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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
POSGRADO EN CIENCIAS MÉDICAS, 
ODONTOLÓGICAS Y DE LA SALUD. 
 
Expresión de distrofina en biopsia de piel de pacientes con distrofinopatías 
(Distrofia Muscular de Duchenne y de Becker) 
 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE 
MAESTRO EN CIENCIAS MÉDICAS 
 
PRESENTA 
ELIGANTY BAHENA MARTÍNEZ 
 
TUTOR DE TESIS: 
DR. RAMÓN MAURICIO CORAL VÁZQUEZ 
 
CIUDAD UNIVERSITARIA, 2012 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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AGRADECIMIENTOS 
 La presente tesis se realizó en el Laboratorio de Biología el Desarrollo de la División 
de Investigación Biomédica, Subdirección de Enseñanza e Investigación del Centro 
Médico Nacional “20 de Noviembre”, Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de 
los Trabajadores del Estado (ISSSTE). 
 El presente trabajo se logró hacer gracias al financiamiento del CONACyT número 
000000000115205 y a la Administración del Patrimonio de la Beneficencia Pública 
(APBP). 
 Gracias al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por haber recibido 
una beca durante la realización de mis estudios de Maestría. 
 Gracias a mis papás y a mi hermano por todo su apoyo. 
 Gracias al Doctor Ramón Mauricio Coral Vázquez por todas sus enseñanzas, por su 
dedicación y toda su paciencia. 
 Gracias al Doctor Garduño por sus sabios consejos en cada seminario. 
 Gracias al Doctor Luis Ángel Ruano Calderón por su trabajo y dedicación. 
 Gracias a la Doctora en Ciencias Luz Berenice López Hernández por todo su apoyo, trabajo 
y enseñanzas. 
 Gracias a los Doctores Vilchis y Aceves por su colaboración y trabajo dedicado. 
 Gracias a mis compañeros y amigos de laboratorio, que sin su ayuda nunca hubiera 
terminado ni hubiera sido lo mismo; sobre todo a Silvia y a Sergio. 
 Gracias al amor de mi vida por todo tu apoyo, por estar siempre a mi lado y animarme a 
seguir mis sueños. Te amo profunda y eternamente. 
 Gracias al pequeño Ricardo por alegrar mi vida. 
 
Índice 
RESUMEN ............................................................................................................................................ 1 
ABSTRACT ............................................................................................................................................ 3 
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 5 
Antecedentes .................................................................................................................................. 5 
Distrofinopatías ............................................................................................................................... 5 
Proteína Distrofina .......................................................................................................................... 6 
Características Clínicas de las Distrofinopatías ............................................................................. 10 
Datos Moleculares de Las Distrofinopatías ................................................................................... 14 
Métodos Diagnósticos de las Distrofinopatías .............................................................................. 16 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................................... 20 
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ......................................................................................................... 20 
JUSTIFICACION .................................................................................................................................. 21 
El uso de la genética molecular en medicina y sobre todo en el diagnóstico de enfermedades 
neuromusculares, ha generado un cambio y un avance muy drástico e importante. ..................... 21 
OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 22 
OBJETIVO PRINCIPAL: .................................................................................................................... 22 
OBJETIVOS SECUNDARIOS: ............................................................................................................ 22 
MATERIAL Y MÉTODOS: .................................................................................................................... 23 
DISEÑO DEL ESTUDIO .................................................................................................................... 23 
POBLACIÓN A ESTUDIAR ............................................................................................................... 23 
TAMAÑO DE MUESTRA ................................................................................................................. 23 
Criterios de Inclusión: .................................................................................................................... 23 
Criterios de Exclusión .................................................................................................................... 25 
Criterios de Eliminación ................................................................................................................ 25 
Evaluación clínica: ......................................................................................................................... 25 
Estudios paraclínicos ..................................................................................................................... 26 
Biopsia de musculo esquelético y piel .......................................................................................... 26 
ESCALA DE MEDICIÓN ................................................................................................................... 28 
Técnicas de fijación de biopsias por congelación ......................................................................... 30 
Técnica de inmunofluorescencia indirecta ................................................................................... 30 
Técnica de inmunohistoquímica con peroxidasa .......................................................................... 32 
Extracción de DNA ......................................................................................................................... 33 
Técnica de MLPA ........................................................................................................................... 35 
RESULTADOS ..................................................................................................................................... 38 
DISCUSIÓN ......................................................................................................................................... 56 
CONCLUSIONES ................................................................................................................................. 66 
ANEXOS ............................................................................................................................................. 67 
FORMATO DE HISTORIA CLÍNICA PARA DISTROFIAS MUSCULARES.............................................. 67 
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO ..................................................................................80 
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA MENORES DE EDAD ....................................... 82 
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO .................................................................................. 84 
PARA TOMA DE BIOPSIA CONTROL ............................................................................................... 84 
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................... 87 
 
1 
 
RESUMEN 
Las Distrofias Musculares son un grupo de enfermedades hereditarias caracterizadas por 
debilidad y degeneración muscular progresiva. La Distrofia muscular de Duchenne (DMD) 
es la forma más frecuente de distrofia en niños con una incidencia de 1 en 3,500 varones 
recién nacidos vivos; este grupo de padecimientos comprende un amplio espectro de 
enfermedades conocidas como distrofinopatías, que van desde la forma más grave que es 
la DMD a formas menos graves como la distrofia muscular de Becker hasta fenotipos más 
leves; todas estas enfermedades son causadas por mutaciones en el gen DMD que codifica 
para la proteína distrofina. 
Para realizar el diagnóstico de las distrofinopatías, en nuestro país se realiza mediante 
una evaluación clínica completa, análisis de niveles séricos de CPK e inmunofluorescencia 
en biopsia de músculo esquelético para detectar la presencia de la proteína distrofina; en 
algunos casos es por pruebas moleculares, PCR múltiple y MLPA. Estas últimas técnicas 
con costosas y no en todos los centros se cuenta con ellas. Por otra parte la 
inmunofluorescencia de biopsia de músculo esquelético es un proceso invasivo. Por esta 
razón es importante la búsqueda de nuevas estrategias menos invasivas y costosas que 
ayuden a determinar el diagnóstico de las distrofinopatías. 
En el presente trabajo se investigó la correlación de la expresión de distrofina en biopsias 
de piel y músculo esquelético de pacientes con distrofinopatía. 
Se incluyeron un total de 27 pacientes, a los cuales se les realizó en un mismo tiempo 
quirúrgico biopsia de piel y músculo esquelético y se analizó expresión de distrofina en 
2 
 
ambos tejidos por técnica de inmunohistoquímica y técnica de inmunofluorescencia 
respectivamente; el análisis de estas biopsias se realizó por dos observadores de manera 
cegada e independiente; en algunos casos se obtuvo muestra de sangre para extracción 
de DNA y realización de técnica de MLPA. No observamos una buena correlación entre la 
expresión de distrofina en biopsia de músculo esquelético y piel de pacientes con 
distrofinopatía. En un afán de tener un diagnóstico de certeza para algunos pacientes se 
realizó el MLPA en 16 (en ellos también se realizó inmunofluorescencia de biopsia de piel 
e inmunohistoquímica de biopsia de músculo), de las cuales en cinco (31.25%) hubo 
deleción, en dos (12.5%) duplicación y nueve fueron negativas (56.25%). 
 
Nuestros datos sugieren que en la población estudiada no hubo correlación entre la 
inmunofluorescencia de piel y la de músculo , por lo cual en esta etapa del estudio no se 
propone utilizarla como una herramienta diagnóstica adecuada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
ABSTRACT 
The Muscular Dystrophies are a group of diseases characterized by progressive 
degeneration and loss of strength. The Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is the most 
frequent kind of dystrophy in boys with an incidence of 1 in 3, 500 new born; this group of 
diseases have a broad expression, from the severe form that is DMD through moderate 
forms like Becker Muscular Dystrophy to middle forms, all of them caused by mutation of 
DMD gene that codifies for the dystrophyn protein. 
For diagnosing this diseases, is required a clinical exploration and also to perform the 
determination of CPK levels and immunofluorescenceanalysis of muscle in order to detect 
the presence of dystrophyn protein. 
Now days the genetic and molecular tests are very useful in the diagnoses of 
dystrophinophaties, the most used of these tests is the MLPA (Amplification probe ligation 
multiple), as this test can amplify the 79 exons of the DMD gene identifying 
deletions/duplications (60-70%) that are the most frequent mutations; there are other 
technics, but their complexity and cost make them inaccessible for all the people, for this 
reason it is important to search for new strategies that are less invasive and also cheaper 
that help us to determine the diagnoses of dystrophinophaties. 
 
In the present work we did the correlation of the dystrophin expression by comparison of 
the skin and muscle biopsies of patients with dystrophinopathies. We included 27 patients 
and realize in the same surgery a skin and muscle biopsy and we looked for the presence 
4 
 
of dystrophinin both tissues by immunohistochemistry and immunofluorescence 
respectively. The biopsies were analyzed by two independent blinded observers, when 
possible we obtained blood for DNA extraction and realization of MLPA technique. 
 
We did not find a correlation in the expression of dystrophin between the two tissues; for 
this reason we do not recommend using the skin biopsy as an alternative for diagnosis. 
 
5 
 
INTRODUCCIÓN 
Antecedentes 
Las Distrofias Musculares son un grupo de enfermedades hereditarias caracterizadas por 
debilidad y degeneración muscular progresiva[1]. Este término incluye por lo menos 30 
diferentes enfermedades[2]determinadas genéticamente. Todas ellas presentan 
afectación muscular en el examen bioquímico e histológico y algunas de ellas también 
presentan alteraciones en órganos diferentes al músculo. El patrón de herencia de estas 
enfermedades puede ser autosómico dominante, autosómico recesivo, ligado al X 
recesivo y de presentación esporádica. 
 
 
Estas enfermedades se pueden clasificar de acuerdo a su forma clínica, su patrón de 
herencia y recientemente también se toma en cuenta la proteína causante de la 
enfermedad; así tenemos que las enfermedades pueden ser clasificadas como: 
laminopatías, titinopatías, distrofinopatías, disferlinopatías, etc.[3]. 
 
