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10/8/2022

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Biología

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MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

POSGRADO EN CIENCIAS
BIOLÓGICAS

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS

PAPEL DE LOS GENES yafE, ydgT y fliK EN LA
ESTABILIDAD DEL GENOMA BACTERIANO

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
(BIOLOGÍA EXPERIMENTAL)

P R E S E N T A:

BLANCA ESTELA HERNÁNDEZ GUADARRAMA

TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. RAFAEL CAMACHO CARRANZA
COMITÉ TUTOR: DRA. MARIA DEL CARMEN GÓMEZ EICHELMANN
DR. JAIME MARIANO MARTÍNEZ SALAZAR

MÉXICO, D.F. Agosto, 2010

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
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objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

UN M~~
POSG DO ~:r.:k
Or. lsidro ÁvU .. Martínez
Director Gener.1 de Administración Eseo"r, UHAM
Pr,s.nt,
COORDINACiÓN
Me permito iIllorrnar a usted que en la reunión ordinaria del Cornfté Acalémico del Posgrado en
aeooas BIológicas. celebrada el dia 14 de JUnio de 2010, se apr0b6 el siguiente jurado para el
ex<WOOfl de grado de MAESTRA EN CIENCIAS BIOlOGICAS (8lOLOGIA EXPERIMENTAl) de la
aullY\a HERNÁNDEZ GUAOARRAMA BlANCA. ESTELA coo númerode cuenta 505013688 coo la
leSIS ü\u!ada ·Plpe! 6t los genes rafE, rd9T y ffiK.n l. estabilidad ct.I gtnOma bactfrVno",
realizada bajO la dlreco6n del Dr. Rafael C.m.cho C&lT1nZl:
Presidente ORA MARIA DEL CARMEN GOMEZ ICHELMANN
Vocal. DRA. ALEJANDRA ALICIA COVARRUBIAS R08LES
Se&zetano: DR RAFAEL CAMACHO CARRANZA
Suplente: DR ZENON CANO SANT ANA
Suplente: DR ARTURO CARlOS 11 BECERRA BRACHO
Sin otro pacticul<M", me es grato envia1e \J/l cordial saludo.
Al . nt,m.nt.
'POR MI RAZA HABLARA EL ESPtRlTLr
Cd. U"",,''''¡', D.F, ' 23~~ 1010
Dr. Juan Hu
"""'""'"

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

A G R A D E C I M I E N T O S

Al Posgrado en Ciencias Biológicas de la UNAM, por haberme permitido aprender
de su enorme sabiduría y retos.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada
para la realización de mis estudios de maestría (Febrero 2005-Diciembre 2006)
(Registro: 193994) y por financiamiento parcial para el proyecto número 41469.

Al Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica
(PAPIIT) IN214908 UNAM., por la beca otorgada para la finalización de mis
estudios de maestría (Mayo-Julio 2008).

A los miembros de mi comité tutoral:
Dr. Rafael Camacho Carranza, Dra. Carmen Gómez Eichelmann y
Dr. Jaime Mariano Martínez Salazar, por sus enseñanzas, consejos y
críticas académicas que fueron clave para la realización, desarrollo y
culminación de ésta investigación.

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

A G R A D E C I M I E N T O S

A los miembros del jurado para mi examen de grado:
Dra. Alejandra Alicia Covarrubias Robles, Dr. Zenón Cano Santana y
Dr. Arturo Carlos II Becerra Bracho por su tiempo, disposición y críticas
académicas que fueron importantes en el manuscrito final de mi tesis de
maestría.

El presente trabajo fue realizado en el laboratorio del Dr. J. Javier Espinosa
Aguirre del Departamento de Medicina Genómica y Toxicología Ambiental
del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad Nacional
Autónoma de México.

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

A G R A D E C I M I E N T O S
Al Dr. Rafael Camacho Carranza, por ser mi ejemplo de inspiración en todo sentido, como
persona, investigador, amigo, un gran ser humano.

A la Dra. Diana María Escobar García por su por su asistencia técnica en el manejo de las
cepas bacterianas, y en diversas metodologías de biología molecular.

A la Bióloga Sandra Luz Hernández Ojeda, por su asistencia técnica en el manejo y
construcción de las cepas bacterianas, así como en diversas técnicas de biología
molecular.

Al QFB. Victor Sanabria Ayala, por su asistencia técnica y académica en los ensayos de
estrés oxidativo.

Al M. en C. Jesús Ricardo Parra Unda, por su asistencia técnica y académica en los
ensayos de estrés oxidativo.

Al Dr. Jorge Humberto Serment Guerrero, por su asistencia técnica, académica y
metodológica en los ensayos de estrés oxidativo en bacterias.

Al Dr. Omar Arellano, por su asistencia técnica, académica y metodológica en el análisis
estadístico de los datos.

Al M. en C. Antonio T. Araujo Soto, por su asistencia técnica en el análisis estadístico de
los datos.

A la Bióloga Claudia Barajas Lemus, por su asistencia técnica, académica y metodológica
en los métodos de transducción bacteriana y en diversas técnicas de biología molecular.

A la M. en IBB. Clementina Castro, por su valiosa crítica académica y asistencia técnica
en diversas métodos de biología molecular.

Al Dr. Antonio Javier Vallecillo, por su valiosa crítica académica y asistencia técnica en
diversos métodos de biología molecular.

A la M. en C. Alejandra Abigail González Valdéz,, por su apoyo técnico, académico y
metodológico en la determinación de actividades de β-galactosidasa.

Al QFB. Gerardo Croda García, por su asistencia técnica en la medición de actividades de
β-galactosidasa.

Al Dr. J. Javier Espinosa Aguirre, por compartir conmigo su gran conocimiento y claridad
de la vida científica y personal, por abrirme las puertas de su laboratorio, por sus consejos
y valiosas críticas académicas, que fueron importantes en el desarrollo de la presente
investigación.

A todas aquellas personas que de una u otra forma me apoyaron durante la realización de
este trabajo.
III

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

D E D I C A T O R I A

“A Dios por estar siempre a mi lado”
“A mi ángel, donde quiera que estés, te he sentido conmigo”

A mis hermanos Norma Gisela y
Elmer Alonso, por estar siempre
conmigo, por su amistad, por
descubrir juntos un mundo lleno de
sorpresas, por convertir momentos
difíciles en un mundo de risas y
juegos.

A mis padres María Luisa
Guadarrama y Albino Hernández,
por darme la vida, por su apoyo
durante mi formación personal y
profesional, por todos sus
sacrificios que hoy dan fruto con la
culminación de un reto más en mi
vida: mi maestría¡.

A mis amigos: Sandra Hernández, Juan Carlos Velázquez, Claudia
Barajas, Netzi Rivera, Dolores Ronquillo, Neus Serrano, Danny Molina,
Víctor Dávila, Luis Serrano, Antonio Araujo, Javier Belmont, Ana
Valencia, Giovanna Salamanca, Abigail Valdéz, Victor Sanabria,
Ricardo Parra, María Elena Cruz, Nancy Flores y a todosaquellos que
tuve la dicha de conocer y que se nos han adelantado. Gracias por las
pláticas, experiencias, alegrías, tristezas y valiosa amistad. Los quiero y
aprecio mucho¡

A la UNAM, por abrirme sus puertas
y por la calidez de su gente. Al Dr.
Rafael Camacho, porque más que mi
tutor, es un gran amigo que ha
confiado en mí. Al Dr. Javier
Espinosa, por ser un ejemplo de
humanidad y vida científica, siempre
me abrió las puertas de su
laboratorio, en donde he aprendido
todo lo que soy, por sus consejos y
hospitalidad. A la Dra. Diana María
Escobar por darme tanto cariño, por
todo el apoyo técnico, académico,
moral, una gran amiga.
A ti por tu apoyo, cariño, fortaleza,
solidaridad y comprensión, quien
me ha enseñado que la pasión por
hacer bien las cosas alimenta el
espíritu, quien comprendió los
momentos entregados al laboratorio
y esperó cada instante para
compartirlo a mi lado, siempre
ayudando a los demás, sin pensar
recibir nada a cambio, gracias
Alfonso Malagón¡. A la familia
Malagón Mendiola, quienes me han
apoyado incondicionalmente en
todo momento.
IV

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

INDICE
RESUMEN……………………………………………………………………………………..... .1
ABSTRACT……………………………………………………………………………………....3
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………......5
CAPÍTULO II. ANTECEDENTES………………………………………………………………8
2.1 Definición y propiedades de los rearreglos genómicos………………….............8
2.2 Formación de los rearreglos genómicos: papel del sistema RecBCD
en la formación de la inversión ……………………………………………….. 11
2.3 Hallazgos del papel de la replicación en la recombinación……………… 14
2.4 Frecuencia de los rearreglos genómicos en el cromosoma bacteriano……… 14
2.5 Evidencias de estabilidad genómica: sintenia entre organismos…………….. 16
2.6 Impacto de las inversiones en el genoma: importancia evolutiva
y biológica………………………………………………………………………….. 17
2.7 Restricción para la generación de inversiones en el cromosoma……………. 21
2.8 Formación de inversiones usando secuencias repetidas largas……………… 23
2.9 Formación de inversiones usando secuencias repetidas pequeñas…………. 23
2.10 Características del modelo: restricción para formar la inversión en el intervalo
his-trp en Salmonella typhimurium……………………………………………… 24
2.11 Papel de los sitios ter y la proteína Tus en la inversión……………………….. 25
2.12 Características de los sitios ter…………………………………………………. 26
2.13 Características del gen tus………………………………………………………. 28
2.14 Características de la proteína Tus………………………………………………. 29
2.15 Características de las mutantes tus…………………………………………….. 30
2.16 Mecanismo de arresto de la replicación mediado por Tus…………………….. 31
2.17 Evaluación de la inversión en el intervalo his-trp de Salmonella
typhimurium…………………………………………………………………………. 34
2.18 Planteamiento del problema…………………………………………………….. . 35
CAPÍTULO III. OBJETIVOS E HIPÓTESIS……………………………………………….... 37
CAPÍTULO IV. DISEÑO EXPERIMENTAL, MATERIAL Y MÉTODOS………………….. 38
4.1 Métodos genéticos………………………………………………………………… 39
4.1.1 Construcción de la cepa silvestre Salmonella typhimurium LT2 con el sistema
de inversión (secuencias repetidas lac en orden invertido)………………… 39
V

