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4/8/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO

FACULTAD DE CIENCIAS

IMPORTANCIA DE LA TRIPTÓFANO HIDROXILASA 1 EN LA
FORMACIÓN DE EDEMA DURANTE LA PRESERVACIÓN
PULMONAR EN UN MODELO DE CONEJO

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
B I Ó L O G A
P R E S E N T A :

CYNTHIA IVETTE DE LEÓN ANDREZ

DIRECTOR DE TESIS:
DR. JOSÉ LUIS ARREOLA RAMÍREZ
2014

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

Esta tesis fue realizada en el Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias
“ISMAEL COSIO VILLEGAS”

La tesis estuvo registrada en el Programa de Becas de Inicio a la Investigación (PROBEI) que otorga
La Comisión Coordinadora de Institutos Nacionales de Salud y Hospitales de Alta Especialidad
(CCINSHAE).

Agradecimientos

Principalmente agradezco a mis padres, por su apoyo constante, por brindarme ese entusiasmo y
motivación para seguir adelante y sobre todo por su amor incondicional, ya que sin ustedes no
habría sido posible cumplir esta meta. ¡Gracias!
A mi hermana Cass por quererme y soportarme siempre, por cada uno de los momentos que
hemos pasado juntas, especialmente cuando no la dejaba dormir por la “tesis”.
A mi mejor amiga Catalina por apoyarme y estar conmigo en todo momento, por sus consejos,
locuras, por las noches de desvelo, y por hacer de mi vida un mundo mejor. Y como bien dicen,
“un amigo es un hermano que se elige”.
A mi tutor y amigo, el Dr. José Luis Arreola por ayudarme y aconsejarme en todo momento;
especialmente gracias por haberme dado la oportunidad de conocerlo, trabajar con usted, y
enseñarme que es lo que realmente importa en la vida…
Al Dr. Raúl Barrera, gracias por compartir conmigo esta gran etapa de mi vida, por hacerme ver
mis errores, aciertos y virtudes, por brindarme tiempo, conocimiento, consejos y sobre todo por
“salvarme la vida” tantas veces.
A la Dra. Paty Segura por el apoyo y ese entusiasmo que me brindó para seguir adelante y a todos
los miembros del laboratorio de Hiperreactividad Bronquial, que formaron parte de este
importante camino.
Al laboratorio de Bioquímica del Instituto Nacional de Cardiología, en especial al Dr. José Zavala y
Javier por el apoyo brindado.
Al Q.F.B. Celedonio por su apoyo y colaboración para la realización de este proyecto.
Para finalizar, gracias a la vida por poner en mi camino a personas tan valiosas y por permitirme
cumplir mis metas, que con esfuerzo y dedicación seguiré cumpliendo.

III

Índice

Abreviaturas ……………………………………………………………………………………………………………………… IV

Resumen ……………………………………………………………………………………………………………………………. V

1 Introducción …………………………………………………………………………………………………………………...... 1
1.1 Serotonina …………………………………………………………………………………………………. 4
1.1.1 Familia de hidroxilasas de amino ácidos aromáticos …………………….. 5
1.1.2 Triptófano hidroxilasa (TPH) ………………………………………………………………………….. 6
1.1.2.1 Isoformas de TPH ……………………………………………………………….. 6
1.1.2.2 Mecanismos de regulación ………………………………………………… 6
2 Justificación ……………………………………………………………………………………………………………………….. 8
3 Hipótesis …………………………………………………………………………………………………………………………….. 8
4 Objetivo general …………………………………………………………………………………………………………………. 8
4.1 Objetivos particulares ……………………………………………………………………………………………… 8
5 Material y métodos ……………………………………………………………………………………………………………. 9
5.1 Animales de estudio ………………………………………………………………………………….. 9
5.1.1 Obtención del bloque cardiopulmonar …………………………………………… 9
5.1.2 Lavado y preservación pulmonar ………………………………………………………………………. 9
5.1.3 Homogeneizado tisular ……………………………………………………………………………………. 10
5.2 Mantenimiento y cultivo in vitro de línea celular tumoral ………………………………………….. 10
5.2.1 Homogeneizado celular …………………………………………………………………………………… 10
5.3 Cuantificación de proteína por Lowry-Follin ………………………………………………………………… 10
5.4 Determinación de mRNA de TPH1 …………………………………….………………………………………… 11
5.5 Detección de TPH1 por inmunohistoquímica …….…………………………………………………………. 11

5.6 Análisis de actividad enzimática de TPH .…………………………………………………………………. 12
5.7 Análisis …………………..……………………………………………………………………………………………… 13
6 Resultados ……………………………………………………………………………………………………………………… 14
6.1 RT-PCR ………………………………………………………………………………………… 14
6.2 Inmunohistoquímica ……………………………………………………………………………….. 15
6.3 Actividad enzimática ……………………………………………………………………………….. 17
7 Discusión ……………………………………………………………………………………………………………………….. 18
8 Conclusiones ………………………………………………………………………………………………………………….. 21
9 Referencias …………………………………………………………………………………………………………………….. 22
10 Anexos ……………………………………………………………………………………………………………………………. 24

Abreviaturas

Resumen

El trasplante pulmonar se ha convertido en la base terapéutica de mayor importancia para la
mayoría de las patologías pulmonares en etapa terminal, de ahí la importancia de la
implementación de nuevas estrategias de preservación del tejido. Actualmente se reporta un
incremento de los trasplantes de pulmón, sin embargo, aún se presentan complicaciones como la
falla primaria del injerto o edema por reimplantación (FPI), la cual representa la principal causa de
muerte en el post-operatorio. La FPI se manifiesta durante las primeras 72 h posteriores al
trasplante y está caracterizada por daño en la membrana alveolo capilar, hipoxia y cambios en la
permeabilidad vascular que resulta en la generación de edema, siendo ésta última una de las
principales causas de la falla para el trasplante exitoso.
Una de las moléculas involucradas en la generación de edema parece ser la serotonina, una amina
biogénica que participa en diversos procesos pulmonares incluyendo los cambios en la
permeabilidad vascular. Dado que la triptófano hidroxilasa 1 es la principal enzima limitante de la
síntesis de serotonina, el estudio de esta enzima es de gran relevancia para la mejor comprensión
de la función de serotonina durante la preservación pulmonar.
Con el objetivo de examinar la posible participación del tejido pulmonar en la producción de la
serotonina, se estudió a la TPH1 durante la preservación pulmonar.
Se encontró la expresión del transcrito de TPH1 en pulmón de conejo así como su actividad
enzimática. Por inmunolocalización se encontró que, como parte del tejido pulmonar, las células
epiteliales, endoteliales y de músculo liso expresan TPH1. En este trabajo se comprobó que el
tejido pulmonar tiene la capacidad de producir serotonina en el conejo, lo que podría sugerirnos la
posible existencia de un sistema serotoninérgico.1

