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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS PARTICIPACIÓN DEL TRANSPORTADOR xCT EN LOS NIVELES DE GLUTATIÓN EN CEREBRO DE RATÓN T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGO P R E S E N T A : ERIK JAVIER CASTILLO PÉREZ DIRECTOR DE TESIS: DRA. MARIA EUGENIA GONSEBATT BONAPARTE CIUDAD DE MÉXICO, 2017 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 Hoja de datos Datos del alumno Castillo Pérez Erik Javier 5513634138 Universidad Nacional Autonoma de México Facultad de Ciencias Biología 310026028 Datos del Tutor Dra. María Eugenia Gonsebatt Bonaparte Datos Sinodal 1 Dra. Patricia Ramos Morales Datos Sinodal 2 Dr. Réne de Jesús Cárdenas Vázquez Datos sinodal 3 Dra. Teresa Imelda Fortoul Vander Goes Datos Sinodal 4 Dra. Regina Dorina Montero Montoya Datos del trabajo Participación del transportador xCT en los niveles de glutatión en cerebro de ratón 60p. 2018 3 Agradecimientos Primero quiero agradecer a la Dra. María Eugenia Gonsebatt, por permitirme integrarme a su grupo de trabajo, así como el apoyo y la asesoría que me dío para mi formación profesional y la culminación de este trabajo. A Pavel Petrosyan agradezco de sobremanera todo el apoyo que me brindaste para prepararme con los conocimientos necesarios para este proyecto y compartir conmigo tantas historia, tantas palabras de aliento y aun en tus momentos más ocupados tomarte el tiempo para checar mi trabajo y ayudarme. a Carlita, Lucio, Daniela, Janikua, Jorge, Angel, Wendy y Viridiana Por todo el apoyo que me brindaron asi como su amistad, consejos y detalles, haciendo de mi estancia en el laboratorio fuera reconfortante. Al Dr. Jorge limón y a Cynthia Navarro gracias por tomarte el tiempo para apoyarme y enseñarme los conocimientos necesarios para la estandarización y el análisis de los PCRs. Vanessa Franco te agradezco todo el apoyo que recibí de tu parte, comenzamos a estar juntos comenzando la carrera y ahorita en la cúspide de la misma quiero que sepas que este logro lo comparto contigo. 4 Dedicatorias A mis padres ustedes fueron la base de todas mis aspiraciones pilares en mi educación y formación como persona, jamas podre dejarles de agradecer cada paso que dieron a mi lado, sé que el camino fue largo, y por momentos parecía no acabar, o tornarse difícil, sin embargo ustedes siempre estuvieron ahí otorgándome su confianza y otras oportunidades que no podría acabar de nombrar, por esto y mucho más quiero decirles que este logro también es de ustedes, LOS AMO Y DE VERDAD GRACIAS POR TODO. A mis hermanos Jessica y Daniel por siempre ser ejemplos de rectitud y sostén emocional, su apoyo y consejos fueron invaluables para mi en diferentes etapas de mi vida, gran parte de mi carácter se lo debo a ustedes entre otras lecciones aprendidas. A los LVs les agradezco en general pero hay 4 amigos específicos que agradezco su amistad, los años, las obligaciones, nuestra variación de prioridades y tipo de desarrollo profesional no han mermado nuestra gran amistad, Alejandro Cervantes, Eduardo Valdez, Giovanni & Alan Zarate crecer a su lado fue extremadamente gratificante y valioso. A Argelia, Victoria y Cota ustedes estuvieron presentes durante la época más dura de mi vida, me brindaron su apoyo, su tiempo y su amistad sin esperar nada a cambio, por lo que mi agradecimiento a ustedes será eterno, y siempre tendrán en mi un amigo. 5 El presente trabajo se realizo en el laboratorio de la Dra. Maria Eugenia Gonsebatt Bonaparte del Departamento de Medicina Genómica y Toxicología Ambiental del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad Nacional Autonoma de México. 