Distrofinopatías 
La distrofina fue la primera proteína cuya mutación se demostró que causaba Distrofia 
Muscular[4]. Mutaciones en el gen de distrofina causan la Distrofia Muscular más 
frecuente que es la de Duchenne-Becker (DMD/DMB). Esta enfermedad se nombró así 
después de que Guillaume Benjamin Amand Duchenne describió esta enfermedad en sus 
publicaciones de 1861 y 1868 llamada: Recherches sur la paralysie musculair e pseudo-
hypertrophique, ouparalysi e myosclerosique[5]. Sin embargo, el médico Ingles Edward 
Meryon había descrito la misma enfermedad algunos años antes; llamándole la atención 
6 
 
el patrón de afección a hombres únicamente, así como que era una alteración particular 
del músculo y no del sistema nervioso. El médico Emil Becker describió una forma de 
distrofia muscular ligada al X clínicamente similar a la Distrofia Muscular de Duchenne 
pero con un curso más benigno [1]. 
 
A pesar de que la DMD se describió por primera vez en 1830, no fue sino hasta 1975 por 
medio de la microscopia electrónica y los análisis bioquímicos que se observó que los 
pacientes con DMD tenían un defecto en el sarcolema [6, 7]. 
 
El gen causante de la enfermedad se identificó en 1987, se le nombró gen de distrofina y 
codifica para una proteína llamada distrofina la cual ahora se sabe que tiene localización 
en el subsarcolema [6]. 
 
Una vez establecida la relación entre la alteración en la proteína distrofina y la DMD se 
realizaron estudios bioquímicos para poder determinar la función de esta proteína [7][8]. 
 
Proteína Distrofina 
En el músculo esquelético la distrofina constituye alrededor del 5% de las proteínas del 
citoesqueleto asociadas a membrana. El gen se localiza en el cromosoma X (Xq21) y se 
expande 2.5Mb. La secuencia del gen comprende79 exones codificando para una 
proteína de 427kDa de 3685 residuos[9]. 
 
7 
 
Esta proteína en forma de barra está compuesta de 4 dominios: 
1. Dominio N-terminal (homologo a α-actina) 
2. Dominio Central o en barra (25 repetidos triple hélice similar a espectrina) 
3. Región rica en cisteína 
4. Dominio C-terminal 
 
El extremo amino tiene un dominio de unión a actina, el cual es responsable de anclar la 
distrofina a la F-actina filamentosa del citoesqueleto. 
 
El dominio central consiste en 24 repetidos similares a espectrina y la flexibilidad de este 
dominio se da por las regiones en forma de bisagra que lo constituyen; dentro de este 
dominio los repetidos de espectrina del 11 al 17 constituyen otro sitio de unión a F-actina. 
En el extremo carboxilo la región rica en cisteína interactúa con la porción intracelular de 
proteína transmembranal β-distroglicano y ancla la distrofina al sarcolema, tiene una 
región α-helice que media su interacción con sintrofinas y también se une a la α-
distrobervina a través de su dominio C-terminal[10]. 
 
La distrofina tiene diversas isoformas; generadas por procesamiento alternativo del RNAm, 
el uso de promotores alternativos que especifican la transcripción de distrofinas tejido-
específicas y por distintas señales de poliadenilación. Existen por lo menos 7 isoformas 
que se expresan en: músculo, corteza cerebral, células de Purkinje cerebelosas, 
cerebro/riñón, retina, nervio periférico y la séptima isoforma que se expresa de forma 
ubicua en hígado y otros tejidos[11, 12]. 
8 
 
 
En diversos estudios se ha observado la expresión de distrofina en músculo liso de 
diversas partes del cuerpo, desde músculo liso gastroesofágico hasta músculo liso 
vascular, pulmón y músculo piloerector de la piel[13][14, 15]. 
 
La proteína distrofina se localiza en la cara citoplásmica de la membrana plasmática de la 
célula muscular o sarcolema; particularmente dentro de los costameros. A través de una 
maquinaria de proteínas que interactúan, los costameros se acoplan al sarcolema con el 
disco Z de fuerza generando miofibrillas [16]. 
 
 
La distrofina es una proteína elástica y flexible que protege al músculo del estrés causado 
por la fuerza de contracción. Esta proteína interactúa con una serie de proteínas del 
sarcolema llamadas “Proteínas asociadas a distrofina” (DAP) las cuales forman un grupo 
de proteínas periféricas presentes en la membrana del músculo que conectan a la matriz 
extracelular con el cito esqueleto (Figura 1)[2]. 
 
9 
 
 
Figura 1.Esquema del complejo de proteínas asociadas a distrofina. Se observa la unión de 
la proteína distrofina (en morado) a F-actina (azul) en su extremo amino; por su parte en 
su extremo carboxilo se observa la unión de distrofina a distrobervina (verde claro) y a 
βdistroglicano (verde esmeralda). También se observan otras proteínas del complejo 
como α, β, δ, γ y ε sarcoglicano (naranja) así como sarcospan (azul) así como el puente 
entre F-actina y laminina 3 (rojo). 
 
Se cree que la función del complejo de proteínas asociadas a distrofina es el de proteger a 
la célula muscular ya que en ausencia de distrofina el complejo se desestabiliza generando 
niveles disminuidos de otras proteínas del complejo; por lo que el papel protector de 
distrofina y las demás proteínas del complejo se pierde; el sarcolema frágil es sujeto a 
daño mecánico generando daño muscular progresivo. La capacidad de regeneración se 
pierde conforme la reserva endógena de células satélite deja de compensar a las fibras 
musculares dañadas, así mismo la extensión de la necrosis y la debilidad membranal se 
10 
 
exacerba por el ejercicio físico [17]. Por otra parte también se cree que este complejo 
participa en la transducción de señales en las fibras musculares. 
 
En la piel se puede encontrar expresión de distrofina en el músculo piloerector [43, 44, 
45], el cual se origina en el tejido conectivo de la dermis y se localiza en los folículos 
pilosos por debajo de la glándula sebácea. Es una banda de músculo liso que se dispone en 
el ángulo obtuso del folículo para producir contracción del mismo. 
 
 
Figura 2. Esquema de la piel en el cual se muestran los diferentes componentes de la 
misma, mostrando el musculo pilo erector. 
 
Características Clínicas de las Distrofinopatías 
 
Las distrofinopatías incluyen un espectro de enfermedades causadas por mutaciones en el 
gen DMD que codifica para la proteína distrofina. 
Músculo pilo erector 
11 
 
Dentro de las manifestaciones clínicas de las formas leves de este espectro de 
enfermedades se incluyen la elevación sérica asintomática de la concentración de 
creatinin fosfocinasa (CPK), calambres musculares con mioglobinuria y miopatía aislada 
del cuádriceps [18, 71]; mientras que las formas graves de este espectro incluyen a la 
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), la Distrofia Muscular de Becker (DMB) y la 
cardiomiopatía dilatada asociada a DMD[18]. 
La Distrofia Muscular de Duchenne es una enfermedad neuromuscular que se hereda 
de forma recesiva ligada al cromosoma X con incidencia de 1 en 3,500 hombres nacidos 
vivos. Los signos y síntomas de esta enfermedad se presentan generalmente en la 
infancia temprana con retraso en el desarrollo sobre todo en la sedestación y la 
deambulación. La edad media a la que inician la deambulación es a los 18 meses, 
algunos pacientes presentan problemas de aprendizaje (5%) y problemas de lenguaje 
(3%). La edad media al momento del diagnóstico en pacientes sin antecedentes 
familiares es a los 5 años (en nuestro país es a los 7 años aproximadamente; según 
datos de la D en C López Hernández, en proceso de publicación)[19, 20]; esta 
enfermedad es rápidamente progresiva y los pacientes afectados están en silla de 
ruedas alrededor de los 12 años. La cardiomiopatía ocurre en todos los individuos 
afectados después de los 18 años[21, 22]. 
 
Los pacientes con DMD tienen movilidad reducida y un riesgo incrementado para 
presentar fracturas. Debido a lo anterior son pocos pacientes sobreviven más allá de la 
12 
 
tercera década de vida, siendo la cardiomiopatía y las complicaciones respiratorias las 
principales causas de muerte[23]. 
 
La presencia de los siguientes datos clínicos nos hacen sospechar en DMD: 
 
 Debilidad muscular simétrica progresiva, a nivel proximal más que distal con 
hipertrofia de gastrocnemios. 
 Inicio de Síntomas antes de los 5 años de edad. 
 Dependencia de silla de ruedas antes de los 13 años. 
 
Cuando no hay historia previa familiar el diagnóstico se puede sospechar en niños con 
retraso en desarrollo con dificultades motoras. Alteraciones cognitivas, de lenguaje y de 
comportamiento se observan en 1/3 parte de pacientes con distrofinopatía. Niveles de 
creatinin cinasa es un marcador bioquímico sensible para detección temprana de DMD y 
se encuentra elevada de 50 a 100 veces lo normal. 
A pesar de que el gen responsable y su producto proteínico se conocen desde hace más 
de 15 años aunado a que existen modelos murinos para esta enfermedad ampliamente 
estudiados, aun no comprendemos en su totalidad el mecanismo fisiopatológico derivado 
de la ausencia de esta proteína distrofina [24]. 
 
La Distrofia Muscular de Becker se caracteriza por un inicio más tardío de debilidad 
muscular, los individuos conservan la de ambulación hasta los 20 años aproximadamente. 
13 
 
A pesar de presentar menor debilidad muscular en comparación a los pacientes con DMD 
la falla cardíaca por cardiomiopatía dilatada es una causa importante de morbilidad y la 
principal causa de mortalidad en estos pacientes, la edad promedio de mortalidad es 
alrededor de los 40 años. 
 
