Monitoreo-de-toxinas-paralizantes-tps-en-los-moluscos-bivalvos-chama-sordida-y-striostrea-prismatica-en-la-baha-de-mazatlan-sinaloa

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MONITOREO DE TOXINAS PARALIZANTES (TPs) EN LOS 
MOLUSCOS BIVALVOS Chama sordida y Striostrea prismatica, EN 
LA BAHÍA DE MAZATLÁN, SINALOA 
T E S I S 
Que para obtener el grado académico de 
Maestro en Ciencias 
(Biología Marina) 
p r e s e n t a 
 
ING. BIOT. SONIA JEANETTHE DELGADO DEL VILLAR 
 
DIRECTOR DE TESIS: DRA. ROSALBA ALONSO RODRÍGUEZ 
COMITÉ TUTORAL: DR. FEDERICO PÁEZ OSUNA 
 DRA. LUZ ELENA VERA ÁVILA 
 DRA. LUZ MARÍA GARCÍA DE LA PARRA 
 DRA. MARÍA DE LOURDES MORQUECHO 
ESCAMILLA 
 
Mazatlán, Sinaloa, enero del 2012 
Unidad Académica Mazatlán 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
2 
 
 
DEDICADA 
 
 
A dios por darme la oportunidad de superarme profesional y espiritualmente, 
por estar a mi lado apoyándome y amándome a cada instante. 
A mi madre María de Jesús Del Villar Aguirre, por entregarme su amor, 
paciencia y apoyo incondicional. Gracias a su trabajo y dedicación, me brindó 
una formación académica, humanista y espiritual, haciendo de mí el ser 
humano que soy ahora. 
A mi padre Candelario Delgado, a mis abuelos Laura Cantero y Raymundo 
Delgado y a mi tía Eva Delgado Cantero que siempre estuvieron apoyándome y 
motivándome en esta etapa de mi vida. 
A Germán Valdez Bibo por todo el amor, paciencia y apoyo brindado durante 
la elaboración tesis, fuiste mi motivación para seguir adelante. 
 
 
 
3 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la UNAM que me abrió las puertas para crecer profesionalmente y al apoyo 
de la beca (41450) otorgada por CONACYT que me permitió desarrollar este 
trabajo de tesis, ayudándome a alcanzar mis metas. 
 
A la Dra. Rosalba Alonso Rodríguez por confiar en mí y darme la oportunidad 
de trabajar bajo su coordinación, por darme un espacio en su laboratorio y 
equipo para el desarrollo de la investigación. 
 
Al Comité de Tesis por su apoyo y contribuciones durante el desarrollo del 
proyecto: Dr. Federico Páez Osuna, Dra. Luz Elena Vera Ávila, Dra. Luz María 
García de la Parra, Dra. Lourdes Morquecho Escamilla. 
 
Al Mat. Germán Ramírez Reséndiz por su apoyo y asesoría en el 
procesamiento estadístico de los datos, a Carlos Suárez por su asistencia 
técnica en la edición de la presente tesis, a Margarita Cordero Ruíz por su 
asesoría, tiempo y dedicación en la gestión de documentos y a María Clara 
Ramírez Jáuregui por las facilidades otorgadas en la biblioteca del Instituto de 
Ciencias del Mar y Limnología, Unidad Académica Mazatlán, UNAM. 
 
A la Ing. María Vicia Bernal Córdova por su apoyo técnico en el análisis de 
toxinas paralizantes y a la Ing. Ana Lourdes Noriega Astorga por su apoyo 
técnico en el cultivo de microalgas. 
 
A Ana María Guadalupe Flores Chavarría por su compañía y ayuda en la 
realización del bioensayo, por hacer muy agradables las jornadas largas de 
trabajo, enseñarme su valentía, responsabilidad y dedicación. 
 
 
 
4 
A mis compañeros de laboratorio Ing. Ruth Arely Pazos Mandujano, Biol. 
Gladys Anahí Martínez Tecuapacho y Germán Juárez Corral por su compañía y 
apoyo en la extracción de toxinas paralizantes. 
 
A la M.C. Carmen Cristina Osuna Martínez por su apoyo en la extracción de 
TPs, duplicación de ADN de los moluscos bivalvos y los trámites para su 
secuenciación. 
 
Al M.C. Jesús Manuel Quintero Álvarez, Germán Javier Velarde Montes, Ing. 
Karla Beatriz Páez Vidal y Biol. Ángel Valdéz Bustamante por compartir sus 
conocimientos en el cultivo de microalgas, brindarme su ayuda y su tiempo en 
el desarrollo del bioensayo. 
 
A Ámbar Yépez y Xóchilt Varela por su apoyo en el recuento de fitoplancton 
en muestras de agua de la bahía de Mazatlán, Sinaloa. 
 
A Jorge Bustamante, Tomasa Cuellar, Sandra Velásquez por hacer ameno el 
trabajo y tener un ambiente unido dentro del laboratorio. 
 
A la Dra. Ana Carolina Ruíz Fernández por el apoyo brindado para obtener 
una beca otorgada por la Organización Internacional de Energía Atómica 
(OIEA) para el entrenamiento de análisis de biotoxinas marinas en Chile. Al Dr. 
Benjamín Suárez Isla, Dr. Américo López Rivera, Fernanda Barrera del Valle y 
Daniel Carrasco Palma por brindarme su conocimiento, paciencia y amistad 
durante mi estancia en Chile. 
 
A la Organización Internacional de Energía Atómica (OIEA) por la beca 
otorgada para realizar un entrenamiento sobre el análisis de biotoxinas en la 
Universidad de Chile (Proyecto RLA/7/014). 
 
 
5 
 
 
Al Dr. Jorge R. Ruelas Inzunza por su apoyo en la preparación de las 
muestras y al Instituto Tecnológico de Mazatlán (ITMaz) por prestar sus 
instalaciones y equipos. 
 
Al Dr. Miguel Ángel Hurtado Oliva por su apoyo y asesoría en el montaje y 
desarrollo del bioensayo. 
 
A la Dra. Silvia Alejandra García Gasca encargada del laboratorio de 
Biología Molecular en el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo 
A.C. (CIAD) de Mazatlán y M. en C. Rubí Hernández, por la realización del 
análisis de ADN de los moluscos bivalvos. 
 
Al Biol. David Reza Mendoza por la gestión realizada para el permiso de 
Pesca de Fomento otorgado por el Instituto Nacional de la Pesca (INAPESCA). 
 
A Gemma Giménez Papiol, técnica en el Instituto de Investigación y 
Tecnología (IRTA) Tarragona, España, por su asesoría en los cálculos de 
toxinas paralizantes. 
 
A Casimiro Ramírez Camarena y Erick J. Náñez Vázquez por facilitar el 
extracto y los resultados de los análisis practicados al mismo para la 
comparación de los resultados obtenidos en esta tesis. 
 
A mis amigos Cinthia Sainz Zamora, Kenia Noriega Villalobos e Iliana 
Cabrales Martínez por su apoyo moral durante mi periodo de estudio, a Elliot 
López Jasso y Edson Moreno Jara por su apoyo y ayuda durante mis 
experimentos. 
 
 
6 
RESUMEN 
Este estudio se realizó con el propósito de generar información para establecer un 
programa de vigilancia de toxinas paralizantes (TPs) en organismos marinos para consumo 
humano en la bahía de Mazatlán, Sinaloa. El monitoreo de toxinas TPs consistió en la 
determinación y comparación de la concentración y del perfil tóxico en dos especies de 
moluscos bivalvos Chama sordida (no comercial) y Striostrea prismatica (comercial) colectados 
entre septiembre del 2006 y septiembre del 2009. Se complementó la información obtenida con 
un bioensayo realizado en el laboratorio, con el fin de verificar la acumulación de TPs en los 
moluscos considerados en el estudio. El bioensayo consistió en exponer a los dos bivalvos a 
una concentración conocida de células vegetativas de Gymnodinium catenatum, 
determinándose la concentración y perfil de TPs en períodos de intoxicación y desintoxicación, 
durante 21 días. Los análisis de TPs se realizaron por cromatografía líquida de alta resolución 
con detector de fluorescencia (HPLC-FD) utilizando el método oficial AOAC (2005) y de 
Lawrence et al. (2005), el método mostró alta sensibilidad para los derivados STX, GTX2,3, 
GTX5, C1,2, dcSTX, dcGTX2,3 y una baja sensibilidad para GTX1,4 y NEO. Las 
concentraciones máximas de TPs durante el monitoreo fueron de 792.3 µg STX eq kg-1 para C. 
sordida y de 887.6 µg STX eq kg-1 para S. prismatica. Se determinó que C. sordida concentró 
TPs con mayor frecuencia durante los tres ciclos anuales. Se presentó un aumento de TPs en 
ambasespecies de marzo a junio de cada año, esta estacionalidad se relacionó con la 
presencia de G. catenatum, principal productor de TPs en la bahía. En octubre del 2006, junio 
del 2007 y enero del 2008 las concentraciones de TPs sobrepasaron el límite máximo 
permisible establecido por las normas mexicanas (800 µg STX eq kg-1). En condiciones de 
laboratorio, no se encontró relación de la concentración y del perfil de toxinas paralizantes entre 
C. sordida y S. prismatica, los valores máximos fueron de 226.2 µg STX eq kg-1 para C. sordida 
y 48.4 µg STX eq kg-1 para S. prismatica. En condiciones naturales, se determinó que no existen 
diferencias significativas (p<0.05) en las concentraciones promedio de los análogos STX, 
GTX2,3, GTX5 y dcSTX presentes en C. sordida y S. prismatica, sin embargo, si se observaron 
diferencias significativas (p<0.05) en las concentraciones de los derivados C1,2 y dcGTX2,3 
encontrados en ambas especies, siendo C. sordida la que presenta mayor concentración de 
estos derivados. En condiciones de laboratorio no se encontraron diferencias significativas 
(p<0.05) en la concentración de los análogos de STX, GTX2,3, GTX5, dcSTX y dcGTX2,3, 
presentes en los dos moluscos, no obstante, existen diferencias significativas (p<0.05) en las 
concentraciones de C1,2 entre ambas especies, siendo C. sordida la que presenta mayor 
concentración de los derivados mencionados. Este trabajo presenta evidencias de los periodos 
más vulnerables de concentración de TPs en moluscos, estos datos son muy importantes para 
proponer medidas de manejo y/o control sanitario, además corrobora que el monitoreo de 
toxinas en moluscos en una zona donde hay antecedentes de eventos tóxicos, es una 
herramienta indispensable en el seguimiento de florecimientos algales nocivos con el fin de 
evitar riesgos de salud para la población local y nacional. 
 
