Efecto-de-la-restriccion-de-alimento-sobre-la-expresion-del-factor-nuclear-kB-NF-kB-y-sus-genes-blanco-en-el-hgado-de-rata

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
MAESTRÍA EN CIENCIAS (NEUROBIOLOGIA) 
INSTITUTO DE NEUROBIOLOGIA 
 
 
 
EFECTO DE LA RESTRICCIÓN DE ALIMENTO SOBRE LA EXPRESIÓN DEL 
FACTOR NUCLEAR κB (NF-κB) Y SUS GENES BLANCO EN EL HÍGADO DE RATA 
 
 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
MAESTRA EN CIENCIAS 
 
 
PRESENTA: 
L.N. ANA CRISTINA GARCÍA GAYTÁN 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
DRA. ISABEL MÉNDEZ HERNÁNDEZ 
INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA, UNAM. 
 
 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
DRA. YAZMÍN MACOTELA GUZMÁN 
INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA, UNAM 
 
DR. MANUEL MIRANDA ANAYA 
FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM 
 
 
CAMPUS JURIQUILLA, QUERÉTARO, DICIEMBRE 2015 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
II 
 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Instituto de Neurobiología 
Los miembros del Jurado del Examen certificamos que la tesis elaborada por Ana 
Cristina García Gaytán, cuyo título es 'Efecto de la restricción de alimento sobre la 
expresión del factor nuclear κB (NF-κB) y sus genes blanco en el hígado de rata' 
se presenta como uno de los requisitos para obtener el grado de Maestra en Ciencias 
(Neurobiología) y cumple con los criterios de originalidad y calidad requeridos por la 
División de Estudios de Posgrado de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
 Firmas 
 
Presidente 
Dr. Gonzalo Martínez de la Escalera Lorenzo __________________________ 
 
Secretario (Tutor) 
Dra. Isabel Méndez Hernández __________________________ 
 
Vocal 
Dr. Rolando Hernández Muñoz __________________________ 
 
Suplente 
Dra. Yazmín Macotela Guzmán __________________________ 
 
Suplente 
Dra. Rocío Brenda Anguiano Serrano ___________________________ 
 
Aprobada por el Comité Académico 
 
______________________________ 
Coordinador del programa: Alfredo Varela Echavarría 
 
 
III 
 
Resumen 
 
El factor nuclear κB (NF-κB) es una familia ubicua de proteínas que regulan la 
expresión de genes implicados en una gama amplia de procesos biológicos, 
principalmente en la respuesta inmunológica y la inflamación. Poco se sabe de su papel 
en estados no inflamatorios. Algunas evidencias sugieren que la subunidad p65 de NF-
κB hepático responde a retos metabólicos, como la restricción de horario de 
alimentación (RHA) en donde, posterior a la ingesta de alimento, aumenta la cantidad 
de la p65 en los núcleos de las células del hígado. Este protocolo de RHA involucra una 
restricción calórica y promueve adaptaciones metabólicas y conductuales, sin evidencia 
de inflamación sistémica. El objetivo de esta tesis fue investigar si la RHA afectaba la 
expresión génica y proteínica de la p65 y de sus genes blanco que codifican para ciclina 
D1 (reguladora de proliferación y gluconeogénesis), IAP-2 (anti-apoptótica) e ICAM-1 
(de adhesión celular). Para esta finalidad, ratas macho Wistar fueron restringidas a dos 
horas de acceso al alimento diariamente por 21 días. Se evaluó, tanto la expresión de 
los RNAm por qPCR como la cantidad relativa de la proteína p65 por Western Blot, en 
el hígado. La RHA implicó restricción calórica y los animales bajo este protocolo 
tuvieron menor glucemia que los de condiciones ad libitum (acceso libre al alimento). La 
RHA aumentó la cantidad relativa de la proteína p65 y del RNAm de la ciclina D1 en los 
horarios posteriores al acceso al alimento, sin incrementar la expresión del RNAm de 
p65. Esto sugiere que la p65 y sus genes blanco responden a este reto metabólico que 
no implica inflamación y esto podría tener un rol en la supervivencia celular y en el 
metabolismo hepático, lo cual es una novedosa perspectiva de la actividad del NF-κB. 
Palabras clave: NF-κB, metabolismo, restricción de alimento. 
 
 
 
IV 
 
Summary 
Nuclear factor κB is a family of ubiquitous transcription factors that regulate genes that 
are involved in a wide range of biological processes, mainly in immune response and 
inflammation. Little is known about its role in non-inflammatory conditions. Some 
evidences suggest that the subunit p65 of NF-κB in liver is activated by metabolic 
challenges such as restricted feeding schedules (RFS), under this protocol the nuclear 
relative quantity of p65 subunit increase in response to food intake. RFS involves calorie 
restriction and promotes metabolic and behavioral adaptations, but it does not promote 
systemic inflammation. The aim of this study was to know if RFS was able to modify: a) 
p65 gene and protein expression and b) expression of its target genes encoding cyclin 
D1 (proliferation and gluconeogenesis regulator), IAP-2 (apoptosis inhibition) and ICAM-
1 (cell adhesion molecule). For this purpose, male Wistar rats were restricted to two 
hours of daily food access during 21 days. mRNA expression was analyzed by qPCR 
and the relative quantity of p65 was analyzed by Western Blot, both in the liver of rats. 
RFS involves caloric restriction and the rats under this protocol had lower blood glucose 
concentrations than those under ad libitum conditions (free food access). RFS also 
increased the relative quantity of protein p65 and the mRNA of cyclin D1 after food 
access time, in regard to AL group. This suggest that p65 and its target genes are able 
to be modified by a metabolic challenge that does not implies systemic inflammation and 
this may affect hepatic metabolism and cell survival, giving a new perspective of NF-κB 
activity. 
Key words: NF-κB, metabolism, food restriction. 
 
 
 
V 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo se realizó en el laboratorio de Fisiología Celular del Departamento de 
Neurobiología Celular y Molecular del Instituto de Neurobiología de la Universidad 
Nacional Autónoma de México, bajo la dirección de la Dra. Isabel Méndez, 
contando con el apoyo económico de CONACYT (No. de becario 298045) y de 
DGAPA-PAPIIT (IN202515). 
 
 
 
 
VI 
 
Agradecimientos 
 
Agradezco enormemente a todas aquellas personas que contribuyeron directa o 
indirectamente al desarrollo de este trabajo. En primer lugar a la doctora Isabel Méndez 
por aceptar guiarme durante toda la maestría, con su consejo, supervisión y asesoría 
como investigadora en el proyecto, pero también por su apoyo personal por motivarme 
día a día a seguir en el camino de la ciencia. 
Así mismo, al doctor Manuel Miranda y la doctora Yazmín Macotela quienes formaron 
parte de mi comité tutor y me proporcionaron acertadas observaciones y aportaciones 
para fortalecer la investigación. Así mismo agradezco a mi jurado, los doctores Gonzalo 
de la Escalera, Rolando Hernández y las doctoras Isabel Méndez, Yazmín Macotela y 
Brenda Anguiano por su apoyo en el fortalecimiento del contenido y presentación del 
presente trabajo así como por sus acertadas y valiosas aportaciones. 
Agradezco al doctor Mauricio Díaz por aceptarme como parte de su laboratorio y 
porque además me proporcionó confianza en mí misma, teniendo siempre un sabio 
consejo y preocupación sincera por mi desarrollo, tanto profesional como personal. 
A los integrantes del laboratorio de fisiología celular del INB, por su amistad y compañía 
y por compartir conmigo día a día sus experiencias y ayudarme a creceren todos los 
aspectos. A Isaías Turrubiate, por su gran apoyo y compañía durante mi estancia en 
este laboratorio. 
 
 
 
 
 
 
VII 
 
Agradecimiento institucional 
 
Agradezco a la Coordinación de Posgrado, en especial a la M. en C. Leonor Casanova 
y a Guadalupe Amador por su asesoría en todo momento para llevar a cabo todos los 
trámites administrativos que la Maestría demanda. A la Dra. Olivia Vázquez y al 
nutriólogo Fernando López por su apoyo técnico y por su amistad. A nuestro 
laboratorista Raúl por su trabajo diario dentro del laboratorio. A la Unidad de 
Proteogenómica en especial a la M. en C. Adriana González Gallardo por permitirme 
hacer uso de sus instalaciones y asesorarme en el uso de los equipos. Al MVZ José 
Martín García y a la Dra. Alejandra Castilla del bioterio. Al Ing. Omar González 
Hernández por ayudarme a hacer uso de las redes y solucionar problemas con mi 
ordenador. 
Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Becario No. 298045) por 
apoyarme económicamente con una beca del inicio al fin de este posgrado. También al 
financiamiento de la DGAPA-PAPIIT (IN202515). 
 
