 
 
DR. DAVID ISRAEL GARCIA RUIZ 
Medico Residente de 3º año 
Cirugía Oncológica 
Hospital de Oncología, CMN S. XXI 
 
 
 
 
 
 
 
DR. MAURICIO SALCEDO VARGAS 
Dr. en Ciencias 
Unidad de Investigación Medica en Enfermedades Oncológicas 
Hospital de Oncología, CMN S. XXI 
 
 
 
 
 
 
 
DR. JOSE FRANCISCO GALLEGOS HERNANDEZ 
Profesor Titular del Curso de Especialización en Cirugía Oncológica 
Hospital de Oncología, CMN S. XXI 
 
 
 
 
 
 
 
DR. GABRIEL GONZALEZ AVILA 
Director de Educación e Investigación en Salud 
Hospital de Oncología, CMN S. XXI 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 3 
“No hay dudas de que es alrededor de la familia y el hogar 
 
que todas las grandes virtudes de una sociedad human 
 
son creadas, fortalecidas y mantenidas” 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Con Todo Mi Cariño y Amor a la Hermosa Familia que La Vida me Dio. 
 4 
 
“cuando el tiempo pase y tu me olvides, 
 
silenciosa vivirás en mi; 
 
porque en la penumbra de mis pensamientos, 
 
todos los recuerdos me hablaran de ti” 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Al Cariño de mis Cariños que Llevo Dentro y día a día esta a mi lado. 
 5 
 
“he amado con demasiado fervor a las estrellas para temerle a la noche” 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Corazón, agradezco al cielo que ya te encuentres cerca, confío que Dios te de el coraje para 
enfrentar la 
 
 vida con alegría, que los ideales que alumbren tu camino sean la amabilidad, la belleza y la verdad. 
 6 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
Al Dr. Mauricio Salcedo Vargas. Dr. En Ciencias de la Unidad de Investigación del H. O. CMN S. 
XXI. Gracias por confiar en mi y darme la oportunidad de adentrarme en ese fascinante mundo de la 
biología molecular. 
 
Al Dr. Gabriel González Ávila. Dir. de Educación e Investigación en Salud del H. O. CMN S. 
XXI. Con usted siempre hay una segunda manera de ver las cosas. Mi gratitud es infinita, tanto en lo 
académico como en lo personal. 
 
Al Dr. José Francisco Gallegos Hernández. Titular del Curso de Especialidad en Cirugía 
Oncológica. Su manera de ver la vida siempre es un ejemplo de cómo enfrentarla. Gracias por ser 
parte de mi formación. 
 
Finalmente una muestra de agradecimiento a todos los médicos de base y adjuntos que día a día 
forjan el espíritu para engrandecerlo y formarlo con carácter inquebrantable. Gracias por la 
confianza y por darme la oportunidad de realizar lo que mas me gusta. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La meta no es vivir para siempre. El objetivo es crear algo que lo haga. 
 
INDICE 
 
 
 
 
RESUMEN 8 
INTRODUCCIÓN 10 
JUSTIFICACIÓN 19 
PROBLEMA A ESTUDIAR 20 
HIPOTESIS 21 
OBJETIVO 22 
MATERIAL Y METODOS 23 
RESULTADOS 31 
DISCUSION 33 
CONCLUSIONES 35 
BIBLIOGRAFIA 36 
ANEXOS 48 
 
 8 
 
 
RESUMEN 
 
 
TITULO: Determinar la expresión del gen CRBP-1 en mujeres mexicanas con cáncer de mama. 
 
 
OBJETIVO: Determinar la expresión de CRBP-1 en cáncer de mama en la población mexicana. 
 
MATERIAL Y METODOS: Estudio piloto, experimental, transversal, descriptivo, observacional, 
en mujeres mexicanas con diagnostico de cáncer de mama, tratadas en el Hospital de Oncología del 
CMN S. XXI entre mayo y junio de 2011. Se analizaron un total de quince muestras de biopsias de 
tejido tumoral mamario, confirmadas como cáncer invasor. Las muestras fueron tomas en la Clínica 
de Tumores de Mama del Hospital de Oncología del CMN S. XXI al momento de la cirugía, en el 
año 2011. Los criterios de inclusión de las muestras de los pacientes fue el no haber recibido 
tratamiento previo, historial clínico completo y aprobación del consentimiento informado. Además 
se analizaron 30 muestras mas de tejido mamario con sospecha clínica de cáncer, de las cuales 15 
fueron de tejido normal y 15 con enfermedad fibroquística de la mama confirmadas por 
histopatología. 
 
RESULTADOS: El análisis por inmunohistoquímica de CRBP-1 en 45 muestras de tumores de 
mama, de las cuales 15 fueron tejido normal. CRBP-1 fue expresado en 6 de 15 muestras de 
carcinoma de mama y en 12 de 15 muestras con enfermedad fibroquística. 
 
CONCLUSIONES: Nosotros mostramos que CRBP-1 frecuentemente no se expresa en cáncer de 
mama humano, de acuerdo a estos datos la ausencia de expresión de CRBP-1 puede sugerir que 
CRBP-1 puede ser un gen supresor en cáncer de mama. 
 9 
SUMMARY 
 
TITLE: CRBP-1 gene Expression in Mexican Women with Breast Cancer. 
 
GOAL: To determine the CRBP-1 expression in mexican women with breast cancer. 
 
MATERILAS AND METHODS: The present work is a pilot study, experimental, tansversal, 
descriptive, observational in mexican women diagnosed with breast cancer, referred to Oncology 
Hospital, CMN S. XXI in a period from May to June 2011. Fifteen samples were analysed of breast 
carcinoma tissue, confirmed to invasive carcinoma. The samples were collected from patients who 
attended in Breast Tumors Service in time of surgery in the year 2011. All the cases were not 
previously treated; all samples were taken after informed consent from the patients and complete 
medical history. Also, 30 samples were analyzed whit medical suspicion of cancer and were 
histological confirmed as 15 normal breast tissue and 15 as breast fibrocystic disease. 
 