 
7 
ABSTRACT 
The purpose of the study was to generate information for establish a monitoring of 
paralytic shellfish toxins (PSTs) in shellfish from Bahia de Mazatlan in Sinaloa, México. The 
monitoring of PSTs consisted of determining and comparing the concentration and profile of 
PSTs toxins in two species of bivalves, Chama sordida (non-commercial) and Striostrea 
prismatica (commercial) collected from September 2006 to September 2009. The information 
was complemented with a bioassay in order to verify the accumulation of PSTs in the two 
molluscs considered in the study exposing them to a known concentration of vegetative cells of 
Gymnodinium catenatum, the concentration and profile of PSTs were determined in periods of 
intoxication and detoxification, during 21 days. The PTs analysis was performance by high 
performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FD) using the official 
method AOAC (2005) and Lawrence et al. (2005), the method showed high sensitivity to STX, 
GTX2,3, GTX5, C1,2, dcSTX, dcGTX2,3 and low sensitivity to GTX1,4 and NEO derivatives. 
The maximum concentrations of PTs during monitoring were 792.3 µg STX eq kg-1 to C. sordida 
and 887.6 µg STX eq kg-1 to S. prismatica. It was found that C. sordida concentrated PSTs more 
frequently during the three annual cycles. There was an increase of PSTs in both species from 
March to June each year, such seasonality is related to the presence of the toxic dinoflagellate 
G. catenatum, it the largest producer of PSTs in the bay. On October 2006, June 2007 and 
January 2008 the PSTs concentrations exceeded the maximum permissible limit set by Mexican 
standards (800 µg STX eq kg-1). Under laboratory conditions, there was no relationship of 
concentration and profile of PSTs between C. sordida and S. prismatica, the maximum values 
were 226.2 µg STX eq kg-1 in C. sordida and 48.38 µg STX eq kg-1 in S. prismatica. Under 
natural conditions, it was determined that no significant differences (p<0.05) in the average 
concentrations of STX, GTX2,3, GTX5 and dcSTX derivatives existed between C. sordida and 
S. prismatica, however, significant differences (p<0.05) were observed in the concentrations of 
C1,2 y dcGTX2,3 derivatives found in both species, C. sordida had a higher concentration of this 
derivatives. Under laboratory conditions, it was determined that no significant differences 
(p<0.05) in the concentrations of STX, GTX2,3, GTX5, dcSTX y dcGTX2,3 derivatives in the two 
molluscs, however, significant differences (p<0.05) were observed in the concentrations of C1,2 
between the two species. C. sordida had a higher concentration of C1,2. This paper presents 
evidence of the most vulnerable periods of PSTs concentrations in mollusks, these data are very 
important to propose measures for handling and management of sanitary control, also confirms 
that PSTs monitoring in shellfish from areas with chronic toxic events is an essential tool to 
prevent health risks to the local and national population consumption of shellfish contaminated 
with these toxins. 
 
 
8 
TABLA DE CONTENIDO 
 
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 16 
2. ANTECEDENTES ........................................................................................... 20 
3. ÁREA DE ESTUDIO ........................................................................................ 24 
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................. 25 
5. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 25 
6. HIPÓTESIS ..................................................................................................... 26 
7. OBJETIVOS .................................................................................................... 27 
7.1. Objetivo general .............................................................................................. 27 
7.2. Objetivos específicos ...................................................................................... 27 
8. METODOLOGÍA .............................................................................................. 28 
8.1. Montaje del método AOAC (2005); Lawrence et al. (2005) ............................ 28 
8.2. Validación del método de Barrera-del Valle et al. (2009) ............................... 30 
8.3. Cultivo de microalgas ...................................................................................... 38 
8.4. Bioensayo (diseño de experimento de acumulación y desintoxicación de 
TPs) (Kwong et al. 2006) ........................................................................... 39 
8.5. Muestreo de moluscos bivalvos C. sordida y S. prismatica ............................ 40 
8.6. Extracción de tejido blando ............................................................................. 40 
8.7. Liofilizado y molido .......................................................................................... 41 
8.8. Análisis de toxinas paralizantes (TPs) en ostión ............................................. 41 
8.9. Análisis estadístico ......................................................................................... 48 
9. RESULTADOS ................................................................................................ 50 
9.1. Montaje del método AOAC (2005); Lawrence et al. (2005) ............................ 50 
 
 
9 
9.2. Validación del método ..................................................................................... 53 
9.3. Monitoreo de TPs en C. sordida y S. prismatica ............................................. 61 
9.4. Bioensayo ....................................................................................................... 65 
9.5. Análisis estadístico ........................................................................................ 68 
10. DISCUSIÓN .................................................................................................74 
11. CONCLUSIÓN ............................................................................................. 80 
12. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 82 
13. ANEXOS ...................................................................................................... 94 
 
 
 
10 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1. Parámetros de análisis de TPs en moluscos .......................................... 29 
Tabla 2. Fase móvil (solución A y B) para el análisis de TPs ............................... 29 
Tabla 3. Programa del gradiente de elución a un flujo de 2 ml/min. ..................... 29 
Tabla 4. Material de referencia interno de TPs en almeja ..................................... 32 
Tabla 5. Factor de cobertura Kn para el cálculo del límite de detección. .............. 34 
Tabla 6. Factores KU y KL para el cálculo de los límites de confianza. Nivel de 
confianza = 95% (Huber, 2003). ............................................................... 34 
Tabla 7. Análisis cualitativo y cuantitativo de TPs................................................. 42 
Tabla 8. Factor de toxicidad (TF) de TPs, CEFAS (2010b). ................................. 47 
Tabla 9. Tiempo de retención de estándares de referencia de TPs. PM = 
peso molecular, STD = estándar de referencia certificado, FT = factor 
de toxicidad, TR = tiempo de retención. ................................................... 50 
Tabla 10. Intervalo de concentración, desviación estándar (Sx, n=3), 
porcentaje de coeficiente de variación (%) y coeficiente de 
correlación (r2) de las curvas de calibración de los estándares de 
referencia de TPs. .................................................................................... 53 
Tabla 11. Comparación de las mezclas de análogos de TPs usadas en este 
estudio y en CEFAS (2010b). ................................................................... 56 
Tabla 12. Precisión de la determinación de estándares de referencia según el 
método de Lawrence et al. (2005) ............................................................ 59 
Tabla 13. Comparación del límite de detección (LD) y cuantificación (LC) de 
TPs entre el resultado de este estudio y CEFAS (2010b). ....................... 60 
Tabla 14. Límite de detección (LD), límite de confianza superior (Upper 
Confidence Limit-LCS) y límite de confianza inferior (Lower 
Confidence Limit-LCI). .............................................................................. 60 
Tabla 15. Incertidumbre de los estándares de referencia y la Incertidumbre 
total del método Lawrence et al. (2005). .................................................. 61 
 
 
11 
Tabla 16. Correlación de las concentraciones de los análogos de TPs en el 
medio natural presentes en S. prismatica. Los valores resaltados son 
las correlaciones que resultaron significativas con α = 0.05, T 0.05 (2), 
34 = 0.329 .................................................................................................. 71 
Tabla 17. Correlación de las concentraciones de los análogos de TPs en el 
medio natural presentes en C. sordida. Los valores resaltados son 
las correlaciones que resultaron significativas con α = 0.05, n = 36 T 
0.05 (2), 34 = 0.329 ........................................................................................ 71 
Tabla 18. Correlación de las concentraciones de los análogos de TPs en 
condiciones de laboratorio presentes en C. sordida. Los valores 
resaltados son las correlaciones que resultaron significativas con α = 
0.05, n = 9, T 0.05 (2), 7 = 666 ..................................................................... 72 
Tabla 19. Correlación de las concentraciones de los análogos de TPs en 
condiciones de laboratorio presentes en S. prismatica. Los valores 
resaltados son las correlaciones que resultaron significativas con α = 
0.05, n = 9, T 0.05 (2), 7 = 666 ..................................................................... 72 
Tabla 20. Valores de T para muestras pareadas con α = .05 en las 
concentraciones de los análogos detectados en C. sordida y S. 
prismática. Los valores resaltados son los análogos que resultaron 
con diferencias significativas α = 0.05, (condiciones naturales n = 36, 
T 0.05 (2), 35 = 2.030, laboratorio n = 9, T 0.05 (2), 8 = 2.306) .......................... 72 
Tabla 21. Comparación del límite de detección y cuantificación de los 
resultados obtenidos en este estudio, CEFAS (2010b) y Lawrence et 
al. (2005). ................................................................................................. 75 
 
 
 
 
12 
ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura 1. Estación de muestreo de moluscos. .......................................................... 24 
Figura 2. Esquema del equipo de cromatografía líquida de alta resolución con 
detector de fluorescencia (HPLC-FD) (AOAC, 2005; Lawrence et al., 
2005). ....................................................................................................... 28 
Figura 3. Metodología para el análisis de toxinas paralizantes, AOAC (2005); 
Lawrence et al. (2005). ............................................................................ 43 
Figura 4. Concentración (µg STX eq kg-1) de TPs en C. sordida y S. prismatica 
en la bahía de Mazatlán, Sinaloa (2006-2009). ....................................... 63 
Figura 5. Composición (% mol) de análogos de TPs en C. sordida, proveniente 
de la bahía de Mazatlán, Sinaloa (2006-2009) ........................................ 64 
Figura 6. Composición (% mol) de análogos de TPs en S. prismatica, 
proveniente de la bahía de Mazatlán, Sinaloa (2006-2009). .................... 64 
Figura 7. Comparación de la frecuencia de cada análogo de TPs en C. sordida y 
S. prismatica. ........................................................................................... 65 
Figura 8. Concentración de TPs en C. sordida durante las etapas del bioensayo. 
Día del muestreo entre paréntesis. .......................................................... 66 
Figura 9. Concentración de TPs en C. sordida durante las etapas del bioensayo. 
Día del muestreo entre paréntesis. .......................................................... 66 
Figura 10. Análogos de STX (% mol) presentes en C. sordida durante el 
bioensayo. ................................................................................................ 67 
Figura 11. Análogos de STX (% mol) presentes en S. prismatica durante el 
bioensayo. ................................................................................................ 67 
Figura 12. Relación entre los índices de condición (IC) de C. sordida y S. 
prismatica. ................................................................................................ 68 
Figura 13. Relación entre la concentración de TPs (µg STX eq kg-1) y el índice 
de condición (IC) de S. prismatica. .......................................................... 68 
Figura 14. Relación entre la concentración de TPs (µg STX eq kg-1) y el índice 
de condición (IC) de C. sordida. ............................................................... 69 
Figura 15. Relación entre la concentración de TPs (µg STX eq kg-1) de C. 
sordida y S. prismatica. ............................................................................ 69 
 