1 Introducción.

El aparato respiratorio es el encargado de captar oxígeno (O2) y eliminar el dióxido de carbono
(CO2) procedente del anabolismo celular. Se divide en 2 porciones: conductora y respiratoria. La
porción conductora situada fuera y dentro de los pulmones, lleva aire del medio externo a estos
órganos y está conformada por la cavidad nasal, boca, nasofaringe, faringe, laringe, tráquea,
bronquios y bronquiolos.
Características histológicas
 Cartílago hialino presente, excepto en bronquiolos, cuya función es evitar el colapso de las
vías aéreas.
 Glándulas seromucosas y células mucosas en todos los conductos excepto en bronquiolos.
 Las vías de conducción respiratoria presentan el clásico epitelio respiratorio, columnar
ciliado seudoestratificado, a todos los niveles, excepto en bronquiolos que presentan un
epitelio simple cuboidal y escamoso.
 Fibras elásticas en tejido conectivo subepitelial, excepto en nariz.
 Alto grado de vascularización.
La porción respiratoria, localizada estrictamente dentro de los pulmones, tiene como función el
intercambio real de oxígeno por dióxido de carbono. El intercambio gaseoso comienza a nivel de
bronquiolos respiratorios hasta llegar a los alveolos (cuyo epitelio escamoso permite la difusión de
estos gases), dentro de éstos se encuentran 3 tipos celulares: neumocitos tipo 1, neumocitos tipo
2 (productores de surfactante) y macrófagos alveolares, además de una gran vascularización1.

Los avances terapéuticos observados en el trasplante de órganos se han obtenido gracias al
desarrollo de métodos que permiten mantener la integridad del órgano con fines de trasplante2.
Desde 1983, el trasplante de pulmón se ha convertido en la base terapéutica con mayor
importancia para la mayoría de las patologías pulmonares en etapa terminal3. Actualmente, la
Sociedad Internacional de Corazón y Pulmón (ISHLT, por sus siglas en inglés) reporta un
incremento de los trasplantes de pulmón, principalmente los bilaterales (Figura 1); a pesar de ello,

aún se presentan complicaciones como la falla primaria del injerto (FPI), la principal causa de
muerte post-operatorio, cuya incidencia oscila entre el 10 y 38%4.

La FPI, también denominada edema por reimplantación, lesión por isquemia reperfusión,
disfunción primaria del injerto, entre otros 5; ha presentado diversas acepciones terminológicas
conduciendo a un documento de consenso que precisó su definición en el año 20056. En ese
consenso se acordó considerar la disfunción primaria del injerto como edema pulmonar no
cardiogénico que se manifiesta durante las primeras 72 hrs posteriores al trasplante, caracterizada
por daño en la membrana alveolo capilar, hipoxia y cambios en la permeabilidad vascular que
resulta en la generación de edema (acumulación de líquido), siendo esta última una de las
principales causas de la falla3.
Se han llevado a cabo estudios que tratan de identificar factores de riesgo que permitan dilucidar
la fisiopatología de la FPI, y así desarrollar posibles opciones terapéuticas. Dado que el sistema
respiratorio se encuentra controlado por el sistema nervioso autónomo (SNA), el cual es muy
importante en diversas funciones respiratorias tales como la regulación del tono de la musculatura
lisa de la vía aérea, la secreción de moco de las glándulas submucosas, las células epiteliales, la
permeabilidad vascular y el flujo sanguíneo, el estudio de los neurotransmisores ha sido de gran
impacto7. Uno de estos neurotransmisores es la sustancia P exógena, cuyos efectos en las vías
aéreas incluyen broncoconstricción, vasodilatación y un incremento en la permeabilidad vascular
Figura 1. Número de trasplantes y tipo de procedimiento por año
3
.
Unilateral
Uni
U
Nú
mer
o
de
tras
pla
nte
s

debido a su acción directa sobre las células cebadas y fibras nerviosas vagales, involucrando a su
vez la liberación de acetilcolina (ACh).
En el pulmón, la ACh provoca la contracción del músculo liso bronquial y vascular a través de los
receptores muscarínicos M2 y M3, respectivamente. En la microcirculación provoca retracción de
la célula endotelial, con lo que incrementa la permeabilidad vascular, favoreciendo la salida de
líquido al espacio intersticial. En pulmones aislados y perfundidos de conejo, la ACh exógena
induce la liberación de sustancia P (Figura 2) proveniente de las fibras nerviosas del sistema
eNANC (sistema excitatorio no adrenérgico no colinérgico). 8

Por otro lado, se han encontrado evidencias que relacionan las modificaciones de la permeabilidad
vascular con cambios en los niveles de serotonina (5-HT) durante la preservación pulmonar en
conejo, en donde el nivel más alto registrado en lecho vascular se encuentra durante los primeros
minutos posteriores a la procuración del bloque cardiopulmonar. Así mismo, se observó que la
adición de antagonistas tanto inespecíficos (metiotepina) como específicos (SB204741) de 5-HT a
Figura 2. Liberación e interacción de la acetilcolina y sustancia P sobre las células de músculo
liso (a través de los receptores muscarínicos M2 y M3) y de las células endoteliales (a través
de su receptor NK-1) respectivamente, lo que causa un incremento en la permeabilidad
vascular.

la solución de preservación durante la fase isquémica reduce significativamente la permeabilidad
vascular en los pulmones preservados, en comparación con la preservación en solución salina
fisiológica (SSF), sugiriendo así a la 5-HT como clave en estos cambios de permeabilidad9 (Figura 3).

1.1. Serotonina
La serotonina (5-HT) es una amina biogénica derivada de triptófano ampliamente distribuida tanto
a nivel de sistema nervioso central como en tejidos periféricos10. Esta indolamina, a través de su
interacción con los más de 15 receptores11 (clasificados farmacológicamente en 7 familias), se
encuentra involucrada en diversos procesos como son la neurotransmisión, motilidad intestinal,
ingesta de alimentos, sueño, homeostasis primaria, regulación del tono vascular, hipertensión
pulmonar, asma, respuesta inmune mediada por células T, comportamiento sexual, así como una
importante participación en desórdenes psiquiátricos como depresión y desórdenes obsesivos
compulsivos 11-19 (Figura 4).

Figura 3. Presencia de la serotonina durante la preservación pulmonar y disminución de su actividad a través del bloqueo de
su receptor. a) Tasa de liberación de 5-HT en pulmones preservados durante 24 hrs a 4°C. b) Efecto de la metiotepina y
SB204741, inhibidor inespecífico y específico de 5-HT2B respectivamente, sobre los cambios de permeabilidad vascular en
pulmones de conejo preservados durante 24 h (figuras obtenidas de la ref. 7).
a) b)

La enzima responsable del primer paso en la síntesis de serotonina es la triptófano hidroxilasa
(TPH), la cual pertenece a la familia de hidroxilasas de aminoácidos aromáticos.