RESULTS: CRBP-1 immunohistochemistry analysis from 45 breast tissues was performed in a 
tissue microarray; 15 were normal breast tissue. CRBP-1 was expressed in 6 of 15 breast carcinoma 
specimens. and in 12 of the 15 fibrocystic disease specimens. 
 
CONCLUSION: We have demonstrated that CRBP-1 is frequently underexpressedin human breast 
cancer. According to this data, the CRBP-1 lack expression could suggest that CRBP-1 could be a 
suppressor gene in breast cancer. 
 
 
 
 10 
INTRODUCCIÓN 
 
 
Aunque el cáncer de mama es muy común, aun hay una substancial brecha en nuestros 
conocimientos de las alteraciones genéticas que contribuyen a esta enfermedad. 
El cáncer de mama esporádico es diverso en términos de estadio, comportamiento clínico, 
características histológicas y alteraciones moleculares. Recientemente, estudios en expresión de 
genes han permitido una clasificación molecular de cáncer de mama que incluye 5 tipos distintos o 
subtipos intrínsecos, ej. Luminal A, luminal B, ERBB2, basal-like y sub tipo normal de mama 
(9-11)
. 
Los marcadores representativos para esta clasificación son receptores a estrógenos (RE), HER2 
(HER2/neu, c-erbB-2), y marcadores basales o mioepiteliales, ej., citoqueratina (CK) 5/6, CK 17 y 
CK 14. Los RE esta sobre regulado en los subtipos luminal A y luminal B, pero disminuye en los 
otros tres. La expresión HER2 es elevada en los subtipos luminal B y ERBB2, pero regulados a la 
baja en los otros tres. El subtipo basal like y subtipo de mama normal son negativos para RE y 
HER2, pero la expresión de marcadores basales/mioepiteliales es positiva únicamente en el primero. 
El subtipo ERBB2 y basal like están correlacionados con comportamiento clínico agresivo y 
mientras que el subtipo luminal A se correlaciona con mejor pronostico 
(10, 11)
. 
El subtipo intrínseco puede también ser definido simplemente en el nivel de expresión de 
proteínas por inmunohistoquímica para RE, receptor a progesterona (RP), HER2 y marcadores 
mioepiteliales/basales 
(12-14)
. Los subtipos moleculares basados en el perfil de expresión de genes 
también se correlacionan con los resultados clínicos 
(12)
. En realidad, para estimar el riesgo y 
elección de la terapia sistémica adyuvante para pacientes con cáncer de mama operable, la 
información sobre RE, RP y expresión de proteína HER 2 es rutinariamente utilizado alrededor del 
mundo 
(15, 16)
. 
Estudios sobre genes individuales y alteraciones cromosómicas en cáncer de mama 
esporádico han sido conducidos por mas de 20 años. Muchas alteraciones genéticas y cromosómicas 
 11 
han sido identificadas, pero los patrones de alteraciones genéticas difieren de caso a caso. Estas 
alteraciones comprenden amplificación del gen HER2 
(17-23)
, mutación del gen TP53 (p53) 
(24-30)
, 
ganancias, perdidas y re arreglos de brazos cromosómicos 
(31-43)
, mutación del gen E-cadherina 
(CDH1) 
(44-48)
, e inactivación del gen BRCA1 
(49-53)
. El tipo de alteración se encuentra fuertemente 
ligado con el tipo histopatológico y grado tumoral, mas que con el tamaño del tumor, estado 
ganglionar o clínico. 
La correlación entre las características histopatológicas y las alteraciones genéticas y 
cromosómicas han sido fortalecidas con la introducción de abordajes moleculares citogenéticos así 
como por la hibridación in situ por fluorescencia (FISH), hibridación genómica comparativa (CGH), 
y arreglos de CGH. En adición, arreglos de CGH permiten la identificación de genes específicos 
desde amplificaciones cromosómicas comunes o regiones eliminadas. 
 
El cáncer es una enfermedad genética que surge de la acumulación de mutaciones en genes críticos. 
Esto permite a la célula escapar del crecimiento normal, control y proliferación hasta comportarse 
como un tumor clínicamente evidente. El cáncer de mama es por mucho el tipo mas común de 
cáncer que afecta a las mujeres alrededor del mundo y la segunda causa de muerte relacionada a 
cáncer en mujeres, solo excedida por el cáncer de pulmón 
(54, 55)
. La heterogeneidad del cáncer de 
mama, el cual se manifiesta con características clínicas y patológicas diversas, nos lleva a nuevas 
vías de caracterización y clasificación de estos tumores 
(56, 57)
. Convencionalmente el diagnóstico y 
tratamiento de cáncer de mama es basado principalmente en variables clínico patológicas 
comúnmente aceptadas caracterizando cada caso de cáncer. Estos parámetros incluyen: tipo 
histológico, edad, tamaño del tumor, estado ganglionar, presencia de metástasis a distancia, grado, 
estado de receptor a estrógenos y receptor a progesterona y estado del receptor HER2. Estos 
parámetros son típicamente usados para determinar el pronostico y predecir la respuesta o 
 12 
resistencia al tratamiento. Sin embargo, el análisis molecular del cáncer de mama ha confirmado su 
fuerte heterogeneidad clínica, señalando la gran necesidad de biomarcadores capaces de predecir la 
respuesta al tratamiento. Reciente estudios se han enfocado principalmente en la variabilidad 
genómica entre pacientes como polimorfismo de nucleótido sencillo, el cual es una eficiente 
herramienta para definir los resultados de la enfermedad o efectividad/toxicidad del tratamiento 
(58, 
59)
. 
Una red de múltiples vías de señalización que involucran los puntos de verificación del ciclo 
celular, reparación del ADN, recombinación y apoptosis efectiva que mantengan la integridad del 
genoma humano 
(60)
. En presencia de factores de estrés internos o externos, los mecanismos de 
respuesta celular se activan para reparar los errores existentes y prevenir el daño al ADN. De las 
fuentes externas de daño al ADN, las mas investigadas son agentes químicos, radiación y virus. En 
los casos de factores endógenos, las especies de oxigeno reactivo son la principal fuente de daño al 
ADN 
(61, 62)
. La falta de reparación al ADN dañado permite la acumulación de lesiones, con lo cual a 
largo plazo resultara en perdida de la integridad genómica. El ADN dañado conduce a mutaciones 
en los genes responsables de reparación y puntos de verificación del ciclo celular, comprendiendo 
así la principal causa de inestabilidad genómica 
(63, 64)
. 
 