La presencia de los siguientes datos clínicos nos hacen sospechar de DMB: 
 
 Debilidad muscular progresiva simétrica y atrofia, de mayor involucro proximal 
que distal, generalmente con hipertrofia de gastrocnemios(la debilidad de 
cuádriceps puede ser el único signo). 
 Calambres inducidos por actividad (presente en algunos pacientes). 
 Contracturas por flexión en el codo (en etapas tardías). 
 Dependencia de silla de ruedas después de los 16 años. 
 Preservación de la fuerza de músculos flexores del cuello (Diferencia entre DMD de 
DMB). 
 
La diferencia clínica entre DMD y DMB se basa principalmente en la gravedad de la 
enfermedad y en la edad a la que el paciente es dependiente de una silla de ruedas: antes 
de los 13 años en DMD y después de los 16 años en DMB. También se ha visto que existe 
un grupo intermedio en el que los pacientes se vuelven dependientes de una silla de 
ruedas entre los 13 y 16 años. Así mismo algunos autores han ampliado el espectro de 
DMB leve a aquellos pacientes con concentración elevada de creatinin fosfocinasa y 
14 
 
distrofina anormal en biopsia de músculo pero con involucro subclínico del músculo 
esquelético.[25]. Cuando estos pacientes desarrollan cardiomiopatía es imposible 
distinguir entre DMB y cardiomiopatía asociada a DMD.[26] 
 
La cardiomiopatía asociada a DMD se caracteriza por dilatación ventricular izquierda y 
falla cardíaca congestiva. 
 
La presencia de los siguientes hallazgos clínicos nos hacen sospechar de Cardiomiopatía 
asociada a DMD: 
 Cardiomiopatía dilatada con falla cardíaca congestiva, presente entre los 20 y 40 
años de edad en los hombres y en edades más tardías en mujeres. 
 Generalmente no hay evidencia clínica de enfermedad en musculo esquelético; 
puede ser clasificado como Distrofia Muscular de Becker subclínico. 
 Progresión rápida a la muerte en hombres y progresión lenta en mujeres. 
 
Las mujeres portadoras de mutaciones en el gen DMD tienen riesgo incrementado a 
padecer esta cardiomiopatía[4]. 
 
Datos Moleculares de Las Distrofinopatías 
En los pacientes con DMD y DMB el fenotipo se correlaciona con el grado de expresión de 
distrofina, lo cual está determinado por la regla del marco de lectura [27, 28]. 
15 
 
 
Pacientes con DMD tienen mutaciones que no conservan el marco de lectura y en 
consecuencia hay una ausencia de la proteína. En el caso de DMB las mutaciones 
respetan el marco de lectura y por lo tanto se genera una proteína más pequeña que llega 
a ser funcional; esta regla tiene una certeza del 91-92% [29-32]. 
 
Se sabe que el 53% de pacientes con distrofinopatía en nuestra población presentan 
deleciones del gen, dato que coincide con lo reportado en el resto de las poblaciones en 
nuestro país no se han reportado duplicaciones ni mutaciones puntuales[29][30, 
31][32][29]. 
 
Por otra parte existen casos en los cuales hay cardiomiopatía asociada a DMD en donde 
no hay alteraciones a nivel de músculo esquelético y se originan por mutaciones que 
producen afección del promotor muscular; sin embargo promotores alternativos son 
activos en músculo esquelético, con lo cual la expresión de distrofina es suficiente para 
prevenir los síntomas del musculo esquelético [18, 33].Esta cardiomiopatía también se 
puede originar por alteración en dominios de la proteína que son de gran importancia 
para el funcionamiento del musculo cardíaco [34]. También se han observado alteraciones 
en la conducción cardiaca en pacientes con distrofinopatías esto relacionado a la 
expresión disminuida de canales de sodio cardíacos secundario a la deficiencia de 
distrofina [35]. 
 
16 
 
Métodos Diagnósticos de las Distrofinopatías 
Para hacer el diagnóstico de esta enfermedad, se realizan una serie de pasos que se 
inician con una evaluación clínica completa, enfocándonos en la forma de inicio, 
distribución de la debilidad muscular y patrón de herencia; se realizan niveles de CPK y 
electromiografía para diferenciar si es un proceso neuropático o miopático. La biopsia de 
músculo esquelético se realiza para detectar cambios no específicos de las fibras 
musculares como variación en el tamaño de las fibras, necrosis focal y regeneración, 
hialinización y en etapas tardías depósito de tejido conectivo y de grasa [36][37]. Por otra 
parte se realiza la inmunofluorescencia de biopsia de músculo esquelético para observar 
el nivel de expresión de la proteína en el tejido. 
 
Combinando las características clínicas de la enfermedad con los estudios de gabinete y la 
inmunofluorescencia podemos tener una orientación de la enfermedad.[38-40]. 
 
En la actualidad son muy empleadas las pruebas genéticas y moleculares en el diagnóstico 
de las distrofinopatías; dentro de estas tenemos prueba de Reacción en cadena de la 
polimerasa (PCR) múltiple y la prueba de amplificación por sonda dependiente de ligación 
múltiple (MLPA), una ventaja de esta ultima es la capacidad de identificar grandes 
deleciones y duplicaciones; otra técnica es la identificación de mutaciones puntuales por 
secuenciación, pero la complejidad de esta técnica y sus altos costos la hacen poco 
accesible [41, 42].Es importante destacar que estas técnicas son empleadas de manera 
rutinaria en países de Europa y en Estados Unidos; sin embargo en México la utilización de 
17 
 
éstas como parte del diagnóstico se realiza en muy pocos centro; por lo que en nuestro 
país continua siendo la inmunofluorescencia de biopsia de músculo esquelético la primer 
técnica de abordaje para confirmar el diagnóstico de estas enfermedades después de la 
clínica y la realización de CPK sérica. 
 
La biopsia de músculo por su parte es una técnica invasiva, la mayoría de veces se lleva a 
cabo en un quirófano con anestesia general (debido a que muchos de los pacientes son 
niños), así mismo es un procedimiento doloroso que deja cicatriz y muchas veces difícil de 
realizarla; también es importante recordar que estos pacientes son más susceptibles a 
presentar complicaciones e incluso muerte por los agentes anestésicos.; por lo que se han 
buscado alternativas que sean menos invasivas, menos costosas y más sencillas de 
realizar. 
 
En 1995 A. Marbini, y colaboradores publicaron un artículo en el cual proponían la 
expresión de distrofina en biopsia de piel como alternativa diagnóstica en pacientes con 
distrofinopatía; dentro de los resultados encontraron que la distrofina estaba ausente en 
las biopsias de los pacientes con DMD estaba disminuida en los pacientes con DMB y 
normal en el resto de los pacientes. Pero el número de pacientes fue muy reducido;[43] 
posteriormente el mismo grupo de trabajo investigó la distribución de proteínas cito 
esqueléticas en biopsia de piel de pacientes con DMD/DMB y pacientes con diversas 
enfermedades neuromusculares; proponiendo a la biopsia de músculo liso como 
18 
 
complementaria a la biopsia de músculo estriado para el diagnóstico de distrofinopatías. 
[14] 
 
En el 2002 Niyama y colaboradores estudiaron la expresión de la proteína distrofina en la 
biopsia de piel de pacientes con enfermedades neuromusculares, observando expresión 
normal de distrofina en pacientes con enfermedades neuromusculares diferentes a 
distrofinopatías; en el caso de los pacientes con DMD/DMB la expresión de distrofina 
estaba ligeramente disminuida, con estos resultados los autores sugirieron que la biopsia 
de piel era muy útil en el diagnóstico de distrofinopatías y podría ser utilizada en etapas 
avanzadas de la enfermedad. [44] Sin embargo el número de pacientes fue muy reducido. 
 
En el 2009 Tanveer y colaboradores realizaron un estudio para evaluar el papel de la 
biopsia de piel en el diagnóstico de distrofinopatías y validar esta prueba para ver su 
utilidad como prueba complementaria/remplazo de la biopsia de musculo; en sus 
resultados obtuvieron expresión de la proteína distrofina muy similar en la biopsia de piel 
comparando con la expresión de esta proteína en la biopsia de musculo; a diferencia del 
estudio realizado por Niyama, estos autores no encontraron diferencia en la 
inmunohistoquímica para los diferentes dominiosen pacientes con DMD, diciendo que 
sus resultados son prometedores; pero no concluyen nada en definitivo[45]. 
 
19 
 
Si bien existen antecedentes acerca de la utilidad de la expresión de distrofina en la 
biopsia de piel, son muy pocos estudios y son poco contundentes al respecto y ninguno 
de los estudios es en población mexicana. 
 
Así mismo como se mencionó anteriormente el diagnóstico de estas enfermedades es 
muy complejo, ya que una solo prueba no basta para establecer el diagnóstico definitivo. 
 
En nuestro país aún son poco accesibles los estudios moleculares para toda la población, 
motivo por el cual es importante la búsqueda de nuevas estrategias menos invasivas y 
costosas que nos ayuden a determinar el diagnóstico de las distrofinopatías. 
 
20 
 
 
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
 
Las distrofinopatías son las distrofias musculares más frecuentes en niños; a pesar de que 
existen diversas técnicas moleculares y genéticas para realizar el diagnóstico definitivo de 
estas enfermedades, en nuestro país son muy pocos centros en los que se realizan. La 
inmunfluorescencia indirecta en biopsia de músculo esquelético junto con la clínica y los 
estudios de gabinete continúa siendo el estándar de oro para su diagnóstico; sin embargo 
ésta es una técnica invasiva, que en muchas ocasiones requiere anestesia general, 
trayendo muchas complicaciones a los pacientes. Por su parte hay estudios en los cuales 
se sugiere que la biopsia de piel puede ser una buena alternativa a la biopsia de músculo 
esquelético; tomando en cuenta que es una técnica menos invasiva y más fácil de realizar, 
en este estudio nos interesa ver la correlación entre la expresión de distrofina en biopsia 
de músculo esquelético y biopsia de piel de los pacientes con distrofinopatía. 
 
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
 
¿Existirá correlación entre la expresión de la proteína distrofina en músculo esquelético y 
la expresión de distrofina en biopsia de piel de pacientes con distrofinopatía? 
 