 
 
 
 
VIII 
 
 
Dedicatorias 
 
 
 
 
Por supuesto, a mis padres Ana Luisa Gaytán y Miguel Ángel García, quienes toda la 
vida me han brindado amor y apoyo incondicional y esta vez no fue la excepción. 
A mis hermanos Lorena Natalí y Miguel Alejandro, a los cuales quiero y admiro 
profundamente y que además son motivadores natos que me ayudan a mantener la 
frente en alto a pesar de las dificultades. 
A mi compañero de vida, Javier Ceballos que me toma de la mano a cada paso para 
caminar a mi lado e impulsarme a ser mejor persona. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sólo la pasión mueve los límites. 
Nick Vujicic 
 
 
 
 
IX 
 
ÍNDICE 
 
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................................... 1 
ANTECEDENTES ....................................................................................................................................... 2 
1. El NF-κB - Una familia de factores de transcripción .......................................................................... 2 
1.1 Regulación de la actividad del NF-κB .......................................................................................... 3 
1.2 Genes blanco del NF-κB .............................................................................................................. 5 
1.3 El papel del NF-κB en la regulación del metabolismo .................................................................. 6 
2 La restricción de horario de alimentación en la actividad y el metabolismo. ...................................... 8 
JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................................... 13 
HIPÓTESIS .............................................................................................................................................. 14 
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................................... 15 
Objetivos específicos ......................................................................................................................... 15 
MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................................................... 16 
Sujetos experimentales ...................................................................................................................... 16 
Diseño experimental .......................................................................................................................... 16 
Registro de peso y consumo de alimento ........................................................................................... 17 
Obtención de muestras de hígado ...................................................................................................... 18 
Técnicas analíticas ............................................................................................................................. 18 
Homogenizado celular ....................................................................................................................... 18 
Western blot ...................................................................................................................................... 19 
PCR en tiempo real ............................................................................................................................ 19 
Registro de la actividad locomotriz ..................................................................................................... 20 
Análisis estadístico de los datos ......................................................................................................... 21 
RESULTADOS ......................................................................................................................................... 22 
Cambios en la ingesta de alimento y somatometría por la RHA. ......................................................... 22 
Actividad anticipatoria al alimento inducida por la RHA ..................................................................... 28 
Expresión del RNA mensajero de la p65 ............................................................................................. 30 
Efecto de la RHA en la concentración de la proteína p65 .................................................................... 33 
Efecto de la RHA en la expresión de genes blanco de la proteína p65 ................................................. 36 
 
 
X 
 
DISCUSIÓN ............................................................................................................................................. 41 
CONCLUSIONES ..................................................................................................................................... 47 
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................................. 48 
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................................ 53 
ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................................................. 55 
 
 
 
 
 
1 
 
INTRODUCCIÓN 
El NF-κB es un complejo de proteínas con función de factores de transcripción que 
regulan la expresión de genes relacionados con una amplia variedad de procesos 
biológicos como la respuesta inmunológica, la proliferación y el desarrollo. Su actividad 
está implicada en algunas patologías como la aterosclerosis, la obesidad y el cáncer; 
sin embargo se sabe poco de su regulación en condiciones fisiológicas. Algunos 
antecedentes sugieren que el NF-κB forma parte de la regulación del metabolismo de la 
glucosa y los lípidos. El hígado es un órgano en donde se llevan a cabo gran parte de 
los procesos involucrados en la regulación de estas vías metabólicas y que por lo tanto 
responde a diferentes condiciones de alimentación. En el protocolo de restricción del 
horario de alimentación (RHA) utilizado en este estudio, se somete al organismo a 
ayunos prolongados constantes con tiempos cortos de alimentación, lo que significa un 
reto metabólico que involucra restricción calórica y que modifica las oscilaciones diarias 
de diferentes parámetros biológicos, obligando al organismo a adaptaciones del 
metabolismo y de otros procesos celulares en función de la presencia o ausencia del 
alimento [1]. En el hígado de roedores, estas adaptaciones incluyen cambios en los 
patrones rítmicos de hormonas, enzimas y sustratos del metabolismo como la glucosa, 
[2] y los ácidos grasos [3], así como de marcadoresde proliferación y apoptosis [4]. La 
RHA también promueve una mayor cantidad relativa de la subunidad p65 del NF-κB en 
el núcleo [5] sin inducir inflamación sistémica. La p65 induce la transcripción de genes 
relacionados con el metabolismo y la supervivencia celular; sin embargo, se desconoce 
su participación en las adaptaciones del hígado ante la restricción de alimento. En este 
estudio se analizaron los efectos de la RHA sobre la expresión del RNA mensajero de 
la proteína que codifica para la p65, la cantidad relativa de la proteína p65 y la 
expresión de algunos de sus genes blanco. 
 
 
 
2 
 
ANTECEDENTES 
1. El NF-κB - Una familia de factores de transcripción 
 
El NF-κB (llamada así por las siglas en inglés de nuclear factor kappa of activated B 
cells) es una familia de factores de transcripción que regula una gran cantidad de 
procesos biológicos, como la respuesta inmunológica, la apoptosis y la proliferación [6] 
(figura 1). Aunque el NF-κB se identificó por primera vez en células del sistema 
inmunológico, en la actualidad se conoce que se encuentra presente en todos los 
tejidos incluido el hígado [7]. 
 
 
Figura 1. Algunas funciones en las que la actividad del NF-κB está implicada. La familia de factores de transcripción κB regula 
una serie genes clave en procesos fisiológicos que son de alta importancia para la homeostasis de los tejidos. 
 
La familia NF-κB está integrada por las proteínas p50, p52, p65 (RelA), RelB y c-Rel, 
que forman homodímeros o heterodímeros, cuya vía de señalización está altamente 
conservada en la evolución [8]. Estas proteínas comparten estructuralmente un dominio 
de homología a Rel (RHD) que media su dimerización y translocación al núcleo. Los 
dímeros del NF-κB se unen a sitios κB dentro de algunas regiones promotoras o 
potenciadoras de sus genes blanco y de esta forma regulan la transcripción a través del 
reclutamiento de co-activadores y co-represores. Algunos miembros de esta familia 
como p65, RelB y c-Rel poseen el dominio de transactivación (TAD) en su extremo C-
terminal, el cual es necesario para la regulación positiva de la expresión de genes 
Supervivencia Proliferación AngiogénesisInvasión Metástasis
 
blanco, mientras que el resto de los miembros que carecen de este dominio tienen un 
papel represor de la transcripción, a menos que formen dímeros con alguna subunidad 
con TAD [6] (figura 2). 
 
Figura 2. Familia de factores de transcripción NF
pueden reconocer dos dominios funcionales importantes: el dominio de homología Rel (RHD) que está presente en las 5 
proteínas del grupo y el dominio de transactivació
dominio de transactivación favorece que la proteína que lo posee se una al DNA y se inicie la transcripción de los genes blan
 
El dímero funcional que en la literatura se ha r
inflamatorios, pero que también se tienen algunas evidencias de que participa en el 
metabolismo es el formado por 
secuestrado en el citoplasma por proteínas denominadas inhibidor
atrapan la secuencia de localización nuclear (NLS) y el sitio de unión al DNA de
[6], impidiendo su translocación al núcleo e inhibiendo su activación
 
1.1 Regulación de la actividad de
 
La señalización del NF-κB comprende 
La vía canónica se ha descrito para diversos tipos celulares e incluye la activación del 
dímero p65:p50, mientras que la no canónica se ha descrito para las células B y se 
Familia NF
blanco, mientras que el resto de los miembros que carecen de este dominio tienen un 
represor de la transcripción, a menos que formen dímeros con alguna subunidad 
 
transcripción NF-κB. Caricatura de las proteínas que forman parte de la familia NF
pueden reconocer dos dominios funcionales importantes: el dominio de homología Rel (RHD) que está presente en las 5 
proteínas del grupo y el dominio de transactivación (TAD) que sólo se encuentra presente en las proteínas p65, RelB y c
dominio de transactivación favorece que la proteína que lo posee se una al DNA y se inicie la transcripción de los genes blan
que en la literatura se ha relacionado más con procesos 
s, pero que también se tienen algunas evidencias de que participa en el 
es el formado por la p65 y la p50 [9]. Este dímero se encuentra 
secuestrado en el citoplasma por proteínas denominadas inhibidor
atrapan la secuencia de localización nuclear (NLS) y el sitio de unión al DNA de
, impidiendo su translocación al núcleo e inhibiendo su activación
.1 Regulación de la actividad del NF-κB 
B comprende dos vías, la canónica o clásica y la no canónica. 
La vía canónica se ha descrito para diversos tipos celulares e incluye la activación del 
mientras que la no canónica se ha descrito para las células B y se 
Familia NF-κB 
 
3 
 
blanco, mientras que el resto de los miembros que carecen de este dominio tienen un 
represor de la transcripción, a menos que formen dímeros con alguna subunidad 
 
Caricatura de las proteínas que forman parte de la familia NF-κB. Se 
pueden reconocer dos dominios funcionales importantes: el dominio de homología Rel (RHD) que está presente en las 5 
n (TAD) que sólo se encuentra presente en las proteínas p65, RelB y c-Rel. El 
dominio de transactivación favorece que la proteína que lo posee se una al DNA y se inicie la transcripción de los genes blanco. 
elacionado más con procesos 
s, pero que también se tienen algunas evidencias de que participa en el 
. Este dímero se encuentra 
secuestrado en el citoplasma por proteínas denominadas inhibidoras de κB (IκB) que 
atrapan la secuencia de localización nuclear (NLS) y el sitio de unión al DNA de la p65 
, impidiendo su translocación al núcleo e inhibiendo su activación (figura 2). 
, la canónica o clásica y la no canónica. 
La vía canónica se ha descrito para diversos tipos celulares e incluye la activación del 
mientras que la no canónica se ha descrito para las células B y se 
 
 
4 
 
refiere a la vía mediante la cual se activa el dímero p100:RelB. En el presente trabajo 
haremos énfasis en la vía canónica. Una gama amplia de estímulos activan la vía de 
señalización del NF-κB, entre los que se encuentran: señales inflamatorias, moléculas 
derivadas de patógenos, estrés oxidativo y algunos intermediarios metabólicos como 
algunos ácidos grasos saturados [10,11]. Esta activación produce que la cinasa de IκB 
(IKKβ) fosforile a la proteína IκB en residuos de serina. Dicha fosforilación induce la 
ubiquitinación de IκB y su posterior degradación en el proteosoma, dando paso a la 
liberación de la NLS del NF-κB, lo cual facilita su translocación al núcleo [12] (figura 3). 
 
Figura 3. Vía de señalización del dímero p65:p50 del NF-κB. Diversos estímulos como activan a receptores integrales de 
membrana, lo que activa a la enzima cinasa de IκB (IKK), que es un complejo de proteínas formado por la proteína NEMO, IKK1 e 
IKK2, esto favorece la fosforilación y posterior degradación de las proteínas IκB, exponiendo la secuencia de localización nuclear 
(NLS) de la p65, lo que permite su translocación al núcleo, una vez en el núcleo el dímero p50-p65 se une al DNA, iniciando la 
activación de sus genes blanco. 
 