6 Índice Abreviaturas______________________________________________________________8 Resumen _______________________________________________________________10 1. Introducción 1.1 Estrés Oxidante _________________________________________________11 1.1.1 Generalidades ___________________________________________11 1.1.2 Radicales libres __________________________________________12 1.1.3 Función de las ROS ______________________________________12 1.1.4 Daño por las ROS _______________________________________13 1.1.5 Antioxidantes. ___________________________________________15 1.2 El Glutatión (GSH) ______________________________________________16 1.2.1 Estructura y función ______________________________________16 1.2.2 Síntesis de GSH _________________________________________18 1.3. Sistema Xc- ___________________________________________________19 1.3.1 Características ___________________________________________19 1.3.2 xCT distribución _________________________________________19 1.4 Sulfasalazina _____________________________________________22 1.5 Acetaminofén __________________________________________________25 1.5.1 Uso normal _____________________________________________25 1,5,2 Metabolismo del AAP_____________________________________25 2 Justificación ___________________________________________________________27 3. Hipótesis______________________________________________________________28 4. Objetivos _____________________________________________________________28 5. Material y Métodos_____________________________________________________29 5.1 Modelos biológicos y tratamiento___________________________________29 7 5.2 Sacrificio y disecciones ___________________________________________29 5.3 Medición de niveles de GSH_______________________________________30 5.4 Extración de RNA _______________________________________________30 5.5 RT- PCR_______________________________________________________31 5.6 PCR tiempo real_________________________________________________32 6. Resultados ____________________________________________________________33 5.1 Niveles de GSH _________________________________________________33 5.2 Integridad del RNA ______________________________________________36 5.3 Efecto sobre el mensajero de xCT y sus inductores. _____________________38 7 Discusión______________________________________________________________43 7.1 Niveles de GSH _________________________________________________43 7.2 Expresión de RNAm de xCT, Nrf2, IkBα y NTrK _____________________46 7.3 Implicaciones de la inhibición de xCT._______________________________47 8.Conclusiones___________________________________________________________50 9. Perspectivas ___________________________________________________________51 10 Referencias ___________________________________________________________52 Anexo I_________________________________________________________________59 8 Abreviaturas ROS: Reactive Oxigen Species (Especies reactivas de oxígeno ) CGS: Enfermedad granulomatosa crónica NO- : Óxido nítrico O2.- : peróxido OH-: Radical hidroxilo O2: Oxígeno molecular GSH: Glutatión reducido GSSG: Glutatión Oxidado EAAC-1: Acarreador de aminoácidos exitatorio LAT: Transportador de aminoácidos tipo L xCT: Transportador Cistina/Glutamato RNAm: Ácido Ribonucleico Mensajero SAS: Sulfasalazina AAP: Acetaminofén ARE: Antioxidant Response Element, Elementos de respuesta antioxidante SNC: Sistema nervioso central Nrf2: Factor Allegado a NFE2 2 IkBa: I-Kappa-B-Alpha NTrk 1: Receptor Neurotropico Tirosina Cinasa. 