Alteraciones genéticas y cromosómicas en cáncer de mama 
 
Las alteraciones genéticas reportadas que ocurren en el carcinoma de mama son mutaciones 
puntuales, amplificación de genes y alteraciones cromosómicas (ganancias, perdidas y 
recombinación incluyendo isocromosomas y translocaciones. Anexo 1. 
Las mutaciones puntuales son la substitución de una base única que causa el remplazo de un 
aminoácido único en la formación de un codón de alto, dando lugar al producto de un gen truncado. 
 13 
Las mutaciones puntuales pueden contribuir a la inactivación de genes supresores de tumor o a la 
activación de proto oncogenes. Los genes p53 
(25-30)
 y E-cadherina son ejemplos de esta situación 
(44-
47)
. 
Las amplificaciones diseminadas de regiones cromosómicas comprenden mas de cien mil 
quilo bases de secuencias de ADN que pueden ocurrir en células con cáncer. Estas amplificaciones 
de ADN pueden producir varios cientos de copias de proto oncogenes que están localizados en la 
unidad amplificada y pueden activar dichos proto oncogenes en asociación a proteínas de sobre 
expresión. La amplificación de genes puede ser identificada citogenéticamente como regiones 
homogéneamente teñidas (HSRs) o dobles minutos (DMs) 
(65)
. Las HSRs son generadas por el 
ensamble de genes amplificados dentro de nuevos cromosomas, mientras que los DMs son pequeñas 
estructuras parecidas a cromosomas. El locus del gen HER2 (c-erbB-2) se localiza en 17q11.2-q12, 
el loci INT2, HST1 y CCND1 (ciclina D1) en 11q13 y el locus MYC (c-myc) en 8q24, son genes 
amplificadores bien conocidos en cáncer de mama esporádico 
(17, 20, 31)
. 
Las alteraciones numéricas en los brazos de los cromosomas fueron inicialmente detectadas 
como perdida de heterocigocidad (LOH). La LOH en células cancerígenas denota la perdida de uno 
de dos alelos heterocigotos en un locus y es detectado por el polimorfismo de longitud de 
fragmentos de restricción (RFLP) usando el análisis de hibridación Southern blot o por reacción en 
cadena de polimerasa (PCR) usando marcadoresmicro satelitales altamente pleomórficos (AC)n. La 
LOH en 1p, 1q, 3p, 7p, 11p, 13q, 16q, 17p, 17q y 18q esta reportada que sucede con relativa 
frecuencia 
(32-38)
. Subsecuentemente el uso de FISH y CGH revelo muchas ganancias y perdidas 
cromosómicas en células cancerígenas de la mama, ej., ganancias de 1q, 4p, 5p12–14, 8q, 9q, 
11q13–14, 16p, 17q12, 17q22–24, 19p, 19q, y 20q13 y pérdidas de 1p, 4q, 6q, 8p, 9p, 11q, 13q, 
16q, 17p, 18p, 21q, y Xq 
(39, 40,
 
66-74)
. 
 
 14 
Algunos de estos cambios cromosómicos son derivados de translocaciones o recombinación 
cromosómicas especificas. Por ejemplo, la ganancia de 1q y perdida de 16q son frecuentemente 
concurrentes en cáncer de mama esporádico y el análisis de cariotipo convencional a mostrado que 
una gran parte de estos cambios es derivada desde isocromosomas, 1q [i(1q)] o cromosomas 
derivados der(1;16)(q10;p10) o der(16)t(1;16) 
(41-43,
 
69, 71)
. La morfología e implicación clínica de 
i(1q) no esta bien caracterizada. Como la primera detección por citogenética y confirmada 
posteriormente por FISH, der(1;16) o der(16)t(1;16) sucedió en cerca del 30% de los carcinomas de 
mama y se correlaciono con histología de bajo grado 
(71, 75)
. 
En el cáncer de mama esporádico la mutación en línea germinal BRCA1 no se detecta, pero 
la inactivación somática del gen BRCA1 por hipermetilación del ADN se ha reportado sucede como 
un evento epigenético. 
(50-53)
. 
 
La epigenética del cáncer de mama 
Las alteraciones epigenéticas en células transformadas involucran cambios en la metilación del 
ADN incluyendo hipometilación global e hipermetilación en un locus especifico, modificación en 
los patrones de cola de histonas alteradas y nucleosomas remodelados. La metilación del ADN es un 
cambio químico derivado enzimáticamente, a la secuencia de ADN que mas común mente ocurre en 
dinucleótidos CpG de mamíferos
 (76)
. La hipometilación de ADN puede estar asociada con 
reactivación de genes e inestabilidad cromosómica permitiendo una regulación a la alza o sobre 
expresión de proto oncogenes, incrementando la recombinación y tasa de mutación, asimetría o 
perdida de cromosoma X inactivado y perdida de la impresión 
(77)
. La hipermetilación del ADN es 
frecuentemente asociada con represión de genes e inestabilidad genómica (a través de silenciación 
de genes reparadores de ADN) permitiendo así la supresión de genes supresores de tumores y 
compactación de la cromatina. 
 15 
 Asociado a la metilación del ADN esta la modificación post traducción de las histonas en 
cola, otro mecanismo epigenético que puede modular la estructura de la cromatina y regular los 
genes de expresión 
(78, 79)
. Adicionalmente, también se ha demostrado que algunos reguladores que 
controlan el remodelado del nucleosoma también están involucrados en la regulación de metilación 
del ADN y modificación de las histonas 
(78-81)
. El entendimiento de todos los cambios epigenéticos y 
su contribución a la tumorogénsis del cáncer de mama es muy importante para seguir avanzando en 
el campo del diagnóstico, pronostico y terapia del cáncer de mama. 
 Aunque los tumores de mama son frecuentemente hipometilados en una amplia escala del 
genoma el número de genes reportados como hipometilados en cáncer de mama es relativamente 
pequeño. Esto se debe probablemente a la posición del ADN hipometilado en las regiones 
pericentromericas del ADN y regiones carentes de genes del genoma, pero, en realidad también a 
que el enfoque de metilación del ADN en cáncer ha sido sobre hipermetilación de islas CpG y 
muchas técnicas solo pueden detectar regiones de hipermetilación. 
 