1.1.1 Familia de hidroxilasas de amino ácidos aromáticos
Las hidroxilasas de aminoácidos aromáticos (AAHs) son una familia de enzimas dependientes de
pterina (2-amino-4(3H)-pteridinona), es decir, requieren del cofactor BH4 (tetrahidrobiopterina)
para hidroxilar a sus respectivos aminoácidos aromáticos y su deficiencia resulta en síntomas
como hiperfenilalaninemia, así como una deficiencia en dopamina y serotonina20.
Dentro de esta familia se encuentran la triptófano hidroxilasa (TPH), la hidroxilasa de fenilalanina
(PAH) y de la hidroxilasa de la tirosina (TH), las cuales tienen un papel importante en el
metabolismo y biosíntesis de neurotransmisores monoaminérgicos y hormonas21.
Este grupo de enzimas forman homotetrámeros en donde cada monómero está constituido por
tres dominios: dominio regulatorio N-terminal (100-190 aa),dominio catalítico (315 aa) y el
dominio de tetramerización C-terminal (25-40 aa)15.
Figura 4. Participación de la serotonina en diversos procesos fisiológicos.

1.1.2 Triptófano hidroxilasa (TPH)
La TPH (EC 1.14.16.4) es la enzima que cataliza la hidroxilación del aminoácido L-triptófano y
produce 5-hidroxitriptofano (5-HTP) en presencia de Fe (II), O2 y BH4 (que actúa como donador de
electrones en la reducción del O2 e hidroxilación del triptófano). La 5-HTP, tras su descarboxilación
por la descarboxilasa de amino ácidos aromáticos (DCAA) da lugar a la 5-hidroxitriptamina o
serotonina (5-HT) (Figura 5).
1.1.2.1 Isoformas de TPH.
La TPH se encuentra en dos isoformas, las cuales provienen de genes distintos. TPH1 y TPH2 en
humano son codificadas en los cromosomas 11 y 12. La TPH2 humana parece expresarse
exclusivamente a nivel de sistema nervioso central, con un peso molecular de 56 kDa (490 aa);
mientras que la TPH1, con un peso molecular de 51 kDa (444 aa), se encuentra expresada
principalmente en la glándula pineal y en regiones periféricas del cuerpo como células de la piel,
células de la mucosa intestinal, células enterocromafines, de musculo liso, así como células
neuroendócrinas de pulmón 15,22 23,24.

1.1.2.2 Mecanismos de regulación de la TPH
Uno de los mecanismos encargados de regular la actividad de la TPH es la fosforilación, la cual es
una modificación postraduccional llevada a cabo a través de dos enzimas: la proteína cinasa II
dependiente de Ca2+-calmodulina (CaMK II; EC 2.7.11.11) y la proteína cinasa dependiente de
cAMP (PKA; EC 2.7.11.11) donde en presencia de la proteína 14-3-3 causan su activación.
Figura 5. Síntesis de serotonina. La TPH es la enzima limitante de la vía y cataliza la hidroxilación del triptófano en
5-hidroxitriptófano, posteriormente esta molécula es descarboxilada dando lugar a la serotonina.

Los sitios de fosforilación de la CaMKII son las serinas 58 y 260, mientras que la PKA fosforila a
TPH1 en la serina 58. En cambio, a pesar de conservar ambos sitios de fosforilación, la TPH2 elude
la fosforilación de estos sitios y en lugar de ello, la serina 19 es fosforilada en la región N-terminal
por la PKA. Posteriormente, la proteína 14-3-3 se une al residuo de fosfoserina en la TPH1,
incrementando la actividad de la enzima e inhibe su desfosforilación (Figura 6). La fosforilación de
TPH1 por la CaMKII conduce su degradación vía ubiquitina-proteasoma dependiente de ATP25; y se
especula que la unión de la proteína 14-3-3 a TPH compite con la degradación ocurriendo sólo en
algunos tejidos o sólo con alguna de las isoformas in vivo, explicando así las sorprendentes
diferencias de estabilidad descritas para la TPH de diferentes fuentes. Además se sugiere que la
fosforilación a través de la CaMKII atenúa la degradación proteolítica en presencia de la proteína
14-3-3.

Figura 6. Estructura de la enzima TPH1. A) Modelo tridimensional de la TPH1 de
conejo. Los colores rosa, morado y amarillo corresponden a las diferentes regiones de
la enzima. B) LA TPH1 tiene tres dominios funcionales, en donde se muestran los sitios
de fosforilación.
a)
Fig
ura
4.
Par
tici
pa
ció
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de
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ot
oni
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div
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os
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.
b)

2 Justificación

Debido a la presencia de serotonina durante la preservación pulmonar, el estudio de la TPH1 es
clave especialmente en la formación de edema, ya que podría brindarnos nuevas estrategias de
preservación al utilizarla como blanco bioquímico y farmacológico para inhibir la producción de
serotonina y a su vez disminuir el edema generado por ésta. En este sentido, se podría mejorar la
viabilidad del órgano y así tener una mayor disponibilidad del mismo con fines de trasplante.

3 Hipótesis

Si el pulmón expresa TPH1 y la presencia de esta enzima en el tejido pulmonar indica su capacidad
para producir serotonina, entonces ésta puede estar directamente relacionada con alteraciones en
la permeabilidad vascular y contribuir a la generación de edema pulmonar en la falla primaria del
injerto durante la preservación del órgano.

4 Objetivo general

Examinar la posible participación del tejido pulmonar en la producción de serotonina durante la
preservación pulmonar.
4.1 Objetivos particulares
• Determinar la expresión del mRNA de TPH1 en pulmón.
• Examinar la expresión proteínica de TPH1 posterior a la procuración pulmonar
• Identificar el tipo celular que expresa TPH1 en el tejido pulmonar
• Determinar la actividad enzimática de TPH1 en el pulmón

5 Material y métodos

5.1 Animales de estudio
En el estudio se utilizaron 6 conejos machos de la cepa “Nueva Zelanda” (peso corporal de 2.5-3.0
Kg), mantenidos en el bioterio del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias bajo un
ambiente controlado de temperatura 21±1° C, 50-70% de humedad y ciclos de luz oscuridad 12/12
h, con un régimen de alimentación y agua ad libitum. Los animales fueron manejados de acuerdo a
los lineamientos de la Ley General de Salud de México y la Guía para el cuidado y Uso de los
Animales de Laboratorio para el Distrito Federal.
5.1.1 Obtención del bloque cardiopulmonar
Cada animal se anestesió a las 10 hrs mediante clorhidrato de Xilazina (3mg/kg i.m, Procin® / Pisa
Agropecuaria) y una dosis de pentobarbital sódico (28mg/Kg i.v, Anestesal®, Pfizer). Se disecó y
canuló la tráquea para ventilarlos mecánicamente (volumen corriente (VC) de 10 mL/Kg,
frecuencia respiratoria (FR) de 55 ciclos/min, presión positiva espiratoria final (PEEP) de 2 cm.H2O)
usando un ventilador para pequeñas especies (Starling, Harvard Apparatus, Holliston, MA),
después de lo cual se realizó una esternotomía media para exponer el bloque cardiopulmonar. De
manera inmediata se inyectó heparina (1000 U/kg) en el ventrículo derecho para posteriormente
ligar las venas cavas y desangrar al animal. El bloque cardiopulmonar se procuró de la cavidad
torácica. El corazón se seccionó transversalmente a nivel de las válvulas aurículo-ventriculares
para colocar dos cánulas de cristal, una en la arteria pulmonar a través del ventrículo derecho y
otra ubicada en la aurícula izquierda. Las estructuras adyacentes fueron incluidas mediante la
ligadura de la arteria pulmonar y aurícula izquierda con seda trenzada 2-0, para disminuir la
distensibilidad de las mismas.
5.1.2 Lavado y preservación pulmonar
Una vez obtenido el bloque cardiopulmonar, se mantuvo bajo ventilación mecánica, se eliminó la
sangre intravascular de los pulmones mediante infusión anterógrada (100-150 mL de SSF) a través
de la cánula pulmonar, a una presión de 20 cm.H2O (generada mediante la elevación a 20 cm de
altura del reservorio con solución). Al final del lavado, se pinzaron simultáneamente las cánulas de
forma que el lecho vascular mantuviera dicha solución. Los pulmones fueron hiperinsuflados 3