9 Resumen El glutatión (GSH) es el antioxidante más abundante en el SNC y también, como en otros tejidos, participa en el metabolismo de xenobióticos. Es un péptido formado por 3 aminoácidos, γ-L-glutamato-L-cisteína-L-glicina. La concentración intracelular de cisteína es muy baja por lo que se importa constantemente para la síntesis de GSH. Esta acción se lleva a cabo por un grupo de proteínas transportadoras, entre las que se encuentra xCT. La sulfasalazina es un fármaco que se usa de manera regular en el tratamiento de varias enfermedades de origen inflamatorio o autoinmune, y uno de sus efectos es la inhibición de xCT. En este trabajo, utilizamos un modelo de ratón para evaluar el efecto de la administración aguda de este fármaco, cuando es administrado en conjunto con un compuesto que demanda GSH como el acetaminofen (AAP). Los animales fueron tratados con dosis de 200 mg de SAS, AAP y SAS+AAP la vía de administración fue intraperitoneales, fueron sacrificados 3 horas después. En distintas regiones cerebrales, hígado y riñón se midieron los niveles de GSH y la expresión de mRNA de xCT, Nrf2 (NFE2-Related Factor 2) , IkBa (I-Kappa-B-Alpha) y NTrk 1 (Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinease 1). Observamos que el tratamiento con SAS disminuyó los niveles de GSH en hipocampo y estriado (p<0.05), mientras que el tratamiento con AAP redujo los niveles de GSH en hígado y a su vez aumentaron los niveles de GSH en riñon . Cuando se administraron SAS y AAP, no encontramos un efecto sinérgico. Los niveles de mRNA de xCT mostraron una disminución significativa en la corteza con todos los tratamientos y un aumento en hipocampo con SAS y SAS+AAP sugiriendo que se indujo una respuesta antioxidante en esta última región, sin embargo no hubo aumento en la transcripción de Nrf2, IkBa y NTrk 1, por lo que concluimos que el estriado y el hipocampo tienen una 10 dependencia mayor a la toma de cisteína por el sistema xCT; el hipocampo es el que responde de una manera más clara. Además la sulfasalazina no tiene un efecto inmediato en órganos como el hígado o riñón y estas 2 sustancias no actúan de manera sinérgica, ya que si bien afectan los niveles de GSH, lo hacen por vías diferentes en los tejidos examinados. 11 1. Introducción 1.1. Estrés Oxidante 1.1.1 Generalidades. El estres oxidante ocurre cuando la producción de especies reactivas de oxigeno (ROS) supera la capacidad de defensa antioxidante y remoción de ROS de la celula. Estudios epidemiológicos y médicos lo han ligado con el ambiente, dieta y estilo de vida (tales como la exposición a radiacion, metales, plaguicidas, particulas en el aire y fármacos (Fig.1) con enfermedades como cáncer, ateroesclerosis y desórdenes neurodegenerativos, estas condiciones están asociadas con estrés oxidante debido a elevados niveles de ROS o insuficiencia en la desintoxificación de estos mismos.(Limon-Pacheco & Gonsebatt, 2009) Fig. 1 Factores ambientales que inducen la formación de ROS y vías de respuesta antioxidante. (Limon-Pacheco & Gonsebatt, 2009) 12 Todavía hay mucho que aprender sobre cómo lograr un equilibrio apropiado entre el estrés oxidante y los niveles de antioxidantes. No podemos ver o sentir el desequilibrio y la primera advertencia podría ser cuando se presentan síntomas clínicos. Actualmente se hacen investigaciones para entender mejor los impactos del estrés oxidante en enfermedades tales como el asma, enfermedad cardiovascular, parto prematuro,lupus y procesos fisiológicos como el envejecimiento.(University of Michigan 2012) 1.1.2 Radicales libres Un radical libre es un átomo o molécula con uno o más electrones no pareados, ejemplos de éstos son: el óxido nítrico (NO- ), súper óxido (O2- ) y radical hidroxilo (OH-). Aunque el oxígeno molecular (O2) tiene 2 electrones no pareados en dos diferentes órbitas, este no es un radical libre. Sin embargo, reacciona rápidamente con muchos otros radicales, dando lugar a especies que son más reactivas y causan oxidación selectiva de lípidos, proteínas y DNA (Kalyanaraman, 2013) Tanto el metabolismo aerobio como el anaerobio está acompañado por la producción de especies reactivas de Oxígeno (ROS) y Nitrógeno (NOS). Los organismos desde los procariontes hasta los mamíferos han desarrollado elaborados y redundantes complejos de defensa que confieren protección contra este tipo de daños. Los datos también indican que las ROS a bajas dosis cumplen funciones de señalización en eventos como división celular, producción, migración, contracción y regulación (Janssen-Heininger et al., 2008). 