 Mas de 100 genes han sido reportados hipermetilados en tumores de mama o cáncer de 
mama 
(76)
. Muchos de los genes aberrantemente metilados juegan un papel importante en la 
regulación del ciclo celular, apoptosis, invasión a los tejidos y metástasis, angiogénesis y 
señalización hormonal 
(82)
. Uno de los reguladores de la proliferación metilado en cáncer de mama 
es el supresor tumoral RAR. La metilación de RAR es un evento epigenético temprano en cáncer 
de mama y se encuentra en lesiones in situ de canceres lobulillar y ductal 
(83)
. 
 
 
 
 
 16 
Papel de CRBP 1 en la señalización. 
 
El retinol (prototipo de vitamina A) y sus metabolitos llamados retinoides juegan un papel 
importante en la fisiología, desarrollo embriológico, visión, mantenimiento de la diferenciación del 
epitelio, función inmune y reproducción 
(84)
. Muchas de estas funciones son mediadas por 
metabolitos del retinol así como por todos los ácidos trans-retinoicos (ATRA)
 (85)
. ATRA modulan 
genes de expresión por medio de receptores nucleares miembros de la superfamilia de genes de 
hormonas esteroideas. Estos receptores, los receptores del ácido retinoico (RARs), y receptor 
retinoide X (RXRs), se encuentran en al menos tres subtipos, designados α, β y γ. Los receptores 
funcionan como heterodímeros con actividad ligando de unión al ADN que transcriben mejor 
factores y regulan la transcripción de varios genes, los cuales juegan un papel importante durante el 
desarrollo y en los tejidos adultos. La expresión y función aberrante de receptores de retinoides 
específicos, primariamente RAR, ha sido asociado con desarrollo y progresión del cáncer 
(86, 87)
. 
Sin embargo recientes estudios han puesto a la luz mecanismos adicionales para anular la 
señalización y carcinogénesis de retinoides. Estos involucran anormalidades localizadas cuesta 
arriba del acido retinoico y sus receptores nucleares. Estos defectos interfieren con el 
almacenamiento del retinol y su metabolismo hacia ácido retinoico resultando en una deficiencia 
localizada de retinoides. Interesantemente, se ha sugerido que la disminución en los niveles de 
RAR pueden estar, al menos en parte, causados por la deficiencia local de vitamina A
(88)
. 
 
 El retinol de la dieta es almacenado en células especializadas del hígado y viajan a diversos 
blancos tisulares por medio de proteínas transportadoras de retinol
(89)
. Sin embargo, el retinol es 
también almacenado en varios tejidos extra hepáticos incluyendo células epiteliales de la mama. Los 
esteres de retinil son la principal forma de almacenamiento de retinol, ellos se pueden concentrar en 
 17 
gotas de lípidos que sirven como organelos de almacenamiento desde los cuales el retinol puede 
movilizarse rápidamente para fomentar el metabolismo a ATRA u otros retinoides
(90)
. La 
esterificación del retinol en preparación para el almacenamiento es catalizada por la enzima lecitin 
retinol acetil transferasa (LRAT), la cual también se localiza en las gotas de lípidos. 
 