veces el volumen corriente para evitar zonas atelectásicas (colapso pulmonar, alveolar) y en estas
condiciones la tráquea fue pinzada. El bloque cardiopulmonar se sumergió en un recipiente con
solución salina fisiológica (NaCl al 0,9%), y se mantuvo a 4°C durante 24 h.
5.1.3 Homogeneizado tisular
Los tejidos de pulmón, corazón, hígado, riñón y colon fueron homogeneizados mediante un
politrón Kinematica Ag PT1300 D en amortiguador 10 mM Tris•HCl pH 7.5, 1 mM EDTA y un coctel
de inhibidores de proteasas (Roche, Mannheim, Germany).
5.2 Mantenimiento y cultivo in vitro de línea celular tumoral.
La línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 fue obtenida a través del reservorio
internacional de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA). Para su mantenimiento
en cultivo in vitro, las células fueron cultivadas en frascos T25 o T75 (Costar) con medio de cultivoRPMI-1640 (Sigma, Co), suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 1 mM
de piruvato de sodio, a 37°C en atmósfera húmeda con 5 % de CO2.
Esta línea celular presenta una actividad alta de TPH1 y fue utilizada como control positivo para los
ensayos de actividad enzimática18.
5.2.1 Homogeneizado celular
Las células MDA-MB-231 fueron centrifugadas y las pastillas celulares fueron almacenadas a -80° C
hasta su uso (bajo estas condiciones, la actividad enzimática se mantiene por más de dos meses).
Para el análisis de la TPH, las pastillas fueron descongeladas y posteriormente homogeneizadas
con un amortiguador RIPA (25mM Tris•HCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% deoxicolato de
sodio, 0.1% SDS) en un homogenizador-dounce de vidrio-teflón (Glas-Col, Indiana, United States),
un coctel de inhibidores de proteasas (Roche, Mannheim, Germany).
5.3 Cuantificación de proteína por Lowry-Follin.
La concentración de proteína fue determinada por el método de Lowry-Follin. Las mediciones
fueron realizadas en un espectrofotómetro Genesys 10 UV Thermo, a una longitud de onda de 740
nm, en donde se utilizaron cubetas de cuarzo de 10.00 mm x 10.00 mm con un volumen de 1 ml
(Anexo 1).

5.4 Determinación de mRNA de TPH1
El RNA total de los tejidos (pulmón, corazón, hígado, riñón y colon) fue extraído utilizando el
reactivo de TRIZOL (Invitrogen). Para la síntesis de cDNA, se realizó el siguiente procedimiento: A 5
µg de RNA total se les hizo reaccionar con 1µl de oligo-dT, 200 mM de dNTPs y 2µl de DTT, 1µl de
RT (Superscript IIRT- Invitrogen), en un volumen final de 20 µl. La reacción se llevó a cabo durante
60 min a 42° C y fue detenida por calentamiento a 70° C durante 15 min. Con el fin de eliminar los
híbridos RNA-cDNA, la muestra fue tratada con 2.5 U/µl de RNAsa-H- durante 30 min a 37° C. La
amplificación por PCR se llevó a cabo con 0.5 µl de cDNA, 50 pM de cada cebador, 30 µM de
dNTPs, 2.5 U de Taq DNA polimerasa, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 1.5 mM MgCl2, todo en
un volumen final de 25 µl. La reacción de PCR se llevó a cabo por 35 ciclos (94°C por 1 min, 55-60°
C por 2 min y 72° C por 3 min), utilizando un termociclador (Programmable Thermal Controller,
model PTC-100, MJ Research, Inc). Los productos amplificados fueron separados por geles de
agarosa al 1.2% y las bandas de amplificación fueron visualizadas con SYBRGreen I (Invitrogen, Life
technologies). Las fotografías se realizaron con una cámara Polaroid (DS34 Polaroid U.S.A).
Los oligonucleótidos utilizados fueron los siguientes:
Gen Oligo
TPH1 Longitud
Sentido 5’-TGGAAAGAGGAAGAGCGACTCTCA-3’
Antisentido 5’-AAACCAAGGAACACTCTCCATGCC-3 287 pb
Top II β
Sentido 5'-GAAGTGTTCACTAGTAAAATACAGT-3'
Antisentido 5'-CATAATCTTTCCATAGCGTAAGGTT-3' 336 pb
El detalle de la selección para elegir el par de cebadores específicos para de TPH1 de conejo se
presenta en el Anexo 2.

5.5 Detección de TPH1 por inmunohistoquímica (IHQ)
Los pulmones sin preservar (T0) así como los preservados durante 24 h (T24) fueron cortados y
fijados por inmersión en formaldehído al 10% durante 48 hrs. Posteriormente fueron incluidos en
parafina y se realizaron cortes de 3 µm para ser montados en portaobjetos con silano.

Para la IHQ, las peroxidasas endógenas fueron inactivadas con 150 µl de peróxido de hidrógeno al
3% (Mouse/Rabbit ImmunoDetector Peroxidase Block, Bio SB) durante 5 minutos con un lavado
posterior con PBS/TWEEN 20 (20x, Spring Bioscience) durante 5 minutos. Se realizó una
recuperación antigénica mediante calor con olla de presión (10 min, 121°C) y se incubó el
anticuerpo primario anti-TPH1 humano (Anti-Tryptophan hydroxylase antibody ab32821, Abcam)
hecho en cabra, con una dilución 1:50 durante 30 min a temperatura ambiente. Al término de la
reacción se adicionó 150 µl del anticuerpo secundario biotinilado durante 15 min (Mouse/Rabbit
ImmunoDetector Biotin Link, Bio SB) y posteriormente se adicionó el complejo estreptavidina
peroxidasa (Mouse/Rabbit ImmunoDetector HRP Label, Bio SB), dejándose incubar durante 15 min.
La reacción se reveló con diaminobenzidina (ImmunoDetector DAB Chromogen, Bio SB) y los
tejidos fueron contrateñidos con hematoxilina de Meyer (Hematoxylin, Dako).
Las fotografías fueron tomadas en un microscopio Zeiss Axio Lab.A1 con una cámara AxioCam ERc
5s y el software Zen, 2012 Blue edition.
5.6 Análisis de actividad enzimática de TPH
La actividad enzimática se determinó a través de un ensayo fluorométrico utilizando un
espectrofluorómetro SLM Aminco-Bowman Series 2 (Figura 7), equipado con un soporte con
temperatura controlada y agitador, a una longitud de onda de excitación de 300 nm y de emisión
de 330 nm 26 (Anexo 3).