 
21 
 
JUSTIFICACION 
 
El uso de la genética molecular en medicina y sobre todo en el diagnóstico de 
enfermedades neuromusculares, ha generado un cambio y un avance muy drástico e 
importante. [46] [7] 
 Las distrofinopatías se diagnostican por las manifestaciones clínicas, hallazgos de estudios 
paraclínicos (CPK), análisis de DNA y el análisis de inmunofluorescencia en biopsia 
muscular que corrobora la ausencia o deficiencia de la proteína [38, 47, 48][49][50]; sin 
embargo ésta última es una técnica invasiva, dolorosa, que requiere anestesia general y 
no siempre se cuenta con el equipo ni los especialistas necesarios para realizarla; así como 
la necesidad de un equipo de microscopio sofisticado hacen que en ocasiones no sea 
accesible en todos loe Centros; por otra parte se ha reportado disminución en la expresión 
de la proteína distrofina en músculo liso de pacientes con distrofinopatía; por lo cual es 
importante tener una prueba menos invasiva en la que se requiere menos tiempo para su 
realización, así como ser menos dolorosa e invasiva y utiliza un equipo de microscopia 
menos complejo (de luz blanca). Por lo anterior es necesario primero determinar si existe 
correlación en la expresión de la proteína distrofina de ambos tejidos en pacientes con 
diagnóstico posible de distrofinopatía (realizado únicamente por clínica y estudios de 
gabinete) y en pacientes con un diagnóstico de certeza (realizado por clínica y MLPA). 
[51, 52] [44, 45] 
 
22 
 
OBJETIVOS: 
OBJETIVO PRINCIPAL: 
• Determinar la correlación entre la expresión de distrofina en biopsia de músculo 
esquelético y la expresión de distrofina en biopsia de piel de pacientes con 
distrofinopatía. 
OBJETIVOS SECUNDARIOS: 
• Determinar la expresión de distrofina por inmunohistoquímica en biopsia de piel 
de pacientes con sospecha clínica de distrofinopatía (Distrofia muscular de 
Duchenne/Becker). 
• Determinar la expresión de distrofina por inmunofluorescencia en biopsia de 
músculo esquelético de pacientes con sospecha clínica de distrofinopatía 
(Distrofia muscular de Duchenne/Becker). 
• Correlacionar los resultados obtenidos de la expresión de distrofina en biopsia de 
piel y músculo de los pacientes con sospecha clínica de distrofinopatía. 
• Realizar MLPA para la determinación de eliminación o duplicación en el gen de 
distrofina. 
 
23 
 
MATERIAL Y MÉTODOS: 
DISEÑO DEL ESTUDIO 
Descriptivo y transversal. 
POBLACIÓN A ESTUDIAR 
En el presente estudio se incluyeron pacientes consultados del servicio de Genética, 
Neurología y especialidades afines del Hospital Centro Médico Nacional XX de Noviembre, 
del Hospital General de Durango, del Hospital Centro Médico Nacional La Raza-IMSS, del 
CREED de Durango y Asociaciones de Distrofia Muscular en México (Guadalajara, 
Chihuhua), así como de centros que refirieron a pacientes, en quienes se sospechó 
distrofia muscular de Duchenne/Becker. 
TAMAÑO DE MUESTRA 
Tamaño de la muestra no probabilístico por conveniencia. 
Todos los pacientes con diagnóstico clínico de distrofia muscular de Duchenne/Becker que 
acudieron a consulta en el periodo de abril del 2010 a abril del 2011. (30 pacientes). 
Criterios de Inclusión: 
 Pacientes con sospecha clínica de distrofia muscular de Duchenne/Becker a los 
que se les realizó biopsia de piel y músculo. 
 Pacientes que aceptaron participar en el estudio. 
 
24 
 
Pacientes con sospecha de Distrofia Muscular de Duchenne: 
 
 Pacientes que presenten debilidad muscular simétrica proximal progresiva (mayor 
afección de miembros inferiores que de miembros superiores) 
 Pseudohipertrofia de gastrocnemios 
 Incremento de Creatinin cinasa sérica más de 10 veces del nivel basal 
 Pacientes que se encuentren en silla de ruedas a los 12 años 
 
Pacientes con sospecha de Distrofia Muscular de Becker 
 
 Debilidad muscular proximal simétrica 
 Conservación de fuerza muscular el músculos flexores del cuello 
 Pseudohipertrofia de gastrocnemios 
 Silla de ruedas más de 16 años 
 Incremento de nivel creatinin cinasa sérica 5 veces más del nivel basal 
 
Subclínico: 
 
 Incremento de creatinin cinasa sérica 
 Hipertrofia de gastrocnemios 
 Mialgia y calambres 
 Mioglobinuria 
25 
 
 
Cardiomiopatía dilatada 
 
Criterios de Exclusión 
 
 Pacientes conocidos con Distrofia muscular de Duchenne que acudieron a consulta 
y que ya habían sido previamente estudiados. 
 
Criterios de Eliminación 
 
 Pacientes en los cuales la muestra fue inadecuada, mal transportada al sitio de 
procesamiento o mal procesada. 
 
Evaluación clínica: 
En cada paciente se realizó una evaluación inicial que incluyó la realización de una historia 
clínica completa con el relato detallado de los antecedentes familiares, personales y 
patológicos, así como de las manifestaciones musculares. Además se realizó una 
exploración física-neurológica completa con determinación exacta de la distribución y el 
grado de la afección muscular. 
Se tomaron en cuenta datos clínicos incluyendo: género, edad, lugar de nacimiento y 
residencia, ocupación, exposición a tóxicos, antecedentes familiares de patología 
26 
 
muscular, escolaridad, edad de inicio de manifestaciones, primeros síntomas y evolución 
de los mismos, posibilidad de factor desencadenante, fecha de diagnóstico, distribución 
de la afección muscular y su grado, la presencia de manifestaciones cardiacas y/o 
respiratorias. Los datos clínicos fueron escritos en un formato único de recolección de 
datos. (Anexo 1) 
En cada caso identificado se realizó árbol genealógico con antecedentes familiares de 
mismas manifestaciones para posterior análisis genético. 
Estudios paraclínicos 
Se solicitaron niveles séricos de CPK. No se excluyeron a los pacientes que n contaban con 
niveles de CPK 
 
Biopsia de musculo esquelético y piel: Previa firma de consentimiento informado (anexos2 y 3) a todos los pacientes se les realizó una biopsia de músculo esquelético abierta y de 
piel en un mismo tiempo quirúrgico y en el mismo sitio ambas (cuadriceps o músculo 
deltoides), mediante anestesia local. Se obtuvieron muestras de músculo estriado y piel 
para análisis por inmunofluorescencia e inmunohistoquímico respectivamente y en caso 
de que fuera factible se tomó muestra de sangre (3ml) en tubo con EDTA para extracción 
de DNA y análisis molecular por técnica de MLPA. 
El análisis inmunohistoquímico de la distrofina se realizó en biopsias de piel normales y se 
estandarizó la técnica. 
27 
 
 
 
 
Pacientes con 
diagnóstico probable 
de distrofinopatía 
Biopsia de músculo y 
piel 
Biopsia de piel 
inmunohistoquimica 
Análisis de 
resultados por 2 
personas diferentes 
Biopsia de músculo 
inmunofluorescencia 
Análisis de 
resultados por 2 
personas diferentes 
Toma de 3ml de 
sangre con EDTA 
Extracción de DNA 
MLPA 
Historia Clínica 
CPK 
Previa firma de 
consentimiento informado 
28 
 
ESCALA DE MEDICIÓN 
 
Se realizó estandarización de expresión inmunohistoquímica de distrofina en biopsias de 
piel y músculo de pacientes sin distrofinopatía y posteriormente se compararon las 
biopsias de músculo y piel de pacientes con distrofia muscular de Duchenne/Becker y se 
determinó si existe expresión, si esta normal, disminuida o ausente (cualitativamente). 
 
Nivel de expresión Reflejo 
+++ Normal 
++- Disminución moderada 
+-- Disminución marcada 
--- Ausente 
 
El análisis de las biopsias se realizó por 2 personas diferentes de manera cegada e 
independiente. 
Se realizará la prueba estadística de índice de kappa para observar concordancia entre los 
observadores, también se realizará la prueba de correlación de Pearson. 
 
 
29 
 
MLPA: 
Se realizó toma de sangre con EDTA para extracción de DNA y realización de técnica de 
MLPA y se analizaron los 79 exones y se observó si hay presencia de deleciones o 
duplicaciones en el gen. 
 
 
30 
 
Técnicas de fijación de biopsias por congelación 
Las biopsias se trasladaron a nuestro laboratorio. 
1) En un vaso metálico se coloca isopentano y se mete en nitrógeno líquido para que 
precipite. 
2) Se corta un pedazo de corcho de 1cm x 1cm además de un pedazo de acetato 
3) Sobre el corcho instalado se coloca 1 gota de tissueteck y colocar la biopsia sobre 
este. 
4) Con el isopentano precipitado dejar caer la biopsia montada en el frasco metálico 
con isopentano y dejarla alrededor de 3min. 
5) Sacar la biopsia del vaso y colocarla en un tubo (membretado) 
6) Dejar el tubo en refrigerador a -70OC. 
7) Corte de biopsia en criostato, los cortes serán de 7micras 
La técnica de fijación y los cortes se realizaron con la misma técnica independientemente 
de que se trate de biopsia de piel o biopsia de musculo esquelético. 
En el caso de las biopsias de piel al momento de fijarlas, se fijaron de tal forma que todas 
las capas de la piel se encontraran en dirección transversal con respecto al corcho. 
Técnica de inmunofluorescencia indirecta 
1) Preparar la cámara húmeda con agua bidestilada 
2) Etiquetar cada laminilla (control negativo, control positivo, Dys 2(extremo 
carboxilo), Dys3 (extremo amino) y DysR(dominio en barra)) 
31 
 
3) Limitar el contorno con plumón hidrófobico 
4) Agregar 1ml de solución bloqueadora a cada laminilla y dejarlo por 1 hora 
5) Diluir el anticuerpo primario de distrofina(dilución de anticuerpo primario Dys 
2 y Dys 3 1:250μl y Dys R 1:200μl). 
6) Adicionar 300 microlitros de dilución a la laminilla correspondiente y PBS al 
control negativo 
7) Dejar el anticuerpo primario 1 hora 
8) Retirar el anticuerpo primario con PBS al 1X mediante 2 lavados: uno rápido y 
el segundo de 10 minutos 
9) Diluir el anticuerpo secundario anti-ratón Cy3 en PBS (Dilución 1:250μl) 
10) Con la luz apagada adiciono 200-500 microlitros de anticuerpo secundario a 
cada laminilla y dejar 1 hora. 
11) Hacer 3 lavados con PBS de 10 minutos el primer y segundo lavado y 15 
minutos el tercero. 
12) Retirar el exceso de PBS 
13) Poner 1 gota de Vectashield con DAPI 
14) Poner cubreobjetos y se sella la laminilla con esmalte 
15) Ver al microscopio. 
16) Guardar las laminillas a 4oC protegiéndolas de la luz. 
 