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

4.1.2 Construcción de las cepas permisivas para inversión en la región his-trp
mediante transposición…………………………………………… ……………. 40
4.2 Mapeo del elemento Tn10d-cam mediante Electroforesis de Campo Pulsado
(Pulsed Field Gel Electrophoresis: PFGE)……………………………………. 40
4.2.1 Cepas bacterianas………………………………………………………………. 40
4.2.2 Condiciones de cultivo………………………………………………………….. 41
4.2.3 Enzimas y reactivos…………………………………………………………….. 43
4.2.4 Preparación del DNA bacteriano embebido en agarosa…………………….. 43
4.2.5 Restricción del DNA bacteriano embebido en agarosa con XbaI…………… 44
4.2.6 Electroforesis en campo pulsado (PFGE)……………………………………... 45
4.3 Mapeo del elemento Tn10d-cam mediante PCR semi-random……………… 45
4.3.1 Extracción del DNA bacteriano…………………………………………………. 45
4.3.2 Diseño de oligonucleótidos para el elemento Tn10d-cam y oligonucleótidos
degenerados……………………………………………………………………… 46
4.3.3 Condiciones de PCR…………………………………………………………….. 47
4.4 Cuantificación del evento de inversión…………………………………………. 48
4.4.1 Cepas bacterianas………………………………………………………………. 48
4.4.2 Construcción de los candidatos con la sobrecarga del gen tus (tus+)
y sin la sobrecarga de tus (tus-): obtención del DNA plasmídico……………. 48
4.4.3 Preparación de células electrocompetentes…………………………………… 49
4.4.4 Electroporación…………………………………………………………………… 49
4.4.5 Cuantificación del evento de inversión…………………………………………. 50
4.5 Frecuencias de transducción entre la cepa silvestre y las mutantes………… 51
4.5.1 Cepas bacterianas……………………………………………………………….. 51
4.5.2 Preparación de lisados y titulación del fago………………………………….. 51
4.5.3 Trasducción………………………………………………………………………. 51
4.6 Medición del sistema del daño a DNA en la cepa silvestre y mutantes……… 51
4.6.1 Cepas bacterianas……………………………………………………………….. 51
4.6.2 Construcción de las cepas mutantes con la fusión sulA31din-9::MudJ
y sulA31din-240:: MudJ mediante transducción con P22…………………….. 52
4.6.3 Medición de fusiones “lacZ”: actividad β-galactosidasa……………………… 52
4.7 Análisis estadístico………………………………………………………………. 53

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

CAPÍTULO V. RESULTADOS……………………………………………………………... 54
5.1 Mapeo del elemento Tn10d-cam mediante PFGE ……………………………. 54
5.1.1 Mapeo del elemento Tn10d-cam en el candidato RC238……………………. 55
5.1.2 Mapeo del elemento Tn10d-cam en el candidato RC256……………………. 57
5.1.3 Mapeo del elemento Tn10d-cam en el candidato RC261……………………. 57
5.2 Mapeo del elemento Tn10d-cam mediante PCR semi-random……………… 57
5.3 Cuantificación del evento de inversión ………………………………………… 63
5.4 Evaluación de las frecuencias de transducción entre la cepa silvestre
y mutantes………………………………………………………………………… 71
5.5 Medición del daño al DNA en la cepa silvestre y las mutantes………………. 72
CAPITULO VI. DISCUSIÓN, CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS…………………… 78
LITERATURA CITADA…………………………………………………………………...…. 96

VII

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

“Aprende a disfrutar las cosas simples de la vida”
Sesbania Guízar +

“Cuando Dios cierra una puerta, siempre deja una ventana abierta”
Un gran amigo

“Libre es quien desea lo que es capaz de realizar, y realiza lo que le agrada”
Juan Jacobo Rousseau

“No vale la pena llegar a la meta si uno no goza del viaje”
Roger Martínez González

“Me gusta la gente que vibra, que no hay que empujarla, que no hay que decirle que haga las
cosas, sino que sabe lo que hay que hacer y lo hace. La gente que cultiva sus sueños hasta que esos
sueños se apoderan de su propia realidad”
Mario Benedetti

“Adelante, no permitas que nadie te robe tu sueño,
Que ningún obstáculo trunque tu camino,
Lo que hiciste ayer pertenece al pasado,
Vale lo que decidas hoy, recuerda tú puedes¡,
Eres un campeón¡, no claudiques¡, no eres mediocre¡,
Tu país te necesita, eres la nueva generación que escogerá gobernante,
Realízate como profesionista de calidad NO de cantidad,
Cultiva la amistad, el amor, la humildad, la honradez y la lealtad

Charles Dickens

VIII

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

RESUMEN
Blanca Estela Hernández-Guadarrama. Papel de los genes yafE, ydgT y fliK en la
estabilidaddel genoma bacteriano.
Director de tesis: Dr. Rafael Camacho-Carranza

Algunos de los efectos que diversos compuestos genotóxicos ejercen, tienen que
ver con la pérdida de estabilidad genómica. Poco se conoce de los mecanismos
que evitan los rearreglos genómicos, aún en la presencia de sustratos
recombinogénicos, por lo cual abordamos una estrategia para explorar estos
mecanismos en Salmonella enterica Serovar typhimurium.
Escherichia coli y Salmonella provienen de un ancestro común del cual
divergieron hace aproximadamente 150 millones años (Ochman y Wilson 1987), y
pese a que sus secuencias de DNA difieren en un 10 a 20% y que sus
mecanismos recombinogénicos están activos, presentan ambos un mapa
genómico casi idéntico (sintenia), evidenciando la presencia de mecanismos de
estabilidad genómica (Segall et al., 1988). Salmonella posee intervalos permisibles
(his-nadA) y no permisibles (his-trp) para la inversión genómica, sin embargo, la
mutación en el gen “tus” permite la inversión del intervalo his-trp. La proteína “Tus”
se une en los sitios “ter”, como el que se encuentra dentro del gen amyA,
localizado en el intervalo his-trp. Lo anterior, de tratarse de un fenómeno general,
puede tener relevancia en áreas de estudio como el cáncer y la diferenciación
(Bostock, 1984; Fenech, 2002).
En éste trabajo aislamos nuevos mutantes por inserción de transposones,
independientes de tus, que también permiten la inversión en el intervalo his-trp.
Mediante restricción y electroforesis en pulso (PFGE) y PCR semi-aleatorio
mapeamos en cinco candidatos la posición de los elementos móviles que permiten
la inversión. En una mutante la inserción se encuentra en el gen yafE, que codifica
para menaquinona, elemento importante en la respiración anaeróbica en E. coli y
Salmonella typhimurium (Neidhardt, 1996) y en la formación del flagelo cuando se
encuentran en condiciones de crecimiento anaerobio (Hertz y Bar-tana, 1977). Un
segundo mutante presenta el transposón en el gen fliK, responsable del control de
la longitud del flagelo en Salmonella typhimurium y E. coli (Macnab et al., 1996).
En el tercer candidato la inserción se encontró en el gen ydgT, un parálogo de hha
en E.coli, que pertenece a una familia de proteínas involucradas en la termo y
osmo-modulación de la expresión de diversos genes y que forma un complejo
heteromérico con H-NS ó StpA, el cual se une a una secuencia de 26 pb de oriC,
1

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

optimizando su actividad; además de modular la expresión de varios operones
bacterianos, entre ellos, factores de virulencia (Paytubi et al., 2004), así como de
la isla de patogenicidad 2 en Salmonella, involucrada en contender con el
ambiente intracelular del macrófago (Coombes et al., 2005).
Los hallazgos anteriores nos hicieron suponer que la participación de
especies reactivas de oxígeno y/o nitrógeno en algunos mutantes pudiera estar
generando sustratos recombinogénicos, disminuyendo la no permisividad de la
región. Por ello, se evaluó la inducción del sistema SOS en los tres mutantes
comparada con la silvestre, mediante las fusiones sulA31din-9::MudJ y sulA31din-
240::MudJ; sin embargo, sólo se observaron diferencias significativas con la fusión
sulA31din-9::MudJ.
Se cuantificó la frecuencia de los eventos de inversión en la cepa tus- y se
comparó con la cepa silvestre. Se observó una frecuencia de 26,000 invertantes
estables en 1x108 células/ml (permisivo), y 13 rearreglos inestables en 1x108
células/ml (no permisivo), respectivamente. Cuando medimos la frecuencia de
inversión en la mutante en yafE observamos 136 invertantes estables en 1x108
cel/ml, la cual se mantiene aún en presencia de una sobrecarga del gen tus+ (330
en 1x108 cel/ml). En la mutante en fliK hay una repercusión importante cuando se
sobrecarga con el gen tus+, pues se observó que el tiempo en el cual llega a fase
exponencial se alarga en comparación con la cepa silvestre y las otras mutantes y,
no hay presencia de invertantes, este fenotipo se revierte al eliminar la sobrecarga
del gen tus+ (75 invertantes estables en 1X108 cel/ml). Finalmente, la frecuencia de
inversión en la mutante con la inserción en ydgT (989 invertantes estables en
1X108 cel/ml) es afectada con la sobrecarga de tus+ (95 invertantes estables en
1X108 cel/ml), pero una vez que se retira la sobrecarga de tus, la frecuencia se
mantiene baja (36 invertantes estables en 1X108 cel/ml).
Se proponen diferentes hipótesis para la explicación del fenómeno
observado.