 
13 
ÍNDICE DE LÁMINAS 
 
Lámina 1. (a) Estándar de referencia C1,2 a 2.1 µmol/L; (b) Estándar de 
referencia GTX5 a 2.6 µmol/L; (c) Estándar de referencia dcSTX a 
2.7 µmol/L; (d) Estándar de referencia STX a 2.6 µmol/L; (e) 
Estándar de referencia GTX2,3 a 2.5 µmol/L; (f) Estándar de 
referencia dcGTX2,3 a 1.4 µmol/L ....................................................... 51 
Lámina 2. (a) Estándar de referencia dcNEO a 2.7 µmol/L; (b) Estándar de 
referencia NEO a 5.2 µmol/L; (c) Estándar de referencia GTX1,4 a 
2.8 µmol/L. ........................................................................................... 52 
Lámina3. Curvas de calibración de estándares de referencia certificados de 
TPs, oxidados con peróxido. ................................................................ 54 
Lámina 4. Curvas de calibración de estándares de referencia certificados de 
TPs, oxidados con solución de periodato. ........................................... 55 
Lámina 5. (a) Matriz de S. prismatica; (b) Matriz de C. sordida. ............................. 56 
Lámina 6. (a) Mezcla I, estándares de referencia NEO y GTX1,4; (b) Mezcla II, 
estándares de referencia dcGTX2,3, dcSTX, GTX2,3, GTX5 y STX; 
(c) Mezcla III, estándar de referencia C1,2; (d) Mezcla IV, estándar 
de referencia dcNEO. .......................................................................... 57 
 
 
 
14 
SIGLAS Y ABREVIATURAS 
 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
AOAC Association of Analytical Communities 
C1,2 N-sulfocarbamoil-11-hidroxisulfato 1,2 
C3,4 N-sulfocarbamoil-11-hidroxisulfato 3,4 
CE Comunidad Europea 
CEFAS Centre for Environment, Fisheries & Aquaculture Science – Centro de 
Ciencias Ambientales, Pesqueras y Acuícolas 
CV Coeficiente de variación, expresado en porcentaje 
dcGTX2,3 Decarbamoil gonyautoxina 
dcNEO Decarbamoil neosaxitoxina 
dcSTX Decarbamoil saxitoxina 
doGTX3 Deoxi-decarbamoil gonyautoxina 
doSTX Deoxi-decarbamoil saxitoxina 
EAM Envenenamiento amnésico por consumo de mariscos 
EAZP Envenenamiento azaspiracido por consumo de mariscos 
ECF Envenenamiento ciguatérico en pescado 
EDM Envenenamiento diarreico por consumo de mariscos 
EM Longitud de onda de emisión 
EN Envenenamiento neurológico 
EPM Envenenamiento paralizante por consumo de mariscos 
EX Longitud de onda de excitación 
FANs Florecimientos algales nocivos 
FAO Food and Agriculture Organization - Organización de las Naciones 
Unidas para la Agricultura y la Alimentación 
FT Factor de toxicidad 
GTX 2,3 N-sulfocarbamoil gonyautoxina 2,3 
GTX1,4 N-sulfocarbamoil gonyautoxina 1,4 
 
 
15 
HPLC-FD High performance liquid chromatography with fluorescense detector - 
Cromatografía líquida de alta resolución con detector de 
fluorescencia 
IC Índice de condición 
IOC Intergovermental Oceanographic Commission - Comisión 
Oceanogáfica Intergubernamental 
KL Factor de cobertura para el límite de confianza inferior (LCI) 
Kn Factor de cobertura para calcular el LD 
KU Factor de cobertura para el límite de confianza superior (LCS) 
LC Límite de cuantificación 
LCI Límite de confianza inferior 
LCS Límite de confianza superior 
LD Límite de detección 
Neotipo Espécimen elegido como el estándar del nombre de una especie o 
subespecie para la cual no existe ninguno del tipo original 
NeoSTX Neosaxitoxina 
NRCC National Research Council Canada – Consejo nacional de 
investigación de Canadá 
PCR Polymerase Chain Reaction - Reacción en cadena de la polimerasa 
PM Peso molecular (g) 
r2 Coeficiente de correlación 
STD Estándar de referencia certificado 
STX Saxitoxina 
Sx Desviación estándar 
TPs Toxinas de tipo paralizante 
TR Tiempo de retención (min) 
U Incertidumbre 
UNESCO United Nations Educational, Scientific and Cultural Organization - 
Organización para la Educación, la Ciencia y la Cultura 
USTD Incertidumbre presentada en el certificado del estándar de referencia 
 
 
16 
1. INTRODUCCIÓN 
Existen 104 especies de microalgas no necesariamente abundantes, 
capaces de producir poderosas toxinas que se transfieren por la cadena 
alimenticia (moluscos, crustáceos y peces de escama) y que pueden 
eventualmente ser consumidos finalmente por seres humanos, provocando 
diversas enfermedades gastrointestinales y neurológicas (Hallegraeff et al., 
1995; Lindahl, 1998; IOC-UNESCO, 2011). 
Las toxinas son metabolitos secundarios sin un papel explícito en la 
economía interna de los organismos productores y con actividades muy 
específicas en mamíferos. Son utilizadas, por los organismos productores 
probablemente como una forma de lucha por espacios, para combatir la 
depredación o como defensa contra el crecimiento excesivo de otros 
organismos (Botana et al., 1996). 
Se ha identificado un gran número de toxinas a partir de los diferentes 
grupos fitoplanctónicos generadores de florecimientos algales nocivos, y con la 
finalidad de simplificar su estudio, se han clasificado de acuerdo con el tipo de 
trastorno que producen, estos son: envenenamiento paralizante por consumo 
de moluscos (EPM), envenenamiento diarreico por consumo de moluscos 
(EDM), envenenamiento amnésico por consumo de moluscos (EAM), 
envenenamiento neurológico (EN), envenenamiento azaspirácido por consumo 
de mariscos (EAZP) y envenenamiento ciguatérico en pescado (ECF) (FAO, 
2005). 
De aproximadamente 2,000 especies de dinoflagelados (Taylor, 1990), 
alrededor de 72 tienen la capacidad de producir toxinas que pueden causar 
algún tipo de daño a los seres humanos y de éstas, 13 especies pertenecen al 
género Alexandrium, 1 especie a Gymnodinium y 1 especie a Pyrodinium 
producen toxinas paralizantes (IOC-UNESCO, 2011) (Anexo 1). 
 
 
17 
Las toxinas del tipo paralizante (TPs), están referidas a la saxitoxina como 
molécula base y son responsables del envenenamiento paralizante por 
consumo de moluscos (EPM). Actualmente se han identificado 57 derivados de 
saxitoxina (STX). Son producidas en gran parte por dinoflagelados 
(Alexandrium, Gymnodinium y Pyrodinium) y cianobacterias (Anabaena, 
Aphanizomenon Cylindrospermopsis, Lyngbya y Planktothrix), entre otros 
organismos (Wiese et al., 2010). Las toxinas TPs han sido las más estudiadas 
desde hace algunas décadas, y se sabe que este tipo de toxinas actúan 
selectivamente sobre las membranas nerviosas; sus grupos guanidina son la 
base estructural de su molécula, los cuales bloquean los canales de los iones 
de sodio, alterando la conducción del impulso nervioso (Anexo 2). De acuerdo a 
los grupos funcionales que se unen a los sitios reactivos de esta molécula, se 
producen derivados de diferente potencia (Anexo 3) y esta variedad de 
derivados conforman un perfil tóxico específico obtenido a partir de una muestra 
de fitoplancton, molusco o agua. 
El dinoflagelado Gymnodinium catenatum, produce toxinas del tipo 
paralizante (TPs), actualmente se conocen 39 análogos de saxitoxina (21 con 
características hidrofílicas y 18 con hidrofóbicas) producidos por esta especie 
(Wiese et al., 2010). Se ha documentado que en México, existe un incremento 
en su frecuencia de aparición, principalmente a lo largo de las costas del 
Océano Pacífico desde la península de Baja California hasta Oaxaca (Cortés-
Altamirano y Alonso-Rodríguez, 1997, Ronsón-Paulín, 1999; Gárate-Lizárraga 
et al., 2005). Debido a la potencia de las toxinas que produce este 
dinoflagelado, su presencia representa un peligro latente, ya que puede ser 
consumido por diversos tipos de moluscos filtradores, siendo éstos los 
principales vectores de toxinas hacia el ser humano (Kimmerer et al., 1994). 
Los ostiones son organismos filtradores, se alimentan de microalgas y 
materiales orgánicos en suspensión, siempre y cuando las partículas tengan el 
 
 
18 
tamaño adecuado para ser ingeridas (Garay, 1999). Los ostiones pueden 
representar un serio problema de salud para los humanos ya que concentran la 
materia orgánica y pueden acumular agentes patógenos tales como las 
bacterias coliformes, salmonelas y Pseudomonas aeruginosa (Kabler et al., 
1964). Entre los contaminantes químicos que acumula el ostión están los 
insecticidas, metales pesados, hidrocarburos, materiales radiactivos y 
biotoxinas, estas afectan diferentes niveles tróficos en el medio marino y 
provocan riesgos para la salud humana (Garay, 1999). 
Los moluscos bivalvos pueden ser sensibles o poco sensibles a las 
toxinas paralizantes, en general, las especies que son poco sensibles a las 
toxinas TPs (e.g., mejillones Mytilus edulis), se alimentan fácilmente de células 
tóxicas y por lo tanto acumulan altos nivelesde estas toxinas (Bricelj et al., 
1990). En contraste, las especies que alcanzan toxicidades relativamente bajas 
(e.g. ostiones Crassostrea virginica), son muy sensibles a la presencia de 
toxinas TPs y exhiben mecanismos fisiológicos y de comportamiento que han 
desarrollado para evitar o reducir la exposición a las células tóxicas (Bricelj y 
Shumway, 1998). Tales mecanismos van desde la reducción de las tasas de 
filtración de alimento, hasta el cierre completo de las valvas (Gainey y 
Shumway, 1988; Wildish et al., 1998). El límite máximo de toxinas que puedan 
acumular los moluscos bivalvos dependerá de la especie de dinoflagelado que 
se trate, la abundancia celular que mantengan, su toxicidad específica, duración 
de los florecimientos y la tasa de filtración del molusco (Bricelj y Shumway, 
1998). 
Los moluscos bivalvos tienen diferente capacidad para acumular, 
biotransformar y eliminar toxinas paralizantes, por lo que éstos son usados 
como organismos centinelas para el monitoreo de la presencia de toxinas TPs. 
Sin embargo, la cinética de acumulación y desintoxicación de las toxinas puede 
variar de acuerdo a la respuesta extrínseca o intrínseca del molusco, a los 
 