El análisis inmunohistoquímico de la distrofina se realizó en biopsias de piel normales 
para estandarizar técnica. 
32 
 
Técnica de inmunohistoquímica con peroxidasa 
 
Se utiliza el Kit Comercial DakoCytomation LSAB2 System HRP. 
 
Con las biopsias de piel montadas es portaobjetos con Poly L lisina. 
 
1. Se colocan las laminillas en una cámara húmeda. 
2. Se traza una línea en el extremo superior de los tejidos y otra en el extremo 
inferior con plumón hidrofóbico y se etiqueta cada laminilla (control negativo, 
Extremos Carboxilo, extremo amino y dominio Rod) 
3. Se realiza bloqueo con peroxidasa. Con el frasco etiquetado como “PEROXIDASE 
BLOCK” se aplican gotas sobre nuestro tejido, la suficiente cantidad como para que 
quede bien cubierto, se deja por media hora, posteriormente se hace 1 lavado 
rápido con PBS al 1% y se vuelve a cubrir nuestro tejido con “PEROXIDASE BLOCK” 
por media hora más. 
4. Se realiza lavado rápido 
5. Se realiza bloqueo por 1 hora con solución bloqueadora (Albumina al 5%, suero 
fetal al 0.5%, Tritón al 0.5% y gelatina al 0.05%) 
6. Se incuba con anticuerpo primario por 1 hora. (Anticuerpos monoclonales 
primarios de laboratorios VECTOR, No. Catálogos: VP-D508, VP-D505 y VP-D507) 
Las diluciones de los anticuerpos primarios son: 
a. Extremo carboxilo 1:250. 
33 
 
b. Extremo amino 1:250. 
c. Dominio Rod 1:200. 
7. Se realizan 3 lavados de 5, 10 y 15 minutos con PBS 1% 
8. Se aplican gotas de frasco etiquetado como “BIOTINYLATED LINK”, se incuba 11min 
y posteriormente se realizan 3 lavados rápidos de las laminillas. 
9. Se aplican gotas del frasco etiquetado como “STREPTAVIDIN-HRP”, se incuba 
11min y posteriormente se realizan 3 lavados rápidos de las laminillas. 
10. Se prepara Solución DAB y posteriormente se aplican gotas para que cubran los 
tejidos, se incuba por 10min y se lava con agua destilada. 
11. Se montan las laminillas con entellan. 
12. Se pone cubreobjetos. 
13. Se observan al microscopio. 
Extracción de DNA 
Método modificado de Gustinchich S. y colaboradores. 
1) Se toma una muestra de sangre (5-10 ml) en un tubo con EDTA como 
anticoagulante. 
2) Se colocan 300µl de sangre en un tubo Eppendorf de 1.5ml estéril. 
3) Se añaden 600µl de DTAB al 8% (Sigma) (1.5M, EDTA 50Mm, Tris 100Mm pH 
8.7) al tubo Eppendorf con sangre. Se mezcla y calienta en termoblock a 65oC 
durante 5 minutos. 
4) Se añaden 550µl de Cloroformo al 100% y se agita manualmente con fuerza 
durante 5 minutos. 
34 
 
5) Se centrifuga a 13, 000 rpm durante 10 minutos. 
6) Después de la centrifugación quedarán 2 fases: una fase proteínica al fondo del 
tubo y una fase acuosa transparente en la superficie, la fase acuosa se 
transfiere a un nuevo tubo Eppendorf del mismo volumen sin tomar partículas 
de la fase proteínica. 
7) Al nuevo tubo con la fase acuosa se le añaden 100µl de CTAB al 5% (Sigma) 
(NaCl 0.4M), se mezclan y se añaden 750µ de H2O estéril (ampolleta). Se 
mezcla despacio hasta que las fases se mezclan, se dejan reposar durante 10 
minutos a temperatura ambiente. 
8) Se centrifuga a 1000rpm durante 5 minutos. 
9) Se descarta el sobrenadante y se conserva el precipitado. 
10) Al nuevo tubo con el precipitado se le añaden 200µl de NaCl 1.2M, se re 
suspende el precipitado y se agregan 850µl de etanol al 100% frio, mezclar y 
dejar precipitar en frio durante 10 minutos. 
11) Centrifugar a 10, 000 rpm durante 5 minutos. 
12) Descartar sobrenadante y conservar precipitado. Agregar 500µl de Etanol al 
70%. 
13) Centrifugar a 10, 000rpm durante 5 minutos y repetir el lavado con etanol al 
70% una vez más y centrifugar en lasmismas condiciones. 
14) Descartar el sobrenadante y conservar el precipitado, secar el precipitado en 
un secador al vacío o en un lugar a temperatura ambiente. 
15) Resuspender el precipitado en H2O estéril o TE. 
35 
 
16) Se cuantifican las muestras en Nano Drop 1000 para dejar las muestras en una 
concentración de DNA de 100ng/µl. 
Técnica de MLPA 
 
1. Desnaturalización del DNA (DÍA 1) 
a. Marcar tubos de 0.2ml 
b. Agregar 5μl de DNA de trabajo a cada tubo (o TE/H2O para la reacción 
control) 
c. Colocar los tubos en el termociclador e iniciar el programa de MLPA (ver 
posteriormente el programa): desnaturalizar la muestra de DNA por 5 
minutos a 98º C y enfriar las muestras a 25º C antes de abrir el 
termociclador 
2. Reacción de hibridación (día 1) 
a. Preparar mezcla maestra de hibridación que contiene para cada reacción: 
1.5ml de buffer de MLPA (tapa amarilla) + 1.5μl de mezcla de sonda (tapa 
negra). Mezclar bien pipeteando o con vortex. Cuando el termociclador 
alcance 25º C, agregar 3 μl de mezcla maestra de hibridación a cada tubo 
muestra. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 
b. Continuar el programa de termociclador: Incubar 1 minuto a 95o C, 
posteriormente 16-20hrs a 60o C. 
3. Reacción de ligación (día 2) 
36 
 
a. Preparar mezcla maestra de ligasa, para cada reacción: 3μL de buffer A 
Ligasa-65 (tapa transparente) + 3μL de buffer B Ligasa-65 (tapa blanca) + 
25μL de agua destilada. Mezclar bien pipeteando o por vortex. 
b. Agregar 1μL de Ligasa-65 (tapa verde) a cada reacción de mezcla maestra 
de ligasa. Mezclar bien pipeteando hacía arriba y hacia abajo. 
c. Continuar el programa del termociclador: pausarlo a 54o C. 
d. Cuando las muestras estén a 54o C, agregar 32 μl de mezcla maestra de 
ligasa a cada tubo de reacción. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia 
abajo. 
e. Continuar el programa de termociclador: 15 minutos de incubación a 54o C 
(para ligación) seguido de 5 minutos a 98oC para inactivación por calor de la 
enzima Ligasa-65 y pausar el programa a 15oC 
4. Reacción de PCR (día 2) 
a. Marcar nuevos tubos para la reacción de PCR. 
b. Preparar la mezcla de buffer de PCR que contiene para cada reacción: 4μl 
de buffer PCR SALSA + 26μl de agua destilada. Mezclar bien con el vortex. 
c. Agregar 30 μl de mezcla de PCR buffer a cada tubo nuevo. 
d. A temperatura ambiente transferir 10μl de cada producto de ligación a 
cada tubo de PCR correspondiente. 
e. Preparar mezcla maestra de polimerasa agregando para cada reacción: 2μl 
de primers de PCR SALSA (tapa café) + 2μl de enzima dilución buffer SALSA 
37 
 
(tapa azul) + 5.5μl de agua destilada + 0.5μl de polimerasa SALSA (tapa 
naranja). 
f. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo, no con vortex. Almacenar en hielo 
hasta que se use. 
g. Continuar el programa de termociclador: pausa a 60º C y poner los tubos 
de PCR en el termociclador. 
h. Mientras estos tubos se encuentran en el termociclador a 60º C, agregar 
10μl de mezcla de polimerasa a cada tubo. Mezclar pipeteando hacia arriba 
y hacia abajo y continuar el programa de termociclador inmediatamente: 
35 ciclos: 30 segundos a 95º C; 30 segundos a 60º C, 60 segundos a 72º C. 
Terminar con 20 minutos de incubación a 72º C y posteriormente pausar a 
15º C. 
Programa de PCR para reacción de MLPA 
Separación de fragmentos 
 Posterior a la reacción de PCR, mezclar 0.7μl de reacción de PCR + 0.2μl de tamaño 
standard LIZ + 9ml de formamida. Sellar el plato de inyección e incubar por 2 
minutos a 80º C. 
 
38 
 
RESULTADOS 
En el presente proyecto se obtuvo un total de 46 pacientes, de los cuales cuatro de los 
pacientes provinieron de la Asociación de Distrofia Muscular de Guadalajara, siete del 
Centro Médico Nacional “La Raza”, 31 de la Asociación de Distrofia Muscular de 
Chihuahua y seis del Hospital General de Durango. Del total de pacientes obtenidos, 21 
pacientes se excluyeron del estudio; quedando un total de 27 pacientes (Gráfica 1). 
 