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

ABSTRACT
Blanca Estela Hernández-Guadarrama. Role of genes yafE, ydgT y fliK in the
stability of the bacterial genome.
Advisor: Dr. Rafael Camacho-Carranza
Some of the effects that various genotoxic compounds exerted, have to do with the
loss of genomic stability. Little is known about the mechanisms that prevent
genomic rearrangements, even in the presence of recombinogenic substrates, thus
addressing a strategy to explore these mechanisms in Salmonella enteric serovar
Typhimurium.
Escherichia coli and Salmonella diverged from a common ancestor about
150 million years ago (Ochman y Wilson, 1987), although their DNA sequences
differ by 10 to 20% and recombinogenic mechanisms are active, both have a
nearly identical genomic map (sinteny), demonstrating the presence of
mechanisms of genomic stability (Segall et al., 1988). Salmonella have permissible
(his-nadA) and not permissible (his-trp) intervals for genomic inversions, however,
the mutation in the “tus” gene allows inversion on the his-trp interval. The protein
"Tus" joins sites "ter" as it is within the amyA gene, located on the his-trp interval.
This, of being a general phenomenon, may have relevance in areas of study such
as cancer and differentiation (Bostock, 1984; Fenech, 2002).
In this work we isolated new mutants by insertion of transposons,
independent of “tus”, which also allow inversion in his-trp interval. By restriction
and pulse field gradient electrophoresis (PFGE) and PCR semi-random in five
candidates mapped the position of these movil elements that allow inversion. In
one mutant the insertion is on yafE gene, coding for menaquinone, an important
element in anaerobic respiration in E. coli and Salmonella typhimurium (Neidhardt,
1996) and in the flagellum formation when growth in anaerobic conditions (Hertz y
Bar-tana, 1977). A second mutant transposon is on the fliK gene, responsible for
flagellar hook-length control in E. coli and Salmonella typhimurium (Macnab et al.,
1996). In the third candidate the insertion was on the gene ydgT, a paralogous of
hha in E. coli, belonging to a family of proteins involved in osmo-and thermo-
modulation of the expression of different genes and forms a heteromeric complex
with H-NS or StpA, which binds to a sequence of 26 bp of oriC, optimizing its
activity; also modulate the expression of several bacterial operons, including
virulence factors (Paytubi et al., 2004) as well as pathogenicity island 2 in
Salmonella, involved in contending with the macrophage intracelular enviroment
(Coombes et al., 2005).
3

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

Previous findings made us suspect that the involvement of reactive oxygen
species and/or nitrogen in some mutants could be generating recombinogenic
substrates, decreasing no permissiveness of the region. Therefore we evaluated
the induction of SOS system in the three mutants compared to wild type by
sulA31din-9::MudJ and sulA31din-240::MudJ fusions, however, significant
differences were observed only with the sulA31din-9::MudJ fusion.
Quantified the frequency of events of inversion in the tus- strainand
compared with the wild-type strain. There was a frequency of 26,000 stable
invertants at 1x108 cells/ml (permissive) and 13 unstable rearrangements at 1x108
cells/ml (not permissive), respectively. When we measure the frequency of
inversion in yafE mutant observed 136 stable invertants in 1x108 cells/ml, which is
maintained in the presence of an overload of tus+ gene (330 at 1x108 cells/ml). In
the mutant at fliK is a significant impact when overload of tus+ gene, as it was
observed that the time in which to reach exponential phase is prolonged in
comparison with the wild-type and the other mutants, and, invertans is not present,
this phenotype is reversed to eliminate the overload of tus+ gene (75 stable
invertants at 1X108 cells/ml). Finally, the frequency of inversion in the mutant with
insertion in ydgT (989 invertants at 1X108 cells/ml) is affect with the overload of
tus+ (95 invertants at 1X108 cells/ml), but once you remove the overhead of tus, the
frequency remains low (36 stable invertants at 1X108 cells/ml).
Different scenarios are proposed for the explanation of the observed
phenomenon.

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN
La estabilidad del genoma se compromete constantemente debido a la presencia
de una variedad de agentes, tanto endógenos (hidrólisis, oxidación, alquilación de
las bases del DNA) como exógenos (radiación ionizante, ultravioleta y agentes
químicos) que inducen la generación de cortes en el DNA (Tuteja et al., 2001).
Si el daño genotóxico no es reparado se generan diversos efectos. A nivel
celular, se ha observado apoptosis o senescencia que afecta el desarrollo de los
organismos (Hakem, 2008). Otros de los efectos notables tiene que ver con la
interrupción de procesos biológicos tales como la replicación del DNA, lo cual
genera rearreglos cromosómicos tales como amplificaciones, deleciones e
inversiones, lo que lleva a la pérdida de estabilidad genómica (Courcelle et al.,
2003), y que tiene como consecuencia, por ejemplo, en el caso del humano a la
predisposición a desórdenes neurológicos, inmunodeficiencia y cáncer (O’Driscoll
y Jeggo, 2006; Subba Rao, 2007; Thoms et al., 2007).
Debido a lo anterior, el genoma se encuentra en equilibrio con fuerzas que
lo inducen a generar rearreglos y que producen variabilidad genética, resultado de
mecanismos de transferencia horizontal, mutación y recombinación (Dobrindt y
Hacker, 2001); y por otra parte, de mecanismos que estabilizan la estructura del
mismo y permiten mantener la organización (Rocha, 2004).
Si bien, la generación de rearreglos genéticos pareciera perjudicial, éstos
también juegan un papel importante en procesos biológicos tales como el
desarrollo (Bostock, 1984), la regulación de genes (Golden et al., 1987; Karmazyn-
Campelli et al., 1989), la formación de anticuerpos (Tonegawa, 1983), la evolución
del genoma (Riley y Anilionis, 1978) y, la replicación y reparación del DNA (Roth et
al., 1994). Estos rearreglos son originados por la recombinación homóloga
intracromosomal de secuencias repetidas directas, como en el caso de las
deleciones, duplicaciones y translocaciones o entre secuencias repetidas
invertidas como en el caso de las inversiones (Roth et al., 1994; Romero y
Palacios, 1997). Estos eventos recombinogénicos cambian la composición del
genoma, en particular las inversiones, que alteran el orden de los genes
rompiendo la sintenia del organismo (Romero y Palacios, 1997), debido a lo
anterior, los rearreglos genéticos difieren de las mutaciones puntuales, ya que los
primeros afectan fuertemente la estructura del cromosoma, impactando a éste
desde el punto de vista evolutivo (Roth et al., 1994).

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

No obstante, varios de los rearreglos estudiados son contra seleccionados y
no se fijan en el genoma; tal es el caso de grandes deleciones o inserciones largas
como amplificaciones (Rocha, 2003). Sin embargo, se han reportado pequeñas
deleciones o duplicaciones asociadas a diversas enfermedades humanas, tales
como el síndrome de oftalmoplegia externa crónica de Kearns-Sayre (Shoffner et
al., 1989), enfermedad de Fabry (Kornreich y Desnick, 1993), angioedema
hereditario (Stoppa-Lyonnet et al., 1990), distrofia muscular de Duchenne (Darras,
1990), así como algunos tipos de cáncer, tales como de seno, pulmón y próstata
(Fenech, 2002).
Es entonces de interés, comprender cuáles son y cómo operan los
mecanismos que estabilizan la plasticidad genómica. Hasta ahora, los estudios se
han centrado en la descripción de los mecanismos de reparación del DNA; se
sabe que las lesiones en el DNA pueden ser removidas por reparación (reparación
por excisión de bases, excisión de nucleótidos, de mismatch, reparación de dobles
cortes) o reemplazadas por recombinación (recombinación homóloga,
recombinación no homóloga). Sin embargo, poco se sabe de los sistemas que
evitan o limitan los rearreglos, una vez que se han generado sustratos
recombinogénicos por rompimiento del DNA (Kowalczykowski et al., 1994).
Se han reportado evidencias de estabilidad genómica; por ejemplo, la
presencia de genomas sinténicos a pesar de tiempos evolutivos considerables, tal
es el caso de la sintenia entre Salmonella typhimurium y Escherichia coli. Ambas
especies provienen de un ancestro común del cual divergieron aproximadamente
hace 150 millones años (Ochman y Wilson, 1987) y, pese a que sus secuencias
de DNA difieren en su contenido de GC en un 10 a 20% y a que sus mecanismos
recombinogénicos están activos, sus genomas poseen un mapa sinténico casi
idéntico, con la excepción de una inversión en E. coli que abarca el 15% del
cromosoma en la región terminal de la replicación que incluye al operón de
triptófano (Lawrence y Ochman, 1998).
Esta conservación es particularmente interesante considerando que los
rearreglos genéticos ocurren en el laboratorio frecuentemente, y que las
duplicaciones, en particular, son extremadamente comunes (Roth et al., 1994). Sin
embargo, éste es un fenómeno general observable en diferentes especies, tanto
en procariontes como eucariontes, lo cual ha revelado que el orden de los genes
se encuentra conservado a lo largo de la evolución.