1.1.3 Funciones de las ROS A bajas dosis las ROS participan en la señalización celular, es importante tener en cuenta que la generación de ROS es una consecuencia de la vida aeróbica sin embargo el la vida 13 anaerobia también se presentan aunque en menor proporción, se han integrado en vías de transducción de señales, la defensa contra microorganismos invasores y de la expresión génica a la promoción del crecimiento o la muerte (Li, Hong, Tan, Wang, & Feng, 2016). Las ROS también pueden proceder de cambios adaptativos para responder a diferentes estímulos externos o internos y estar asociados a la tumorgenesis, metástasis e inclusive en la generación de resistencia a medicamentos para algunos tipos de cáncer (Song et al., 2017). Los fagocitos (neutrófilos, monocitos, eosinófilos) eliminan a invasores patógenos y defienden al huésped a través de la generación de compuestos oxidantes antimicrobianos como el O2 o O2.- que actúan con la reactividad anteriormente comentada ( Fig. 2). Por ejemplo, la desregulación de procesos que utilizan la producción de ROS, pueden dar como resultado algunos padecimientos como la enfermedad granulomatosa crónica (granulomatous chronic disease) CGS por sus siglas en inglés. Este padecimiento es una mutación hereditaria de la NADPH oxidasa que la hace no funcional. Este desorden genético, afecta la producción de superóxidos y otros reactivos intermediarios en las células fagocíticas del sistema inmunológico, lo que promueve el desarrollo de infecciones y otras complicaciones inmunológicas (Kalyanaraman, 2013). 1.1.4 Daño por las ROS El daño producido por las ROS ocurre generalmente sobre macromoléculas como lípidos, proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos: Peroxidación lipídica: Las membranas celulares están formadas por grandes cantidades de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA por sus siglas en inglés). Estas largas cadenas de 14 ácidos grasos contienen dos o más uniones dobles C-C que son más fácilmente oxidables que los lípidos monosaturados o saturados. Es aquí donde se produce el daño que se conoce como peroxidación lipídica que se ha definido como el deterioro oxidativo de los PUFA (Halliwell and Gutteridge, 2007). Esto afecta a las estructuras celulares ricas en ácidos Figura 2 Representación de un fagocito envolviendo en una vacuola a un microorganismo, la NADPH oxidasa se activa selectivamente en la pared de la vacuola, generando superóxido y peróxido de hidrógeno en el lumen vacuolar. Las enzimas son liberadas a partir de vacuolas de des granulación de gránulos citoplasmáticos. Obtenido y modificado de Kalyanaraman, 2013. grasos poliinsaturados, como la membrana celular, el retículo sarcoplásmico, los organelos citoplásmáticos, etc. Este daño puede alterar la permeabilidad de la membrana celular produciendo edema y muerte celular. Proteínas: En estas moléculas los aminoácidos como fenilalanina, tirosina, histidina y metionina sufren oxidación. Además, se forman entrecruzamientos de cadenas peptídicas, y 15 formación de grupos carbonilos. Muchas veces, esto ocasiona la pérdida de su conformación tridimensional, función, o capacidad de acoplamiento con los sustratos. Ácidos nucleicos: La oxidación de las bases pueden dar lugar a mutaciones e iniciar procesos de carcinogénesis, porque dan lugar a pérdida de expresión de genes supresores de tumores o por lo contrario, a la expresión de oncogenes. Además, pueden ocurrir delecciones, fragmentaciones, interacciones estables ADN-proteínas, reordenamientos cromosómicos y desmetilación de citosinas del ADN, lo que modula la expresión de algunos genes (Gutiérrez 2002). 