Figura 7. Espectrofluorómetro SLM AMinco-Bowman Series 2 utilizado para el registro de actividad
enzimática de la TPH1, con una longitud de onda de excitación de 300 nm y emisión de 330 nm.

Brevemente, a un tubo de vidrio con un volumen de 10 ml se agregó el amortiguador de fosfatos
HEPES/NaOH•(NH4)2SO4 a una concentración de 50 mM Hepes y 200 mM de (NH4)2SO4, 0.025 g/L
de catalasa, 25 mM (NH4)2Fe (II)(SO4)2.6H2O, 60 µM triptófano y agua y se incubó durante 3
minutos a 30°C.
Posteriormente se agregó 100 µg del homogeneizado celular y se dejó incubar por 5 minutos. Por
último se agregaron al ensayo 7mM de DTT y 300 μM de BH4/HCl dejándose incubar por 3
minutos a 30°C. El volumen final del ensayo fue de 2500 μl.
Pasados los 3 minutos se detuvo la reacción con una solución de 0.6% de ácido perclórico, 0.1 %
de ácido ascórbico y 5 mM de EDTA.
Se colocaron 2 ml en la cubeta y se procedió a medir fluorescencia emitida por el producto de la
actividad enzimática (5-HTP) en el espectrofluorómetro.

5.7 Análisis
Los datos se expresaron en forma de media aritmética ± desviación estándar. Los promedios y
desviación estándar fueron realizados en la hoja de cálculo de Excel, 2013. Los grupos de datos
fueron analizados en gráficas mediante el programa SigmaPlot 12.3.

Hepes/NaOH
(NH4)2SO4
pH 7.0
(NH4)2Fe(SO4)2 Catalasa Triptófano H2O
Proteína
celular
(TPH)
DTT BH4
Volumen en µl 1000 50 50 50 - - 100 50
Concentración
en la solución
stock
125 mM
Hepes; 500
mM
(NH4)2SO4
1.27 mM 1.25 g/L 3 mM - - 175 mM 15 mM
Concentración
en el ensayo
50 mM, 200
mM
25 μM 0.025 g/L 60 μM variable 100 µg 7 mM 300 μM
Tabla 1. Concentraciones de reactivos y diagrama empleado para la determinación de la actividad enzimática de TPH1

3 min 5 min 3 min

6 Resultados

6.1 RT-PCR
Con el propósito de determinar si el pulmón tiene la capacidad de sintetizar serotonina, decidimos
buscar la presencia del mensajero que codifica para TPH1, por lo cual se realizó un experimento
de RT-PCR en donde utilizamos un par de oligonucleótidos específicos para el gen de conejo.
En la figura 8 se muestra que en los diferentes tejidos analizados: pulmón, corazón, hígado, riñón y
colon se presenta una banda de 287 pb lo que corresponde al tamaño esperado de la secuencia de
amplificación del mRNA. La intensidad de amplificación entre cada uno de los tejidos mostró
pequeñas diferencias. En el caso específico del pulmón, este presentó una intensidad de banda
muy similar a la del riñón.
Los resultados de este experimento indican que el tejido pulmonar expresa mRNA de TPH1, lo que
abre la posibilidad de que la enzima pudiera ser sintetizada

Figura 8. a) Amplificación por RT-PCR
llevado a cabo para mRNA de TPH1 (287 pb)
y Topoisomerasa II beta. Líneas: (PM) peso
molecular (Ctrl) control (1) pulmón
(2) corazón (3) hígado (4) riñón y (5) colon
de conejo. El amplicón de TPH1 es de 287
pares de bases.
b) Análisis de densitometría del mRNA de
TPH1 realizado a travésdel software Image
J.

b)
a)

6.2 Inmunohistoquímica
Con el propósito de determinar si en el pulmón de conejo, el mRNA de THP1 se traduce en
proteína, se realizó la técnica de inmunohistoquímica. Debido a que no existen comercialmente
anticuerpos específicos anti-TPH1 de conejo, se decidió utilizar un anticuerpo específico anti-TPH1
humano. Pruebas iniciales mostraron que este anticuerpo marca positivamente en el epitelio
bronquial de tejido humano (Figura 9).

En la figura 10 se muestra que inmediatamente después de la procuración del bloque
cardiopulmonar (T0) las células del epitelio alveolar (D), el epitelio respiratorio (bronquio y
bronquiolos: A, B) y el endotelio vascular presentan TPH1, mientras que las células del cartílago y
del músculo liso no (A, C). Por otro lado, se puede observar que 24 horas después de ser
preservado el tejido (T24), hay un ligero incremento en la expresión de TPH1 en las células en las
cuales TPH1 ya se encontraba presente. Sorprendentemente, las células del músculo liso que no
expresaban TPH1 son positivas a la inmunodetección a las 24 h (G). En todas las células
observadas, la marca positiva presenta una localización citoplásmica.

Figura 9. Epitelio respiratorio de pulmón de humano, en donde se observa la marca positiva en células tanto del
bronquio (100µm) como del bronquiolo (20 µm)
100 µm
Músculo liso

Figura 10. Detección inmunohistoquímica de la enzima Triptófano hidroxilasa 1 (TPH-1) en pulmón de conejo (400X). En
el grupo control (T0) se observa una reacción positiva a TPH1 en las células del epitelio respiratorio tanto del bronquio (A)
como del bronquiolo (B), mientras que el cartílago se muestra negativo. A nivel alveolar (D) se observa también que las
células del epitelio y endoteliales son positivas para TPH1. Las células de músculo liso (C) son negativas.
Después del tiempo de preservación (T24) se observa un incremento en la intensidad de la tinción en las células. El
epitelio respiratorio continúa siendo positivo para el bronquio (E) y bronquiolo (F); el epitelio alveolar también continúa
mostrándose positivo a la reacción (H). Sorprendentemente, el músculo liso (G) se torna positivo a la TPH-1.

6.3 Actividad enzimática
Con la finalidad de comprobar si la TPH1 encontrada en el tejido pulmonar se presenta como una
proteína activa, se realizó un análisis de actividad enzimática. Para poder llevar a cabo este
estudio, se utilizó como control una línea celular de cáncer mamario denominada MDA-MB-231, la
cual se ha reportado que expresa grandes cantidades de TPH.
En el recuadro de la figura 11 se observa un ensayo típico de la determinación de actividad
enzimática de TPH de la línea celular. La gráfica muestra que existe una correspondencia lineal (r2=
0.94) entre la concentración de proteína celular y la fluorescencia en la longitud de onda que
corresponde a la emisión de 5-hidroxitriptofano (5-HTP).
A partir de estos resultados se analizó la actividad de TPH en distintos tejidos, en donde se detectó
actividad de TPH en homogeneizados de pulmón e hígado en T0, presentando este último un
registro mayor de actividad (Figura 11). La línea celular MDA-MB-231 utilizada como control
mostró una alta actividad de TPH, la cual fue 19 y 8 veces mayor en comparación con el pulmón e
hígado, respectivamente.
Actividad de TPH
MDA-MB-231 Pulmón
U
n
id
a
d
e
s
a
rb
it
ra
ri
a
s
d
e
f
lu
o
re
s
c
e
n
c
ia
(
lo
g
1
0
)
0.001
0.01
0.1
1
Proteína ( g)
0 100 150 200 300
U
n
id
a
d
e
s
a
rb
it
ra
ri
a
s
d
e
f
lu
o
re
s
c
e
n
c
ia
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Coeff icients:
b[0] 2.28e-3
b[1] 0.1311
r ² 0.9453124275

b)
Figura 11. Actividad de TPH en distintos tejidos de conejo. a) Se muestra la actividad de TPH en 100
mg de homogeneizados de pulmón e hígado en comparación con 100 µg extracto total de la línea
MDA-MB-231. b) En el recuadro de la derecha se muestra la actividad de TPH en función de
concentraciones crecientes de proteína total de MDA-MB-231. La gráfica representa el promedio de
tres experimentos independientes y la desviación estándar.
b) a)