 La evidencia ha mostrado que la esterificación del retinol esta disminuida en diferentes 
líneas celulares de carcinomas humanos, incluyendo cavidad oral, riñón, piel, mama y próstata en 
relación a sus respectivas contrapartes normales
(91, 92)
. Esto provee evidencia, que la reducción de la 
esterificación fue asociada con disminución en la expresión de LRAT en las células tumorales y 
tejidos relacionados con las células normales o correspondientes al tejido
(92)
. Ya que la expresión de 
LRAT es regulada por retinoides, la disminución en el retinol almacenado y la consecuente 
disminución en el retinol libre y su metabolito ATRA puede ser una razón para la disminución en 
los niveles de LRAT. Así, la diminución en el almacenamiento del retinol en tejidos malignizados 
resultaría en un estado de deficiencia local de retinoides a pesar de la adecuada ingesta de vitamina 
A y almacenamiento hepático. 
 También se ha demostrado que el nivel de proteína de unión al retinoide celular 1 (CRBP-1) 
disminuyen en células cancerígenas de mama y su expresión restaurada resulta en efecto supresor 
tumoral 
(93)
. También se ha demostrado que la expresión de CRBP-1 es silenciada por metilación del 
ADN en muchos tumores(94)
 así como diversos genes supresores de tumor incluyendo RAR2
(95)
. 
 Farias et. al. Resumió una serie de estudios complementando abordajes los cuales han 
mostrado que en las células del epitelio de la mama, CRBP-1 esta localizado primariamente en gotas 
lipídicas, las cuales son organelos donde el retinol es almacenado
(96)
. Por lo tanto, ello provee 
evidencia, asociando la presencia de CRBP-1 en estas gotas con aumento del almacenamiento de 
retinol, incrementando la actividad del receptor de ácido retinoico (RAR), y estimulando la 
 18 
diferenciación acinar. Esta estimulación de la diferenciación puede ser evocada con tratamiento con 
ácido retinoico y disminuida por antagonistas RAR. También, CRBP-1 suprime la tumorogénesis de 
células malignas de glándula mamaria de ratón y xenoinjertos de cáncer de mama humano en 
ratones atímicos. Basado en estos resultados se concluye que CRBP-1 juega un papel pivote en 
señalización de retinoides y la activación fisiológica de RAR es dependiente del nivel de ATRA y 
este depende de la disponibilidad del retinol almacenado y su precursor. Estos hallazgos apoyan el 
modelo en el cual CRBP-1 media el retinol almacenado y una sustancial disminución en CRBP-1 
llevaría a la disminución de la producción de ATRA y anular los niveles y actividad de RAR, 
permitiendo la perdida de la diferenciación celular y progresión tumoral. 
 Esto ha sugerido que los retinoides fisiológicamente pueden actuar como factores endógenos 
quimiopreventivos suprimiendo la expansión temprana de clonas aberrantes, previniendo así la 
formación de lesiones premalignas. Esta aseveración es apoyada por los hallazgos en los cuales la 
señalización de los retinoides puede estar comprometida a diferentes niveles en estadios tempranos 
del desarrollo del cáncer. Diversos grupos han demostrado que niveles de RAR disminuyen en 
estadios tempranos de carcinogénesis
(86)
. Cuatro de cinco casos de carcinomas de mama que no 
expresaron CRBP-1 tampoco expresaron RAR
(97)
. Las líneas celulares de cáncer de mama positivo 
a receptores estrogénicos (ER+) inhiben su crecimiento por ATRA y 4-oxoretinol, mientras que solo 
4-oxoretinol es efectivo contra líneas tumorales ER-
(98)
. Por lo tanto, la disminución en el 
almacenamiento de retinol debido a la regulación a la baja de CRBP-1 y LRAT se espera afecte el 
desarrollo de canceres de mama RE+ y RE-. 
 
 
 
 
 19 
JUSTIFICACION 
 
Los biomarcadores tumorales son usualmente proteínas medibles en suero, plasma o tejido tumoral 
y pueden ser usados para identificar individuos con incremento en la predisposición para desarrollar 
cáncer. La búsqueda de etapas tempranas de cáncer y/o asistencia en el diagnostico de cáncer y 
manejo de los pacientes a través de la estadificación de grupos de pacientes y predicción de 
respuesta o pronostico al tratamiento. 
 Actualmente no esta claro que biomarcadores proteínicos pueden ser cuantificados con la 
sensibilidad y especificidad deseada, en plasma o suero, para la detección temprana de cáncer de 
mama. Las firmas de expresión de genes en células de sangre periférica han probado su uso 
mostrando una sensibilidad y especificidad similar a la que se puede obtener por medio de la 
mastografía. Los cambios en la metilación del ADN pueden ser marcadores usados para la 
detección temprana de cáncer de mama ya que el DNA es relativamente estable comparado con 
otros recursos como mRNA y puede ser obtenido de fluido de lavado ductal, fluido aspirado del 
pezón y DNA libre en células sanguíneas, así como aspiración por aguja fina del tumor primario. 
Usando un panel génico en el que se incluya determinación de CRBP-1 se podrá determinar 
respuesta al tratamiento y probablemente la progresión tumoral antes de la malignización de los 
tejidos. 
 
 
 
 
 
 
 20 
PROBLEMA A ESTUDIAR 
 
La expresión de CRBP-1 es menor en canceres humanos que en las células normales, la perdida 
somática de la función de CRBP-1 en cáncer de mama es un evento que contribuye a la progresión 
tumoral por depresión crónica de la actividad RAR permitiendo a las células tumorales escapar de la 
diferenciación y mayor crecimiento autónomo, por tanto es importante determinar la expresión de 
CRBP-1 en pacientes mexicanas con cáncer de mama. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 21 
HIPOTESIS 
 
El presente estudio es de tipo descriptivo por lo que no se especifica una hipótesis, sin embargo, 
podemos mencionar que basado en los antecedentes, podríamos encontrar la expresión del CRBP1 
en menos del 50% de los casos de cáncer de mama. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 22 
 
OBJETIVO 
 
Determinar la expresión de CRBP-1 en cáncer de mama en la población mexicana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 23 
MATERIAL Y METODOS 
 
Fecha de inicio y conclusión 
 Junio 2011 a marzo 2012. 
 
Ámbito 
 Lugar: México DF. 
 Sitio: Hospital de Oncología Centro Médico Nacional S. XXI 
 Servicio: Departamento de Investigación en Onco-genómica. 
 
Tipo de estudio 
 Estudio piloto, experimental, transversal, descriptivo, observacional 
 
Universo de Estudio 
 Todos los pacientes que cumplan con los criterios de inclusión que sean candidatos a 
protocolo por cáncer de mama y tratamiento quirúrgico inicial y que acepte entrar al estudio. 
 
Criterios de selección 
Criterios de inclusión 
 Ambos géneros 
 De 28 a 80 años 
 Tumor de mama sospechoso 
Criterios de no inclusión 
 Embarazo 
 24 
 Tratamiento oncológico por cáncer de mama previo 
 
Criterios de exclusión 
 Pacientes que deseen salir del estudio 
 
Variables 
Independientes 
 Edad 
 Etapa clínica (estado ganglionar) 
 Receptores hormonales 
 Diagnóstico histológico 
 Her2/neu 
Dependientes 
 CRBP-1 
 
Población de estudio 
Se incluyeron en este estudio 45 mujeres referidas de centros de atención e segundo nivel 
durante mayo y junio del 2011, al servicio de Tumores de Mama del Hospital de Oncología de CMN 
S. XXI, con diagnóstico de cáncer de mama invasor. A dichas pacientes, como parte del protocolo 
se solicitaron laminillas y bloques de parafina para confirmar el diagnóstico de envío. 
 