 
19 
factores ambientales, como temperatura, salinidad, abundancia celular del 
dinoflagelado, y sobre todo del tiempo de exposición de las poblaciones de 
moluscos a la micoalga tóxica (Bricelj y McQuarrie, 2003). El bivalvo Chama 
sordida (Anexo 4) ha sido considerado un neotipo localizado en la bahía de 
Mazatlán, Sinaloa por Valentich-Scott y Coan (2010); no es un producto de 
consumo humano, sin embargo, comparte el hábitat con la especie comercial 
Striostrea prismatica; posee una concha inequivalva e inequilátera, de forma 
muy variable, pero generalmente redondeada, a menudo distorsionada y 
cubierta de excrecencias de organismos marinos o erosionada por organismos 
perforantes; gruesa y pesada, fuertemente cementada al sustrato por la valva 
izquierda (inferior) que es mucho más grande y profunda que la valva derecha 
(superior) más o menos aplanada (Poutiers, 1995). 
El molusco bivalvo S. prismatica (Anexo 5) se localiza a lo largo de toda la 
costa del Océano Pacífico mexicano, adherido al sustrato rocoso (Páez-Osuna 
et al., 1993). Esta especie se distribuye desde la Paz, Baja California hasta el 
norte de Perú (Keen, 1971). La pesquería de este ostión es artesanal (Van der 
Heiden y Hendrickx, 1979) y ocupa el 7º lugar de importancia por peso 
desembarcado en México. Sinaloa contribuye con el 12.07% de la producción 
nacional (SEDEPESCA, 1994). 
La presencia de TPs en alimentos procedentes del mar en las costas del 
Pacífico mexicano puede representar un grave problema de salud, la detección 
de estas toxinas es un elemento indispensable para evitar riesgos a la 
población por el consumo de mariscos contaminados con biotoxinas. 
 
 
 
20 
2. ANTECEDENTES 
Gymnodinium catenatum es una de las especies más peligrosas dentro 
del grupo de los dinoflagelados tóxicos, se han registrado florecimientos algales 
de esta especie a lo largo de la línea de costa de todos los continentes, excepto 
en la Antártica (Bolch y Reynolds, 2002). Oshima et al. (1987) confirmaron que 
cepas de G. catenatum aisladas de Tasmania, Australia producen TPs, y su 
perfil está integrado por saxitoxina (STX), decarbamoil saxitoxina (dcSTX), 
gonyautoxinas (GTX1-GTX5) y las N-sulfocarbamoil-11-hidroxisulfatos (C1-C4). 
Análisis posteriores revelaron que estas cepas también producen toxinas 
hidrofóbicas de TPs, detectando deoxi-decarbamoil saxitoxinas (doSTX) y 
deoxi-decarbamoil gonyautoxina (doGTX3) (Oshima et al., 1993). Los perfiles 
de toxinas de G. catenatum en Australia, Brasil, China, Japón, Corea, México, 
Portugal, Singapur, España y Uruguay han sido comparados y contrastados 
(Anderson et al., 1989; Oshima et al., 1993; Mendez et al., 2001; Negri et al., 
2001; Proença y Tamanaha, 2001; Holmes et al., 2002; Ordás et al., 2004; Park 
et al., 2004; Garáte-Lizárraga et al., 2005) detectando una variación significativa 
entre poblaciones de diferentes regiones biogeográficas. 
En 1979, 1986 y 1988 se presentaron florecimientos algales nocivos 
(FANs) en la bahía de Mazatlán, Sinaloa, de manera tal que el producto 
ostrícola se convirtió en un vector de envenenamiento paralizante por consumo 
de moluscos (EPM), específicamente en 1979 el consumo de ostión de roca (S. 
prismatica) provocó la muerte de 3 personas (Mee et al., 1986; Cortés-
Altamirano et al., 1995). 
Desde 1979, los eventos de mortandad de peces y moluscos bivalvos han 
sido relacionados con florecimientos algales en la bahía de Mazatlán, 
distinguiéndose G. catenatum como una especie común presente y en 
ocasiones dominante, que generalmente se manifiesta de abril a mayo (Mee et 
al., 1986; Cortés-Altamirano et al., 1995). 
 
 
21 
Eventos de mortandad de nauplios y camarones adultos ocurrieron 
durante febrero-mayo de 1985, 1997, 2001 y en el 2003, coincidiendo con una 
serie de florecimientos de microalgas, registrándose en todos los casos G. 
catenatum en las costas de Sinaloa. En el año 2001 se iniciaron los análisis de 
toxicidad con el método de bioensayo en ratón (Cortés-Altamirano y Alonso-
Rodríguez, 1997) y por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Gárate-
Lizárraga et al., 2002). En un estudio mensual durante 2003, la toxicidad rebasó 
el límite máximo permisible de 800 µg STX eq kg-1 para el consumo de 
mariscos (Acevedo-Medina, 2005). De abril a mayo del 2006 se presentaron 3 
eventos de marea roja en Sinaloa desarrollados por Chattonella marina y G. 
catenatum en concentraciones de 332 x 103 céls L-1 y 148 x 103 céls L-1 
respectivamente, en muestras de fitoplancton se detectó la presencia de STX 
(Cortés-Altamirano et al., 2006; Alonso-Rodríguez com. pers.) 
Mee et al. (1986) realizaron los primeros estudios toxicológicos de 
microalgas en condiciones naturales en México, utilizando el bioensayo ratón, 
encontraron niveles altos de saxitoxina en muestras de ostión (Crassostrea 
iridescens= Striostrea prismatica) y mejillón (Choromytilus palliopuncatus) en 
las costas de Oaxaca y Chiapas, determinando un tiempo de depuración de dos 
meses. En mayo de 1999 se analizaron TPs en muestras de almeja Catarina 
(Argopecten ventricosus) proveniente de la bahía Concepción, determinando 
concentraciones arriba del límite máximo permisible 2980 μg STX eq kg-1, en 
abril del 2001 muestras de ostras (C. iridescens) provenientes de la bahía de 
Mazatlán tuvieron una concentración de TPs de 394 μg STX eq kg-1 (Gárate-
Lizárraga et al., 2004a). Posteriormente Gárate-Lizárraga et al. (2004b) 
registraron por primera vez, la presencia de TPs en la almeja Chocolata en la 
bahía de La Paz, observando concentraciones de 1.4 - 54.6 μg STX eq kg-1 y un 
perfil de toxinas compuesto principalmente por STX, GTX2, GTX3, dcGTX2, 
dcGTX3, C2, dcSTX y B1. 
 
 
22 
En condiciones naturales, se ha observado que algunos moluscos pueden 
incrementar el grado de potencia de las toxinas que han ingerido. En estudios 
realizados en España y Portugal, moluscos que consumieron G. catenatum 
mostraron una conversión de toxinas de tipo N-sulfocarbamato (C1,2, C3,4, 
GTX5, GTX6) a carbamatos (STX, NeoSTX, GTX1,4, GTX2,3) (Anderson et al., 
1989, Rodríguez-Vázquez et al., 1989, Oshima et al., 1990, 1993, Franca et al., 
1996, Vale y Sampayo, 2001). En cambio en otras regiones como Tasmania, 
se han registrado perfiles muy similares a los encontrados, tanto para el 
dinoflagelado G. catenatum como para los moluscos contaminados, 
caracterizados por altas proporciones de toxinas N-sulfocarbamatos de baja 
potencia (C1,2 y C3,4) (Oshima et al., 1987) (Anexo 3). 
En abril del 2003, se presentaron eventos de florecimientos algales 
nocivos (FANs) en las costas del Estado de Sinaloa, registrándose una 
toxicidad en fitoplancton de hasta 5.31 pg STX eq cel-1, mortalidadde larvas de 
camarón hasta del 100% en algunos sistemas de producción y una acumulación 
de TPs en moluscos bivalvos de 8876.2 µg STX eq kg-1 para S. prismatica y 
27870 µg STX eq kg-1 para Chama buddiana (identificada en este estudio como 
C. sordida), este último superó 35 veces el límite máximo permisible para 
consumo humano (Alonso-Rodríguez et al., 2004b). 
Recientemente se ha incrementado el número de estudios de laboratorio 
referentes a la acumulación y eliminación de las toxinas en los moluscos 
bivalvos, sobre todo en lugares donde los florecimientos algales tóxicos tienden 
a ser recurrentes (Blanco et al., 1997; Jaime et al., 2006); Chen y Chou (2001) 
observaron que al alimentar durante 18 días a la almeja púrpura Hiatula rostrata 
Lighttoot, con el dinoflagelado Alexandrium minutum Halim, la glándula 
digestiva acumuló grandes concentraciones de toxinas TPs. Sekiguchi et al. 
(2001), evaluaron la acumulación y desintoxicación de las toxinas paralizantes 
en la escalopa Patinopecten yessoensis alimentada con el dinoflagelado 
 
 
23 
Alexandrium tamarense, encontrando que la cantidad de toxina era proporcional 
a la cantidad de dinoflagelados ingerido. 
Por la presencia de florecimientos estacionales del dinoflagelado G. 
catenatum (principal productor de las toxinas TPs) en la bahía de Mazatlán, 
Sinaloa, se ha implementado un monitoreo mensual de los moluscos bivalvos 
C. sordida y S. prismatica desde septiembre del 2006 a la fecha. En este 
estudio se pretende conocer la concentración de TPs de tipo hidrofílico en dos 
especies de moluscos bivalvos durante tres ciclos anuales así como verificar y 
comparar su capacidad de acumulación de TPs y proponer el uso de uno de 
ellos como biomonitor para el seguimiento de estas toxinas. 
 