7 Discusión
Evidencias obtenidas en el laboratorio indican la presencia de serotonina durante la preservación
pulmonar, y que ésta a su vez parece tener un papel importante en la permeabilidad vascular, ya
que al utilizar bloqueadores de los receptores de 5-HT, el coeficiente de filtración capilar (Kfc)
disminuye9. Adicionalmente, se han logrado identificar células tanto de sistema inmune
(macrófagos y linfocitos), como plaquetas y células neuroendócrinas o de Kultschitzky, con la
capacidad de producir y/o liberar 5-HT; además, en algunos modelos de estudio como el de
hipertensión arterial pulmonar (PAH) se menciona la presencia de TPH1 en células endoteliales
humanas24. En este sentido, y dado que la serotonina observada en los volúmenes de lavado
durante la preservación pulmonar difícilmente podría provenir de plaquetas o células del sistema
inmune circundantes, intentamos dilucidar el origen de este registro de 5-HT en el tejido
pulmonar.
Mediante experimentos tipo RT-PCR logramos detectar expresión del mRNA de TPH1 en tejido
pulmonar de conejo, lo que se convirtió en nuestra primera evidencia y nos permitió plantearnos
la posibilidad de que este tejido tuviera la capacidad de sintetizar la enzima TPH1. Es importante
señalar que a pesar de la presencia de una cadena de mRNA para TPH1, su introducción a la
maquinaria de traducción no está completamente asegurada ya que existen varios mecanismos
reguladores que podrían interferir con el proceso de formación de una proteína activa, tales como
los siARN y los miARN27.
Sin embargo, los resultados de IHQ mostraron que varias células del aparato respiratorio expresan
TPH1 y descartan la posibilidad de una inhibición a nivel del transcrito. Así, los resultados
mostraron que las células pulmonares que expresan TPH1 son principalmente de origen epitelial y
aparecen desde el nivel proximal (epitelio bronquio-lobular, segmentado, epitelio cilíndrico
seudoestratificado, ciliado, no en células caliciformes) hasta el distal (bronquiolos (sin epitelio
ciliado, epitelio aplanado, con células caliciformes, y alveolos (neumocitos tipo I y II); indicando de
esta manera su posible capacidad de producir y secretar 5-HT.
En el epitelio alveolar, los resultados indican también la presencia de TPH1 en sus tres
componentes celulares (neumocitos tipo I, II y macrófagos) y su expresión se ve ligeramente
incrementada a las 24h (Figura 10). En relación con estos resultados podemos postular que la
expresión de TPH1 por el epitelio alveolar podría estar directamente relacionada con la presencia

de serotonina en el espacio alveolar y ser este el mecanismo a través del cual se altera la
regulación del aclaramiento alveolar. En parte este mecanismo de desregulación podría ser
explicado por una actividad inhibitoria de serotonina sobre el canal de sodio epitelial sensible al
amilorida (ENaC), lo cual podría afectar el transporte de iones (Na+ y H+) y por lo tanto el
movimiento de fluidos a través del epitelio alveolar, lo cual conlleva a una disminución en la
capacidad de la célula para mantener el equilibrio dentro y fuera del alveolo, dando como
resultado la formación del edema28. Sin embargo, cabe mencionar que existen otros factores que
pueden estar implicados en la formación del edema, tales como el óxido nítrico, la hipoxia y los
mediadores del sistema inmune, los cuales también tienen una acción directa y afectan la función
del ENaC y las acuaporinas29.
Por otro lado tenemos que las células epiteliales (epitelio seudoestratificado cilíndrico y ciliado
hasta el monoestratificado plano) también presentan TPH1,indicando así la capacidad de las
mismas para producir serotonina. Cabe mencionar que se observó un incremento en la expresión
de TPH1 de estas células a las 24 h comparado con las 0 h. La expresión de TPH1 por células
epiteliales es parecida a los resultados encontrados en el tejido pulmonar humano, en donde
esencialmente son las células epiteliales pulmonares bronquiales las que expresan TPH1.
Además de los tipos celulares mencionados anteriormente, se encontró también que células de
músculo liso arterial son positivas a TPH1, pero a diferencia de las otras, TPH1 se expresa 24 horas
después de la preservación pulmonar y no antes; esto podría deberse a un mecanismo de
comunicación secundario en el sistema.
Como ya es bien sabido, las enzimas también presentan mecanismos que regulan su actividad. En
este sentido, logramos detectar la expresión de TPH1 en varios tipos celulares del pulmón, pero su
presencia no indica necesariamente una enzima activa, ya que como se mencionó antes, la TPH1
es regulada por varias moléculas: i.e. el cofactor BH4, o los eventos de fosforilación en serinas. Al
realizar el registro de actividad enzimática en donde se midió el producto final de la TPH1 que es la
5-HTP, se encontró que esta enzima se encuentra activa en los homogeneizados de pulmón e
hígado de conejo; a pesar de ello el registro fue menor comparada con las células de cáncer de
mama MDA-MB-231 (Figura 11), en las cuáles se ha descrito que sobre-expresan TPH1 y secretan
grandes cantidades de serotonina; en estas células tumorales la serotonina actúa como señal de
proliferación (mecanismo autócrino), mismo que no ha sido observado en células epiteliales