1.1.5 Antioxidantes. Los organismos aerobios sobreviven en presencia de oxígeno solo porque tienen defensas antioxidantes. Los antioxidantes pueden ser sintetizados por el organismo o tomado del ambiente como por ejemplo la dieta (Halliwell and Gutteridge 2015). Un antioxidante es cualquier sustancia que, aún cuando presenta una baja concentración comparado con un sustrato oxidable, retrasa o previene significativamente la oxidación de dicho sustrato, o cualquier sustancia que retrasa, previene o remueve el daño oxidativo de una molécula (Halliwell and Gutteridge 2015). Las estrategias de defensa antioxidantes incluyen: -Agentes que catalíticamente remueven las ROS -Agentes que controlan la formación de ROS - Agentes que protegen biomoléculas contra daño oxidante u otros procesos -“Agentes sacrificables” que preferentemente reaccionan con ROS y detienen el ataque a otras biomoléculas más importantes, por ejemplo el glutatión (GSH) -Reacciones que dan como resultado moléculas citoprotectoras (Halliwell y Gutteridge 2015). 16 1.2 El Glutatión (GSH) 1.2.1 Estructura y función El GSH es un péptido que consta de 3 aminoácidos: c-L-glutamato-L-cisteína-L-glicina, (Fig. 3). Es el antioxidante celular más abundante y participa en el metabolismo de xenobióticos. Se encuentra presente en todas las células de prácticamente todos los organismos. En los organos de mamíferos, el tejido del hígado es el que cuenta con mayor síntesis y contenido de GSH, contiene entre 7 y 10 mM mientras que la mayoría de los demás tejidos tienen entre 1 y 3 mM. El GSH celular se encuentra (Limon-Pacheco & Gonsebatt, 2009) en 2 formas, como tiol reducido (GSH ) y bisulfuro oxidado (GSSG). El GSH es la forma predominante y existe en concentraciones milimolares en la mayoría de las células (Lu, 2009) . Fig.3 Estructura del glutatión conformado por c-L-glutamato-L-cisteina-glicina. La función principal del GSH (más no la única) es como antioxidante y en la desintoxicación de xenobióticos y/o sus metabolitos. Los compuestos electrofílicos forman conjugados con el GSH ya sea espontáneamente o a través de reacciones catalizadas por las GSH-S transferasas (GSTs). En los hepatocitos las formas conjugadas son comúnmente a través de la bilis. El GSH se oxida a GSSG que puede ser reducido por la GSH Reductasa (Fig. 4) ( Lu, 2009). 17 El GSSG puede ser activamente exportado de la célula por lo que el estrés oxidante severo agota las reservas de GSH si su síntesis no alcanza a compenzar la disminución de la poza celular. ( Lu, 2009). Fig. 4 Metabolismo celular del GSH; síntesis de GSH a partir de los 2 pasos enzimáticos y ciclo de óxido reducción del GSH a partir de la Glutatión reductasa y glutatión peroxidasa (Ramirez et al., 2006). El GSH atraviesa infimamente la barrera hematoencefálica; por otro lado, si bien existen niveles elevados del péptido en la célula, no se ha descrito un sistema de almacenamiento de GSH, por lo que se asume que su presencia celular se debe a la síntesis de novo o su reciclamiento por la glutatión reductasa. Por lo tanto, la célula requiere una biosíntesis 18 constante de GSH para protegerse del daño celular causado por las ROS originadas en la mitocondria por el metabolismo aerobio y demás reacciones metabólicas (Ramos 2016). 