Una serie de modificaciones pos-traduccionales inducen la actividad transcripcional de 
la p65 y de estas, la fosforilación de serinas o treoninas es la modificación pos-
traduccional más relacionada con la actividad transcripcional del NF-κB [13]. Estas 
modificaciones se llevan a cabo por cinasas que son parte de la vía de señalización κB 
o por algunas enzimas de diferentes vías metabólicas, ya que favorecen la habilidad del 
Estrés 
ambiental
Membrana celular
Citoplasma
Estrés 
metabólico
TNF-a, IL-1, 
IL-6
Moléculas derivadas
de patógenos
Señales de
crecimiento
Transcripción 
de genesNúcleo
Inhibidor de IKK-2
Il-6
Ccnd1 
Birc2
Icam1
 
 
5 
 
NF-κB de interaccionar con diversos co-activadores que favorecerán la transcripción de 
genes blanco involucrados en una amplia variedad de procesos biológicos.1.2 Genes blanco del NF-κB 
 
Las proteínas que forman parte de la familia del NF-κB tienen la capacidad de regular 
una gran cantidad de genes involucrados en procesos de inflamación (por ejemplo: Il6, 
Il10 y Tnf), de proliferación (Ccnd1), de supervivencia (Birc2) y de adhesión (Icam1) 
[14]. El gen Ccnd1 codifica para la proteína ciclina D1, clásicamente descrita como una 
proteína reguladora del ciclo celular, forma un complejo con Cdk4 o Cdk6 y su 
incremento dentro de la célula permite el paso de la fase G1 a la fase S del ciclo. 
Recientemente se demostró en ratones, que la ciclina D1 participa en la regulación de 
la gluconeogénesis, proceso de biosíntesis de glucosa y lo hace de manera 
independiente de la progresión del ciclo celular. En este sentido, la realimentación 
posterior a un ayuno provoca el aumento en la expresión de ciclina D1 en hepatocitos 
post-mitóticos. Por su parte, la insulina a través de inhibir la actividad de la glucógeno 
sintasa cinasa 3-beta (GSK-3β) evita la fosforilación de la ciclina D1, siendo esto una 
señal para su translocación al núcleo y evitando su degradación. La ciclina D1 en el 
núcleo induce río abajo la actividad de la acetil-transferasa GCN5 que acetila e inhibe al 
co-activador PGC-1α y esto lleva a la disminución de la transcripción de genes 
gluconeogénicos [15]. Por lo tanto, la ciclina D1 nuclear inhibe la gluconeogénesis 
independientemente de la progresión del ciclo celular. Por otra parte, es bien conocido 
que altas concentraciones de glucosa e insulina inducen la síntesis de lípidos en forma 
de ácidos grasos y triglicéridos en un proceso conocido como lipogénesis, y esto lo 
hacen promoviendo la transcripción de genes lipogénicos. La ciclina D1 también tiene 
un papel inhibitorio en la regulación de la lipogénesis hepática inducida por glucosa, a 
través de la inhibición de la expresión y de la actividad de la proteína de unión al 
elemento de respuesta a los hidratos de carbono (ChREBP) y de la inhibición de la 
unión del factor nuclear de hepatocitos 4α (HNF4α) a sitios promotores y esto resulta en 
 
 
6 
 
la inhibición de la expresión de genes lipogénicos en el hígado tras una ingesta con alto 
contenido de carbohidratos, en acciones dependientes e independientes de CDK4 [16]. 
 
El gen Birc2 codifica para la proteína cIAP, que pertenece a una familia de proteínas 
inhibidoras de la apoptosis (IAP). Este grupo de proteínas también es parte de la 
respuesta inmunológica y de la inflamación; se ha identificado tanto a cIAP1 como a 
cIAP2 como reguladoras y como genes blanco del NF-κB [17]. Ambas proteínas se 
encuentran ampliamente distribuidas en diversos tejidos como el hígado, el riñón, los 
pulmones y el sistema nervioso central [18,19]. Estas proteínas tienen un dominio de 
reclutamiento de caspasa y un dominio RING que puede funcionar como una ligasa E 
[20] lo que permite que su acción inhibitoria de la apoptosis. 
Icam1 es un gen que codifica para la proteína del mismo nombre, molécula de adhesión 
intercelular 1 (ICAM-1) y es otro gen blanco del NF-κB. Tejidos endoteliales y células 
del sistema inmunológico expresan esta proteína en pocas cantidades de manera 
constitutiva y ante un estímulo nocivo al organismo se incrementa la expresión de su 
mensajero y de su proteína. La presencia de esta proteína en un tejido se utiliza como 
indicador de la magnitud de inflamación ya que es una glicoproteína esencial en la 
migración de leucocitos y linfocitos T hacia el sitio de la lesión [21]. En el hígado, 
además del endotelio, los hepatocitos expresan ICAM-1 en niveles bajos [22], aunque 
no se conoce su función en condiciones no inflamatorias. 
 
1.3 El papel del NF-κB en la regulación del metabolismo 
 
Como se mencionó previamente, la actividad transcripcional del NF-κB está presente en 
condiciones que involucran inflamación, supervivencia y al metabolismo y se ha 
estudiado ampliamente en patologías como la obesidad y la diabetes mellitus [23]. 
 
Algunas evidencias muestran el efecto regulador de la actividad del NF-κB sobre el 
metabolismo energético. En este sentido, la sobreexpresión de la p65 a través de 
 
 
7 
 
manipulaciones genéticas en ratones tiene efectos en el tejido adiposo, ya que aumenta 
el gasto de energía, inhibe la diferenciación de los adipocitos y disminuye la hipertrofia 
del tejido adiposo [24]. La sobre-expresión de la p65 induce aumento en citocinas pro-
inflamatorias, las cuales confieren resistencia a la obesidad sin modificar el consumo de 
alimento y sin inducir resistencia a la insulina aun con dieta alta en grasa; la presencia 
de inflamación en el tejido adiposo de ratones no obesos tiene efectos benéficos para la 
homeostasis metabólica, ya que la activación constitutiva de la IKKβ, induce la 
translocación de la subunidad p65 del NF-κB al núcleo, disminuye la glucemia, mejora 
la tolerancia a la glucosa y a la insulina y disminuye el peso de los depósitos de tejido 
adiposo blanco [25]. Esta conclusión es apoyada por estudios en modelos 
genéticamente modificados en donde se disminuye o se incrementa la expresión de 
genes que codifican para algunas interleucinas o por estudios en donde el uso de 
drogas anti-inflamatorias inducen ganancia de peso y acumulación de grasa [26,27]. 
 
Contrario a la gran cantidad de estudios que demuestran la participación del NF-κB en 
los estados inflamatorios inducidos en patologías metabólicas, algunas evidencias 
muestran que la activación de este factor de transcripción no solamente se induce en 
respuesta a estrés metabólico. Estudios realizados en sujetos no obesos, demostraron 
el aumento de la subunidad p65 del NF-κB en el núcleo de células mononucleares de 
sangre periférica, como respuesta a la ingesta del alimento [28]. El aumento en la 
activación del NF-κB quizá esté favorecido por el incremento de la producción de 
especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas por la actividad mitocondrial en función 
de la ingesta de alimento [29]. La activación del NF-κB se ha asociado al aumento de 
moléculas pro-inflamatorias como ICAM-1 soluble en sangre posterior al consumo con 
carbohidratos de alto índice glucémico [28], así como en respuesta a una infusión de 
ácidos grasos [30] y a la ingesta de una comida con alto contenido de azúcares, 
proteínas y grasas [31]. El contenido energético de la dieta tiene influencia en la 
activación del NF-κB. En modelos murinos y en humanos, la restricción calórica 
promueve la disminución en la activación del NF-κB en comparación con la 
alimentación ad libitum (AL) [32], siendo este un ejemplo de cómo el estado energético 
inducido por la dieta modifica la actividad del NF-κB. 
 
 
8 
 
 
El hígado es uno de los reguladores centrales del metabolismo en el organismo. 
Participa en el mantenimiento de los niveles apropiados de nutrientes en sangre y en la 
homeostasis metabólica. La actividad del NF-κB en el hígado bajo condiciones 
fisiológicas y ante retos metabólicos se ha estudiado escasamente y siendo este órgano 
tan importante en la homeostasis metabólica resulta relevante conocer si el NF-κB 
participa en esta regulación. A este respecto, la restricción de horario de alimentación, 
que involucra pocas horas de alimento al día y restricción calórica, induce la 
translocación de la p65 al núcleo en el horario posterior al acceso al alimento, en el 
hígado de ratas [5]. En este último modelo, no se conoce si la respuesta de la p65 
impacte en genes blanco que afecten al metabolismo y/o a la supervivencia del hígado. 
Aunque en rata no se ha demostrado, se sabe que la translocación de la p65 al núcleo 
células hepáticas de ratones presenta variaciones circadianas en ausencia de estímulos 
pro-inflamatorios [33]. Por otro lado, en líneas celulares de hepatocitos, dosis elevadas 
de glucosa incrementan la actividad transcripcional del NF-κB evaluada en términos de 
actividad de luciferasa, en ausenciade otros activadores como interleucinas [34]. Estos 
antecedentes ponen de manifiesto que el NF-κB responde a cambios en el metabolismo 
energético en el hígado y que podría tener un papel en el metabolismo hepático. 
 