normales de la glándula mamaria18. Es importante mencionar que una mayor actividad de TPH1 en
las células MDA-MB-231 podría ser el resultado de: a) la transformación maligna que da como
resultado la sobreexpresión de varios genes y sus productos, y b) el mayor grado de pureza de la
enzima al provenir de un homogeneizado celular.
Los efectos de la serotonina están asociados a la presencia de sus receptores; por ejemplo, los
receptores 5-HT1 y 5-HT2B son mediadores de vasodilatación a través de la liberación endotelial de
óxido nítrico, mientras que el 5-HT2A se encuentra involucrado en vasoconstricción arterial
23. Por
otro lado 5-HT7 se expresa en células de vasos sanguíneos periféricos y ocasiona la relajación del
músculo liso30. Entonces, el efecto final de la serotonina observado varía según el tipo de receptor
al que se una y además depende de la disponibilidad de serotonina que está definida de acuerdo a
mecanismos de encendido y apagado. La señal de encendido sugerida se da a través de la síntesis
y liberación de 5-HT ante estímulos como la hipoxia o la propia manipulación del tejido durante la
procuración pulmonar.
En un sistema de señalización por serotonina, un hecho relevante es la participación de un
transportador (SERT) en las distintas células que expresan TPH1 y probablemente secreten
serotonina, en donde este transportador tiene la función de recaptura de la propia serotonina y
funcionaría como el mecanismo de apagado del sistema. En este sentido, será necesario identificar
si las mismas células que expresan TPH1 en el pulmón de conejo, también co-expresan este
transportador y en qué condiciones lo expresan. Con la presencia del SERT en las células del tejido
pulmonar se completarían los elementos necesarios para proponer la existencia de un sistema
serotoninérgico en el pulmón de conejo. Cabe resaltar que tampoco se debe olvidar la
participación de las plaquetas como recapturadoras de 5-HT en el sistema in vivo.
La serotonina (5-HT) es uno de los neurotransmisores más ampliamente estudiados del sistema
nervioso central, sin embargo también está presente en una gran variedad de tejidos periféricos
incluyendo los componentes del sistema inmune lo que le otorga diversos papeles además de su
acción como neurotransmisor. Un número creciente de estudios ha revelado que las células T,
células B, células dendríticas y macrófagos son capaces de sintetizar o capturar serotonina. Bajo
ciertos estímulos, estas células pueden liberar la serotonina hacia el compartimiento extracelular,
lo que implica que existe una comunicación autócrina o parácrina con diferentes células del
sistema inmune. Se surgieren cuatro funciones importantes para la 5-HT que incluyen la activación

de células T y células natural killer, respuestas de hipersensibilidad retardada, la producción de
factores quimiotácticos y la inmunidad natural mediada por los macrófagos. Debido a que
nuestros resultados muestran que la TPH1 se encuentra ampliamente distribuida en las distintas
células epiteliales del pulmón, es posible que la serotonina pueda mediar no solo la comunicación
entre las células inmunes, sino también que esta molécula puede estar involucrada en una
comunicación bidireccional entre células del sistema inmune y las células epiteliales del aparato
respiratorio. La estimación de los niveles de serotonina en el espacio extracelular en condiciones
fisiológicas y bajo circunstancias patológicas permitirá entender mejor procesos tales como la
inflamación, trombosis y la isquemia. Así, la posible función reguladora que pueda desempeñar la
serotonina es una vía prometedora para avanzar en el conocimiento del papel de ésta en el
sistema inmune y su interacción con el sistema respiratorio.
Uno de los eventos de mayor importancia en la FPI es la formación del edema pulmonar, generado
como consecuencia de un incremento en la permeabilidad vascular, así como de un daño al
epitelio alveolar en donde la capacidad normal de aclaramiento de los espacios aéreos alveolares
se ve disminuida por la falla del transporte transepitelial de Na+ y Cl- 31,32 Dadas las evidencias
anteriores en donde se sabe que serotonina afecta la permeabilidad vascular9 y a su vez es una de
las moléculas capaces de detener el aclaramiento normal de los alveolos, la TPH1 podría
convertirse en una de las dianas farmacológicas para emplearse en algunas patologías que lleven
asociadas alteraciones de un sistema serotoninérgico, de ahí la gran trascendencia de este estudio.

8 Conclusiones
Con base en los resultados obtenidos demostramos que el transcrito de TPH1 se encuentra en el
tejido pulmonar de conejo, y éste a su vez tiene la capacidad de traducirse en proteína, la cual
encontramos durante la preservación en la mayoría de las células del tejido pulmonar. Por otro
lado, las evidencias de actividad enzimática nos demuestran que es funcional. Dicho lo anterior el
tejido pulmonar está claramente involucrado en la producción de serotonina durante la
preservación pulmonar en conejo.

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10 Anexos

Anexo 1. Curva patrón de albúmina
Para la cuantificación de proteínas mediante la técnica de micro-Lowry-Follin, se realizó una curva
patrón con albúmina (1mg/ml). Los valores de D.O740nm obtenidos en el espectrofotómetro fueron
interpolados en la curva de referencia para obtener la concentración proteica.

Anexo 2. RT-PCR. Diseño de oligonucleótidos
Oryctolagus cuniculus tryptophan hydroxylase 1 (TPH1), mRNA
NCBI Reference Sequence: NM_001099955.1
LOCUS NM_001099955 1412 bp mRNA linear MAM 29-MAY-2010
DEFINITION Oryctolagus cuniculus tryptophan hydroxylase 1 (TPH1), mRNA.
ACCESSION NM_001099955
VERSION NM_001099955.1 GI:153791956
KEYWORDS .
SOURCE Oryctolagus cuniculus (rabbit)
ORGANISM Oryctolagus cuniculus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Glires; Lagomorpha;
Leporidae; Oryctolagus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1412)
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TITLE Cloning and expression of rabbit and human brain tryptophan
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=9986

hydroxylase cDNA in Escherichia coli
JOURNAL Arch. Biochem. Biophys. 315 (2), 445-453 (1994)
PUBMED 7986090
COMMENT PROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet been subject to final
NCBI review. The reference sequence was derived from L29305.1.
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1412
/organism="Oryctolagus cuniculus"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:9986"
gene 1..1412
/gene="TPH1"
/gene_synonym="TPH"
/note="tryptophan hydroxylase 1"
/db_xref="GeneID:100101558"
CDS 1..1335
/gene="TPH1"
/gene_synonym="TPH"
/EC_number="1.14.16.4"
/note="tryptophan hydroxylase 1 (tryptophan
5-monooxygenase)"
/codon_start=1
/product="tryptophan 5-hydroxylase 1"
/protein_id="NP_001093425.1"
/db_xref="GI:153791957"
/db_xref="GeneID:100101558"
/translation="MIEDNKENKDHSLERGRATLIFSLKNEVGGLIKALKIFQEKHVNLLHIESRKSKRRNSEFEIFVDCDTNREQLNDIFHLLKSHTNVLSVTPPDNFTMKEEGM
ESVPWFPKKISDLDHCANRVLMYGSELDADHPGFKDNVYRKRRKYFADSAMSYKYGDP
IPKVEFTEEEIKTWGTVFRELNKLYPTHACREYLKNLPLLSKYCGYQEDNIPQLEDIS
NFLKERTGFSIRPVAGYLSPRDFLSGLAFRVFHCTQYVRHSSDPFYTPEPDTCHELLG
HVPLLAEPSFAQFSQEIGLASLGASEEAVQKLATCYFFTVEFGLCKQDGQLRVFGAGL
LSSISELKHVLSGHAKVKPFDPKITYKQECLITTFQDVYFVSESFEDAKEKMREFTKT
IKRPFGVKYNPYTRSIQILKDAKSITNAMNELRHDLDVVSDALGKVSRQLSV"