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Entre otros, se ha descrito el intervalo histidina-triptófano (his-trp) en
Salmonella enterica como no permisivo para la generación de inversiones (Segall
et al., 1988; Segall y Roth, 1989, 1994; Miesel et al., 1994; Sandler et al., 1996).
Fue este intervalo (his-trp) el que se empleó como modelo en el siguiente trabajo,
para buscar genes adicionales a tus, involucrados en las restricciones para la
inversión de esta región del cromosoma bacteriano, para lo cual se realizó
mutagénesis generalizada através de eventos de inserción de transposones
(Ruvkun y Ausuble, 1981; Way et al., 1984; Kukrul et al., 1987; Elliot y Roth, 1988;
Hughes y Roth, 1988; Kleckner et al., 1991, 1977; Hillen y Berens, 1994; R.
Camacho, comunicación personal).
Se considera que los mecanismos encontrados, de ser generales para otros
organismos, incluidos el hombre, pudiera tratarse de un conocimiento útil para
comprender ciertas patologías en áreas del cáncer, la toxicología ambiental y la
teratogénesis, por citar algunas.

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CAPÍTULO II. ANTECEDENTES

2.1 Definiciòn y propiedades de los rearreglos genómicos

Los rearreglos genómicos son originados mediante recombinación homóloga,
entre secuencias repetidas directas, como en el caso delas deleciones,
duplicaciones y translocaciones y secuencias repetidas invertidas, como las
inversiones (Roth et al., 1994; Romero y Palacios, 1997) (Figura 2.1). Las
secuencias repetidas pueden estar localizadas en el mismo cromosoma
(intracromosomal) o en cromosomas hermanos (Roth et al., 1994).
Las deleciones y duplicaciones pueden formarse mediante un intercambio
completo en un solo evento (reincorporación de ambas secuencias flanqueantes)
entre secuencias repetidas directas localizadas en cadenas hermanas (Figura 2.2
y 2.3, izquierda), mientras que un intercambio parcial (un par de secuencias se
reincorpora, el otro par de extremos es degradado) es suficiente para hacer los
dos tipos de rearreglos por separado (Figura 2.2 y 2.3, izquierda) (Roth et al.,
1994). Una deleciòn puede formarse tambièn (en un principio) por un intercambio
intracromosomal parcial entre dos secuencias repetidas (Figura 2.3, derecha), lo
que puede generar una deleción y un fragmento linear, en caso de un intercambio
completo, pueden formarse tanto una deleción y un fragmento circular libre (Roth
et al., 1994).

Figura 2.1 Formación de los
rearreglos genómicos. Se
muestra el segmento de un
cromosoma silvestre en donde
la línea gruesa señala la región
afectada por cada uno de los
rearreglos: una deleción
designada por una cuadro, la
cual genera una nueva
secuencia; una duplicación, en
donde se observa una nueva
secuencia en el punto de unión;
finalmente, se describe una
inversión, la cual no genera
pérdida o ganancia de material
sino la creación de una nueva
secuencia (Roth et al., 1994).

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Cuando se generan duplicaciones en tandem (grupo), pueden ser
inestables, es decir, el intercambio entre cadenas hermanas entre diferentes
copias de los segmentos repetidos pueden regresar al cromosoma como estado
haploide (o generar una amplificación) (Konrad, 1969; Rocha, 2003); por otro lado,
las duplicaciones per se pueden perderse debido al tamaño del segmento
duplicado, ya que son regiones largas, asi como por el intercambio entre los
segmentos repetidos en un cromosoma individual (Figura 2.3, derecha). La
frecuencia de estos eventos es de 1% por generación (Roth et al., 1994).
Las inversiones pueden generarse de diversas formas y es un evento más
demandante que los anteriores. La forma más simple es un intercambio
intracromosomal completo entre secuencias repetidas en orientación invertida; en
este intercambio ambas secuencias flanqueantes deben ser reintegradas (Figura
2.1, 2.2 y 2.4, izquierda). La otra posibilidad implica una serie de intercambios
parciales que ocurren simultáneamente o secuencialmente mediante la interacción
de cromosomas hermanos (Figura 2.4, derecha). Los eventos anteriores fueron
apoyados por los estudios de Smith y colaboradores (1991, 1987), donde
generaron inversiones mediante recombinación homóloga entre secuencias
repetidas en orientación invertida (ambas secuencias de 1.4 kb) empleando
bacterias y derivados del fago lambda.

Figura 2.2 Ejemplos de eventos de
intercambio recíproco y no recíproco. A).
Un intercambio no recíproco (intercambio
parcial) une un par de marcadores, pero
no une el segundo par, de tal forma que
sólo se recupera una recombinante con
una dúplex. Un intercambio recíproco
involucra intercambio en ambas
secuencias flanqueantes (intercambio
total), por lo tanto se recuperan dos
recombinantes con dúplex. B). Un
intercambio no recíproco entre repetidos
en orden directo en cromosomas
hemanos pueden formar una
recombinante con una deleción o una
duplicación C). Un intercambio recíproco
entre repetidos en orden invertido puede
formar una inversión del material que
interviene. (Miesel et al., 1994)
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Estos estudios le permitieron detectar intercambios completos por lo que
propuso que su formación está asociada principalmente a la ruta de
recombinación RecBCD, así como a procesos de replicación (Smith GR, 1989).

Los rearreglos tienen importantes implicaciones de carácter evolutivo; las
deleciones pueden remover múltiples funciones y tienen un carácter irreversible;
las duplicaciones pueden por ejemplo, amplificar la región codificadora de un gen,
de ahí que sean consideradas como reversibles y como un “estado regulatorio”
que permite disminuir la presión de selección de uno o varios genes que pueden
modificar su tasa de evolución; en tanto que las inversiones cambian la orientación
de una secuencia en el cromosoma, interrumpiéndola en sólo dos puntos, son
irreversibles, aunque se ha reportado que pueden ser reversibles a una menor
frecuencia que las amplificaciones (R. Camacho, datos personales) y que pueden
modificar drásticamente la sintenia del genoma.
Figura 2.3 Intercambios desiguales involucrados en la formación de duplicaciones y deleciones. Arriba se
muestra la región de un cromosoma silvestre con pequeñas secuencias repetidas. Los eventos
esquematizados a la izquierda son intercambios entre cromosomas hermanos que forman una duplicación o
deleción entra las secuencias repetidas. A la derecha, intercambios intracromosomales que forman una
deleción o segregan una duplicación (Roth et al., 1994)

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2.2 Formaciòn de los rearreglos genómicos: papel del sistema
RecBCD en la formación de la inversión
Dependiendo del tamaño de las secuencias involucradas en el proceso de
recombinación, los rearreglos genómicos pueden clasificarse en dos grupos;
aquellos cuya formación es dependiente de RecA y los que son independientes de
RecA (Roth et al., 1994). RecA es una proteína que promueve el apareamiento
homólogo e intercambio de cadenas, esencial en los eventos de recombinación
homóloga (Kowalczykowski et al., 1994). Cuando las secuencias repetidas
homólogas son grandes (kilobases en longitud), la recombinación es llevada a
cabo por la proteína RecA (como es el caso de las duplicaciones y deleciones); sin
embargo, cuando involucra secuencias repetidas pequeñas (100pb a 1kb) los
intercambios ocurren mediante mecanismos independientes de RecA (Roth et al.,
1994).
Estudios previos han demostrado que la formación de inversiones es
llevada a cabo principalmente por la ruta de recombinación RecBCD (en intervalos
permisivos) (Mahan y Roth, 1989; Clark y Sandler, 1994; Segall y Roth, 1994;
Galitski y Roth, 1997), el cual requiere un intercambio recíproco entre dos
secuencias en el mismo cromosoma (Figura 2.4 y 2.5). En el caso de los intervalos
no permisivos, los sustratos para iniciar la ruta están ausentes.
Figura 2.4 Intercambios involucrados en la formación de inversiones. Arriba región de un cromosoma silvestre
con un segmento flanqueado por repetidos naturales en orden inverso. En principio, las inversiones pueden
formarse tanto por intercambios intra- o intercromosómicos. A la izquierda de la figura se esquematiza la
formación de una inversión en un único cromosoma circular, el cual requiere un intercambio completo (ambos
pares de secuencias son reintegrados). A la derecha, se describe la formación de una inversión mediante la
interacción de cromosomas hermanos. En éste caso, se requieren dos intercambios, pero intercambios
parciales son suficientes (un par de secuencias flanqueantes son reintegrados) (Roth et al., 1994).