1.2.2 Síntesis de GSH. La síntesis de GSH se da en el citosol a partir de los aminoácidos constituyentes y de dos pasos enzimáticos dependientes de ATP. El primer paso en la síntesis de GSH se considera el paso limitante en la velocidad de síntesis de GSH porque depende de la importación de cisteína; este paso está catalizado por la Glutamato- Cisteína Ligasa o γ-glutamilcisteina sintetasa l-glutamato + l-cisteina + ATP c-glutamil-l-cysteine + ADP + Pi En el segundo paso la GSH sintetasa, une la γ-glutamil-L-Cisteina, con la L-Glicina. γ -glutamil-L-cysteina + L-glicina + ATP GSH + ADP + Pi Esta síntesis como anteriormente se mencionó tiene como limitante el primer paso enzimático y este a su vez está limitado por la disponibilidad de cisteína intracelular, la cual no es biosintetizada por la célula, por lo cual debe importarla del medio extra celular (Fig. 4) (Lu, 2009). Los tejidos usan diferentes sistemas transportadores para hacer frente a la demanda intracelular de cisteína. El transporte de cisteína a través de la membrana plasmática está mediada por el sistema ASC (alanine, serine, cysteine-preferring), otro miembro del sistema L (Leucine-Preferring), LAT-1 y 2 (aunque este último solo se encuentra en riñón) (Large Aminoacid Transporter-) (Conrad & Sato, 2012) En células neuronales, EAAC-1 (Excitatory Amino Acid Carrier-1), un miembro del sistema Xag (Transportadores de Aminoácidos sodio independientes con una alta afinidad por el glutamato y el aspartato) contribuye a la toma de cisteína extracelular. Otro sistema 19 para importar cisteína es el sistema Xc- siendo este el transportador más ampliamente encontrado en los mamíferos (Conrad & Sato, 2012) 1.3. Sistema Xc- 1.3.1 Características El Transportador Cistina/Glutamato, también conocido como el sistema Xc-, es un transportador de aminoácidos sistémicos independiente de sodio, dependiente de cloro, que en condiciones normales, toma cistina extracelular y la intercambia por glutamato intercelular, en una proporción de 1:1. Es un heterodímero que está conformado por dos subunidades, la subunidad pequeña xCT (Conrad & Sato, 2012) también llamada SLC7A11 (Ye et al., 2014), que es la específica y la responsable del intercambio de sustratos y la subunidad grande 4f2hc también llamada CD98/SLC3A2 (Ye et al., 2014), común en otros sistemas de transporte y necesario para el anclaje de xCT en la membrana plasmática (Conrad & Sato, 2012). xCT es la subunidad catalítica del sistema Xc- y transporta al interior de las células cerebrales el amino ácido L-Cys2, forma disulfuro de la L-Cys. La actividad en la entrada de L-Cys2 está acoplada a la salida de L-Glu, por lo que se ha sugerido que su actividad puede ocasionar un aumento extracelular de L-Glu (Lau & Tymianski, 2010) La expresión de Xc- es inducida por varios estímulos, incluidos estrés oxidante, privación de aminoácidos, presencia de lipopolisácaridos bacterianos, y estrés nitrosante. 1.3.2 Expresión de xCT. El transportador antiporte xCT está ampliamente distribuido en el cerebro. Se encuentra altamente expresado en células endoteliales, ependimales, de la leptomeninges y en los 20 plexos coroideos (Burdo, Dargusch, & Schubert, 2006). El gen que codifica para xCT está bajo el control de factores de crecimiento como NGF el cual responde a receptores como NTRK1 (Indo, 2018), factores de transcripción como NfκB el cual en citoplasma se encuentra formando complejos con algunos inhibidores como IκBs; IκBα, IκBβ, IκBε, and Bcl-3 (Hayden & Ghosh, 2004), que previenen su traslocación al nucleo y Nrf2 el cual es regulado como se observa en la figura 5 son factores nucleares sensibles al potencial óxido- reductor celular (Dringen, 2000) que se unen los elementos de respuesta antioxidante (ARE) presentes en los genes de enzimas o moléculas antioxidantes. También responde a factores como el Factor activador de la transcripción ATF4 (por sus siglas en ingles) el cual reacciona ante la carencia de aminoácidos uniéndose a los elementos de respuesta