 
Gráfica 1. Se muestra el total de pacientes que se reclutaron en un inicio para el estudio y 
cuantos se excluyeron y los motivos por los cuales fueron excluidos. 
 
 
27 
 
5 
16 
21 
 
PACIENTES INCLUIDOS 
INCLUIDOS
EXCLUIDOS
MAL PROCESAMIENTO
MAL TRANSPORTE
39 
 
Con el objetivo de tener la caracterización clínica de nuestro universo muestral, 
consideramos importante enmarcar las principales manifestaciones los pacientes 
incluidos, ya que estas características pueden correlacionarse con la presencia, deficiencia 
o ausencia de niveles de expresión de distrofina en las biopsias de músculo esquelético y 
piel. Del total de pacientes que se estudiaron cinco tenían sospecha de DMB y formas 
leves de distrofinopatía por clínica y 21 tuvieron sospecha de DMD y en un paciente no se 
pudo determinar el fenotipo. La mayoría de los pacientes con sospecha de DMD 
presentaron síntomas de la enfermedad a edades tempranas (3.16 años en promedio) con 
retraso en el inicio de la de ambulación y caídas frecuentes. De los pacientes con DMB y 
formas leves de la enfermedad, la edad de inicio de síntomas fue a los 17 años con 
debilidad muscular. 
 
En la tabla 1 se engloban las principales características clínicas encontradas en los 
pacientes; podemos observar que en la mayoría de ellos la edad a la que se tomó la 
biopsia fue a los 13.9 años, cuando la enfermedad está ya en estadios avanzados; 
haciendo difícil el análisis de la misma debido a que a esta edad la mayoría de los 
pacientes presentan mucha sustitución de músculo por tejido conectivo y tejido celular 
subcutáneo. Contrario a lo escrito en la literatura, solo uno de los pacientes presentó 
antecedentes familiares de distrofinopatía (3.2%) y el resto de los pacientes (96.8%) fue 
por mutación de novo. 
 
40 
 
Cinco pacientes tuvieron pérdida de la deambulación y el resto tuvo alteraciones en la 
marcha; cuatro de los pacientes con pérdida de la de ambulación tuvieron la sospecha 
clínica de DMD y en uno de ellos no se determinó el diagnóstico. En seis pacientes (24%) 
se presentó alteraciones del aprendizaje. En cuatro pacientes (14.81%) se encontró 
escoliosis, dos de los cuales se encontraban en silla de ruedas; otra alteración encontrada 
fue quiste aracnoideo, que no es característico de la enfermedad. 
41 
 
Tabla 1. Características clínicas de los pacientes 
Número 
Paciente 
Edad de 
biopsiaa 
Diagnóstico
b 
Antecedentes 
familiares 
Perdida 
de ambulación 
Alteración en 
Aprendizaje 
Alteraciones 
sistémicas 
Niveles de 
CPK 
1 17 DMB NO NO NO 
600 
2 8 DMD NO NO NO 
 
3 67 ND NO SI NO 
 
4 11 DMD NO NO NO 
9000 
5 8 DMD NO NO SI 
10000 
6 19 DMD NO SI SI 
3000 
7 14 DMD NO SI SI ESCOLIOSIS 
 
8 37 DMB NO NO NO CARDIOPATÍA 
1600 
9 14 DMD SI SI SI ESCOLIOSIS 
 
10 27 FORMAS LEVES NO NO NO 
 
11 10 DMD NO NO NO 
12000 
12 10 DMD NO SI NO 
7000 
13 12 DMD NO NO NO 
7708 
14 10 DMB NO NO NO 
77 
15 2 DMD NO NO SI 
2971 
16 11 DMD NO NO NO 
5460 
17 1 DMD NO NO NO 
16000 
18 8 DMD NO NO NO 
13145 
19 8 DMD NO NO NO 
4714 
20 8 DMD NO NO NO 
 
21 7 DMD NO NO NO 
8007 
22 25 FORMAS LEVES NO NO NO 
10726 
23 9 DMD NO NO NO ESCOLIOSIS 
12689 
24 8 DMD NO NO NO 
18886 
25 8 DMD NO NO SI 
 
26 9 DMD NO NO NO ESCOLIOSIS 
8815 
27 9 DMD NO NO NO QUISTE ARACNOIDEO 
9725 
aLa edad a la que se tomó la biopsia coincide con la edad actual del paciente. 
bLa presentación clínica de los pacientes se clasificó en distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker (DMB), formas leves 
y no determinado (ND). 
42 
 
Posteriormente ya que se realizó la Historia Clínica y Exploración Física a cada uno de los pacientes, se procedió a 
la toma de biopsia de musculo esquelético y de piel en un mismo tiempo quirúrgico, todas las biopsias se 
realizaron de forma ambulatoria con anestesia local por un médico especialista; las biopsias se tomaron del 
músculocuádriceps o del músculo deltoides de manera indistinta. A todas se les realizó la técnica de tinción de 
hematoxilina-eosina para valorar la morfología general de las fibras de músculo esquelético y de la piel (Figuras 1 
y 2). 
 
 
 
Figura 1. Técnica de Tinción de hematoxilina-eosina. a) Biopsia de músculo de control en donde se observa tejido 
muscular con tamaño de fibras simétrico y núcleos en la periferia. b) Biopsia de músculo de paciente número 26, 
se observan fibras asimétricas, con infiltración de tejido conectivo y tejido celular subcutáneo (flecha) así como 
centralización de núcleos. c) Biopsia de músculo de paciente número 12, se observa abundante sustitución de 
tejido muscular por tejido celular subcutáneo, así como deformación de las fibras musculares (flecha) y 
centralización de los núcleos. 
 
 
Con esta técnica pudimos observar cambios en los pacientes con distrofinopatía, los cuales consistieron 
principalmente en el cambio del tamaño y forma de las fibras musculares, centralización de los núcleos y 
sustitución de tejido muscular por tejido conectivo y tejido celular subcutáneo; siendo más evidentes estos 
cambios en pacientes con enfermedad en estadios avanzados.(Figura 1 a y b ) 
 
 
a b c 
43 
 
 
 
 
 
Se realizó tinción de hematoxilina-eosina en piel, no se observaron cambios en los pacientes con distrofinopatía 
en comparación con la piel de controles (Figura 2 ). 
 
 
 
 
Figura 2. Técnica de Tinción de hematoxilina-eosina a) Biopsia de piel control, se observan todas las capas de la 
piel con sus núcleos. b) Biopsia de piel de paciente número 9, observamos todas las capas de la piel. 
 
 
Una vez que se realizó la técnica de hematoxilina-eosina de las biopsias de músculo y piel de los pacientes, se 
procedió a realizar la técnica de inmunofluorescencia indirecta de los cortes de las biopsias. Ésta técnica en 
músculo esquelético se tenía previamente estandarizada, por lo cual no hubo ningún contratiempo al momento 
de realizarla; en el caso de la piel la técnica no estaba estandarizada, así que se realizaron diversos experimentos 
con modificaciones entre ellos para encontrar las condiciones óptimas, pero se observó que con la técnica de 
inmunofluorescencia indirecta había mucho fondo generado por inmunofluorescencia inespecífica y además se 
perdía la estructura normal de la piel lo que hacía imposible su análisis (Figura 3), por lo cual se decidió cambiar 
a b
44 
 
de técnica a inmunohistoquímica con peroxidasa debido a que con ésta se puede hacer una localización más 
precisa de la reacción, generando menor inespecificidad; para esto se utilizó un kit comercial. 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Técnica de inmunofluorescencia indirecta de biopsia de piel. Se observa inmunofluorescencia 
inespecífica en todo el tejido, no se distingue la estructura de la piel; solo se diferencian unos núcleos que 
pudieran corresponder a epidermis (flecha). 
 
 
 
 
45 
 
Para valorar si eran comparables las técnicas de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica, se realizaron ambas 
técnicas en músculo esquelético de algunos pacientes y controles y se observó que si eran equiparables (Figura 
4), motivo por el cual se decidió utilizar la técnica de inmunofluorescencia para las biopsias de músculo (debido a 
que se tenían los recursos para realizar inmunofluorescencia y no los kits necesarios para realizar 
inmunohistoquímica a todas las muestras). 
 
 
 
 
 
Figura 4. a) Técnica de Inmunohistoquímica con peroxidasa de músculo esquelético normal, se observa la 
expresión de distrofina (de color café bien delimitado) en el contorno de las fibras musculares. b) Técnica de 
Inmunofluorescencia indirecta en biopsia de músculo esquelético normal, se observa la expresión de distrofina en 
el contorno de las fibras musculares. 
 
 
Una vez que se tuvieron las inmunohistoquímicas de la piel y las inmunofluorescencias de músculo, todos los 
cortes se valoraron por 2 observadores (Tabla2). 
 
 
 
 
 
a b 
46 
 
 
Tabla 2. Comparación de resultados de observación de inmunofluorescencia de biopsia de músculo entre 2 
observadores. 
 