 
 
24 
3. ÁREA DE ESTUDIO 
La bahía de Mazatlán se localiza en el sur del estado de Sinaloa entre los 
23° 10’ 36’’ a 23° 20’ 00’’ N y los 106° 20’ 00’’ a 106° 25’ 35’’ O (Figura 1); está 
delimitada al oeste por el Golfo de California. El clima de la región es cálido 
subhúmedo con lluvias en verano con una precipitación media anual de 800.3 
mm. Las temperaturas oscilan entre 24° y 34°C (García, 1973). En esta 
localidad las estaciones del año no son bien diferenciadas; hay dos épocas muy 
marcadas; la lluviosa, de julio a octubre, y la de estiaje, con poca o nula 
precipitación pluvial, de noviembre a junio (Acevedo-Medina, 2005). La bahía 
presenta un intervalo de salinidad entre 25.8-38.4. La velocidad de corriente 
superficial varía entre 0.1 y 2.5 m/s con valores medios de 0.55 y 0.28 m/s para 
otoño e invierno, respectivamente (Álvarez-León, 1977). Los vientos 
predominantes de octubre a mayo, provienen del noroeste y de junio a 
septiembre soplan vientos del suroeste. 
Los sitios de muestreo para la recolección de ostión se ubicaron en la 
zona circundante al emisor submarino de aguas municipales tratadas con el fin 
de monitorear la presencia del dinoflagelado G. catenatum (Acevedo- Medina, 
2005). 
 
Figura 1. Estación de muestreo de moluscos. 
 
 
25 
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
Se registran florecimientos recurrentes del dinoflagelado tóxico G. 
catenatum en la bahía de Mazatlán, Sinaloa, los cuales representan riesgos 
para la salud humana, el medio ambiente, el turismo y la acuicultura por la 
producción de toxinas paralizantes y su acumulación en moluscos bivalvos de 
importancia comercial y para el consumo humano. 
 
5. JUSTIFICACIÓN 
Debido a la presencia del dinoflagelado G. catenatum y la acumulación de 
TPs en moluscos, es factible efectuar el monitoreo de estas toxinas en estos 
organismos para determinar su variación estacional entre septiembre del 2006 a 
septiembre del 2009. 
Los organismos biomonitores reflejan la variación temporal y geográfica de 
las concentraciones de los contaminantes. Los ostiones frecuentemente son 
utilizados como biomonitores debido a que son sésiles, longevos, resistentes, 
fáciles de recolectar, poseen un tamaño adecuado y están identificados 
taxonómicamente. Por lo anterior, es importante el estudio de organismos 
biomonitores como el molusco C. sordida porque es una especie no comercial 
que comparte el hábitat con la especie comercial S. prismatica, su 
disponibilidad es durante todo el año ya que no está sujeto a explotación ni 
regulación y se tienen indicios de que esta especie tiene la capacidad para 
acumular TPs (Gárate-Lizárraga et al., 2008). 
La presencia de toxinas paralizantes TPs en alimentos procedentes del 
mar en las costas sinaloenses puede representar un grave problema de salud. 
La detección de estas toxinas como parte de un programa de vigilancia, es un 
elemento indispensable para evitar enfermedades en la población local y 
nacional por el consumo de mariscos contaminados con biotoxinas. 
 
 
26 
6. HIPÓTESIS 
 
H1: Los moluscos bivalvos Chama sordida y Striostrea prismatica tienen la 
capacidad de acumular toxinas paralizantes en el medio natural y en algunos 
eventos alcanzan concentraciones que superan el límite máximo permisible 
para consumo humano. 
 
H2: Los perfiles de las toxinas paralizantes de C. sordida y S. prismatica en el 
medio natural, son iguales. 
 
H3: C. sordida tiene mayor capacidad de acumulación de toxinas paralizantes 
en el medio natural. 
 
H4: Existe una relación en la acumulación y perfil de toxinas paralizantes entre 
C. sordida y S. prismatica en condiciones de laboratorio. 
 
 
 
 
27 
7. OBJETIVOS 
 
7.1. Objetivo general 
Determinar la concentración y los perfiles de toxinas paralizantes (TPs) en el 
medio natural y en condiciones de laboratorio, utilizando cromatografía líquida 
de alta resolución con detector de fluorescencia. 
 
7.2. Objetivos específicos 
1. Validar el método de detección de toxinas paralizantes por cromatografía 
líquida de alta resolución con detección de fluorescencia desarrollado por 
Lawrence et al. (2005). 
2. Determinar la variación de la concentración de toxinas paralizantes en 
moluscos bivalvos C. sordida y S. prismatica en el medio natural durante el 
período de estudio y comparar con los niveles máximos permisibles por las 
normas mexicanas e internacionales. 
3. Identificar y comparar los perfiles de las toxinas paralizantes en los bivalvos 
C. sordida y S. prismatica durante los tres ciclos de estudio. 
4. Verificar la acumulación y comparar los perfiles de TPs en los moluscos C. 
sordida y S. prismatica mediante un bioensayo en el laboratorio. 
5. Comparar los análogos de TPs presentes en el cultivo de G. catenatum con 
los acumulados en los dos moluscos bivalvos en el bioensayo. 
6. Con base en los resultados obtenidos de los análisis de las muestras de los 
tres ciclos anuales y del bioensayo, determinar cuál de estos moluscos es el 
mejor biomonitor con fines de seguimiento de toxinas paralizantes. 
 
 
 
28 
8. METODOLOGÍA 
8.1. Montaje del método AOAC (2005) y de Lawrence et al. (2005) 
El método de cromatografía líquida de alta resolución con detector de 
fluorescencia (High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence 
Detection HPLC-FD) desarrollado por Lawrence et al. (2005) permite la 
detección de la mayoría de los análogos de TPs de tipo hidrofílico presentes en 
una mezcla, sin importar su número o grupo químico al que pertenecen (Figura 
2). Los parámetros del análisis, preparación de fase móvil y gradiente de 
elución se encuentran definidos en las Tablas 1-3. 
 
Figura 2. Esquema del equipo de cromatografía líquida de alta resolución con 
detector de fluorescencia (HPLC-FD) (AOAC, 2005; Lawrence et al., 2005). 
 
 
29 
Tabla 1.- Parámetros de análisis de TPs en moluscos 
Parámetros Datos 
Columna Phenomenex, Gemini 5µm 
C18 110 A, 150 x 4.60 mm 
Detector de fluorescencia 
(Varian Pro Star 363) 
340 nm EX, 395 nm EM 
Volumen de Inyección 
(automuestreador) 
30 o 50 µl 
Tiempo de análisis 14 min 
Flujo de fase móvil2 ml/min 
 
Tabla 2. Fase móvil (solución A y B) para el análisis de TPs 
A (Formiato de amonio 0.1M) B (Formiato de amonio 0.1M) 
Pesar 6.5 g de formiato de amonio y 
diluirlo en 500 ml de agua Milli-Q, ajustar 
pH a 6 con ácido acético (si es 
necesario) y aforar a 1L con agua Milli-Q. 
 
Pesar 6.5 g de formiato de amonio, 
diluirlo en 500 ml de acetonitrilo al 5%, 
ajustar pH a 6 con ácido acético (si es 
necesario) y aforar a 1L con acetonitrilo 
al 5%. 
 
Tabla 3.- Programa del gradiente de elución a un flujo de 2 ml/min. 
Tiempo (min.) Solución A (%) Solución B (%) 
0 100 0 
5 95 5 
9 30 70 
10 30 70 
14 100 0 
 
 
 
30 
8.2. Validación del método de Barrera-del Valle et al. (2009) 
En 2006 la Comisión Europea aprobó el método AOAC (2005); Lawrence 
et al. (2005) como el método oficial del monitoreo de TPs en moluscos bivalvos. 
Este método fue validado por CEFAS (2009; 2010a; 2010b) utilizando 
estándares de referencia certificados (National Research Council Canada, 
NRCC) incluyendo la toxina neosaxitoxina (NEO), gonyautoxinas (GTX1,4, 
GTX2,3 y GTX5), saxitoxina (STX), decarbamoil saxitoxina (dcSTX) y N-
sulfocarbamatos (C1,2). Recientemente para la metodología de Lawrence et al. 
(2005) han sido validadas las determinaciones de decarbamoil neosaxitoxina 
(dcNEO) y la decarbamoil gonyautoxina 2,3 (dcGTX2,3) (CEFAS, 2010b). 
Durante este estudio se realizó la validación del método AOAC (2005) y de 
Lawrence et al. (2005), siguiendo los parámetros regulatorios del 
funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados 
de la Comunidad Europea (CE, 2002), descritos en el Diario Oficial de las 
Comunidades Europeas, con el fin de determinar que las condiciones del 
laboratorio fueran las apropiadas para obtener resultados confiables utilizando 
esta metodología. 
 
8.2.1. Linealidad 
La linealidad caracteriza la capacidad de un método analítico de entregar 
como respuesta una señal de magnitud Y (área del pico) directamente 
proporcional a la cantidad (concentración) del analito a determinar, en donde Y 
= a + bc. Esta relación debe ser aparentemente lineal, y por medio de análisis 
de regresión puede determinarse el coeficiente de correlación de la recta (r2) 
que no debe ser menor a 0.99 (CE, 2002). 
 
 
31 
Se prepararon soluciones de cada uno de los estándares de TPs a 
diferentes concentraciones, determinando el rango de detección mediante un 
escaneo, posteriormente se estableció un intervalo de concentraciones acorde 
con su detección para el análisis de la solución stock y 5 diluciones, se 
inyectaron 30 o 50 µl de cada concentración (30 µl oxidación con peróxido o 50 
µl para la oxidación con periodato) por triplicado y se definió el tiempo de 
retención para la identificación de cada derivado de las TPs. Utilizando el 
paquete Microsoft Office Excel (2007) se realizó un análisis de regresión lineal 
con los resultados del área bajo la curva (µV*min) y se construyeron gráficos de 
dispersión ajustados a una línea recta. 
 
 8.2.2. Especificidad o selectividad 
La especificidad es la capacidad de un método de determinar 
inequívocamente un analito en presencia de otros componentes en la muestra 
de ensayo, esto significa que el pico de la sustancia a determinar se separe 
adecuadamente de los picos de impurezas u otros componentes. 
Para asegurar la selectividad del método se evaluaron los compuestos 
propios de la matriz (Anexo 6), las soluciones de oxidación (blancos de 
reactivos) (Anexo 7) y los estándares de referencia certificados que pudieran 
interferir con el (los) analito (s). 
 