a aminoácidos (AARE). En ratón, en el promotor del gen xCT hay una región ARE y 2 para AARE (Ye et al., 2014). En humanos encontraron que hay 2 regiones ARE en promotor de xCT, como se muestra en la figura 6 (Ye et al., 2014). Fig.5 Regulación de xCT a través de la activación de NRF2 en presencia de ROS, tomado de (Habib, Linher-Melville, Lin, & Singh, 2015) 21 Figura 6.Analisis del promotores del gen xCT en humanos, donde se indican las zonas ARE y AARE así como su ubicación especifica (Ye et al., 2014) El GSH tiene una alta relevancia en el CNS porque las células del cerebro, en especial las neuronas, consumen altos niveles de oxígeno y tienen bajos niveles de enzimas desintoxificadoras de ROS, haciendo más susceptible a este tipo celular al estrés oxidante, además hay autores que consideran a GSH como un reservorio de glutamato (Dringen, 2000). Estudios sobre el papel fisiológico de xCT sugieren que la inhibición aguda de xCT disminuye el nivel extracelular de L-Glu en la corteza prefrontal y compromete el funcionamiento cerebral, lo que indica que xCT puede participar en la señalización excitadora normal de L-Glu (Lutgen et al., 2014). Así mismo, esta inhibición disminuye los niveles intracelulares de cistína reduciendo la síntesis de GSH. El mantenimiento de los niveles de GSH en células de mamíferos es crítico para la desintoxificación de xenobióticos y la prevención de daño por estrés oxidante, especialmente relevante en el SNC (Bridges, Natale, & Patel, 2012). En el hígado de ratones, xCT no está expresado de manera constitutiva, sin embargo se ha observado que en condiciones de estrés oxidante se induce su expresión (Song et al., 2017) y puede generar un buen aporte de cisteína al hígado. En el hígado este transporte no tiene tanta importancia como en otros tejidos porque cuenta con otras vías de obtención de 22 cisteína tales como la via de la transulfuración, sin embargo, la inducción de xCT parece tener un efecto hepato protector contra el estrés oxidante (Song et al., 2017) Una alta expresión de xCT y glutamato extracelular son comúnmente observadas en células cancerígenas. La proteína de xCT está altamente expresada en las células de glioma, y su expresión está negativamente correlacionada con la supervivencia en cánceres de mama invasivos y carcinomas de células escamosas esofágicas (Habib et al., 2015). Algunos tipos de cáncer agresivos presentan en ocasiones una elevada capacidad antioxidante lo cual se asocia al desarrollo de resistencia a las terapias anticancerígenas que se reciben, por lo que xCT es un blanco farmacológico, para el desarrollo de tratamientos contra diferentes tipos de cáncer. Los principales factores de transcripción asociados a la modulación de la síntesis y expresión de antioxidantes y xCT son Nrf 2 y ATF4 1.4.1 Sulfasalazina La Sulfasalazina (SAS) se desarrolló hace unos 80 años como un fármaco antiinflamatorio. Desde entonces, la SAS ha sido aprobada por la Union Europea y USA Food and Drug Administration y se ha aplicado en ensayos clínicos de poli artritis reumática y en particular para la colitis ulcerosa crónica. La vía de administración permitida es oral y debido a la actividad azoreductora de las bacterias del colon, la SAS se metaboliza a sulfapiridina y ácido 5-aminosalocílico (5-ASA) en el colon, actuando localmente (Sehm et al., 2016) . De manera que una vez que el fármaco se encuentra en el compartimiento sanguíneo encontramos tanto al fármaco original como asus dos metabolitos. 