2 La restricción de horario de alimentación en la actividad y el metabolismo. 
 
La restricción del horario del alimento (RHA) es el protocolo en donde el acceso al 
alimento se limita a un período corto del día durante la etapa de reposo del animal y 
esto se hace de forma repetida a lo largo de 21 días [35]. Esto tiene efectos sobre los 
ritmos biológicos (oscilaciones de parámetros fisiológicos como la secreción hormonal y 
la conducta), los cuales tienen la capacidad de modificarse por la presencia o ausencia 
de factores externos (sincronizadores o zeitgebers) como la luz y el alimento, fenómeno 
conocido como sincronización. Esta sincronización permite que los organismos se 
adapten de mejor manera a los cambios en el ambiente y es un reflejo de la plasticidad 
de la fisiología de los organismos para permitir la supervivencia [35]. En roedores, la 
 
 
9 
 
exposición a una RHA pone de manifiesto a un reloj biológico circadiano que ha sido 
denominado oscilador sincronizado por alimento (OSA), el cual promueve que los 
ritmos de parámetros moleculares, hormonales y conductuales se modifiquen en 
función de la presencia del alimento. Dentro de estos parámetros se ha definido que la 
corticosterona, la temperatura corporal y la actividad locomotriz incrementan en las 
horas previas al acceso al alimento. También hay una marcada hiperfagia y una 
disrupción del periodo de descanso [36] . Así mismo hay mayor lipólisis, menor cantidad 
de triacilgliceroles hepáticos [37] y mayor activación de enzimas gluconeogénicas [2]. El 
OSA tiene ritmos cercanos a 24 h, es decir, sólo se presenta si el estímulo se da en 
periodos cercanos a este tiempo y persiste 4 ó 5 días después de haber quitado el 
estímulo (la presentación de la comida a una hora establecida) y en condiciones de 
oscuridad constante [36]. 
 
La manifestación observable de la presencia del OSA es el incremento de actividad en 
las 3 o 4 horas previas al acceso al alimento, conducta que ha sido denominada 
actividad anticipatoria al alimento (AAA) [38,39]. Esta actividad anticipatoria no depende 
de estímulos olfativos o gustativos, si no de las que podría ser el reflejo de los cambios 
en el metabolismo energético de acuerdo a las características nutricionales que resultan 
de la restricción del alimento [3]. Se propone que la AAA es una adaptación del 
organismo para incrementar la actividad cuando es más probable encontrar el alimento 
y la disminución de esta cuando no es necesaria, lo que se traduce en la optimización 
del gasto energético [40]. La anticipación al alimento también prepara al organismo a 
recibir el alimento a través del incremento en la secreción colinérgica vagal que a su 
vez incrementa la secreción enzimática, para mejorar la eficiencia con la cual digiere el 
alimento y absorbe y metaboliza los nutrientes [41,42]. Esta anticipación es endógena y 
tienen participación del sistema circadiano ya que se presenta a una hora determinada 
en ausencia de estímulos externos como la luz [35]. 
 
La sincronización inducida por la RHA permite ver un re-arreglo de los parámetros 
fisiológicos y este último se refleja en un patrón de oscilaciones diferente al que se 
observa en ratas alimentadas ad libitum, por lo que la implementación de este tipo de 
 
 
10 
 
manipulaciones permite explorar, entre otras cosas, la plasticidad que presentan los 
organismos para adaptar su fisiología a retos ambientales y la temporalidad con la que 
se presentan dichas adaptaciones. 
 
El protocolo de restricción de horario de alimento, en donde se da acceso al alimento 
por 2 h al día diariamente a las ratas, implica una restricción calórica de 
aproximadamente 30% al final de los 21 días del experimento [43] y ocasiona la pérdida 
de peso y de tejido adiposo blanco. Esta RHA presenta cambios en parámetros ya 
antes descritos para la restricción calórica, por ejemplo, hay disminución del promedio 
diario de glucemia, hay incremento del metabolismo gluconeogénico en función del 
incremento de hormonas gluconeogénicas como los glucocorticoides y el glucagon; por 
otro lado y hay disminución de la insulinemia [2]. Desde una perspectiva circadiana, se 
observan cambios en la hora en la que se presentan algunas variables fisiológicas, tal 
es el caso de la temperatura corporal, las enzimas digestivas y la actividad eléctrica del 
intestino [3]. Este ajuste de la actividad circadiana en función de la ingesta y el balance 
energético se ha relacionado con la expresión del OSA, el cual obedece a la estrecha 
asociación entre el sistema digestivo, los procesos endocrinos y el efecto que esto tiene 
sobre el sistema nervioso central [36]. 
 
Durante la RHA la principal fuente de energía es la oxidación de lípidos y esto favorece 
que en el hígado sólo haya una degradación parcial de glucógeno [44]; que el estado 
redox en la mitocondria y en el citoplasma se incline hacia la oxidación, dado que 
aumenta la relación NAD/NADH y la carga energética del hepatocito se incrementa en 
función de la relación ATP/ADP/AMP [3]. También se sabe que la RHA incrementa la 
presencia de la sirtuína-1 deacetilasa dependiente de NAD (SIRT1) en el hígado, esta 
enzima tiene efectos sobre el metabolismo energético y regula una gran cantidad de 
procesos a nivel epigenético silenciando o incrementando la actividad de algunos 
factores de transcripción como la familia FoxO [2] y se sabe que puede inhibir la 
actividad del NF-κB [45]. El estado oxidado predominante que subyace a la RHA podría 
favorecer la actividad de SIRT1 y esto podría tener un papel en la regulación de genes 
gluconeogénicos a través de un mecanismo dependiente del NF-κB [2]. 
 
 
11 
 
 
Por tanto, este protocolo de RHA proporciona dos mecanismos que impactan en la 
fisiología del organismo y en el metabolismo de los nutrientes: la restricción calórica y la 
manifestación el OSA. Resulta interesante que la relación entre el sistema circadiano y 
el metabolismo no es unidireccional, si no que los dos tienen la capacidad de influir en 
el otro [46]. Es decir, la forma en la que se presenta el alimento en el protocolo RHA 
(una vez al día durante dos horas en un horario fijo) favorece la restricción calórica y 
también modifica parámetros de los ritmos biológicos. 
 
La RHA no implica un estado inflamatorio sistémico, ya que en el suero de ratas 
alimentadas bajo la restricción de alimento los niveles de citocinas son similares a las 
ratas alimentadas ad libitum [5]. Bajo estas condiciones, como se mencionó 
previamente, se observó en cortes de hígado a través de la técnica de 
inmunohistoquímica, que había incremento en la cantidad relativa del NF-κB nuclear 
justo después de la ingesta de alimento en las ratas alimentadas bajo la restricción [5], 
pero aún se desconocen las implicaciones de esta activación del κB sobre diferentes 
aspectos de la fisiología hepática como el metabolismo, la proliferación o la 
supervivencia celular. Tampoco se conoce si este incremento nuclear de la proteína 
p65 del NF-κB se origina por modificaciones pos-transcripcionales o pos-traduccionales. 
El análisis de la cantidad de RNAm del gen codifica para la p65, de la cantidad relativa 
de la proteína y de la cantidad de RNAm de los genes blanco de la p65 en diferentes 
puntos temporales, puede ofrecer una perspectiva más amplia acerca de los 
mecanismos que pudieran estar implicados en dicha regulación. 
 
Con los antecedentes previos proponemos que tanto el RNAm como la proteína de la 
subunidad p65 del NF-κB puede presentar variaciones a lo largo del día pueden ser 
modificadas bajo el protocolo de restricción por alimento y estas variaciones pueden 
tener influencia sobre las adaptacionesya previamente descritas. Por esta razón, 
utilizaremos la RHA como modelo para aportar una pieza más al conocimiento del papel 
que desempeña este factor de transcripción en la fisiología hepática. 
 
 
12 
 
 
Tabla 1. Resumen de los cambios fisiológicos que induce la restricción de horario de alimento. Se presentan lo que se ha 
descrito en la literatura acerca de este protocolo de restricción de horario de alimento. 
Ad libitum RHA 
Normal Ingesta energética Disminuida 
No presente Actividad anticipatoria al alimento Presente 
Normoglucemia, sin variaciones Glucemia 
Aparente hipoglucemia con 
variaciones en el día 
Normal Tolerancia a la glucosa Incrementada 
No necesario Metabolismo gluconeogénico Incrementado 
Incrementada Adipogénesis Disminuida 
No presente Modificaciones circadianas 
Modificación de horario de 
activación de enzimas digestivas, y 
de los incrementos de la 
temperatura corporal. Se 
robustecen los ritmos circadianos. 
No presente Inflamación No presente 
 
 
 
 
13 
 
JUSTIFICACIÓN 
 
Clásicamente, se sabe que la p65 del NF-κB puede responder a estímulos pro-
inflamatorios, pero también a la modificación del estado redox propiciada por la 
activación de diversas vías metabólicas y la activación de esta proteína incrementa la 
transcripción de genes pro-inflamatorios, así como de genes que intervienen en vías 
gluconeogénicas y de otros que inhiben la apoptosis y que favorecen la proliferación. 
Algunas evidencias más recientes en la literatura científica también sugieren que la 
subunidad p65 del NF-κB responde a la generación de estrés oxidativo, a 
concentraciones elevadas de glucosa o al incremento de especies reactivas de 
oxígeno; también hay evidencia que sugiere que la activación de este factor de 
transcripción está involucrado en la inhibición de la adipogénesis, en la tolerancia a la 
glucosa y en la generación de depósitos de tejido adiposo blanco. El hígado es uno de 
los principales órganos reguladores del metabolismo de la glucosa y de los lípidos, sin 
embargo, se conoce poco acerca del papel de la p65 en el metabolismo hepático El 
modelo de restricción de horario de alimentación implica un estado fisiológico 
emergente no inflamatorio, que permite observar las adaptaciones que ocurren en el 
metabolismo hepático a lo largo del tiempo; entre estas adaptaciones es pertinente 
mencionar la disminución de los depósitos de tejido adiposo blanco, el incremento de la 
glucemia y de la insulinemia en el horario posterior a la ingesta del alimento y en el 
mismo horario se incrementa la cantidad relativa de la p65 en el núcleo de células del 
tejido hepático. Derivado de lo anterior, consideramos que la RHA es un buen modelo 
para ampliar nuestro conocimiento acerca de los mecanismos que subyacen al 
incremento de la proteína p65 en el núcleo y del efecto que esto podría tener sobre la 
transcripción de sus genes blanco. 
 