Muestras biológicas 
Se analizaron un total de 15 muestras de biopsias de tejido tumoral mamario, confirmadas 
como cáncer invasor. Las muestras fueron tomas en la Clínica de Tumores de Mama del Hospital de 
 25 
Oncología del CMN S. XXI al momento de la cirugía, en el año 2011. Los criterios de inclusión de 
las muestras de los pacientes fue el no haber recibido tratamiento previo, historial clínico completo y 
aprobación del consentimiento informado. Además se analizaron 30 muestras mas de tejido 
mamario con sospecha clínica de cáncer, de las cuales 15 fueron de tejido normal y 15 con 
enfermedad fibroquistica de la mama confirmadas por histopatología. 
 El intervalo de edad de las muestras de las pacientes varió entre 30 a 83 años de edad, la 
madia fue de 49 años. Las muestras analizadas se encontraban en estadio temprano (I: IA, IB y II: 
IIA, IIB) ya que uno de los criterios era el no haber recibido tratamiento oncológico previo, esto de 
acuerdo a la clasificación de TNM, AJCC 7º edición utilizada para etapificación de cáncer a nivel 
mundial. 
Los procedimientos que se llevaron a cabo en el procesamiento de estas muestras han sido 
aprobados por el comité de ética local del IMSS, previo consentimiento informado de los pacientes. 
 
Procesamiento de los tejidos 
Las biopsias fueron fijadas en etanol 70% por 12 horas y posteriormente incluidas en 
parafina. Antes de incluir el tejido en parafina, se realizó la deshidratación mediante una serie 
gradual de soluciones acuosas de menor a mayor grado de etanol, iniciando con etanol 30% hasta 
llegara a etanol 100% para eliminar el agua. Luego de deshidratar el tejido,se pasó a una solución 
de xilol para el aclaramiento de tejido y posteriormente se llevó a cabo la inclusión en parafina para 
formar un bloque sólido, que pueda ser cortado en un microtomo. Posteriormente se realizó la 
tinción de hematoxilina y eosina a los tejidos, para confirmar el tipo histológico de carcinoma de 
células escamosas. Se seleccionó el área tumoral con al menos el 80% de células transformadas en la 
muestra, con el apoyo de un patólogo. 
 
 26 
Construcción del arreglo de tejidos 
La construcción de los arreglos de tejidos, se realizó con los 15 tejidos embebidos en 
parafina de muestras de tumor de mama, se incluyeron para el arreglo de muestras invasoras del 
tumor de la mama, El arreglo de tejido fue relizado mediante el empleo del Tissue-Arrayer ATA 100 
de chemicon, siguiendo las instrucciones del equipo. Este sistema de precisión es operado de manera 
semi-automatizada y permite arreglar en un solo bloque de parafina, múltiples muestras de tejido, lo 
que permite analizar de decenas a cientos de muestras pequeñas de tejido en condiciones 
homogéneas y con un mínimo consumo de reactivos, en comparación con las técnicas 
convencionales de inmunohistoquímica. 
Inicialmente, se realizaron cortes y tinciones de hematoxilina y eosina a partir de los tejidos 
en bloques de parafina y se realizó la sección del área tumoral con al menos 80% de células 
transformadas, en los portaobjetos de las muestras teñidas. Posteriormente se localizó el área 
seleccionada en el bloque de tejido donante en parafina. Se construyó un bloque de parafina en 
blanco, que se utilizó como bloque receptor del arreglo de tejido. Se preparó el Tissue Arrayer 
colocando dos agujas de punción, la donante y la receptora con una sección de 2 mm en la torreta. 
Se colocó el bloque receptor en su receptáculo y se seleccionó el punto de inicio en la posición cero 
para los dos micrómetros X y Y. Se realizó una perforación en el bloque receptor y se retiró el 
cilindro blanco de parafina sobrante de la aguja receptora. De la misma manera, se colocó el bloque 
donante en su receptáculo y se perforó el área seleccionada, con la aguja del donante. Se deslizó el 
receptáculo receptor hasta lo posición de la aguja donante y se colocó el cilindro de tejido donante 
en el orificio previo que se había efectuado en el bloque receptor. Se avanzó la torreta del Tissue 
Arrayer a una distancia de 3mm del orificio anterior haciendo una nueva perforación con la aguja de 
punción receptora y se repitieron los pasos anteriores sucesivamente, hasta completar la primera fila 
de orificios y oclusión con cilindros tisulares donantes en el bloque receptor. Se repitieron los pasos 
 27 
descritos para la segunda y siguientes filas. Hasta completar el arreglo de tejidos. Al terminar el 
arreglo se incubó el bloque a una estufa a 60ºC durante 10 min. para homogeneizar los posibles 
espacios creados en la parafina de los bloques receptores de arreglos tisulares entre orificio receptor 
y orificio de tejido donante. Una vez terminado el arreglo se procedió a realizar los cortes 
histológicos de 4 micras, para realizar la inmunohistoquímica. 
 
Detección de la proteína CRBP-1 por inmunohistoquímica 
La determinación de la expresión de la proteína CRBP1 se realizó mediante la técnica de 
inmunohistoquímica. Se tomó el arreglo de tejidos y se le realizaron varios cortes de 4 μm, los 
cortes de los tejidos se incubaron a 37ºC toda la noche, posteriormente se realizó el desparafinado y 
re-hidratación mediante una incubación a 60ºC por 20 minutos seguido de dos baños de xilol por 10 
min. Cada uno y baños en soluciones graduales de etanol de mayor grado 100% hasta agua. La 
exposición del antígeno se efectúo en una olla de presión con un amortiguador de citrato a pH 6, 
seguida de un lavado con agua corriente por 3 min. La detección de la proteína se realizo mediante 
la técnica de Biotina/Estreptavidina amplificada (BSA), utilizando el protocolo de tinción de DAKO 
Envision. Para la detección de la proteína CRBP1, se utilizó el anticuerpo monoclonal primario anti-
CRBP1, clona MCA2530 de Serotec a una dilución de 1:00. La incubación se hizo de 1 hora y se 
contratiñió con hematoxilina montándose, el tejido en medio acuoso. Se utilizó como control 
negativo tejido de corazón ampliamente reportado que no expresa la proteina y tejido de placenta, 
como control positivo se utilizó un tejido de hígado y riñón con alta expresión para la proteína 
CRBP1. La evaluación de la reacción de inmunohistoquímica, se realizó en un microscopio óptico, 
considerándose la expresión de la proteína a la reacción positiva entre la interacción del anticuerpo 
primario con el anticuerpo secundario (precipitación café). 
 