 8.2.3. Exactitud o veracidad 
La exactitud es la proximidad entre los resultados individuales del ensayo 
y el valor real, se expresa como porcentaje de recuperación. 
 
 
32 
La exactitud del método se determinó a partir de los datos obtenidos del 
análisis del material de referencia interno (Tabla 4), utilizando la siguiente 
fórmula: 
 
Criterio de aceptación: La diferencia entre la concentración patrón y la 
encontrada debe estar dentro del intervalo – 20 % a + 10% (CE, 2002). 
Tabla 4.- Material de referencia interno de TPs en almeja 
 
 
 
 
 
 
 
 8.2.4. Precisión 
La precisión es el grado de concordancia de resultados entre ensayos 
independientes, obtenidos bajo condiciones determinadas. Para evaluar la 
precisión analizó una concentración conocida del estándar de referencia 
certificado (mínimo 6 veces), posteriormente se calculó la desviación estándar y 
el coeficiente de variación de las concentraciones obtenidas. 
 
Material de referencia interno: Extracto de almeja Donax gracilis 
Localidad: El Zapotal, Chiapas 
Muestreo: 10-octubre-2001 
Dilución 1:30 con agua ajustada con HCl a pH 3-4. 
Concentración promedio: 28035 µg STX eq Kg-1 
Los análisis del extracto se presentan en el Anexo 8 
 
 
33 
 
 
Criterio de aceptación: el coeficiente de variación (CV) para el análisis 
repetido del estándar de referencia (≥ 1000 µg/Kg) debe ser < 16% (CE, 2002). 
 
8.2.5. Límite de detección (LD) y cuantificación (LC) 
El límite de detección (LD) corresponde a la menor cantidad de la 
sustancia analizada que puede distinguirse de la ausencia de esa sustancia (un 
valor blanco) con un intervalo de confianza establecido (generalmente 95%), 
bajo las condiciones determinadas. 
Se determinó el LD de acuerdo al método descrito por Huber (2003), a 
partir del punto de menor concentración de la curva de calibración, el cual se 
analizó por sextuplicado (mínimamente). Se calculó el promedio y la desviación 
estándar de las concentraciones obtenidas. Con estos datos, se aplicaron la 
siguientes ecuaciones (Ec.1-3), considerando un 1-α = 5%. 
……………………………………………………………..Ec.1 
Dónde: 
LD = límite de detección 
Sx = desviación estándar de los residuales 
Kn = factor de cobertura (constante), se encuentra definido en Tabla 5 
 
 
 
 
 
 
34 
Tabla 5. Factor de cobertura Kn para el cálculo del límite de detección. 
Número de 
determinaciones 
(n) 
Factor de cobertura Kn 
Resultado único 
(m=1) 
Media de dos resultados 
(m=2) 
1-α=5% 1-α=1% 1-α=5% 1-α=1% 
2 7.73 38.97 6.31 31.82 
3 3.37 8.04 2.67 6.36 
4 2.63 5.08 2.04 3.93 
5 2.34 4.10 1.78 3.13 
6 2.18 3.63 1.65 2.75 
7 2.08 3.36 1.56 2.52 
8 2.01 3.18 1.50 2.37 
9 1.96 3.04 1.45 2.26 
10 1.92 2.96 1.42 2.19 
 
La incertidumbre del límite de detección se define como la incertidumbre 
de la desviación estándar calculada para el límite de detección. El intervalo de 
confianza es asimétrico, debido a que el límite superior teóricamente puede ser 
infinito, y el inferior no puede ser negativo. Por esta razón los límites de 
confianza deben calcularse con dos factores de cobertura K derivados de una 
distribución chi-cuadrada: 
- Límite de confianza superior: LCS = LD x KU………………………….Ec.2 
- Límite de confianza inferior: LCI = LD x KL…………………………….Ec.3 
Tabla 6.- Factores KU y KL para el cálculo de los límites de confianza. Nivel de 
confianza = 95% (Huber, 2003). 
N KL KU 
2 0.446 31.91 
3 0.521 6.285 
4 0.566 3.729 
5 0.599 2.874 
6 0.624 2.453 
7 0.644 2.202 
8 0.661 2.035 
9 0.675 1.916 
 
 
35 
Finalmente se expresa el límite de detección (LD), con su incertidumbre 
asociada; es decir, el valor verdadero se sitúa entre los límites inferior y 
superior, con una probabilidad de 95%. 
El límite de cuantificación (LC) es la concentración más baja de analito 
que se puede determinar con un nivel aceptable de incertidumbre, se calculó 
utilizando la siguiente fórmula: 
 
Dónde: 
LQ = límite de cuantificación 
Sx= desviación estándar 
 
 8.2.6. Incertidumbre 
Para estimar la incertidumbre global se deben tomar en cuenta las 
distintas fuentes de incertidumbre que afectan a las mediciones. El 
procedimiento propuesto por la guía Eurachem (2005) consiste en hacer un 
inventario de todas las fuentes de incertidumbre, en forma de un diagrama 
causa-efecto del proceso de medición.Las siete principales fuentes de incertidumbre de acuerdo a ISO/IEC 17025 
(2005), son las siguientes: 
 
 
 
 
 
RESULTADO + 
INCERTIDUMBRE 
 
Personal 
Instalaciones y 
condiciones 
ambientales 
Calibración y 
validación del 
método 
Trazabilidad 
Equipamiento Muestreo 
Manejo de 
estándares y 
muestras 
 
 
36 
Las principales fuentes de incertidumbre (U) identificadas en la 
determinación de cualquier analito mediante cualquier método analítico pueden 
agruparse en cuatro componentes: 
 
1.- Incertidumbre debida a la precisión. Corresponde a la variabilidad 
experimental del método analítico, y en ella se incluyen las fuentes de 
incertidumbre asociadas a todas las etapas del método, consideradas en forma 
global (se incluyen: la precisión de la balanza, la etapa de extracción, la curva 
de calibración, la recuperación y la precisión del material volumétrico). Se 
determina a partir de la desviación estándar obtenida en el análisis repetido de 
una misma muestra o de un material de referencia certificado: 
 
Uprecisión = incertidumbre debida a la precisión 
Sx = desviación estándar de los resultados obtenidos en el análisis de las 
réplicas de la muestra 
n = número de replicas 
 
2.- Incertidumbre debida a la verificación de la trazabilidad. Considera la 
incertidumbre asociada a asegurar que el método proporciona resultados 
rastreables. Para asegurar esto se analizó una dilución del estándar de 
referencia certificado (STD), con los consiguientes componentes de error 
asociado (incertidumbre del propio estándar y los términos de incertidumbre 
asociados a la precisión experimental en la determinación del estándar). Se 
calcula utilizando la siguiente fórmula: 
 
 
37 
 
Utrazabilidad = incertidumbre debida a la verificación de la trazabilidad 
USTD = incertidumbre reportada en el certificado del estándar de referencia 
K = factor de cobertura (constante = 2) 
Sx = desviación estándar de los resultados obtenidos en el análisis de la 
dilución del estándar de referencia 
n = número de determinaciones del estándar de referencia certificado 
 
3.- Incertidumbre debida a la heterogeneidad de la muestra. Ésta se incluye en 
la incertidumbre total, ya que el STD, corresponde a una muestra homogénea. 
Para calcular esta incertidumbre es necesario dividir la muestra en varias 
fracciones (por lo menos 3) y homogenizar por separado cada una de ellas. 
Luego se realiza la extracción y análisis de cada fracción de la muestra por el 
mismo analista, bajo las mismas condiciones y en un intervalo de tiempo 
definido. A partir de los resultados se determina la incertidumbre de 
heterogeneidad con la siguiente fórmula: 
 
Uheterogeneidad = incertidumbre debida a la heterogeneidad de la muestra 
Sx = desviación estándar de los resultados obtenidos en el análisis de 
diferentes fracciones de una misma muestra 
 
4.- Incertidumbre debida a otros términos. 
 
 
 
 
38 
8.3. Cultivo de microalgas 
 
 8.3.1. Microalga tóxica (Gymnodinium catenatum) 
Las condiciones de cultivo fueron: salinidad del medio de cultivo de 35, 
con ciclos de luz obscuridad 12:12 hrs. intensidad de lámparas fluorescentes de 
75 µE m2/s-1 y temperatura del cuarto de cultivo de 23°C. 
Las cepas de G. catenatum (Anexo 9) se inocularon en tubos de 20 ml con 
medio líquido f2 enriquecido con selenio (ácido selenioso H2SeO3 9 H2O) 
(Anexo 10). Una vez que el inóculo incrementó su densidad, fue transferido a 
matraces de 125 ml, colocando el mismo volumen de medio de cultivo (50:50, 
v:v), dejando dos tercios del volumen del matraz con aire, cuando nuevamente 
el matraz desarrolló color, fue transferido a un matraz de mayor volumen, 
manteniendo la proporción de 50% del medio de cultivo nuevo hasta completar 
4 L (Martínez-Tecuapacho, 2009). 
 
 8.3.2. Microalgas no tóxicas (Dunaliella tertiolecta, 
Nannochloropsis oculata, Thalassiosira sp.) 
Las condiciones de cultivo de las microalgas no tóxicas (Anexos 11, 12 y 
13) fueron las siguientes: medio de cultivo f2 (Dunaliella tertiolecta, 
Nannochloropsis oculata); f2+silicatos (Si) (Thalassiosira sp.): 36 ‰ de 
salinidad, ciclos de luz obscuridad 12:12 hrs, 75 µE m-2s-1 de intensidad 
lumínica y temperatura de 23°C. 
 