 
 
14 
 
HIPÓTESIS 
 
En el hígado de ratas sometidas al protocolo de restricción de horario de alimento, se 
incrementará tanto la transcripción del RNAm, como la cantidad relativa de la proteína 
de la p65, lo que inducirá el incremento de la transcripción de los genes blanco de este 
factor de transcripción en los horarios posteriores a la ingesta del alimento. 
 
 
 
 
 
15 
 
OBJETIVO GENERAL 
 
Caracterizar los perfiles temporales de: el RNA mensajero de la subunidad de p65 del 
NF-κB, la proteína p65 y los genes blanco que codifican para ciclina D1, para IAP-2 y 
para ICAM-1 durante un periodo de 24 horas, en condiciones de alimentación ad libitum 
y bajo la restricción del horario de alimentación. 
Objetivos específicos 
 
1. Corroborar la restricción calórica y la presencia del OSA a través de la ganancia de 
peso, el consumo de alimento, peso de los tejidos y la actividad locomotriz de las ratas 
a lo largo de los 21 días de la RHA. 
 
2. Analizar los niveles de expresión del RNA mensajero de Rela (que codifica para la 
proteína p65 del NF-κB) y de los genes blanco del NF-κB de Ccnd1 (el que codifica 
para ciclina D1, reguladora de la proliferación celular), de Birc2 (que codifica para la 
proteína reguladora de la apoptosis IAP-2) y de Icam1 (el que codifica para la proteína 
ICAM-1, con propiedades de adhesión intercelular) en un periodo de 24 horas en 
condiciones de alimentación ad libitum y ante la RHA. 
 
3. Evaluar si la concentración de la subunidad p65 del NF-κB en homogenizado tiene 
variaciones a lo largo de 24 horas de manera diferencial en el protocolo de RHA. 
 
 
 
 
16 
 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
Sujetos experimentales 
 
Ratas macho Wistar (180-220 g al inicio del experimento) se mantuvieron en cajas de 4 
ratas para los análisis de RNA mensajero y proteínas. Para la medición de la actividad, 
se mantuvieron en cajas individuales. Estuvieron en condiciones de ciclos ciclos luz-
oscuridad 12:12 (encendido de la luz a las 8:00 hrs), a temperatura constante (22°C ± 
1) y con libre acceso al alimento (dieta de roedor 5001 de LabDiet, Brentwood, 
Missouri) y agua durante los tres días de adaptación previos al inicio del experimento. 
El procedimiento experimental fue aprobado por el Comité de Bioética del Instituto de 
Neurobiología, UNAM y se realizó de acuerdo a la "Guía para el cuidado y uso de 
animales de experimentación" de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
 
Diseño experimental 
 
Para el análisis de los perfiles temporales del efecto de la restricción de alimento, las 
ratas se asignaron al azar a cualquiera de los siguientes grupos: 
1. Grupos ad-libitum (AL): los animales control se mantuvieron con acceso libre al 
alimento y al agua durante las 24 horas del día. 
2. Grupo de restricción de horario de alimentación (RHA): los animales experimentales 
se mantuvieron con acceso al alimento durante 2 horas diariamente (de 12:00 a 14:00 
h) y libre acceso al agua. 
 
Después de 21 días, subgrupos de 4 animales se sacrificaron para obtener las 
muestras de hígado, con intervalos de 3 horas, iniciando a las 8 h hasta terminar un 
ciclo completo de 24 horas (8:00, 11:00, 14:00, 17:00, 20:00, 23:00, 2:00 y 5:00 h). 
 
También se tuvieron controles de cambios agudos en la alimentación: 
 
 
17 
 
 
a) Grupo de ayuno (AY): animales que estaban bajo alimentación ad libitum se 
sometieron a un ayuno único de 22 horas y posteriormente se sacrificaron a las 11:00 h. 
 
b) Grupo de ayuno-realimentación (RE): animales que estaban bajo alimentación ad 
libitum se sometieron a un ayuno de 22 h y se realimentaron por 2 h, inmediatamente 
después para ser sacrificados a las 14:00 h. 
 
Registro de peso y consumo de alimento 
 
El peso corporal de las ratas bajo alimentación RHA y AL se registró cada semana 
antes del apagado de las luces. El consumo del alimento se midió diariamente, pesando 
el alimento antes y después del horario de alimentación. 
 
Perfiles de glucosa y test de tolerancia a la glucosa 
 
Para el perfil diario de glucosa, el día 20 del experimento se seleccionaron al azar 5 
ratas de cada grupo experimental a las que se les tomó una pequeña gota de sangre de 
la cola cada 3 horas empezando a las 17:00 h y terminando a las 14:00 h del día 
siguiente aplicándola directamente sobre las tiras reactivas del glucómetro (Contour TS 
de Bayer), tomándose el registro para su posterior análisis. Para la curva de tolerancia 
a la glucosa se seleccionaron otras 5 ratas de cada grupo a las cuales se les dejó 
ayunar durante 8 horas. Finalizado este periodo se les tomó una muestra de sangre de 
la cola para determinar cuantitativamente la glucosa basal (minuto 0), posteriormente se 
les administró una inyección con 2 miligramos de glucosa por gramo de peso corporal 
de manera intra-peritoneal y se tomó una muestra de glucosa a los 15, 30 60, 120 y 180 
minutos posteriores a la inyección, estos valores se registraron para su análisis 
posterior.18 
 
Obtención de muestras de hígado 
 
Las ratas se sacrificaron por decapitación. Se obtuvieron los hígados completos de 
cada rata y se colocaron en hielo para su manipulación. Se dividieron en pequeñas 
porciones, asegurándose que siempre se tomara el mismo lóbulo del hígado. Estas 
porciones se dividieron para dos procedimientos diferentes: análisis de la expresión del 
mensajero de los RNA mensajeros por PCR cuantitativo y evaluación de la cantidad 
relativa de la proteína por Western Blot. 
 
Técnicas analíticas 
 
Para la cuantificación de proteína se separaron 50 mg de tejido hepático para ser 
homogenizado para el posterior análisis semi-cuantitativo de la subunidad p65 del NF-
κB por Western Blot. La cuantificación de RNAm se realizó por PCR cuantitativo (qPCR) 
utilizando aproximadamente 30 mg de las muestras de hígado. 
 
Homogenizado celular 
 
Para el análisis de la proteína p65 del NF-κB, se separaron 50 mg de hígado se 
homogeneizaron y lisaron en 500 µl de buffer RIPA (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM 
NaCl, 1mM EDTA, 1% nonidet-40) al que se agregaron 30 µl de coctel inhibidor de 
proteasas (Sigma-Aldrich, #P8340 St Luis, MO, EUA) y 20 µl de coctel inhibidor de 
fosfatasas (Sigma-Aldrich, #P0044 St Luis, MO, EUA). Los homogeneizados se 
guardaron a -80°C para su posterior uso. 
 
 
 
 
19 
 
Western blot 
 
El homogeneizado de hígado se usó para la cuantificación de proteína total por el 
método de Bradford con el fin de normalizar la cantidad de proteínas de las muestras a 
procesar (60 µg). Las muestras se corrieron en geles de poliacrilamida al 10%, 
posteriormente se transfirieron a membranas de polifluoruro de vinilideno (PVDF) y se 
bloquearon por 1 hora en buffer TBST (20mM Tris, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5% Tween 
20) conteniendo 5% de leche sin grasa. Posteriormente, las membranas se lavaron e 
incubaron con el anticuerpo primario específico anti-p65 total (Abcam, Cambridge UK), 
en dilución 1/1,000 en buffer TBST, en agitación suave. Las membranas se lavaron y se 
incubaron durante dos horas con el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo marcado 
con fosfatasa alcalina a temperatura ambiente, en agitación suave. Después del lavado, 
las bandas se revelaron con el estuche comercial de sustratos conjugados AP (marca 
Bio Rad, Ca., EUA). Finalmente, se hizo el análisis densitométrico de las bandas 
usando el programa Image Lab (v 3.0 Bio Rad, Ca., EUA). Las densitometrías de cada 
proteína se normalizaron con la densitometría del control de carga GAPDH (Abcam, 
Cambridge UK) en el caso de homogeneizado. 
 
PCR en tiempo real 
 
Se extrajo el RNA total de 30 mg de hígado congelado a -80°C con el estuche comercial 
SV Total RNA Isolation System (Promega, Wi., EUA). La cantidad de RNA se cuantificó 
por medio de un espectrofotómetro Nanodrop a λ 260 y se observó la pureza con la 
relación 260/280. Una cantidad constante de RNA total (2 ng) se procesó con 
transcriptasa reversa para sintetizar el DNA complementario. Se diseñaron 
oligonucleótidos específicos de Rela, Birc2, Ccnd1 e Icam1 para amplificar productos 
específicos a partir del DNA complementario (tabla 2). Las amplificaciones se hicieron 
usando el Master Mix SYBR Green para qPCR (Thermo Fisher Scientific, Ma., EUA) en 
un volumen final de reacción de 10 µl conteniendo DNA complementario (1/100) y 0.5 
µM de cada uno de los pares de oligonucleótidos en el Master Mix de SYBR Green. El 
 
 
20 
 
protocolo fue el siguiente: activación de la DNA polimerasa Taq y desnaturalización del 
DNA a 95°C por 10 minutos, seguido de 40 ciclos de amplificación de 10 segundo a 
95°C, 30 segundos a 62°C y 30 segundos a 72°C. Los datos de amplificación fueron 
analizados por el método 2-∆∆CT y los umbrales de cada ciclo (CT) se normalizaron con 
el gen endógeno proteína ribosomal S18 (Rps18) y de esta manera se calcularon las 
cantidades de relativas a cada gen. 
 