 
 28 
Expresión de la proteína en tumor de la mama. 
 
La evaluación de la expresión de la proteína CRBP1, se realizó mediante la técnica de 
inmunohistoquímica sobre los cortes de los arreglos de tejidos. La técnica se hizo de acuerdo al 
protocolo de tinción de DAKO Envision. La intensidad de la reacción de Biotina/Estreptavidona 
amplificada (BSA), fue evaluada por dos observadores independientes, para determinar los casos 
positivos y negativos a la expresión de la proteína CRBP1. 
 
Operacionalizacion de las variables 
 Edad: tiempo transcurrido a partir del nacimiento de un individuo. 
 Etapa clínica (estado ganglionar): método de estadiaje de neoplasias basado en el sistema 
TNM desarrollado por AJCC. 
 Receptores hormonales: receptores a estrógeno y progesterona marcador de riesgo en cáncer 
de mama. 
 Diagnóstico histológico: examen de muestras de tejido bajo microscopio. 
 Her2/neu: Oncogen localizado en el cromosoma 17 expresado en pacientes con cáncer de 
mama asociado a progresión y evolución desfavorable. 
 CRBP-1: proteína de unión al retinol celular. 
 
 
 
 
 
 
 
 29 
Análisis estadístico 
 
Estadística descriptiva e inferencial 
Las muestras biológicas para realizar el presente estudio se tomaron de la pieza quirúrgica 
una vez realizada la cirugía a las pacientes en etapa temprana no sometidas a neoadyuvancia, 
por lo cual este procedimiento no modifico el tratamiento de las pacientes, que 
subsecuentemente se trataron conforme a las guías internacionales. Esta metodología no es 
comparable pero si complementaria por lo que en esta situación no es necesario un análisis 
estadístico propiamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 30 
Aspectos éticos 
 
El estudio se llevo acabo de acuerdo a los lineamientos establecidos de forma internacional en 
la Declaración e Helsinki de la Asociación Medica Mundial, adoptada por la 18º asamblea 
mundial (Helsinki 1964), revisada por la 29º Asamblea Medica Mundial (Tokio 1976) y 
enmendada por la 35º Asamblea Mundial (Venecia 1983) y la 41º Asamblea Mundial (Hong 
Kong 1989), 48º Asamblea General (Somerset West 1996) y 52º Asamblea General 
(Edimburgo 2000), básicamente en lo concerniente a sus pacientes, referente a principios 
básicos e investigación medica asociada a la atención profesional (Investigación Clínica). 
También se cumplió con lo establecido en el código de Núremberg de 1947 y el reporte de 
Belmont de 1979. A nivel nacional se respeto lo establecido en el Titulo 5º referente a la 
Investigación para la Salud de los Estados Unidos Mexicanos, en sus artículos 96, 100, 101, 102 
y 103. 
 
Los permisos apropiados de investigación fueron obtenidos del comité de ética, todos los 
pacientes que participaron en el estudio firmaron un consentimiento informado. No se dio 
información sobre el análisis genético realizado a ningún paciente ANEXO2. 
 
 
 
 
 
 
 
 31 
RESULTADOS 
 
Los resultados obtenidos para las muestras tumorales se describen a continuación: 6 de las 15 
muestras (40%) se observo reacción positiva para expresión de CRBP1, las 9 (60%) restantes fueron 
negativas para la reacción (Fig001). La tinciónde las células es de localización citoplasmática, en el 
caso del tejido tumoral que expresa la proteína se observa como se da la tinción en lo amplio del 
epitelio afectado (FIg002). 
 
Fig. 1 análisis de CRBP-1 por inmunohistoquímica sobre cortes 
de arreglos de tejidos. Muestra de tejido con carcinoma de mama 
negativo a expresión de CRBP-1. 
 
 
Fig. 2 análisis de CRBP-1 por inmunihistoquimica sobre cortes 
de arreglos de tejidos. Las áreas teñidas en color café muestra 
la intensa reacción en tejido mamario normal debido a la 
expresión de CRBP-1. 
 
 
 32 
Los datos del análisis por inmunohistoquímica de CRBP-1 en 45 muestras de tumores de 
mama. De las cuales 15 fueron de tejido normal en la muestra de sección. CRBP-1 fue expresado en 
todas las muestras de tejido mamario normal, pero no se expreso en 3 de 15 muestras con 
enfermedad fibroquística y en 9 de 15 muestras de carcinoma de mama. 
 La perdida de CRBP-1 no se asocio con la edad del paciente o con el estatus de receptores 
esteroideos, aunque hay una asociación con la enfermedad negativa a RP. No hay una asociación 
aparente en la expresión de CRBP-1 y el estado ganglionar o sobre expresión de HER2/neu (datos 
no mostrados). 
 La frecuencia de perdida de CRBP-1 fue similar en tumores de bajo grado comparado con 
tumores de alto grado. 
 Basado en los datos de metilación, es claro que aquellas muestras CRBP-1 negativas tienen 
el promotor metilado evitando su activación, por tanto, aquellas muestras positivas no existe 
metilación alguna en su promotor. Dado que la mayoría de las muestras de cáncer de mama no 
expresan al CRBP-1 podría sugerir que este puede ser uno de los eventos celulares que se asocian a 
la falta de respuesta de las pacientes a los tratamientos que se dan. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 33 
DISCUSION 
 