 
 
 
39 
8.4. Bioensayo (diseño de experimento de acumulación y 
desintoxicación de TPs) (Kwong et al. 2006) 
El bioensayo tuvo una duración de 39 días, consistió en tres etapas: 
aclimatación, acumulación y desintoxicación de TPs en moluscos bivalvos; se 
acondicionaron dos estanques con 20 L de agua de mar filtrada, cada uno con 
25 ostiones de una especie de molusco (C. sordida y S. prismatica), se 
monitoreó la temperatura, pH y salinidad, se mantuvo un recambio de agua 
diario y aireación durante todo el bioensayo. 
• Aclimatación 
Se recolectaron 25 ejemplares de cada especie, se colocaron en su 
respectivo estanque con temperatura, pH y salinidad controlada (24°C, pH 7.8, 
35‰). La alimentación diaria consistió en la equivalencia en número de células 
de D. tertiolecta, N. oculata y Thalassiosira sp. del 6% de peso seco de cada 
especie de molusco (dato calculado con respecto al peso promedio de 10 
ejemplares para cada especie), el tiempo de aclimatación fue de 10 días. 
• Acumulación 
La alimentación diaria consistió en la equivalencia en número de células 
de G. catenatum del 6% de peso seco de cada especie de molusco (dato 
calculado con respecto al peso promedio de 10 ejemplares para cada especie), 
diariamente durante 7 días, se tomaron muestras (tres organismos) de cada 
especie a los días 1, 3, 5,7 durante el período de acumulación de toxinas TPs. 
• Desintoxicación 
Esta etapa consistió en la desintoxicación de los moluscos, se alimentaron 
con microalgas no tóxicas en la equivalencia del número de células (D. 
tertiolecta, N. oculata y Thalassiosira sp.) correspondientes al 6% del peso seco 
 
 
40 
de cada molusco durante 22 días. Se tomó un organismo de cada especie en 
los días 1, 3, 5, 7, 11, 15, 19, 22 durante el período de desintoxicación. 
 
8.5. Muestreo de moluscos bivalvos C. sordida y S. prismatica 
El sitio de recolección de organismos se ubicó a 23° 11’ 1’’ N y 106° 25’ 
33.9’’ O, se encuentra frente al emisor submarino, zona donde se descargan las 
aguas municipales, esta zona está sujeta a descargas de aguas parcialmente 
tratadas caracterizadas por poseer un elevado contenido de materia orgánica, 
nutrientes orgánicos e inorgánicos y sólidos en todas sus formas, provenientes 
del drenaje pluvial, drenaje doméstico y drenaje industrial. La extracción de 
ostión en este sitio es escasa, sin embargo, los pescadores locales 
comercializan el producto extraído entre la población local (Acevedo- Medina, 
2005). 
La obtención de las muestras de ostión se realizó mensualmente, 
mediante buceo libre por ostioneros de la localidad, con un permiso de Pesca 
de Fomento Núm. DGOPA.08082.110808.2219 otorgado por el Instituto 
Nacional de la Pesca (INAPESCA). Se obtuvieron 24 piezas de cada molusco 
bivalvo, a los cuales se les realizó un análisis de ADN para corroborar la 
identidad de las especies descrito en el Anexo 14. La limpieza del material de 
cristalería se realizó siguiendo el método de Moody y Lindstrom (1997) descrito 
en el Anexo 15. 
8.6. Extracción de tejido blando 
Inmediatamente después de la recolección del molusco, a éste se le 
cepilló removiendo el material adherido sobre la concha, posteriormente se 
tomaron las medidas biométricas (largo, ancho y espesor) de cada ostión. El 
tejido blando fue extraído con un cuchillo de acero inoxidable, y se lavó 
 
 
41 
utilizando agua purificada desionizada Milli-Q para remover impurezas o restos 
de la concha. Posteriormente se colocaron y se pesaron tres ostiones en cada 
charola pre-pesada (estos datos servirán para obtener el peso húmedo del 
tejido), se mantuvieron en congelación por 72 horas, a una temperatura de -10 
a 15°C.8.7. Liofilizado y molido 
La liofilización es un método para la preservación de materiales biológicos 
sin modificarlos, congelando su contenido de agua y eliminando posteriormente 
el hielo por sublimación del agua en condiciones de vacío, sin el deterioro que 
produciría el calentamiento en el proceso tradicional de secado. Para este 
estudio se utilizó una liofilizadora LABCONCO. Su funcionamiento consiste en 
extraer el agua del tejido blando a una temperatura de -48°C durante 72 horas, 
con presión al vacío de 0.024 mBar. 
Las muestras liofilizadas, se molieron durante 10 minutos a una 
temperatura no mayor de 60°C en un molino automático (Retsch) equipado con 
mortero de ágata, previamente lavado en HNO3 2M durante 72 horas (evitando 
que las soluciones de lavado tengan contacto con las partes metálicas del 
mortero) y un último enjuague con agua destilada, secado en una estufa a 
60°C. 
 
8.8. Análisis de toxinas paralizantes (TPs) en ostión 
El método AOAC (2005) y de Lawrence et al. (2005) consiste de 2 etapas: 
1. Análisis cualitativo.- Determina la presencia o ausencia de TPs en muestras 
de ostión. 
 
 
42 
2. Análisis cuantitativo.- Determina la concentración individual y total de TPs 
presentes en cada muestra. 
El método se muestra esquematizado en la Figura 3, y en la Tabla 7 se 
definen los procesos de oxidación y limpieza a seguir de acuerdo al tipo de 
análogo presente en la muestra. 
 
Tabla 7. Análisis cualitativo y cuantitativo de TPs 
 
Grupo Toxina Método cualitativo Método cuantitativo 
N-hidroxiladas 
GTX1,4 
Limpieza C18 + 
oxidación periodato 
Limpieza COOH 
(F2) + oxidación 
periodato 
Neo 
dcNEO 
 
No-N-
hidroxiladas 
GTX2,3 
Oxidación peróxido GTX5 
STX 
C1,2 
dcGTX2,3 
 
 
 
 
 
43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Metodología para el análisis de toxinas paralizantes, AOAC (2005) y 
de Lawrence et al. (2005). 
Análisis 
cuantitativo 
Análisis 
cualitativo 
 
 
44 
8.8.1. Extracción de TPs 
 
1. Pesar 5 ± 1 g de tejido homogenizado (fresco) en un tubo de centrífuga 
graduado de 15 ml. 
2. Añadir 3 ml de ácido acético 1% TUBO 1. 
3. Mezclar en vortex durante 1 minuto. 
4. Aflojar tapa. 
5. Llevar a baño María (100°C) durante 5 min. 
6. Mezclar en vortex durante 1 min. 
7. Introducir el extracto a baño de agua fría por 5 min. 
8. Centrifugar a 4500 rpm por 10 min. 
9. Decantar el sobrenadante en otro tubo de centrífuga al que identificaremos 
como TUBO 2. 
10. Añadir 3 ml de ácido acético al 1% en el tubo con residuo sólido TUBO 1. 
11. Mezclar en vortex durante 1 min TUBO 1. 
12. Centrifugar a 4500 rpm por 10 min TUBO 1. 
13. Colectar el sobrenadante del TUBO 1 en el TUBO 2. 
 
 8.8.2. Limpieza con cartucho SPE-C18 
 
1. Acondicionar el cartucho SPE C18 con 6 ml de metanol seguido de 6 ml de 
agua Milli-Q. 
2. Agregar 1 ml del extracto y colectar el efluente 
3. Lavar con 2 ml de agua Milli-Q y colectar con el efluente del extracto 
4. Ajustar el extracto a pH 6.5 con NaOH 1M 
5. Diluir el extracto a 4 ml con agua Milli-Q 
Nota: Mantener el flujo de 2-3 ml/min., no permitir que el cartucho seque. 
 
 
45 
 8.8.3. Análisis cualitativo (oxidación con periodato) 
 
1. Agregar 100 µl del extracto o estándar de referencia en un tubo Eppendorf 
de 2 ml. 
2. Añadir 500 µl de solución de periodato. 
3. Mezclar en vortex durante 1min. 
4. Adicionar 5 µl de ácido acético concentrado 
5. Mezclar en vortex durante 1 min. 
6. Reposar durante 10 min. 
7. Analizar en HPLC-FD utilizando la técnica de Lawrence et al. (2005). 
 
 8.8.4. Análisis cuantitativo (oxidación con peróxido) 
 
1. Agregar 25 µl de peróxido al 10% en un tubo Eppendorf (2 ml). 
2. Añadir 250 µl de NaOH 1N. 
3. Mezclar en vortex durante 1 min. 
4. Adicionar 100 µl del estándar o extracto. 
5. Mezclar en vortex durante 1 min. 
6. Reposo durante 2 min. 
7. Agregar 20 µl de ácido acético concentrado. 
8. Mezclar en vortex durante 1 min. 
 
 8.8.5. Limpieza con cartucho SPE-COOH 
 
1. Pasar 10 ml de solución de acetato de amonio 0.01M a un flujo entre 2 y 3 
ml/min. Dejar 3 ml en el cartucho. 
 
 
46 
2. Pasar 2 ml de alícuota del extracto recolectado de la limpieza con el 
cartucho SPE-C18. 
3. Colectar el efluente en un tubo graduado de 15 ml marcado como Fracción 
1 (contiene toxinas C), pasar 4 ml de agua al cartucho y colectar dentro del 
mismo tubo, ajustar el volumen final a 6 ml. 
4. Pasar 4 ml de NaCl 0.05 M en el cartucho y colectar en un tubo graduado 
de 5 ml marcado como Fracción 2 (contiene GTX1,4, GTX2,3, B-1, B-2, 
dcGTX2,3), asegurar que el volumen final sea 4 ml con agua Milli-Q. 
5. Pasar 5 ml de NaCl 0.3 M por el cartucho y recolectar en un tubo graduado 
de 5 ml marcado como Fracción 3 (contiene SXT, NEO, dcSTX), asegurar 
que el volumen final sea 5 ml (tubo 3). 
6. Oxidación con periodato. 
 
 8.8.6. Cálculos de concentración 
El análisis de TPs se conforma de 2 etapas: 
1.- Análisis cualitativo 
Es el análisis en el cual se identifica la presencia (positivo) o ausencia 
(negativo) de un analito (STX, NEO, dcNEO, dcSTX, GTX2,3, GTX1,4, GTX5, 
C1,2) en la muestra, se determina comparando los tiempos de retención de los 
estándares de referencia STD (estándar de referencia certificado) y la muestra. 
2.- Análisis cuantitativo 
Es el reprocesamiento de una muestra positiva con el solvente de oxidación 
adecuado para cada TPs. Las concentraciones de TPs (µmol/L) se calcularon 
con respecto a la curva de calibración, relacionando la respuesta de 
fluorescencia (µV*min) entre los estándares de referencia y la muestra positiva, 
posteriormente se reprocesan los datos obteniendo concentraciones en µg STX 
eq kg-1. (Giménez, com. pers, 2011). 
 