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La enzima RecBCD es una helicasa altamente procesivay una potente
exonucleasa que reconoce DNA de doble cadena y entra a una región de ruptura
doble (Figura 2.6) (Kowalczykowski et al., 1994; Myers y Stahl, 1994). Esta
desenrolla rápidamente el DNA (1kb por segundo) degradando uno o ambos
extremos (Goldmark y Linn, 1972; Roman y Kowalczykowski, 1989; Roman et al.,
1992). RecBCD reconoce y responde a secuencias de DNA específicas llamadas
“Chi” (5’-CTGGTGG-3’). El encuentro con “Chi” atenúa su actividad de
exonucleasa, modificando la degradación 3’- 5’ por 5’- 3’ y convierte a esta
enzima en una recombinasa (Stahl et al., 1990).
La enzima modificada por “Chi” desenrrolla el DNA y, presumiblemente,
promueve la recombinación liberando un sustrato de cadena sencilla requerido
para el intercambio mediado por RecA (Dixon y Kowalczykowski, 1991). Si la
enzima RecBCD es responsable para la formación de la inversión, entonces se
asume que la ruptura de doble cadena y secuencias “Chi” correctamente
orientadas dentro o cerca de las secuencias recombinantes son requeridas para
la formación de la inversión.

Figura 2.5 Modelo para la formación de la inversión mediada por RecBCD. (1) La enzima RecBCD entra
al cromosoma circular a una región con ruptura de doble cadena cercano a las secuencias repetidas
invertidas (flecha). RecBCD degrada el cromosoma hasta que encuentra una secuencia “Chi” en
orientación adecuada. (2) El encuentro con “Chi” atenúa la actividad exonucleasa de RecBCD,
convirtiéndola en una recombinasa. (3) La enzima RecBCD estimulada por “Chi” se mueve hacia la
secuencia repetida donde promueve el intercambio recíproco con el segundo repetido. (4) Formación de
una recombinante que lleva una inversión. El cromosoma tiene un hueco en el sitio de degradación de
RecBCD, el cual es reparado a partir de un cromosoma hermano (la región reparada es indicada por una
línea gris gruesa (Miesel et al., 1994)
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Los intervalos no permisivos pueden presentarse cuando las secuencias
participantes no proporcionan sustratos para RecBCD, tal como sitios de ruptura
doble y/o apropiadas secuencias “Chi” correctamente orientadas (Figura 2.5 y
2.6).

Figura 2.6 Modelo para la iniciación de la recombinación mediada por RecBCD. A). Iniciación del
intercambio en una cepa RecBCD+. La enzima RecBCD reconoce DNA de cadena doble y entra en
una región donde se presenta doble ruptura y se mueve desenrollando y degradando el DNA (las
dos cadenas 3’ y 5’). El encuentro con una secuencia “Chi” frena la actividad exonucleasa debido
quizá a la subunidad RecD (óvalo). RecBC continúa desenrollando el DNA y promueve la
generación de DNA de cadena sencilla que sirve como sustrato para el intercambio de cadenas
mediado por RecA y generar la unión de una molécula intermediaria. (B) en una mutante RecD, la
enzima pierde su actividad exonucleasa y promueve el intercambio cerca del sitio donde se
encuentra la cadena de doble hebra (Kowalczykowski et al., 1994).

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2.3 Hallazgos del papel de la replicación en la recombinación
Se ha reportado la formación de horquillas de replicación en los procesos de
recombinación bacteriana (Kogoma, 1996, 1997; Sandler et al., 1996). Se observó
que mutantes PriA tienen un fenotipo Rec- en la recombinación llevada a cabo por
conjugación o transducción. PriA no es esencial para la replicación pero ensambla
las horquillas en la replicación no programada, ayudando en la constitución del
replicosoma reclutando a la helicasa DnaB.
El hallazgo anterior supone que una proporción de la recombinación de
fragmentos de DNA en el cromosoma se lleva a cabo mediante la generación de
eventos replicativos inducidos por los extremos libres de la cadena en síntesis, y
que los eventos recombinogénicos al emplear la invasión de cadenas puede
disparar la replicación, incluso de manera completa del cromosoma produciendo
dos cromosomas hermanos, uno de ellos con la incorporación recombinogénica
del elemento invasor de cadenas (Smith, 1991).
Esta propuesta recombinogénica-replicativa se complementa con la
observación de que las secuencias “Chi” en E. coli están orientadas en dirección
ori-terminus en una proporción 9:1, con unas 60 copias. Las secuencias “Chi” son
reconocidas por la enzima RecBCD que degrada al DNA que presenta doble corte
de cadenas; cuando la enzima encuentra una secuencia “Chi” orientada
adecuadamente, se detiene la degradación por inactivación de la exonucleasa
RecD, e inicia la liberación del extremo 3’ de la doble cadena de DNA, el cual
actúa como hebra invasora en el proceso recombinogénico (Thaler y Stahl, 1988;
Kowalczykowski et al., 1994; Kuzminov, 1995). Kuzminov (1995) sugirió que la
bacteria repara el daño a DNA por recombinación empleando el procesamiento
del corte de doble cadena del lado más cercano al origen de replicación para
iniciar una nueva horquilla de replicación (proporción 9:1); el otro extremo del
corte es degradado. En el caso de horquillas colapsadas, la nueva horquilla
sustituye a la anterior, reparando el corte doble mediante un intercambio no
recíproco.

2.4 Frecuencia de los rearreglos genómicos en el cromosoma
bacteriano

La medición de las frecuencias de los rearreglos en el genoma presenta
dificultades debido a que los sistemas usados para medirlos no son equivalentes.
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En el caso de las deleciones se ha reportado que son frecuentes cuando ocurren
entre secuencias repetidas largas directas, ésta situación es poco frecuente a
menos que las secuencias repetidas sean colocadas experimentalmente sin que
incluya un gen esencial (Roth et al., 1994), pero no es así en un cromosoma
silvestre donde la presencia de estas secuencias es limitada, probablemente
debido a su letalidad potencial. Esto explica que el tamaño de las deleciones
abarque menos del 1% del cromosoma, representando el 10% de las mutaciones
espontáneas y una frecuencia aproximadamente de 10-6 en una población celular
sin selección (Roth et al., 1994).
Las duplicaciones, por otra parte, no tienen restricción en tamaño y
localización en el cromosoma. De hecho, se han reportando un gran grupo de
duplicaciones en varios loci en el cromosoma de Salmonella (Anderson y Roth,
1981) y se han descrito en casi todas las regiones del cromosoma, con excepción
de la región terminus (Roth et al., 1994), lo que podría reflejar el efecto letal de
tener dos copias de ésta región o la inestabilidad de los eventos. A partir de estos
estudios se ha estimado que la frecuencia de las duplicaciones en una región del
cromosoma es cercano al 10% en una población celular sin selección (Roth et al.,
1994).
Sin embargo, el análisis del impacto de las inversiones en la evolución de
los genomas, presenta dificultades debido a la variedad en los tiempos evolutivos
de divergencia de los genomas entre las diferentes especies, por lo que el valor de
estos eventos no es fácilmente extrapolable para poder realizar generalizaciones.
Como se ha descrito previamente, la formación de una inversión es
mecanísticamente más difícil que el que involucra la formación de una deleción o
duplicación. Se ha sugerido que una inversión requiere la unión de ambos pares
de secuencias que flanquean el sitio que va a recombinar, mientras que no se
requiere un cambio total para la formación de una duplicación o deleción (Roth et
al., 1994). Por lo tanto, es difícil medir su frecuencia debido a que los métodos de
detección dependen de los fenotipos observados y resulta complicado generarlos
en gran escala en un cromosoma silvestre (Roth et al., 1994). De hecho, lacaracterización de mutaciones en diversos operones bacterianos no ha revelado la
disrupción de genes derivado de inversiones, según estudios de Hartman y
colaboradores (1964).
Esto sugiere que el mecanismo para la formación de inversiones puede ser
difícil y que deben existir fuerzas evolutivas mucho más fuertes que aquéllas
asociadas a su formación, es decir al proceso en sí de recombinación (Barton y
Kirkpatrick, 2006).
15

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Debido a lo anterior, la mayoría de los experimentos que se plantean para
el estudio de las inversiones involucra el uso de secuencias colocadas en el
cromosoma. Por lo tanto, no se tiene una estimación de la frecuencia de las
inversiones.
2.5 Evidencias de estabilidad genómica: sintenia entre organismos

La comparación de genomas de especies relacionadas ha permitido determinar el
grado de divergencia estructural entre ellos, definiéndose la sintenia como la
conservación evolutiva de la posición de los genes y su contexto. Conforme más
distancia filogenética se tiene entre dos genomas, menor es la sintenia (Casjens,
1998; Nadeau y Sankoff, 1998).
La presencia de genomas sinténicos a pesar de tiempos evolutivos
considerables, es el argumento central para proponer la existencia de mecanismos
de permanencia de la estructura genómica; tal es el caso de la sintenia entre
Salmonella typhimurium y Escherichia coli. Ambas especies provienen de un
ancestro común del cual divergieron aproximadamente hace 150 millones años
(Ochman y Wilson, 1987) y, pese a que sus secuencias de DNA difieren en su
contenido de GC en un 10 a 20% y que sus mecanismos recombinogénicos están
activos, sus genomas poseen un mapa sinténico casi idéntico, con la excepción de
una inversión en E. coli que abarca el 15% del cromosoma en la región terminal de
la replicación que incluye al operón de triptófano (Lawrence y Ochman, 1998).
Sin embargo, ésto es un fenómeno general observable en diferentes
especies; así, la construcción de mapas genéticos en varias especies bacterianas,
ha revelado que el orden de los genes se encuentra conservado a lo largo de la
evolución. Se ha reportado que entre las especies del género Brucella existe
sintenia con excepción de una inversión de 640 kbp en B. abortus en relación con
otras 5 especies (Michaux et al., 1993; Michaux-Charachon et al., 1997; Jumas-
Bilak et al., 1998); lo mismo se ha observado entre las especies Neisseria
menigitidis y N. gonorrhoeae (Bihimaier et al., 1991; Dempsey et al., 1991, 1995;
Bautsch, 1993; Dempsey y Cannon, 1994; Gaher et al., 1996); Campylobacter
jejuni y C. upsalensis (Chang y Taylor, 1990; Nuijten et al., 1990; Taylor et
al.,1992; Kim et al., 1993; Bourke et al., 1995; Newnham et al., 1996; Karlyshev et
al., 1998); así como en Streptomyces lividans y S. coelicolor, pese a la pequeña
conservación de los sitios de restricción (Kieser et al., 1992; Leblond et al., 1993;
Lin et al., 1993; van Wezel GP et al., 1995; Redenbach et al., 1996); lo mismo se
observa entre Brucella melitensis y B. suis diversos Mesorhizobium (Paulsen et al.,
16