 
La proteina codificada por este gen, la cual lleva el mismo nombre (CRBP-1), ha sido ampliamente 
estudiada, debido a su marcada importancia en el metabolismo del retinol, como proteína clave para 
que este pueda ser almacenado o metabolizado para los diferentes procesos que requiera el 
organismo, tales como proliferación, diferenciación y apoptosis celular. 
 La proteina celular 1 de unión a retinol se encuentra ampliamente distribuida por el 
organismo, incluyendo el tejido mamario; su función y participación en procesos carcinogénicos ha 
sido reportada en diversos estudios para tratar de entender un poco más acerca de su importancia en 
estos procesos. La función de esta proteína quedó demostrada mediante el uso de ratones Knock-out, 
los cuales se demostró que presentaron susceptibilidad a padecer hipervitaminosis A, dentro de la 
que se encuentra, la metaplasia escamosa queratinizante. 
 Los datos reportados a la fecha en los cuales se ha estudiado la participación de esta 
proteína en diversos tipos de cáncer, tales como cáncer de mama, vejiga, colon y ovario entre otros, 
han indicado que la pérdida de la expresión de la proteína tiene una asociación con el grado de 
avance del tumor. Por lo que esto viene a corroborar estudios realizados, en los cuales se ha 
demostrado, que la presencia de esta proteína tiene efectos inhibitorios en el desarrollo de tumores 
epiteliales, por su capacidad de revertir ciertos procesos cancerosos. 
 Los mecanismos relacionados con la regulación de la expresión de la proteína hasta esa 
fecha eran poco conocidos, hasta el trabajo donde realizaron experimentos de metilación en líneas 
celulares de cáncer de mama, colón y cérvix, y muestras de cáncer gastrointestinal y linfomas donde 
se reporta que la hipermetilación de CRBP-1 se asocia con la pérdida de la expresión de la 
proteína
(94)
. 
 En el presente estudio se analizó que alteraciones genéticas y que a nivel de expresión 
estaba sufriendo esta proteína, nosotros mostramos que CRBP-1 frecuentemente no es expresado en 
 34 
cáncer de mama humano, nuestros datos no permiten distinguir entre la expansión selectiva de una 
sub población negativa a CRBP-1 de células epiteliales de cáncer de mama vs perdida especifica de 
CRBP-1 por cáncer. 
 La relevancia biológica de la falta de expresión de CRBP-1 en cáncer de mama radica en, si 
la perdida de CRBP-1 se esperaría comprometiera la captación de retinol y por ende la síntesis de 
ácido retinoico daría una ventaja en el crecimiento de las células con cáncer. 
La frecuencia de perdida de CRBP-1 fue similar en tumores de bajo grado comparado con 
tumores de alto grado. Estos hallazgos sugieren que la perdida de CRBP-1 sucede tempranamente en 
un proceso de múlti-pasos en la carcinogénesis. Por ejemplo, la perdida de CRBP-1 parece ocurrir 
antes que la perdida de RAR, la cual fue reportada a suceder en tumores mas avanzados
(99)
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 35 
CONCLUSIONES 
 
Nosotros mostramos que CRBP-1 frecuentemente no se expresa en cáncer de mama humano, de 
acuerdo a estos datos la ausencia de expresión de CRBP-1 puede sugerir que CRBP-1 puede ser un 
gen supresor en cáncer de mama 
CRBP- 1 es infra expresado en cáncer de mama permitiendo la perdida de diferenciación celular y 
progresión tumoral y pobre respuesta a los tratamientos. 
Seria interesante determinar si la disminución en los niveles de CRBP-1 también suceder en 
estadios pre malignos, mostrando disminución de los niveles de estas proteínas y explorar su valor 
pronostico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 36 
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A N E X O 1 
 49 
ANEXO 2 
 
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS DE 
INVESTIGACION CLINICA 
 
Ciudad de México, D.F, a ________de _________ de 2011 
 
Por medio de la presente acepto participar en el proyecto de investigación titulado 
 
DETERINACINO DE LA EXPRESION DE CRBP-1 EN MUJERES MEXICANAS CON CANCER DE 
MAMA 
 
autorizado por el Comité local de investigación. 
 
El objetivo de DETERMINAR LA EXPRESION DE LA PROTEINA CRBP-1 EN CANCER DE MAMA 
se me ha explicado, mi participación consistirá simplemente en someterme al procedimiento diagnostico 
de rutina y de la muestra de biopsia o del espécimen quirúrgico una parte será procesada para la 
determinación de la expresión de dicha proteína. 
 
Declaro que se me han informado 
ampliamente sobre los posibles riesgos, inconvenientes, molestias y beneficios derivados de mi 
participación en el estudio. El investigador principal se ha comprometido a darme información oportuna 
sobre cualquier duda que plantee acerca de los procedimientos que se llevaran al cabo. 
 
Entiendo que conservo el derecho de retirarme del estudio en cualquier momento en que lo considere 
conveniente, sin que ello afecte la atención médica que recibo del Instituto. 
 
Me han asegurado que no se me identificará en las presentaciones o publicaciones que deriven de este 
estudio y que los datos relacionados con mi privacidad serán manejados en forma confidencial. 
 
 
 
 
 
______________________________ ______________________________ 
Nombre y firma del paciente Nombre, matrícula y firma del 
o represente legal investigador principal 
 
 
 
 
 
_____________________________ ______________________________ 
Nombre y firma del testigo Nombre y firma del testigo 
 
 
 
 
 
	Portada
	Índice
	Resumen
	Introducción
	Justificación
	Problema a Estudiar
	Hipótesis
	Objetivo
	Material y Métodos
	Resultados
	Discusión
	Conclusiones
	Bibliografía
	Anexos