Tabla 2. Relación de las secuencias utilizadas para la reacción en cadena de la polimerasa. 
Nombre del 
oligonucleótido Especie Secuencia 
Tamaño del 
producto 
T° de 
alineación Referencia 
Rps18 sense 
Rattus 
norvegicus 
TTCAgCACATCCTgCgAgTA 
136 pb 62°C 
[47] Rps18 antisense gCAgACATTgACCTCACCAA 
Rela sense Rattus 
norvegicus 
CACCAAAgACCCACCTCACC 
238 pb 62°C 
[48] Rela antisense CCgCATTCAAgTCATAgTCCC 
Birc2 sense Rattus 
norvegicus 
CTTAgTCAAgggAAATgC 
136 pb 59°C 
 [49] Birc2 antisense CAATgACAAgCCTgAAAC 
Ccnd1 sense Rattus 
norvegicus 
ggAgCCCCTgAAgAAgAgC 128 pb 
62°C 
[50] Ccnd1 antisense ggCggATAgAgTTgTCAgTg 
Icam1 sense Rattus 
norvegicus 
gCAgACCACTgTgCTTTgAg 
94 pb 59°C 
 [48] Icam1 antisense TCCAgCTCCACTCgCTCT 
 
Registro de la actividad locomotriz 
 
Se evaluó la actividad locomotriz de 10 ratas macho Wistar (180-220 g), enjauladas 
individualmente. Se mantuvieron en ciclos 12:12 luz/oscuridad (encendido de las luces 
a las 8:00 h), a una temperatura de 22°C. Al inicio del registro de la actividad las ratas 
se alimentaron ad libitum durante 14 días y en los siguientes 21 días se les permitió el 
acceso al alimento sólo dos horas al día (12-14 h). Posteriormente, para analizar la 
persistencia, se mantuvieron en ayuno y en oscuridad constante durante 46 h, tiempo 
durante el cual no se tuvo acceso al cuarto de registro. El registro de la actividad 
locomotriz fue hecho utilizando haces de luz infrarroja colocados estratégicamente en 
las jaulas de las ratas, dentro de la cual tenían libre movilidad durante las 24 h del día. 
 
 
21 
 
Los equipos y el programa (ACTBIO) para la adquisición de datos se diseñaron en la 
Facultad de Psicología, UNAM. Cada interrupción del haz de luz se consideró como un 
evento único y estos datos se recolectaron por una computadora de escritorio cada 10 
minutos y se analizaron con el programa ACTIVIEW (Minimitter, Sunriver, Oregón). 
 
Análisis estadístico de los datos 
 
Los resultados se expresaron como la media ± el error estándar de la media. Los 
puntos temporales de la cantidad relativa de la proteína representan el promedio de 4 
sujetos y los de la expresión del mensajero representan el promedio de 8 sujetos de 2 
experimentos diferentes. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando los 
programas Sigma Stat (v 3.5, Systat Software Inc., Ca., EUA) y Prisma GraphPad (v 5.0 
GraphPad Software, Inc.). Las diferencias estadísticas entre los diferentes puntos de las 
curvas de tiempo se determinaron por ANOVA de una vía y la prueba post-hoc de 
Tukey. Las diferencias entre grupos fueron consideradas estadísticamente significativas 
cuando p≤0.05. El análisis de los parámetros rítmicos se realizaron por COSANA 
Software (v 3.1 desarrollada por Benedito Silva AA, 1996). 
 
 
 
22 
 
RESULTADOS 
 
Cambios en la ingesta de alimento y somatometría por la RHA. 
 
La restricción del horario de alimento conlleva una restricción calórica según lo 
reportado previamente [43]. Con la finalidad de confirmar esto, se analizó la ingesta 
energética que tuvieron las ratas durante los 21 días del experimento, tanto en el grupo 
control ad libitum (AL) como en el experimental de restricción del horario de 
alimentación (RHA). El promedio diario de la ingesta calórica del grupo AL durante los 
21 días fue de 122 kcal, mientras el del grupo RHA fue de 62 kcal, lo que significa que a 
lo largo del experimento, el grupo RHA ingirió el 50.7% de energía que ingirió el grupo 
AL (figura 4). En función de la cinética de la ingesta energética a lo largo de los 21 días 
del experimento se observa que al principio las ratas consumen muy pocas calorías, 
pero a lo largo de los 21 días incrementan paulatinamente este consumo, sin alcanzar 
la cantidad que consumen las ratas AL. El día 21, el grupo RHA consumió 41% menos 
que el grupo AL. La prueba de ANOVA de 2 vías muestra que hubo diferencias 
estadísticas entre la ingesta calórica de ambos grupos desde el primer día del 
experimento,lo que permaneció a lo largo del mismo (p<0.001). En el grupo AL el 
consumo permaneció constante a lo largo de los 21 días, mientras que en el grupo RHA 
se observó una pendiente positiva del día 1 al 5 en el consumo de alimento (p<0.05 por 
ANOVA de una vía) y a partir del día 11 permaneció sin cambios hasta el día 21. 
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
In
g
es
ta
 (
K
ca
l)
0
20
40
60
80
100
120
140
AL
RHA 
&
 
 
 
 
23 
 
Figura 4. Ingesta calórica durante 21 días. La restricción de horario de alimento modificó la ingesta calórica de las ratas bajo 
dicho protocolo desde el primer día del protocolo y lo mantuvo por debajo de la ingesta del grupo control a lo largo de los 21 
días. Los círculos azules simbolizan al grupo control con alimento ad libitum (AL) y los círculos rojos al grupo con restricción del 
horario de alimentación (RHA). Datos como medias ± SEM, n=10. La línea recta horizontal azul representa el promedio de 21 
días del grupo AL, la línea punteada horizontal roja, el promedio de 21 días del grupo RHA. 
&
 p<0.001 grupo RHA vs grupo AL, 
ANOVA de 2 vías y test post-hoc de Bonferroni. 
Para evaluar el efecto de la restricción calórica sobre el peso corporal se registró el 
peso corporal de las ratas 1 vez por semana. El grupo AL incrementó el 36% de su 
peso inicial, mientras que el grupo RHA perdió el 9% (figura 5). En la gráfica se puede 
observar que ambos grupos tienen el mismo promedio de peso corporal al inicio del 
experimento (día 0) y que en la primera semana (día 7), las ratas del grupo RHA ya 
tienen un peso corporal significativamente menor al grupo AL. Esta condición se 
mantiene así hasta el final del experimento. El análisis de los datos mediante ANOVA 
de dos vías muestra que los pesos de las ratas de ambos grupos son estadísticamente 
diferentes entre sí desde la primera semana del experimento (p<0.001) y hasta el final. 
El análisis de ANOVA de una vía revela que las ratas del grupo AL ganaron peso de 
manera constante. Por otro lado, las ratas del grupo RHA perdieron peso la primera 
semana y lo mantienen bajo hasta la semana 3 (día 20) con un ligero incremento al final 
del experimento. El promedio de las tres mediciones del peso corporal de las ratas bajo 
RHA es del 31% con respecto al mismo dato del grupo AL. 
Tiempo (semanas)
-2 -1 0 1 2 3
P
es
o
 c
o
rp
o
ra
l 
(g
)
150
200
250
300
350
400
450
AL
RHA
&
 
 
 
24 
 
Figura 5. Peso corporal evaluado por cada semana del experimento. El peso se evaluó cada 7 días en ambos grupos. Las ratas 
bajo el protocolo RHA disminuyeron su peso durante la primera semana y lo mantuvieron así durante el resto del experimento. 
El promedio del peso del grupo RHA es significativamente menor que el grupo AL. Los círculos azules simbolizan al grupo AL y los 
círculos rojos al grupo RHA. Datos como medias ± SEM, n=10. La línea recta horizontal azul representa el promedio de 21 días 
del grupo AL, la línea punteada horizontal roja, el promedio de 21 días del grupo RHA. 
&
 p<0.001 vs grupo AL, para todos los 
días experimentales, ANOVA de 2 vías con test post-hoc de Bonferroni. 
 
El análisis de la relación entre la ingesta calórica y el peso corporal nos permite saber 
cuál es el consumo de calorías por cada gramo de peso corporal. En la gráfica se 
puede observar que para el grupo RHA esta relación disminuye durante la primera 
semana (día 7) a expensas de la disminución de la ingesta calórica y se mantiene así 
hasta la segunda semana (día 14), durante la tercera semana (día 20) se pierde la 
diferencia estadística en comparación con el grupo AL (p>0.05 por ANOVA de dos vías) 
(figura 6) Estos resultados sugieren que el grupo RHA no consume suficientes calorías 
para mantener la ganancia de peso corporal durante la primera semana y que quizá, al 
final de la segunda semana el incremento de la ingesta favorece un ligera ganancia de 
peso que se reflejará durante la tercera semana, alcanzando una ingesta calórica por 
cada gramo de peso corporal similar a la que tiene el grupo AL. 
 Tiempo (semanas)
0.0 1.0 2.0 3.0
In
g
es
ta
 /
 P
es
o
 c
o
rp
o
ra
l
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
AL
RHA & &
 
Figura 6. Relación entre la ingesta calórica y el peso corporal durante 3 semanas. Los datos de la semana cero corresponde a la 
relación entre la ingesta y el peso del día 0, los de la semana 1 a la relación del día 7, los de la semana 2 al día 14 y los de la 
semana 3 al día 20. Se presentaron diferencias entre ambos grupos solamente en la semana 1 y en la semana 2, recuperándose 
la proporción de calorías consumidas por gramo de peso corporal en la semana 3. Los círculos azules simbolizan al grupo control 
 
 
25 
 
con alimento ad libitum (AL) y los círculos rojos al grupo con restricción del horario de alimentación (RHA). Datos como medias ± 
SEM, n=10. 
&
 p<0.001 vs grupo AL, ANOVA de 2 vías con test post-hoc de Bonferroni. 
 