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2002). Lo anterior señala que los mecanismos de estabilidad cromosomal son
generales en las bacterias.
En el caso de eucariontes, la sintenia abarca pequeños grupos de genes;
en plantas por ejemplo, entre la papa y el tomate, los marcadores de DNA
complementario (cDNA) a lo largo de los 12 cromosomas fueron colineales
(Bonierbale et al., 1988).
Algo similar se ha observado en plantas herbáceas, pese a la diversidad en
el tamaño de su genoma y al número de cromosomas (Devos y Gale, 1997; Gale y
Devos, 1998; Keller y Feuillet, 2000), en el caso de la familia de las rosáceas
(familia de plantas y árboles), particularmente entre la subfamilia Prunoideae
(especies leñosas y arbóreas con estípulas pequeñas y caducas: ciruela, cereza) y
la familia Maloideae (especies leñosas y arbóreas con estípulas caducas:
manzanas, peras) se observan largos bloques sinténicos (Dirlewanger et al.,
2004). Domínguez et al. (2003) reportó la existencia de bloques sinténicos entre
Arabidopsis y cuatro especies de dicotiledóneas de tres familias principales:
caryophyllidae, rósidas y asteridae. Los bloques contienen varios loci, sugiriendo
la presencia de rearreglos cromosómicos tales como duplicaciones, inserciones,
deleciones, translocaciones e inversiones.
Szamalek et al. (2006) por otro lado, comparó 11,518 pares de genes que
son semejantes y tienen un antepasado común (genes ortólogos) entre humanos y
chimpance, con el objetivo de detectar regiones sinténicas con pequeños arreglos
y encontró regiones en orden invertido, nueve de los cuales representan micro-
inversiones que abarcan más de tres genes. Estas inversiones fueron confirmadas
por FISH y PCR, las cuales resultaron ser polimórficas: tres en el chimpance y uno
en el humano.

2.6 Impacto de las inversiones en el genoma: importancia evolutiva y
biológica

Los estudios de asociación entre rearreglos cromosómicos y la pérdida de
estabilidad se han llevado a cabo principalmente entre γ-proteobacterias, debido a
la disponibilidad de los genomas secuenciados (Belda et al., 2005) y a su relación
entre ellas, pese a los diferentes tamaños y contenido de genes de sus genomas,
la alta frecuencia de eventos de transferencia horizontal y la existencia de
restricciones para el cambio del orden de los genes (Campo et al., 2004).
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La comparación entre genomas de 30 distintas γ-proteobacterias ha
revelado que las inversiones son uno de los principales rearreglos entre especies
estrechamente relacionadas (Hughes, 2000), éstas son frecuentemente simétricas
alrededor del eje de replicación del DNA (Eisen et al., 2000; Tillier, Collins 2000).
Las inversiones cromosómicas son raras en la naturaleza pero muy frecuente en
el laboratorio (Louarn et al., 1985; Haack y Roth,1995), lo que sugiere la existencia
de presión de selección para mantener la estructura cromosómica original.
Debido a lo anterior, se ha considerado a las inversiones como uno de los
principales motores del cambio en la estructura del cromosoma (Roth et al., 1994;
Liu y Sanderson, 1996; Hughes, 2000). Evidencias posteriores a estas
aseveraciones fueron proporcionadas por Sankoff (2003), quien llevó a cabo
comparaciones entre genomas de especies relacionadas de procariontes y
eucariontes, donde observó varios patrones de rearreglos cromosómicos en
diferentes linajes evolutivos, siendo particularmente interesante la distribución
estadística de secuencias repetidas invertidas. De hecho, se ha considerado que
el primer gran rearreglo cromosómico entre especies fue causado por inversiones
(Eisen et al., 2000; Tillier y Collins, 2000; Zivanovic et al., 2002). Aunque la única
excepción a esta regla se encuentra entre Mycoplasma pneumonie y M.
genitalium, en donde la comparación entre sus genomas detectó varias
translocaciones y no inversiones (Himmelreich et al., 1997).
De esta manera, las inversiones cromosómicas se han encontrado como
diferencias fijas entre especies y como estructuras polimórficas intraespecie, tanto
en grupos de animales como de plantas (Kirkpatrick y Barton, 2006). Ejemplos de
las ventajas biológicas obtenidas debido a la presencia de inversiones, se han
encontrado en diversos organismos. Bacteroides fragilis, una bacteria oportunista,
presenta una elevada tasa de variación antigénica en los componentes de
superficie de su pared celular (Parkhill et al., 2005). Los mecanismos que generan
esta variabilidad antigénica se desconocían, hasta que se obtuvo la secuencia
completa de su genoma, en donde se observaron inversionesgenómicas en las
secuencias llamadas fix, correspondientes a su región promotora, las cuales
puede presentarse en dos orientaciones alternativas. Experimentalmente se pudo
sugerir que dependiendo de la orientación en la que se encuentre el promotor, se
da la expresión de los distintos polisacáridos y que ésta pudiera ser dependiente
de las condiciones ambientales en las que se encuentre este organismo dentro del
intestino para evadir el sistema inmune (Cerdeño-Tárraga et al., 2005).

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Pseudomona aeruginosa, una bacteria oportunista responsable de la
fibrosis quística en pulmón, emplea la inversión entre elementos móviles (IS,
secuencias de inserción) para el silenciamiento de antígenos y para generar una
elevada tasa de hipermutabilidad, que le permite adaptarse al huésped (Kreese et
al., 2003). Recientemente se reportó que Mycoplasma penetrans, una bacteria que
infecta humanos, presenta variabilidad en su superficie antigénica debido a un
evento de inversión en la región promotora del gen mpl, que codifica la
lipoproteína P35 (Kenri et al., 2003), para la cual existen en Mycoplasma
penetrans 38 genes, cada uno con una secuencia promotora invertible.
En eucariontes, en particular en los genomas de cloroplastos de las células
vegelates, se ha reportado la presencia de extensas y pequeñas inversiones. En la
familia de las asteráceas se caracterizaron dos inversiones en el DNA del
cloroplasto, una extensa de 22.8 kb ubicada entre los genes trnC-GCA y rpoB y
una pequeña de 3.3 kb dentro de una inversión de 22.8 kb, entre los genes trnE-
UUC (Figura 2.7) mediante alineación comparativa de secuencias (Kim Ki-Joong
et al., 2005). La idéntica distribución filogenética de las inversiones en las
Asteráceas reveló que esta es una característica importante para definir a los
miembros de la familia, la cual ocurrió simultáneamente o dentro de un pequeño
periodo de tiempo después del origen de la familia. Mediante el uso del reloj
molecular, basándose en las secuencias de seis subunidades de NAD(P)H,
NAD(P)H deshidrogenasa y de la subunidad de la ribulosa-1,5-bifosfato
carboxilasa/oxigenasa (rbcl), estimaron que el origen de las inversiones ocurrió a
medianos del Eoceno (42–47 MYA) (Kim Ki-Joong et al., 2005).

Kim y Hae-Lim (2005) reportaron la presencia de pequeñas inversiones
entre 5-50 pb en el genoma de cloroplastos de monocotiledóneas y dicotiledóneas.
Estos rearreglos son poco frecuentes en plantas terrestres a diferencia de las
extensas inversiones y se localizan a 100 pb hacia abajo de la región 3’ de los
genes. La presencia de los eventos favorece la formación de estructuras o loops
en forma de tallo-asa (“hairpin”) que tienen como función estabilizar las moléculas
de mRNA correspondientes (Figura 2.8) y generar, mediante recombinación
intracromosomal orientaciones “flip-flop” en las asas. Además se observaron
inversiones de 11 pb en las regiones no codificadores trnL-F de nueves especies
de Jasmium elegans. Las pequeñas inversiones en secuencias no codificadoras
pueden influir en el alineamiento e interpretación de las reconstrucciones
filogenéticas.
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Figura 2.8 Localización y distribución de una inversión de 11 pb en nueve especies de Jasminum. Las dos
diferentes adhesiones de Jasminum elegans tienen diferentes orientaciones en la estructura del asa. Las dos
formas (A y B) de estructura tallo-asa tienen casi idénticos valores de energía libre (Kim y Hae-Lim, 2005).