Se diseñaron oligonucleótidos específicos de TPH1 para conejo a través de la NIH, los cuales se me
muestran a continuación:
ORIGIN
1 atgattgaag ataataaaga gaacaaagac cattctttgg aaagaggaag agcgactctc
61 attttttcct taaagaatga agttggagga cttataaaag cactgaaaat cttccaggag
121 aaacatgtga acctgttaca tattgagtcc cgaaaatcta agagaagaaa ctcagaattt
181 gagatttttg ttgactgtga taccaacaga gaacaattga atgatatttt tcatcttctg
241 aagtctcata ccaatgttct ttctgtgact ccaccagata attttactat gaaggaagaa
301 ggcatggaga gtgttccttg gtttccaaag aagatttcag acctggacca ttgtgctaac
361 cgagttctga tgtatggatc tgagctagat gcagaccacc ctggcttcaa agacaatgtc
421 taccgtaaaa gacgaaagta ctttgcagac tcggctatga gctataaata tggagacccc
481 attcctaagg ttgaattcac ggaagaggag attaagacct ggggaaccgt attccgggag
541 ctcaacaaac tctatccgac ccatgcttgc agagagtatc tcaaaaattt acctctgctt
601 tccaagtatt gtggatatca ggaagacaat atcccacagc tggaagatat ttcaaacttt
661 ttaaaagagc gcacaggttt ttccattcgt cctgtggctg gttacttatc accaagagat
721 ttcttatcag gtttagcctt tcgagttttt cactgcactc aatatgtgag acacagttca
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7986090
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/531213
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=9986
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/153791956?from=1&to=1412
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=100101558
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/153791956?from=1&to=1335
http://www.expasy.org/enzyme/1.14.16.4
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/153791957
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=100101558

781 gaccccttct ataccccaga gccggatacc tgccatgaac tcttaggtca cgttcccctt
841 ttggctgagc caagttttgc tcagttctcc caagaaattg gcctggcttc ccttggagct
901 tcagaggagg ctgttcaaaa actggcaacg tgctactttt tcactgtgga gtttggtcta
961 tgtaaacaag acggacagtt acgagtcttc ggcgctggct tactttcttc tatcagtgaa
1021 ctcaaacatg tgctttctgg acatgccaaa gtaaagcctt ttgatcccaa gattacgtac
1081 aaacaagaat gcctcatcac aacttttcag gatgtctact ttgtatctga aagctttgaa
1141 gatgcaaagg agaagatgag agaatttacc aaaacaatta agcgtccctt tggagtgaaa
1201 tataatccct acacacgaag cattcagatc ctgaaagacg ccaaaagcat aacgaatgcc
1261 atgaacgagc tgcggcatga tcttgacgtt gtcagcgacg cccttgggaa ggtcagcagg
1321 cagctgagtg tctgacggct gccagtccta actcagacac cgtctgagca tcgattcaga
1381 ggccttggtg ggccagccct gcttttcttg ga

Después de la obtención de la secuencia de oligonucleótidos, se corrió un Blast homology para
nuestros oligonucleótidos, en donde de obtuvo lo siguiente:
Primer-BLAST Primer-Blast results

NCBI/ Primer-BLAST : results: Job id=JSID_01_740104_130.14.22.21_9002 more...
Input PCR template
none
Specificity of primers
Target templates were found in selected database: Refseq mRNA
Other reports
Search Summary
Search parameters and other details
Search parameter name Search parameter
value
Number of Blast hits analyzed 36509
Entrez query
Min total mismatches 2
Min 3' end mismatches 2
Defined 3' end region length 5
Mismatch threshold to ignore
targets
6
Misprimed product size
deviation
5000
Max number of Blast target
sequences
50000
Blast E value 30000
Blast word size 7
Max candidate primer pairs 1000
Min PCR product size 68
Max PCR product size 1000
Min Primer size 15
Opt Primer size 20
Max Primer size 25
Min Tm 57
Opt Tm 60
Max Tm 63
Max Tm difference 3
Repeat filter AUTO
Low complexity filter Yes
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primerinfo.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1354738972&job_key=JSID_01_740104_130.14.22.21_9002
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

NM_001099955.1: 1.
.1.4K (1.4Kbp)

Find on
Sequence:

Sync
Alignment
View

To
ols

Confi
gure

Detailed primer reports

Primer pair 1

Sequence (5'->3') Length Tm GC%
Self
complementarity
Self 3'
complementarity
Forward
primer
TGGAAAGAGGAAGAGCGACTCTCA 24 63.11 50.00 6.00 3.00
Reverse
primer
AAACCAAGGAACACTCTCCATGCC 24 63.35 50.00 4.00 1.00

Ejemplos de los resultados de homologías.

>NM_001099955.1 Oryctolagus cuniculus tryptophan hydroxylase 1 (TPH1), mRNA

product length = 287
Forward primer 1 TGGAAAGAGGAAGAGCGACTCTCA 24
Template 38 ........................ 61

Reverse primer 1 AAACCAAGGAACACTCTCCATGCC 24
Template 324 ........................ 301

>NM_001197191.1 Canis lupus familiaris tryptophan hydroxylase 1 (TPH1), mRNA

product length = 287
Forward primer 1 TGGAAAGAGGAAGAGCGACTCTCA 24
Template 38 .A...................... 61

Reverse primer 1 AAACCAAGGAACACTCTCCATGCC 24
Template 324 .............G.T.....A.. 301

>XM_003993033.1 PREDICTED: Felis catus tryptophan hydroxylase 1 (TPH1), mRNA

product length = 287
Forward primer 1 TGGAAAGAGGAAGAGCGACTCTCA 24
Template 38 .A...........G.......... 61

Reverse primer 1 AAACCAAGGAACACTCTCCATGCC 24
Template 324 .............G.T.....A.. 301

>XM_001083991.2 PREDICTED: Macaca mulatta tryptophan hydroxylase 1 (TPH1), mRNA

product length = 287
Forward primer 1 TGGAAAGAGGAAGAGCGACTCTCA 24
Template 126 .A.....G........A.G..... 149

Reverse primer 1 AAACCAAGGAACACTCTCCATGCC 24
Template 412 .............G.T.....A.. 389

>NM_004179.2 Homo sapiens tryptophan hydroxylase 1 (TPH1), mRNA

product length = 287
Forward primer 1 TGGAAAGAGGAAGAGCGACTCTCA 24
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1354738972&job_key=JSID_01_740104_130.14.22.21_9002
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=153791956
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=308235943
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=410973280
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=297268306
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=226342925

Template 64 .A.....G........A.G..... 87

Reverse primer 1 AAACCAAGGAACACTCTCCATGCC 24
Template 350 .............G.T.....A.. 327

Por último, los distintos pares de oligonucleótidos fueron sintetizados por la compañía Sigma a
una concentración de 100µM.
Anexo 3. Espectro de absorción de triptófano y 5-hidroxitriptofano, producto de la TPH.
Para realizar la actividad enzimática por espectrofluorometría se midió el producto de la enzima
TPH1, que es la 5-HTP. En la figura siguiente (Figura 12) se muestra que existen diferencias de
absorción entre el triptófano y la 5-HTP lo cual nos permite diferenciarlas en nuestro ensayo.

Figura 12. Espectro de Absorción de triptófano (negro)
y 5-hidroxitriptofano (rojo) en 10mM de HCl.
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