 
47 
 
 
Dónde: 
C = Concentración de cada análogo de STX (µmol/L) 
FT = Factor de toxicidad equivalente (Tabla 8) 
VF = Volumen final del purificado (L) (C18 = 0.004, F1= 0.006, F2= 0.004, F3= 
0.005). 
CM = Cantidad de la muestra analizada (C18= 0.0008333 kg, 
COOH=0.0004167 kg) 
PM = Peso molecular de STX (372.2) 
 
Tabla 8. Factor de toxicidad (TF) de TPs, CEFAS (2010b). 
Toxina TF 
STX 1 
NeoSTX 0.924 
GTX1,4 0.994 
GTX 2,3 0.638 
GTX5 (B1) 0.064 
C1, 2 (GTX8) 0.096 
dcSTX 0.513 
dcNeoSTX (GTX7) 0.513 
dc-GTX2,3 0.377 
 
 
 
 
48 
 8.8.7. Cálculos de composición de toxinas 
Después de calcular la concentración individual de los análogos (µmol) y 
la concentración total de TPs (µmol) presentes en una muestra, es necesario 
determinar la porción de cada análogo con respecto al 100% de la 
concentración total de TPs expresado en % mol, esta variedad de derivados 
representan el perfil tóxico de las TPs. 
8.9. Análisis estadístico 
El estudio consistió de un muestreo mensual de C. sordida y S. prismatica 
extraídos del mismo sitio, durante 3 años. Se tomaron 24 organismos de cada 
especie, posteriormente se organizaron en 8 muestras conteniendo 3 
organismos cada una. Para su análisis, las 8 muestras independientes fueron 
integradas en una muestra compuesta mensual. En total se tomaron 288 
muestras independientes que se integraron en 36 muestras compuestas de 
cada molusco por lo que se procesaron 72 muestras del monitoreo. Durante el 
bioensayo se recolectaron 41 muestras de cada especie y 6 filtros de 
microalgas. En total se procesaron 72 muestras del monitoreo y 88 muestras 
del bioensayo, teniendo un total de 160 muestras analizadas. 
El bioensayo consistió en tres etapas: aclimatación, intoxicación y 
desintoxicación, se colocaron en un estanque 25 organismos de cada especie 
de bivalvo, se marcaron todos los organismos para su identificación mediante 
un código de colores, posteriormente se sacrificaron 3 organismos de cada 
molusco en un tiempo determinado para determinar la concentración de TPs, la 
elección de los organismos a analizar durante el muestreo fue al azar, se utilizó 
una tabla de números aleatorios. Las medidas biométricas(largo, ancho, 
espesor), el índice de condición (IC) y la concentración TPs de cada organismo 
se organizó en una base de datos. Para definir el tipo de pruebas estadísticas a 
utilizar, se realizó un análisis exploratorio de datos. Posteriormente a los datos 
 
 
49 
se les aplicó la prueba de normalidad Kolmogorov-Smirnov, resultando que 
ellos no presentaban una distribución normal, por lo que se utilizó la prueba no 
paramétrica de Wilcoxon para contrastar datos pareados (Wilcoxon, 1945; 
Wilcoxon and Wilcox, 1964) con el fin de determinar diferencias significativas 
entre la concentración de TPs de las dos especies de moluscos bivalvos. Se 
realizó un análisis de varianza no paramétrico (ANOVA, Kruskal-Wallis) para 
determinar si existían diferencias significativas en la acumulación de TPs 
durante la presencia de florecimientos algales, G. catenatum y en la ausencia 
de las dos anteriores. Se evaluó el coeficiente de correlación para determinar si 
existía una relación lineal entre las concentraciones de los análogos presentes 
en las muestras de moluscos. Finalmente se utilizó la prueba t para medias de 
dos muestras pareadas para determinar si existe una diferencia significativa 
entre las concentraciones de los análogos entre los dos moluscos. Para la 
realización de estas pruebas se utilizó el Programa Excel 2007 de Microsoft. 
 
 
50 
9. RESULTADOS 
 
9.1. Montaje del método AOAC (2005); Lawrence et al. (2005) 
Durante el tiempo de análisis (14 min) fue posible detectar todos los 
estándares certificados de TPs, cada uno con diferente tiempo de retención, en 
un rango de 5.3 a 10.6 min., con excepción de los estándares dcNEO y dcSTX, 
los cuales coincidieron en un tiempo de retención de 5.8 min. (Tabla 9). Los 
estándares de C1,2, GTX5, STX, dcSTX, GTX2,3, dcGTX2,3 fueron oxidados 
con la solución de peróxido, NEO, dcNEO y GTX1,4 fueron oxidados con la 
solución de periodato, con el objetivo de obtener compuestos fluorescentes. En 
la lámina 1, se observan las figuras a-f con los cromatogramas 
correspondientes a los estándares de referencia oxidados con peróxido y en la 
lámina 2 se pueden apreciar los cromatogramas oxidados con la solución de 
periodato. 
 
Tabla 9.- Tiempo de retención de estándares de referencia de TPs. PM = peso 
molecular, STD = estándar de referencia certificado, FT = factor de toxicidad, 
TR = tiempo de retención. 
TOXINA PM CONCENTRACIÓN STD (µmol/L) FT 
TR 
(min) OXIDACIÓN 
C1,2 475.4 149 0.096 5.3 
Peróxido 
GTX5 (B1) 379.4 65 0.064 9.8 
STX 372.2 65 1 10.6 
dcSTX 329.2 62 0.513 5.8 
GTX2,3 395.4 157.6 0.638 8.7 
dcGTX2,3 352.3 142 0.377 2.9 
 
dcNEO 345.2 28.9 0.513 5.8 
Periodato NEO 315.1 65.6 0.924 7.1 
GTX1,4 411.4 80 0.994 8.6 
 
 
51 
 
Lámina 1. (a) Estándar de referencia C1,2 a 2.1 µmol/L; (b) Estándar de 
referencia GTX5 a 2.6 µmol/L; (c) Estándar de referencia dcSTX a 2.6 µmol/L; 
(d) Estándar de referencia STX a 2.7 µmol/L; (e) Estándar de referencia GTX2,3 
a 2.5 µmol/L; (f) Estándar de referencia dcGTX2,3 a 1.4 µmol/L. 
 
 
52 
 
 
 
 
Lámina 2. (a) Estándar de referencia dcNEO a 0.75 µmol/L; (b) Estándar de 
referencia NEO a 2 µmol/L; (c) Estándar de referencia GTX1,4 a 2.8 µmol/L. 
 
 
 
53 
9.2. Validación del método 
9.2.1. Linealidad 
Se realizaron gráficos de respuesta obtenida en función de la 
concentración y se evaluó su ajuste a una distribución lineal, mediante el 
coeficiente de correlación (r2). Debido a que se observaron diferencias entre las 
respuestas de fluorescencias de los análogos, se trabajó con intervalos de 
concentración diferentes para cada uno. Se utiliza el coeficiente de variación y 
el coeficiente de correlación para evaluar la linealidad, en todas las curvas de 
calibración el coeficiente de variación fue < 5% y la R2 >0.99 (Tabla 10) 
cumpliendo con el criterio de aceptación descrito en CE, 2002. 
Para elaborar las curvas de calibración se determinaron mínimo 5 
concentraciones para cada análogo de TPs y se analizaron por triplicado 
(Lámina 3 y 4). 
Criterio de aceptación: La curva de calibración para la cuantificación de 
TPs debe ser lineal con un coeficiente de correlación 0.99 ≤ Correlación ≤ 1. 
Tabla 10.- Intervalo de concentración, desviación estándar (Sx, n=3), 
coeficiente de variación (%) y coeficiente de correlación (r2) de las curvas de 
calibración de los estándares de referencia de TPs. 
TOXINA Concentración STD (µmol/L) Sx CV (%) r
2 
C1,2 0.053 6.31 421.82 1.9 0.9997 
GTX5 (B1) 0.014 10.53 278.00 1.3 0.9944 
STX 0.014 10.39 224.47 1.4 0.9923 
dcSTX 0.013 5.15 755.52 1.3 0.9986 
GTX2,3 0.064 7.61 334.19 1.0 0.9912 
dcGTX2,3 0.071 8.52 477.56 1.3 0.9986 
dcNEO 0.145 11.59 74.97 1.4 0.9947 
NEO 0.650 15.59 1106.78 3.7 0.997 
GTX1,4 0.690 6.90 383.3 1.2 0.9989 
 
 
54 
 
Lámina 3. Curvas de calibración de estándares de referencia certificados de 
TPs, oxidados con peróxido. 
Oelgado-deI Villar, 2012 
STX Ct2 
100010 _600CO 
.400CO 
1 ~00 1 0 _ :200CO , 
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Oelgado-deI Villar, 2012 
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55 
 
Lámina 4. Curvas de calibración de estándares de referencia certificados de 
TPs, oxidados con solución de periodato. 
 
9.2.2. Especificidad o selectividad 
Este método no es especifico para los análogos dcNEO, C1,2 y dcSTX 
debido que estas toxinas presentan tiempos de retención similares. Para evitar 
que los picos de algunos estándares se traslaparan (mezclas de estándares de 
referencia sugeridas por CEFAS, 2010b, Tabla 11). También se evaluaron los 
compuestos propios de las matrices (Lámina 5), estos compuestos no 
presentaron interferencias con la detección de los análogos de TPs. 
 
 
56 
De acuerdo con los resultados de la señal de respuesta, obtenidos en el 
montaje de la técnica, se decidió trabajar con 4 mezclas específicas de 
análogos, evitando interferencias entre tiempos de retención (TR) y las 
diferentes soluciones de oxidación. 
En los cromatogramas de las mezclas se puede apreciar una separación 
adecuada y definición entre los grupos de análogos (Lámina 6). 
 
 
Lámina 5. (a) Matriz de S. prismatica; b) Matriz de C. sordida. 
Nota: La respuesta de fluorescencia de los compuestos presentes en las 
matrices, no interfieren con la respuesta de los análogos de TPs (La escala de 
la lámina 5 es de 0 a 9000 µV). 
Tabla 11.- Comparación de las mezclas de análogos de TPs usadas en este 
estudio y en CEFAS (2010b). 
MEZCLA TOXINAS TOXINAS CEFAS(2010b) 
I NEO, GTX1,4 NEO, GTX1,4 
II dcGTX2,3, dcSTX, GTX2,3, GTX5, 
STX 
dcGTX2,3, dcSTX GTX2,3, GTX5, 
STX. 
II C1,2 C1,2, dcGTX2,3 
IV dcNEO dcNEO 
Lámina