Figura 2.7 Mapa genómico comparativo que muestra los dos eventos de inversión en el genoma del
cloroplasto en miembros de la familia Asterácea. Se observa la inversión de 22.8 kb y una de 3.3 kb dentro
de la de 22.8 kb. Las flechas horizontales indican la dirección de la transcripción y las flechas verticales
indican los sitios finales de las inversiones (Kim Ki-Joong et al., 2005)

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En humanos, Stefansson y colaboradores (2005) reportaron la presencia de
una inversión de 900 kb en el brazo largo del cromosoma 17 (17q21.31), una
región que contiene varios genes, incluyendo aquellos que codifican el receptor 1
de la hormona liberadora de corticotropina (CRHR1) y la proteína Tau asociada a
microtúbulos (MAPT). Este evento generó la presencia de dos linajes distintos, el
linaje H1(cromosoma 17 sin la inversión) y el H2 (cromosoma 17 con la inversión)
que son haplotipos de MAPT. Se cree que los linajes H1 y H2 divergieron hace 3
millones de años, sin embargo no hay evidencia de procesos de recombinación. El
linaje H2 es raro en la población africana, poco frecuente en asiáticos pero
presente en europeos, con una frecuencia del 20%, en cuya población la
estructura del haplotipo indica una historia de selección positiva. Además de
revelar la presencia de H2 en la población de Islandia, los resultados de este
estudio mostraron una ventaja en la fertilidad de las mujeres de Islandia, ya que
observaron mayores frecuencias de recombinación (mayor número de hijos) en la
región del cromosoma 17 de las madres que poseen el linaje H2 que las del linaje
H1 (Figura 2.9).

2.7 Restricción para la generación de inversiones en el cromosoma
Gran parte de los trabajos sobre formación de inversiones ha involucrado el uso
de secuencias bien caracterizadas en orden inverso, ubicadas en posiciones
conocidas del cromosoma para observar su recombinación (Segall y Roth, 1989,
1994). Se ha observado que secuencias colocadas en orden inverso en algunos
sitios del cromosoma (sitios permisivos) recombinan para formar inversiones,
mientras que las mismas secuencias en otros sitios (sitios no permisivos) no
forman inversiones, sin embargo, las mismas secuencias en orden directo en los
mismos “sitios no permisivos”, pueden recombinar y formar una duplicación
(Segall y Roth, 1988).
Se han planteado varias hipótesis acerca del fenómeno observado, una de
ellas implica que el producto de la inversión en una región no permisiva genera
letalidad, pero los estudios de Miesel et al. (1994) plantean que no es así; ya que
se puede forzar la inversión mediante técnicas de transducción de dos fragmentos
simultáneos en la bacteria. También se ha sugerido que las secuencias que
flanquean las secuencias que recombinan pueden mostrar restricción para la
formación de las inversiones. Sin embargo, Mahan y Roth (1991) revelaron que no
son las secuencias que flanquean a las secuencias que recombinan las que
determinan la inversión, sino el material genético presente dentro del intervalo
cromosomal. La hipótesis alterna es que existe un mecanismo que evita la
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formación de las inversiones en ciertas regiones del cromosoma pero no en otras
y que en estas últimas no es un efecto de letalidad el que lo impide sino otro tipo
de restricción.

Figura 2.9 Polimorfismo por inversión de un segmento de 900 kb en el locus 17q21.31. La construcción de la región
se hizo usando clonas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC clones, en cuadros verdes). El cromosoma H2 es
estructuralmente diferente. En particular la región entre los marcadores DGS17S332 223 y DG17S161 215 (en
cuadros) está invertida en el cromosoma H2 en relación con el cromosoma H1. LCR: (Low-copy repeats; repetidos de
baja copia); MAPT: (Microtubule-associated protein Tau; proteína Tau asociada a microtúbulos); NSF (N-
ethylmaleimide-sensitive factor gene; ATPasa en células eucariontes)(Stefansson et al., 2005).

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2.8 Formación de inversiones usando secuencias repetidas largas
Para explorar la formación de inversiones en el cromosoma se ha reportado la
inserción de secuencias homólogas con alelos mutantes en diferentes partes del
cromosoma, para que al generar la inversión por recombinación, se restaurara
una copia funcional (Konrad, 1977; Zieg y Kushner, 1977; Mahan y Roth, 1988;
Segall et al., 1988; Segall y Roth, 1989; Mahan et al., 1990). Los ensayos
emplean secuencias lac y las recombinantes obtenidas (lac+) fueron resultado de
eventos de intercambios completos, dobles intercambios o conversión génica.
Sin embargo, empleando la posición normal del locus lac no se logró aislar
inversiones, por lo que se colocó en sitios diferentes del cromosoma (Konrad,
1977; Zieg y Kushner, 1977), lo cual reveló que en E. coli como en Salmonella, la
posibilidad de formar una inversión depende de la posición de las secuencias
recombinantes en el cromosoma (Rebollo et al., 1988; Segall et al., 1988).
Adicionalmente, estos estudios reportaron un hallazgo interesante: la función de
RecBCD en la formación de inversiones; sin embargo para varios intervalos, el
efecto en la mutación RecB redujo de 3 a 1000 veces la frecuencia de inversión
(Mahan y Roth, 1989), suprimiéndose el fenotipo por la presencia de
transposones activos, debido a que su presencia genera rupturas que pueden ser
utilizados como sustratos por la enzima RecBCD.

2.9 Formación de inversiones usando secuencias repetidas pequeñas
Schofield et al. (1992), examinaron la formación de una pequeña inversión de
800pb, comprendida entre los genes lacI y lacZ, ambas con una secuencia
invertida repetida de 12-23pb y colocadas en un plásmido F’, en el cual obtuvo
recombinantes Lac+ con una frecuencia de 10-7 en una cepa silvestre, pero ésta
se redujo 1000 veces por una mutación en los genes recA y recC. Lo anterior
reveló nuevamente el papel del sistema RecA y RecBCD en los intercambios
entre homologías extremadamente pequeñas. Dado que la enzima RecBCD
reconoce dobles rupturas en el DNA, la observación de la dependencia del
sistema en eventos de inversión utilizando secuencias pequeñas y largas, hace
pensar en el origen de las rupturas, ya que cuando se usa el plásmido F’, las
rupturas pueden generarse cuando hay apareamiento entre las células F’ (Roth et
al., 1994).

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2.10 Características del modelo: restricción para formar la inversión
en el intervalo his-trp en Salmonella typhimurium
El modelo que empleamos aquí en Salmonella typhimurium permite el estudio de
la recombinación iniciada por cualquier lesión en el DNA, evaluando intercambios
recíprocos entre secuencias homólogas en orden invertido (inversiones) que se
encuentran separadas en el mismo cromosoma. Asume que la replicación
involucrada en la recombinación, está sujeta a funciones de terminación de la
replicación que involucra a los sitios ter y a la proteína Tus (Miesel, 1994).
La sintenia entre Salmonella typhimurium y Escherichia coli se ha
preservado a lo largo de 150 millones de años de separación evolutiva (Ochman y
Wilson, 1987) y, pese a que los sistemas de recombinación homólogos que
pueden dar como resultado rearreglos genómicos en las diferentes regiones del
cromosoma son operantes, estos organismos presentan un mapa genómico casi
idéntico (sintenia), evidenciando la presencia de mecanismos que mantienen la
estabilidad genómica (Segall et al., 1988). Se tienen ejemplos claros de regiones
en las cuales los eventos de inversión están prohibidos (his-trp) ó permisivos (his-
nadA) (Figura 2.10). En el intervalo his-trp se ha descrito que la mutación null del
gen tus modifica este fenotipo a permisivo (Miesel et al., 1994; Sandler et al.,
1996; JR. Roth, comunicación personal). La proteína Tus se une a los sitios “ter”,
del cual hay varias copias, como por ejemplo el que se encuentra dentro del gen
amyA, e inhibe el paso de la horquilla de replicación en un sentido (Hill et al.,
1989).

Figura 2.10 Zonas permisibles
(líneas sólidas) (nadA) y no
permisibles (líneas
discontinuas) (his-trp) para
inversión en el cromosoma de
Salmonella typhimurium. Se
muestra el intervalo en estudio
histidina-triptófano (his-trp), el
cual es no permisivo para
inversión. La mutación en el gen
tus, localizado cerca de la
región de término de la
replicación, genera la
permisividad (Roth et al., 1994).

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2.11 Papel de los sitios “ter” y la proteína Tus en la inversión
La mayoría de las horquillas de replicación terminan cerca del sitio “dif”, donde el
sistema XerCD efectúa la recombinación sitio específica que resuelve los dímeros
circulares y los cromosomas concatenados (Bird et al., 1972; Hill, 1997). Esta
región puede contener características críticas para la partición de los cromosomas
en las células hijas (Masters y Broda, 1971; Louarn et al., 1987) (Figura 2.11).