La restricción calórica durante 21 días promueve múltiples cambios en la composición 
corporal. Al final de los 21 días se pesaron tanto los tejidos adiposos visceral y gonadal, 
como el hígado. Se calculó el peso relativo de los órganos respecto al peso corporal de 
cada rata (se dividió el peso de cada órgano entre el peso corporal de la rata) 
correspondiente. En la figura 7 podemos ver que el peso relativo del tejido adiposo 
perirrenal del grupo RHA es 50% menor que el del grupo AL al final del experimento y el 
peso del tejido adiposo gonadal del grupo RHA es 40% del peso del tejido adiposo 
gonadal del grupo AL. La pérdida de los tejidos adiposos visceral y gonadal es una 
consecuencia de la restricción calórica que promueve el uso de las reservas 
energéticas para el mantenimiento de las funciones vitales. El hígado disminuyó un 
25% del peso relativo con respecto al grupo AL, este cambio de peso se puede deber a 
la pérdida de glucógeno o a la disminución de riego sanguíneo, aunque no descartamos 
que también haya cambios en el tamaño o en la cantidad de células hepáticas. 
Liver
H
íg
ad
o
 (
g
) 
/ 
P
es
o
 c
o
rp
o
ra
l 
(g
)
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
AL 
RHA
 
Perirrenal GonadalT
ej
id
o
 a
d
ip
o
so
 (
g
) 
/ 
P
es
o
 c
o
rp
o
ra
l 
(g
)
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
AL 
RHA
 
Figura 7. Peso relativo del hígado y del tejido adiposo gonadal y del perirrenal. Al final del experimento, se tomó el registro del 
peso corporal de cada rata y posterior al sacrificio de los animales, se pesó cada uno de los órganos. Los datos presentados en 
las gráficas corresponden a la relación del peso de cada órgano entre el peso de la rata correspondiente. El protocolo de RHA es 
una restricción calórica que promueve la disminución de las reservas energéticas, lo que se observa en la disminución del peso 
relativo de los tejidos adiposos. El peso del hígado también disminuye durante este protocolo. Las barras azules representan al 
grupo AL y las barras rojas al grupo RHA. Datos como medias ± SEM, n=10. 
&
 p<0.05 vs grupo AL, t de Student. 
 
 
 
& 
& 
& 
 
 
26 
 
Diferencias en el manejo de la glucosa 
 
La actividad de la proteína p65 responde de manera diferencial a las concentraciones 
de glucosa [34]. Se analizó la glucemia de las ratas de ambos grupos para saber si las 
diferencias en la ingesta energética afectaban la forma en la que manejaban la glucosa 
a lo largo del día y después de un reto de glucosa. A los 20 días de iniciado el 
experimento se tomó una gota de sangre de la cola de cada una de las ratas en 
intervalos de 3 horas y se colocó en una de las tiras reactivas del glucómetro Contour 
Ts para hacer la evaluación de la concentración de glucosa en sangre. La glucemia del 
grupo AL no presentó variaciones estadísticas a lo largo del día. Por el contrario, la 
glucemia del grupo RHA, presentó dos picos en los niveles de glucemia, el primero a 
las 8 h y el segundoa las 14 h, el primer pico coincide con el horario de encendido de 
las luces y el segundo pico, con el final del horario de acceso al alimento (figura 8A). El 
promedio de todos los puntos temporales del grupo RHA es diferente contra el mismo 
dato del grupo AL (figura 8B). Esto es evidencia de que las ratas AL se están 
alimentando continuamente a lo largo del día y por lo tanto logran mantener estable la 
cantidad de glucosa en sangre. Las ratas bajo la RHA están ayunadas la mayor parte 
del día y responden de manera evidente a la ingesta del alimento; el pico de glucemia 
que se presenta a las 8 hrs podría ser un reflejo de la preparación del organismo para 
mantener a las ratas con energía suficiente para la búsqueda de alimento que se ve 
reflejada en la AAA. 
Tiempo (horas)
8 11 14 17 20 23 2 5 8'
G
lu
ce
m
ia
 (m
g/
dl
)
70
80
90
100
110
120
130
 Condición alimenticia
AL RHA
P
R
O
M
E
D
IO
 D
IA
R
IO
 G
LU
C
E
M
IA
 (m
g/
dl
)
0
20
40
60
80
100
120
 
 
Figura 8. Perfil diario de glucosa. La concentración de glucosa en sangre fue evaluada el día 20 del experimento con la finalidad 
de conocer las variaciones de este parámetro a lo largo del día en función de la ingesta o no del alimento. A. Representación 
# 
+ 
* 
& 
A B 
 
 
27 
 
gráfica del promedio de glucemia por punto temporal. Se observa que la glucemia de las ratas bajo la RHA presenta variaciones 
a lo largo del día con dos momentos de elevación en la concentración (8h y 14h) que no se presentan en el grupo RHA. Grupo AL 
con círculos azules y el grupo experimental con círculos rojos, n=5. # p<0.05 vs 17h, 20h y 23 h de RHA, + p<0.05 vs 17h y 20 h de 
RHA por ANOVA de una vía. * p<0.05 vs el mismo punto temporal del grupo AL por ANOVA de dos vías. B. Representación 
gráfica de los promedios diarios de glucosa. El promedio de la glucemia de las ratas bajo la RHA es estadísticamente más bajo 
que el del grupo AL. & p<0.05 vs AL por t de Student. 
 
La curva de tolerancia a la glucosa nos indica la velocidad con la que se metaboliza el 
azúcar que ingresa al organismo. Esta prueba se hizo posterior a un ayuno de 8 horas 
en cada uno de los grupos. Se tomó la glucemia basal justo antes de la aplicación de la 
dosis de glucosa. Se inyectó de forma intraperitoneal una dosis de glucosa de 2 mg/g 
de peso corporal y se tomó una gota de sangre de la cola en los minutos 15, 30, 45, 60, 
120 y 180 posteriores. Se analizó la glucemia colocando la gota de sangre en las tiras 
reactivas del glucómetro marca Contour Ts. Se elaboró la curva de tolerancia a la 
glucosa con los promedios de glucemia de cada una de las ratas. Se observó que en 
ambos grupos incrementa de manera similar la concentración de glucosa en el minuto 
15, pero la glucemia de las ratas del grupo AL sigue incrementando hasta el minuto 30 
y la de las ratas RHA permanece con valores similares al minuto 15 y al minuto 60 ya 
presenta valores similares a los valores basales. Este efecto se puede deber a que las 
ratas secretan más insulina (este dato concuerda con los antecedentes previamente 
presentados), a que sean más sensibles a la insulina o a ambas (figura 9). 
 
a
a
a
a
a
a
Tiempo (min)
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
G
lu
ce
m
ia
 (m
g/
dl
)
50
100
150
200
250
300
350
400
450
*
a
a
a
a
a
a
 
 
 
28 
 
Figura 9. Curva de tolerancia a la glucosa. Respuesta en diferentes tiempos posteriores a una dosis de glucosa de 2 mg/g de 
peso corporal aplicada intraperitonealmente. Representación gráfica de los promedios de las glucemias en los tiempos 
indicados. El minuto 0 es momento el inmediato anterior a la aplicación de la dosis. La velocidad para recuperar los niveles 
basales de glucemia es mayor en las ratas bajo el protocolo RHA que el de las ratas AL; la glucemia de las ratas RHA incrementa 
al inicio de la prueba pero a los 60 minutos ya regresa a niveles basales mientras que la glucemia de las ratas AL regresa a 
niveles basales hasta los 180 minutos. Los círculos azules representan al grupo AL y los rojos, al grupo RHA. n=5 *p<0.05 vs AL 
en el mismo punto temporal por ANOVA de dos vías, test post-hoc de Bonferroni, 
a 
p<0.05 vs el tiempo 0 de cada uno de los 
grupos por ANOVA de 1 vía, test post-hoc de Tukey. 
 
Actividad anticipatoria al alimento inducida por la RHA 
 
Se registró la actividad de las ratas a lo largo de las 24 h del día durante 14 días de 
alimentación ad libitum y 21 días de alimentación restringida. Los datos muestran el 
incremento de la actividad previa a la presentación del alimento en el grupo RHA o 
actividad anticipatoria al alimento (AAA), lo que, de acuerdo a la literatura, confirma la 
presencia del OSA. 
 
Como se observa en la figura 10, la actividad total no se modifica en ambos grupos, 
sino la distribución de esa actividad a lo largo de las 24h. Mientras que el 71% del total 
de la actividad en AL está durante la fase de oscuridad, el 57% de la actividad en RHA 
está durante la fase de luz, con un 13% durante la AAA. La presencia del OSA se 
confirmó con la permanencia de la AAA en condiciones de oscuridad constante y 
ayuno, a lo que se le conoce como persistencia (figura 11). 
 
 
A
ct
iv
id
ad
 (
in
te
rr
u
p
ci
on
es
 /
 1
0 
m
in
)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Figura 10. Actividad locomotriz en un periodo de 24 h.
un régimen AL que fue posteriormente sometida a 21 días bajo RHA. 
alimentadas ad libitum y bajo RHA. La línea azul represe
representa el horario en el cual se permitió el acceso al alimento a las ratas bajo RHA y la región gris representa la fa
oscuridad. Datos como medias ± SEM. n=6
actividad anticipatoria. Datos como medias. n=6.
 
 8A
ct
iv
id
ad
 (
in
te
rr
u
p
ci
o
n
es
 / 
10
 m
in
)
0
20
40
60
80
A 
C 
 Tiempo (horas)
 8 12 16 20 0
A
ct
iv
id
ad
 (
in
te
rr
up
ci
on
es
 /
 1
0 
m
in
)
0
10
20
30
40
AL RHA
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
AA 
Luz 
Oscuridad 
 
. Actividad locomotriz en un periodo de 24 h. A. Gráfico representativo de la actividad 
un régimen AL que fue posteriormente sometida a 21 días bajo RHA. B. Histograma de la actividad de ratas a lo larg
La línea azul representa al grupo AL y la roja, al grupo RHA. 
representa el horario en el cual se permitió el acceso al alimento a las ratas bajo RHA y la región gris representa la fa
Datos como medias ± SEM. n=6. C. Representación de la distribución de la actividad en las diferentes fases y de la 
actividad anticipatoria. Datos como medias. n=6. 
 