 Observador 1 Observador 2 
Paciente D2 D3 DR D2 D3 DR 
1 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 
2 (+--) (+--) (++-) (+--) (+--) (+--) 
3 (+++) (++-) (+++) (+++) (++-) (+++) 
4 (++-) (---) (---) (++-) (---) (---) 
5 (+--) (---) (---) (+--) (---) (---) 
6 (---) (---) (---) (---) (---) (---) 
7 (+--) (+++) (+++) (+--) (+++) (+++) 
8 (+++) (++-) (+++) (+++) (++-) (+++) 
9 (++-) (---) (---) (++-) (---) (---) 
10 (+--) TMI
* 
(+--) (+--) TMI (+--) 
11 (+--) (+++) (+++) (+--) (+++) (+++) 
12 (---) (+--) (---) (---) (+--) (---) 
13 (---) (+--) (+--) (---) (+--) (+--) 
14 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 
15 (++-) (+--) (++-) (++-) (+--) (++-) 
16 (+++) (+++) (++-) (+++) (+++) (++-) 
17 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 
18 (---) (+--) (---) (---) (+--) (---) 
19 (++-) (+--) (+--) (++-) (+--) (+--) 
20 (---) (---) (---) (---) (---) (---) 
21 (+++) (++-) (+--) (+++) (++-) (+--) 
22 (+--) (+--) (+++) (+--) (+--) (+++) 
23 (---) (---) (+--) (---) (---) (+--) 
24 (+++) (+++) (++-) (+++) (+++) (++-) 
25 (---) (---) (++-) (---) (---) (++-) 
26 (---) (---) (---) (---) (---) (---) 
27 (---) (---) (+--) (---) (---) (+--) 
TMI* Tejido muy infiltrado 
Al analizar las biopsias de musculo esquelético por 2 observadores de manera independiente y cegada, 
concordaron el 100% de las observaciones. 
47 
 
Tabla 3. Comparación de resultados de observación de inmunohistoquímica de biopsia de piel entre 2 
observadores. 
Observador 1 Observador 2 
Paciente D2 D3 DR D2 D3 DR 
1 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 
2 (---) (---) (---) (---) (+--) (+++) 
3 (+++) (++-) (+++) (+++) (+--) (---) 
4 (---) (---) (---) (+++) (---) (+++) 
5 (+++) (+--) (+--) (+++) (+--) (+++) 
6 (---) (---) (---) (---) (---) (---) 
7 (+--) (+++) (+++) (+--) (+++) (+++) 
8 (+++) (++-) (+++) (+++) (++-) (+++) 
9 (---) (---) (---) (---) (---) (+++) 
10 (+++) (---) (---) (+++) (---) (---) 
11 (+--) (+++) (+++) (+--) (+++) (+++) 
12 (---) (---) (---) (---) (---) (---) 
13 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 
14 (---) (++-) (+++) (---) (++-) (+++) 
15 (+--) (---) (---) (---) (---) (---) 
16 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (---) 
17 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 
18 (---) (---) (---) (---) (---) (---) 
19 (---) (---) (+++) (---) (---) (+++) 
20 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 
21 (+++) (++-) (+--) (+++) (++-) (+--) 
22 (+++) (+--) (+++) (+++) (+--) (+++) 
23 (---) (---) (---) (---) (---) (---) 
24 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 
25 (+--) (---) (+--) (++-) (+--) (+--) 
26 (---) (---) (---) (---) (---) (---) 
27 (---) (---) (+--) (---) (---) (---) 
 
48 
 
En la biopsia de piel al analizarlas por 2 observadores de manera independiente y cegada hubo concordancia de 
los resultados en 19 de los 27 pacientes que corresponde al 70%. Al realizar la prueba estadística se observó que 
esta concordancia fue de .438 con una p de 0.022 no significativa; concluyendo que hay concordancia moderada. 
 
Una vez realizadas las comparaciones entre los observadores para cada una de las técnicas, se decidió buscar la 
correlación entre los resultados obtenidos en la biopsia de músculo y piel de cada uno de los pacientes; al hacer 
esta comparación hubo correlación en 12 de las 27 muestras (44%) (Tabla 4). Haciendo el análisis estadístico de 
correlación de Pearson se obtuvo una correlación de o.378 con p de 0.52, con lo cual concluimos que no hay 
correlación. 
 
Tabla 4.Comparación entre los resultados obtenidos en las observaciones de biopsia de músculo y piel de cada 
uno de los pacientes.Biopsia músculo Biopsia piel 
Paciente D2 D3 DR D2 D3 DR 
1 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 
2 (+--) (+--) (++-) (---) (+--) (+++) 
3 (+++) (++-) (+++) (+++) (+--) (---) 
4 (++-) (---) (---) (+++) (---) (+++) 
5 (+--) (---) (---) (+++) (+--) (+++) 
6 (---) (---) (---) (---) (---) (---) 
7 (+--) (+++) (+++) (+--) (+++) (+++) 
8 (+++) (++-) (+++) (+++) (++-) (+++) 
9 (++-) (---) (---) (---) (---) (+++) 
10 (+--) (---) (+--) (+++) (---) (---) 
11 (+--) (+++) (+++) (+--) (+++) (+++) 
12 (---) (+--) (---) (---) (---) (---) 
13 (---) (+--) (+--) (+++) (+++) (+++) 
14 (+++) (+++) (+++) (---) (++-) (+++) 
15 (++-) (+--) (++-) (---) (---) (---) 
49 
 
16 (+++) (+++) (++-) (+++) (+++) (---) 
17 (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) (+++) 
18 (---) (+--) (---) (---) (---) (---) 
19 (++-) (+--) (+--) (---) (---) (+++) 
20 (---) (---) (---) (+++) (+++) (+++) 
21 (+++) (++-) (+--) (+++) (++-) (+--) 
22 (+--) (+--) (+++) (+++) (+--) (+++) 
23 (---) (---) (+--) (---) (---) (---) 
24 (+++) (+++) (++-) (+++) (+++) (++-) 
25 (---) (---) (++-) (++-) (+--) (+--) 
26 (---) (---) (---) (---) (---) (---) 
27 (---) (---) (+--) (---) (---) (+--) 
 
Con los datos obtenidos en nuestro estudio observamos que hay correlación moderada entre ambas técnicas y 
que por lo tanto la biopsia de músculo esquelético continua siendo el estándar de oro en el diagnóstico de las 
distrofinopatías en nuestro país; ahora bien hay que tomar en cuenta que la mayoría de los pacientes llegan al 
especialista y se les realiza la biopsia de músculo a edades avanzadas y esto al momento de analizar la biopsia 
trae complicaciones debido a que ya hay mucha infiltración del músculo por tejido conectivo y tejido celular 
subcutáneo; esta infiltración hace difícil la interpretación de los resultados ya que se genera una señal de 
fluorescencia muy intensa e inespecífica que se llega a confundir con la expresión esperada o en muchas 
ocasiones es tanta la sustitución del tejido que es muy difícil encontrar fibras musculares y no se realiza una 
adecuada interpretación de la expresión de distrofina en estas biopsias (Figura 5 ). 
 
 
 
 
 
50 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Técnica de inmunofluorescencia indirecta para distrofina en biopsia de músculo esquelético a) Paciente 
17 en el cual se observa la expresión normal, las fibras están bien delimitadas y simétricas, aún no hay infiltrado 
de tejido conectivo. b) Paciente 9, observamos que hay fibras musculares de diferentes tamaños con forma es 
irregular y observamos tejido celular subcutáneo sustituyendo a las fibras musculares normales (flecha blanca). c) 
Paciente 10, observamos que hay mucho infiltrado de tejido celular subcutáneo sustituyendo a las fibras 
musculares normales, nos queda duda que haya presencia de fibra muscular (flecha blanca). 
 
 
 
Con lo anterior recalcamos la importancia de que el diagnóstico se realice a edades tempranas para poder 
obtener una biopsia adecuada y hacer un buen análisis de la expresión de la proteína distrofina. 
 
En México las distrofinopatías se diagnostican tardíamente, ya que generalmente solo se realiza una evaluación 
clínica que en ocasiones no es muy precisa, motivo por el cual no es fácil tener un grupo de pacientes 
clínicamente homogéneo; además de que hay distrofias musculares que clínicamente son muy similares a 
distrofinopatía, pero a nivel molecular son otras las proteínas causantes de la enfermedad [42] . Por tal motivo, 
en un grupo de pacientes se realizó la técnica de MLPA a algunos de los pacientes cuando se tuviera acceso a la 
muestra de sangre, esto con el fin de corroborar la presencia de deleciones y duplicaciones del gen y así poder 
 a b c 
51 
 
dar un diagnóstico definitivo de la enfermedad y poder correlacionar también en este grupo la deficiencia de la 
distrofina en la biopsia de piel y músculo. (Tabla 5) 
Tabla 5. Datos moleculares de los pacientes con distrofinopatía 
 
Número de 
Paciente 
Biopsia de 
músculo
a 
Biopsia 
de piel
b 
MLPA Mutaciónc Fenotipo 
1 (---) (+--) DEL 52 No fase. DMD 
2 (++-) (---) NEGATIVO DMD 
3 (++-) (---) DUP 1, 42 -43 No fase. DMD 
4 (++-) (++-) DEL 45-47 Fase DMB 
5 (++-) (---) DUP 2 No fase. DMD 
6 (+--) (+++) NEGATIVO Formas 
leves 
7 (++-) (++-) NEGATIVO DMD 
8 (+--) (+--) DEL 10 Fase. DMD 
9 (+--) (---) DEL 5-6 No fase. DMD 
10 
 
(+--) (+--) NEGATIVO DMD 
11 (---) (---) DEL 35 Fase. DMD 
12 (---) (+++) NEGATIVO DMD 
13 (---) (---) NEGATIVO DMD 
14 (++-) (---) NEGATIVO DMD 
15 (+--) (++-) NEGATIVO DMB 
16 (++-) (+++) NEGATIVO DMD 
17 (+--) (+++) Del 19 No fase DMD 
18 (---) (---) DEL 51-54 No fase DMD 
 
a
se refiere al promedio de la expresión de distrofina en los 3 dominios en la biopsia de músculo. 
b
 se refiere al promedio de la expresión de distrofina en los 3 dominios de la biopsia de piel. 
c
Efecto de la mutación sobre el marco de lectura del gen: No fase- no respeta el marco de lectura del gen; Fase-Respeta el marco de 
lectura del gen. 
 
52 
 
Se analizó la muestra de DNA de 18 pacientes por medio de MLPA (Tabla 5); a partir de esto se obtuvieron nueve 
(50%) resultados negativos; en siete (38.89%) pacientes se mostró deleción y dos (11.1%) pacientes tuvieron 
duplicación. Del total de mutaciones encontradas, cuatro (44.44%) se localizaron en el punto caliente mutacional 
menor (exón 2-20) y uno más se localizó en el punto caliente mayor (11.11%). 
 