Figura 2.11 Localización intracelular del origen y término de la replicación durante la división celular y
modelo de la división cromosómica en E.coli. (A) Células en duplicación en un tiempo de 60 minutos. Un
origen de replicación (círculo verde) en el cromosoma es localizado cerca de la orilla de un nucleoide. Una
copia del segmento replicado permanece en la misma posición, mientras que la otra migra en la orilla
opuesta, donde se localiza el término de replicación (círculo rojo). Después, el término de replicación
migra a la mitad de la célula. La distancia entre el origen y el polo celular más cercano es constante
durante el ciclo de división celular, pese a la elongación celular. Un ciclo de replicación celular es
completado y el término es duplicado a la mitad de la célula. Se forma un septum, resultando en nuevas
células que tienen un término de replicación localizado en el borde del nucleoide, cerca de un polo nuevo
creado por división celular. Regiones en blanco y gris indican espacios citosólicos y nucleoides. (B).
Modelo de separación de cromosomas hijos. Los patrones de migración específicos del centrómero-oriC
(círculo verde) y término (círculo rojo) se muestran en la célula durante el ciclo de división celular. Las
flechas pequeñas indican el doblado del cromosoma y el sitio de división celular, respectivamente.
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Se ha postulado que los sitios “ter”, cuando están orientados
adecuadamente y ocupados por la proteína Tus, favorecen que las horquillas de
replicación terminen sincrónicamente en el sitio “terC” en terminus. Las horquillas
de replicación se mueven libremente a través de los sitios “ter” en una dirección,
pero son bloqueados en la orientación opuesta y están orientados de manera tal
que permiten el paso de las horquillas provenientes del origen, en dirección a la
región término en la zona “dif” (Kuempel et al., 1988). Kuempel et al. (1991) y
Louarn et al. (1996) han sugerido que las horquillas que pasan el sitio “dif”, son
detenidas por los sitios “ter” del lado opuesto del cromosoma, por lo cual se
propone que los sitios “ter” coordinan el encuentro de las horquillas de replicación
bidireccionales de la bacteria, en una región cercana al sitio “dif”, donde se
encuentra la maquinaria para segregación y partición del cromosoma. Esto se
apoya en el hecho de que la mayoría de los sitios “ter” se encuentran en la mitad
del cromosoma más cercana al sitio “dif”.

2.12 Características de lossitios “ter”
Los sitios “ter” son secuencias de 23 pb localizadas en la región término de
la replicación (Roecklein y Kuempel, 1992). Poseen una región altamente
conservada con residuos de guanina en la posición 6, y una región rica en
adenina/timina en la posición nueve de 11 nucleótidos (Tabla 2.1). La orientación
de las secuencias “ter” es asimétrica (Figura 2.12), ésta característica a permitido
sugerir que es una región clave para la unión y actividad de Tus.
Cada uno de los sitios es específico para el arresto de las horquillas de
replicación, que vienen tanto en sentido de las manecillas del reloj como en
sentido contrario de las manecillas del reloj. De esta manera los sitios “ter”
funcionan de una manera polar, esto es, los sitios “ter” detienen la horquilla de
replicación en una dirección, pero no en la dirección contraria. En Escherichia coli
se han localizado siete sitios “ter” (TerA-TerG). TerB, TerC, TerF y TerG se
encuentran en posición para deterner a la horquilla de replicación en sentido de
las manecillas del reloj y TerA, TerD y TerE en posición para detener a la horquilla
que viene en sentido contrario a las manecillas del reloj (Figura 2.12) (Hill et al.,
2005).
Existen evidencias para la existencia de sitios “ter” adicionales. Francois et
al. (1989) identificaron diez diferentes fragmentos cromosomales con homología a
la secuencia TerA. También se han encontrado en plásmidos de E. coli, por
ejemplo en el R6K (Germino y Bastia, 1981) y en miembros del grupo de
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compatibilidad IncFII, tal como R100 y R1 (Hill et al., 1988). Al igual que en el
cromosoma de E. coli, éstos sitios “ter” dependen también de la proteína Tus.

Tabla 2.1 Secuencias de nucleótidos de
sitios ter presentes en E.coli, Salmonella
typhimurium y plásmidos. Los pares de
bases que interaccionan con la proteína Tus
se indican en un cuadro. La orientación en la
que se muestran las secuencias, indican
que la horquilla de replicación que se
aproxima de lado izquierdo es bloqueada,
mientras que las horquillas que entran del
lado derecho no son bloqueadas (Hill et al.,
2005).

Figura 2.12 Posición de los sitios ter y el gen
tus en el cromosoma de E. coli. Todos los
sitios “ter” (Ter A, TerB, TeC, TerD, TerE,
TerF y TerG)están orientados de tal forma
que las horquillas de replicación pueden
viajar en dirección origen-terminus, pero no
en dirección opuesta. El gen tus está debajo
de TerB (Hill et al., 2005).

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Los sitios “ter” identificados a la fecha están localizados principalmente en
regiones intergénicas, donde la actividad transcripcional es baja. Además, la
orientación de los sitios “ter” que bloquea la horquilla de replicación, también frena
la actividad de la RNA polimerasa, de ahí que se sugiere que tenga un papel
importante en la inhibición de la transcripción (Roecklein y Kuempel, 1992). De la
misma forma, si la orientación del sitio “ter” es permisiva para la transcripción,
como ocurre con el sitio TerF en el gene rcsC, la función de la RNA polimerasa
podría no ser afectada y ésta podría incluso desplazar a Tus, posiblemente
reduciendo la efectividad de unión al sitio “ter” (Sharma y Hill, 1992).

2.13 Características del gen tus
Mediante deleciones de la región TerB, se observó que el sitio TerA, a una
distancia de 350 pb también se inactivaba; sin embargo, la introducción de un
plásmido portador de la región intermedia restaura la actividad en TerA, sugiriendo
la existencia de un factor trans-activador codificado por un gen en la vecindad de
TerB necesario para detener la horquilla de replicación. El nombre de éste gene es
tus (terminus utilization substance) (Kobayashi et al., 1989).
El gen tus se encuentra a 11 pb por debajo del sitio TerB (aproximadamente
en el minuto 37) (Figura 2.13). Tanto el sitio de unión al ribosoma (RBS) y la
región promotora -10 se traslapa a TerB, lo cual sugiere que la transcripción del
gen es regulada por la unión de Tus a ésta secuencia de reconocimiento
(Kobayashi et al., 1989) (Figura 2.13).
Generalmente en la célula están presentes menos de 100 copias de la
proteína Tus (Natarajan et al., 1993). Este bajo nivel de expresión es debido a
varias características de la región del gen tus. Primero, el principal promotor de la
transcripción del gen tus que está localizado inmediatamente después de gen,
muestra una baja homología a la secuencia de promotores en E. coli y es
probablemente transcrito a bajo nivel (Roecklein y Kuempel, 1992).
La región que codifica tus tiene dos largos marcos de lectura abiertos
(ORFs) separados por 75 pb, con el sitio TerB situado entre dos ORFs y justo por
debajo del segundo ORF. La inactivación del segundo ORF, inactiva al gen tus, lo
cual correlaciona in vitro con la pérdida de actividad de unión a DNA y con la
pérdida de la detención de la replicación de los sitios “ter” (Hill et al., 1989).

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2.14 Características de la proteína Tus
La secuencia del gen tus corresponde a una proteína altamente básica de 309
aminoácidos y tiene una masa molecular de 35,780 Da, a un pH de 7.5 (Hill et al.,
1994). Está compuesta de un mayor número de residuos de aminoácidos básicos
que ácidos y tiene dos dominios: un amino y un carboxilo (Figura 2.14a). El
dominio amino (residuos 5-174 y 237-282) (Figura 2.14c) consiste de una región
con α-hélice, hoja-β y tres lazos cerca del DNA. Las tres α-hélices (αI, αII y αIII)
forman una hélice antiparalela alineada en paralelo con el DNA (Figura 2.14b). El
lazo L3 (residuos 196-204) entre las dos α-hélices contactan el surco menor del
DNA (Kamada et al., 1996). Por otro lado, las α-hélices IV y V que están
conectadas por una vuelta a través de un esqueleto de DNA, abrazan el esqueleto
de fosfato de ambos surcos. La hoja (βLFIJ), dentro del núcleo amino hidrofóbico
localizado dentro de una hoja-β (βCADKE/βLFIJ, Figura 2.14a) contribuye a la
unión del DNA (Kamada et al., 1996).
Mediante experimentos de filtración en gel se estimó que una proteína
monomérica de Tus puede cubrir aproximadamente 13 pares de bases cuando se
une al DNA en forma B (Hill et al., 1994). Este hallazgo es consistente con los
resultados de protección y los experimentos de “footprinting” (Gottlieb et al., 1992)
en donde se mostró que el contacto DNA-proteína entre Tus y el sitio TerB se
concentró entre una secuencia de 11 pares de bases. Tus se une a TerB en una
relación molar 1:1 (Coskun-Ari et al., 1994) presenta una alta afinidad in vitro
(constante de disociación de 3.4X10-13 M) y la vida media del complejo Ter-tus es
de aproximadamente 550 minutos a pH 7.5 en un buffer que contiene 150mM de
glutamato de potasio (Gottlieb et al., 1992).

Figura 2.13 Relación entre TerB y el
gen tus. Se muestra el gen tus, su
región promotora (-10) y su sitio de
unión a ribosoma (RBS). La proteína
Tus regula la expresión de tus
mediante la unión de la secuencia
TerB y bloquea el inicio de la
transcripción de tus. La secuencia
TerB está encerrada en un cuadro y
las bases que interactúan con Tus
están sombreadas (el gen tus está
justo debajo de TerB) (Dixon et al.,
2005).

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2.15 Características de las mutantes tus
Kamada et al. (1996), investigaron 12 mutantes cuya habilidad para bloquear la
replicación del DNA estaba alterada. Aislaron las mutantes que contenían
substituciones