Tiempo (horas)
 12 16 20 0 4 8
AY - RHA
79% 
18% 
43% 
44% 
13% 3% 
B 
 
29 
 
 4 8
AL
RHA
 
de la actividad o actograma de una rata bajo 
Histograma de la actividad de ratas a lo largo de 24 h 
ta al grupo AL y la roja, al grupo RHA. La región sombreada en rojo 
representa el horario en el cual se permitió el acceso al alimento a las ratas bajo RHA y la región gris representa la fase de 
Representación de la distribución de la actividad en las diferentes fases y de la 
 
AY - RHA
 
 
30 
 
Figura 11. Persistencia de la actividad en condiciones constantes. Histograma de la actividad de las ratas del grupo RHA. La 
gráfica representa a las ratas en condiciones de ayuno y oscuridad constante. La barra roja ubicada en el eje de las X indica el 
horario en el que tendrían acceso al alimento (12-14h) y la barra gris, la fase de oscuridad que tendría en condiciones luz-
oscuridad (20 - 8 h). Datos como media ± SEM. n=3. 
 
Expresión del RNA mensajero de la p65 
 
En estudios previos se observó que la cantidad relativa de la p65 en el núcleo del tejido 
hepático presentaba un pico que coincidía con el final del acceso al alimento [5]. La 
presencia de la p65 en el núcleo significa actividad de esta proteína. Con la finalidad de 
conocer si este pico era debido al aumento en la expresión delRNA mensajero de la 
p65 y/o al aumento en la concentración de la proteína, se analizó la cantidad de la 
expresión de Rela que codifica para la subunidad p65 del NF-κB en tejido hepático de 
rata como primer punto de regulación de este factor de transcripción en un periodo de 
24 h con intervalos de cada 3 h. La expresión de dicho gen se analizó a través de PCR 
cuantitativo. Los resultados mostrados se expresan como la cantidad relativa 
normalizada con el gen constitutivo Rps18. La representación de las variaciones 
temporales y entre grupos se muestra en la figura 12. En el grupo AL, la expresión de 
Rela a lo largo del día no presenta variaciones significativas (p>0.05 ANOVA de una 
vía). Aunque el grupo RHA tiende a tener un perfil oscilatorio, no hay variaciones 
estadísticamente significativas entre las diferentes horas del día. El promedio de la 
expresión de Rela a lo largo del día no es diferente entre el grupo AL y el RHA (p>0.05 
prueba U de Mann-Whithey), o en ningún punto temporal (p>0.05 ANOVA de dos vías). 
 
 
31 
 
 
Figura 12. Perfil de expresión del gen que codifica para la p65 a lo largo de 24 h. Representación gráfica del perfil diario del gen 
Rela normalizado con el gen Rps18, analizado por qPCR. La expresión del RNAm de Rela en el hígado de las ratas RHA no es 
estadísticamente diferente a los valores de este RNAm en los hígados de ratas bajo AL. Los círculos azules representan al grupo 
AL y los círculos rojos al grupo RHA. Área roja representa horario de acceso al alimento (12-14h). Área gris representa la fase de 
oscuridad (20-8h). Datos como medias ± SEM, n=8. No hay diferencias significativas. 
 
Para conocer si el ayuno o la realimentación posterior a un ayuno inducen cambios 
en la expresión del RNA mensajero de Rela se analizaron muestras de hígado de 
ratas sometidas a estas condiciones. La expresión de este gen tampoco es sensible a 
cambios agudos en la alimentación: ayuno (AY) o realimentación posterior al ayuno 
(RE)(p>0.05 prueba t de Student) (figura 13). En resumen, se puede decir que la 
expresión del RNA mensajero de la proteína p65 es estable ante diferentes 
condiciones de alimentación. 
Tiempo (h)
8 11 14 17 20 23 2 5 8'
m
R
N
A
 R
el
a/
R
p
s1
8
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
AL 
RHA
 
 
32 
 
 Condición alimenticia
AL RHA AY
m
R
N
A
 R
el
a/
R
p
s1
8
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Condición alimenticia
RHA RE
m
R
N
A
 R
el
a/
R
p
s1
8
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
 
Condición alimenticia
AY RE
m
R
N
A
 R
el
a/
R
p
s1
8
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
 
Figura 13. Expresión del gen Rela normalizada con el gen endógeno Rps18 en hígado de rata bajo diferentes condiciones 
alimenticias. A. Expresión de Rela en el punto temporal de las 11:00 h. B. Expresión de Rela en el punto temporal de las 14:00 
h. C. Expresión de Rela después de 22h de ayuno (AY) y del efecto de realimentar por 2h a ratas ayunadas 22h (RE). La barra azul 
representa al grupo AL, las barras rojas representan al grupo RHA, las barras verdes al grupo AY y la barra rosa al grupo RE. 
Datos como media ± SEM. n=8.No hubo diferencias significativas. 
 
 
B A 
C 
 
Efecto de la RHA en la concentración
 
El siguiente punto de regulación se puede observar mediante el análisis de la 
relativa de la proteína total en el tejido hepático en diferentes puntos temporales 
largo del día. La cantidad relativa de la proteína se analizó 
de muestras de hígado homogenizado con buffer de lisis
de las bandas se cuantificó con el 
normalizó con la densitometría de las bandas de la proteína control GAPDH. E
promedio de las 24 h de la
embargo, el análisis temporal mostró que e
dos valles, uno a las 8 h y otro a las 23 h, así como un pico a las 2 h que se mantuvo 
hasta las 5 h. El grupo RHA presentó un perfil parecido al grupo AL p
aparición de un pico a las 14 h, que coincide con el término del acceso al alimento.
sugeriría que la el incremento de la proteína
previo, se debe a que hay mayor cantidad de proteína p65 total, lo q
encontrado ante una infusión de ácidos grasos en células mononucleares periféricas 
[30] (en este estudio dan un bolo de ácidos grasos que provoca inflamación con 
aumento en la p65 pero no en Ik
Figura 14. Perfil diario de la proteína p65 de
cuantitativa de la proteína p65 en homogenizado de hígado de rata hecha a través de Western Blot. 
concentración de la proteína p65 
El siguiente punto de regulación se puede observar mediante el análisis de la 
de la proteína total en el tejido hepático en diferentes puntos temporales 
largo del día. La cantidad relativa de la proteína se analizó por medio de Western Blot 
de muestras de hígado homogenizado con buffer de lisis (figura 15
de las bandas se cuantificó con el programa Image Lab (v 3.0 Bio Rad, Ca., EUA)
con la densitometría de las bandas de la proteína control GAPDH. E
de la concentración de la p65 en ambos grupos fue s
embargo, el análisis temporal mostró que el grupo AL presentó un perfil oscilatorio con 
dos valles, uno a las 8 h y otro a las 23 h, así como un pico a las 2 h que se mantuvo 
hasta las 5 h. El grupo RHA presentó un perfil parecido al grupo AL p
aparición de un pico a las 14 h, que coincide con el término del acceso al alimento.
el incremento de la proteína p65 en el núcleo observada en un estudio 
previo, se debe a que hay mayor cantidad de proteína p65 total, lo q
encontrado ante una infusión de ácidos grasos en células mononucleares periféricas 
(en este estudio dan un bolo de ácidos grasos que provoca inflamación con 
p65 pero no en Ikβ ni en la actividad de IKKβ). 
de la proteína p65 del NF-κB en lisado de hígado de rata . Imagen representativa de la evaluación semi
cuantitativa de la proteína p65 en homogenizado de hígado de rata hecha a través de Western Blot. 
 
33 
 
El siguiente punto de regulación se puede observar mediante el análisis de la cantidad 
de la proteína total en el tejido hepático en diferentes puntos temporales a lo 
por medio de Western Blot 
(figura 15). La densitometría 
Image Lab (v 3.0 Bio Rad, Ca., EUA) y se 
con la densitometría de las bandas de la proteína control GAPDH. El valor 
p65 en ambos grupos fue similar. Sin 
l grupo AL presentó un perfil oscilatorio con 
dos valles, uno a las 8 h y otro a las 23 h, así como un pico a las 2 h que se mantuvo 
hasta las 5 h. El grupo RHA presentó un perfil parecido al grupo AL pero con la 
aparición de un pico a las 14 h, que coincide con el término del acceso al alimento. Esto 
p65 en el núcleo observada en un estudio 
previo, se debe a que hay mayor cantidad de proteína p65 total, lo que coincide con lo 
encontrado ante una infusión de ácidos grasos en células mononucleares periféricas 
(en este estudio dan un bolo de ácidos grasos que provoca inflamación con 
 
Imagen representativa de la evaluación semi-
cuantitativa de la proteína p65 en homogenizado de hígado de rata hecha a través de Western Blot. 
 
 
34 
 
Tiempo (h)
8 11 14 17 20 23 2 5 8'
p
65
/G
A
P
D
H
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
AL 
RHA
A, *
a
b
B
 
 
Figura 15. Perfil diario de la proteína p65 del NF-κB en lisado de hígado de rata . Círculos azules, grupo AL y círculos rojos, 
grupo con RHA. Datos como medias ± SEM, n=4. Área roja representa horario de acceso al alimento (12-14h). Área gris 
representa la fase de oscuridad (20-8h) 
a
 p<0.05 vs 2 h y 5 h de AL; 
b
 p<0.05 vs 20h, 2h y 5h de AL; 
A
 p<0.05 vs 8h, 11h y 23h de 
RHA; 
B
 p<0.05 vs 2h y 5h de RHA por ANOVA de una vía, post-hoc de Tukey. * p<0.05 vs el mismo punto temporal de AL por 
ANOVA de dos vías, post-hoc de Bonferroni. Datos como medias ± SEM, n=4. 
 
El aumento de la proteína a las 14 h en el grupo RHA, no se presentó con la 
realimentación posterior al ayuno agudo de 22 h (RE) (figura 16), por lo que la condición 
de realimentación bajo la RHA, es diferente a aquella seguida de un ayuno por única 
ocasión en los