Considerando el resultado del análisis por la técnica de MLPA nueve (33.33%) de los pacientes incluidos en 
nuestro estudio tuvieron el diagnóstico definitivo de distrofinopatía y a 18 (66.66%) pacientes se les realizó el 
diagnóstico de posible distrofinopatía. Del total de pacientes con diagnóstico definitivo de distrofinopatía, en 
cuatro (44.4%) hubo correlación entre los niveles de expresión de proteína distrofina en la biopsia de piel y 
músculo esquelético y en cinco (55.55%) pacientes no hubo correlación. Al aplicar la prueba estadística de 
coeficiente de correlación de Pearson obtuvimos una correlación de.132 con lo cual decimos que no existe 
correlación entre los niveles de expresión de distrofina entre las biopsias. 
 
La prueba de MLPA para el paciente dos resultó negativa; al comparar éste resultado con la expresión de 
distrofina en biopsia de músculo esquelético y piel, encontramos disminución marcada y ausencia de la expresión 
de la proteína respectivamente, con estos resultados hacemos el diagnóstico de posible DMD; lo cual hace 
complejo el asesoramiento genético, debido a que a pesar de que no se encontraron duplicaciones/deleciones 
del gen, no se puede descartar que existan mutaciones puntuales no identificadas por esta técnica. Por otra parte 
si solo tomamos en cuenta la biopsia de músculo observamos que hay disminución leve de la expresión de 
distrofina, que en dado caso de que la clínica no fuera sugerente del diagnóstico tendríamos que sospechar otro 
tipo de distrofia muscular; si tomamos en cuenta los resultados de la biopsia de músculo esquelético y la biopsia 
53 
 
de piel, a pesar de que resultados no concuerdan, ambos nos orientan a una alteración en la expresión de la 
proteína. 
 
En el paciente seis la prueba de MLPA fue negativa, nos enfrentamos al mismo problema que el paciente anterior, 
debido a que en la biopsia de músculo hay disminución de la expresión moderada, pero este resultado no 
concuerda con la biopsia de piel cuya expresión es normal; si tomamos en cuenta que fenotípicamente el 
paciente se clasificó como forma leve de la enfermedad, podría caber la posibilidad de pensar en otro tipo de 
distrofia. Este tipo de situaciones hace difícil el asesoramiento genético de los pacientes, ejemplificando así que el 
abordaje y diagnóstico no siempre es tan sencillo aun cuando se cuenta con múltiples herramientas para su 
diagnóstico; un fenómeno que nos podría explicar la falta de concordanciaentre la biopsia de piel y músculo son 
los fenómenos de procesamiento alternativo que se llevan a cabo en el gen. 
 
En los pacientes 7 y 8 observamos que a pesar de que el MLPA es negativo, la expresión de distrofina en las 
biopsias tuvo disminución leve y moderada respectivamente y analizando nuestra tabla concluimos que los 
resultados entre la biopsia de piel y músculo concuerdan no dejando duda de que existe disminución de la 
expresión de distrofina, siendo casos posibles de distrofinopatía. 
 
El paciente uno tuvo deleción del exón 52, afectando el marco de lectura, esperando que no haya producción de 
proteína o que la proteína sea tan pequeña o anómala que se degrade, dándonos un fenotipo grave (DMD); al 
analizar la expresión de distrofina en biopsia de músculo se encuentra ausente y en biopsia de piel está 
disminuida de manera marcada; fenotípicamente el paciente se clasificó como DMD. En este caso en particular 
podemos ver que a pesar de que la expresión de distrofina en biopsia de piel y músculo no concuerdan, en ambas 
54 
 
hay disminución marcada y ausente, variación que podría deberse a que es un método cualitativo. En este 
paciente concordó la clínica con la expresión de distrofina y lo molecular. 
 
El paciente cinco presenta duplicación del exón 2, que es la duplicación más frecuentemente reportada en los 
pacientes con distrofinopatía (DMD), al analizar la mutación con el programa frame checker se observó que esta 
duplicación no respeta el marco de lectura, concordando con la clínica, ya que al paciente se le clasificó 
fenotípicamente como DMD. Al buscar la expresión de la proteína en biopsia de músculo esquelético hubo 
disminución leve de la expresión de distrofina y en la biopsia de piel hubo ausencia de la expresión, si analizamos 
no concordaron los resultados de las biopsias de piel y músculo a pesar de que en ambas hubo disminución de la 
expresión proteínica. 
 
El paciente nueve presenta deleción de los exones 5-6 que no respeta el marco de lectura, concordando con la 
clínica que es un fenotipo DMD y al buscar la expresión de distrofina en la biopsia de músculo esquelético y piel 
se observa que hay disminución marcada y ausencia de la expresión respectivamente y a pesar de que no 
concuerdan los resultados entre las biopsias, en ambas hay disminución importante de la proteína. 
 
El paciente 11 presenta deleción del exón 35 que respeta el marco de lectura, pero fenotípicamente el paciente 
presenta fenotipo DMD y al buscar comparar la expresión de distrofina en biopsias de músculo esquelético y piel, 
ambas concuerdan que hay ausencia de la expresión de distrofina, observando que en este paciente hubo mayor 
relación entre las biopsias y la clínica que entre la clínica y el MLPA, lo cual nos deja ver que aún hay muchas 
cosas que comprender de esta y de la mayoría de las enfermedades genéticas. 
 
55 
 
El paciente tres presentó una mutación compleja que consiste en una doble duplicación del exón 1 y 42-43, la 
cual es muy interesante, ya que hasta el momento no se ha reportado esta mutación. Fenotípicamente tiene 
DMD, al analizar la expresión de distrofina en biopsia de piel y músculo esquelético no concuerda a pesar de que 
en ambas hay deficiencia. 
 
El paciente cuatro tuvo deleción del exón 45-47 con fenotipo DMB y concuerda la expresión de distrofina en piel 
y músculo. 
 
 
 
 
56 
 
 
DISCUSIÓN 
 
Las distrofinopatías son la forma de distrofia muscular más frecuente en niños; a pesar de que se describieron 
desde 1861[5] y su gen se identificó en 1987 [6],su diagnóstico continua siendo tardío [48], situación que es 
perjudicial para nuestros pacientes, ya que existen reportes en los cuales con un diagnóstico temprano, el uso de 
esteroides y otras alternativas terapéuticas se puede mejorar de manera importante su calidad de vida [53, 54]. 
 
En la actualidad se cuentan con múltiples técnicas moleculares y genéticas para el diagnóstico de estas 
enfermedades [55-57]; sin embargo, en nuestro país son muy pocos los Centros Hospitalarios que cuentan con 
los equipos necesarios y el personal capacitado para realizarlas de manera habitual; por lo cual es de suma 
importancia buscar alternativas diagnósticas sencillas y más accesibles a nuestro medio. La exploración clínica, la 
evaluación de niveles séricos de CPK y la biopsia de músculo esquelético continúan siendo los elementos 
diagnósticos principales; no obstante la biopsia de músculo esquelético es un método muy invasivo y en etapas 
tardías es compleja su interpretación, por lo que se han buscado técnicas más sencillas y accesibles; entre estas 
tenemos resultados muy alentadores en cuanto al uso de la biopsia de piel como herramienta diagnóstica 
alternativa [14, 43, 45]; no obstante existen resultados contradictorios y este tipo de estudios no se ha realizado 
en población mexicana. 
 
Considerando lo anterior, como parte principal de este trabajo se realizó la comparación entre la expresión de 
distrofina en biopsia de músculo esquelético y de piel en pacientes con diagnóstico de distrofinopatía. 
 
57 
 
Se incluyeron 27 pacientes del sexo masculino, la mayoría de ellos originarios del Norte del país (Chihuahua);en 
este estado de la República hay una “Asociación de Distrofia Muscular” la cual posiblemente difunde información 
sobre la enfermedad, ayudando a identificar un mayor número de pacientes. 
 
Solo uno de los pacientes tuvo antecedentes familiares de distrofinopatía, contrarío a lo descrito en la literatura 
internacional [1, 3, 9], pero situación que coincide con un reporte realizado por Alcántara et al (1999), en donde 
se refiere que el 62% de los pacientes con distrofinopatía en México se presentan por mutaciones de novo. 
 
Del total de nuestra población incluida en el estudio,18 pacientes (66.66%) tuvieron el diagnóstico de posible 
distrofinopatía; debido a que a pesar de presentar alteraciones clínicas concordantes con distrofinopatía y 
disminución o ausencia de los niveles de expresión de distrofina en la biopsia de músculo, no se demostró la 
presencia de mutación en el gen. En nueve pacientes (33.33%) se realizó el diagnóstico definitivo de 
distrofinopatía. De los pacientes con diagnóstico definitivo de distrofinopatía, uno (9.6%) tuvo la sospecha de 
DMB por clínica y el resto (88.8%) tuvo sospecha clínica de DMD. En relación a los pacientes con diagnóstico 
posible de distrofinopatía, en cuatro (22.22%) se tuvo la sospecha de DMB, en uno (0.55%) no se pudo establecer 
el diagnóstico y en 13 (72.22%) se tuvo el diagnóstico de DMD por clínica. Estudios previos indican que la 
incidencia de DMD es mayor que la DMB y formas leves de la enfermedad [9]. Los datos de esta tesis concuerdan 
con lo anterior. 
 
El 22% de los pacientes presentó alteraciones del aprendizaje, pero no se corroboró si estas alteraciones se 
debían a un coeficiente intelectual bajo o eran debido a un abandono y mala rehabilitación de los pacientes; pero 
hay reportes en los cuales se ha observado que el complejo de proteínas asociadas a distrofina juegan un papel 
58 
 
importante en la maduración de receptores de neurotransmisores y en la regulación de su liberación durante la 
sinapsis, generando alteraciones en la memoria y retraso mental[62]. 
 
La mayoría de los pacientes presentan síntomas a edades tempranas (3.16 años en promedio), siendo los más 
frecuentes la alteración en la marcha y la debilidad muscular proximal; no obstante la biopsia de músculo 
esquelético y el diagnóstico se realizan en promedio a los 9.23 años (6.07 años después de los primeros 
síntomas), situación que no es exclusiva de nuestro país; ya que en países de Latinoamérica como Brasil se 
reporta un retraso en el diagnóstico de 5 años e incluso en países industrializados como Estados Unidos éste es 
de 2.6 años[48, 58-61].El hecho de que a los pacientes se les realice la biopsia de músculo después de varios