23 La SAS (no metabolizada) puede inhibir la motilidad leucocitaria, la síntesis de IL-1 y la IL-2, inducir la apoptosis de células cancerosas, e inhibir el factor nuclear kappa B (NFκ- B). Estudios recientes indicaron que SAS puede inhibir asimismo, al transportador antiporte de glutamato xCT (Lutgen et al., 2014). Esta inhibición es competitiva (Gout, Buckley, Simms, & Bruchovsky, 2001) La SAS es ampliamente administrada en casos de artritis reumatoide y otros trastornos mediados por inflamación, como la enfermedad de Crohn. Se han reportado varios casos de lesión hepática asociada al tratamiento con sulfasalazina. La lesión hepática inducida por la sulfasalazina podría conducir a la insuficiencia hepática y a la necesidad de trasplante hepático e incluso a la muerte del paciente. Algunas investigaciones también indicaron un deterioro de la función renal después de la terapia con sulfasalazina. La lesión renal inducida por sulfasalazina podría ser potencialmente irreversible. El mecanismo preciso por el que la sulfasalazina induce daño hepático y renal es desconocido, algunas investigaciones apuntan al rol de las ROS y estrés oxidante inducido por este farmaco (Reza et al. 2016) por su capacidad de inhibir xCT y así afectar la síntesis de GSH, haciendo susceptible al órgano al estrés oxidante. Sin embargo otros estudios muestran que el aumento de los niveles de glutamato en el cáncer de hueso (entre otros) es responsable de generar el microambiente necesario para el avance del cáncer así como la síntesis de GSH necesario para el mantenimiento de estas células (Sehm et al., 2016; Slosky et al., 2016) además del dolor producido en el cáncer de hueso, por lo tanto un antagonista del sistema xCT como la sulfasalazina puede tener doble utilidad como terapia complementaria para el cáncer de hueso (Fig. 7; Slosky et al., 2016) y otros cánceres que causan efectos inflamatorios como los gliomas 24 Fig. 7 Efecto de la sulfasalazina en el cáncer de hueso; al inhibir el sistema xCT se evita la liberación del glutamato, lo que ayuda como analgésico y además impide la creación del microambiente propicio para la progresión del cáncer (Slosky et al., 2016). 25 1.5 Acetaminofen 1.5.1 Uso común El acetaminofén (N-(4-hidroxifenil) acetamida) (AAP) o también conocido como paracetamol, es uno de los fármacos más comunes usados en México, EU y el resto de mundo, como antipirético y analgésico siendo muy seguro en dosis terapéuticas, aunque puede tener un efecto hepatotóxico en dosis altas o continuas (Kucera et al., 2017). Actualmente, en México es un medicamento al cual se puede tener acceso sin receta médica y ocupa uno de los principales lugares de ventas en México consumiéndose más de 600 millones de cajas. La sobredosis de AAP es la mayor causa de hepatotoxicidad en Estados unidos y el Reino Unido (Rello, 2015). 1,5,2 Metabolismo del AAP El AAP es usualmente conjugado con ácido glucoronido y sulfato en el hígado, los que son posteriormente excretados. Sin embargo, en concentraciones altas, parte del AAP es metabolizado por el citocromo P450., CYP2E1 el cual oxigena al AAP produciendo N- acetil-p-benzoquinonimina (NAPQI), la cual tiene como resultado formas que se conjugan con GSH, lo que puede llegar a agotar o reducir las pozas de GSH citoplasmáticas y mitocondriales (Song et al., 2017). Esto puede dar inicio a daño mitocondrial, afectar la cadena respiratoria mitocondrial, generando ROS (Fig.8), fragmentación del DNA, necrosis en hepatocitos, entre otras consecuencias. (Song et al., 2017). https://es.wikipedia.org/wiki/Hidroxilo https://es.wikipedia.org/wiki/Fenil https://es.wikipedia.org/wiki/Acetamida 26 Figura 8 Metabolismo del acetaminofén. Un 90% se metaboliza por los glucurónidos y sulfatos. Solo entre el 5 y 10% se metaboliza por el CYP2E1, siendo de gran importancia la presencia del CYP2E1 para el efecto tóxico del AAP 27 2. Justificación El GSH es el antioxidante más importante del SNC, aquí, el transportador xCT es modulado positivamente por la presencia de xenobióticos como el arsénico y fármacos con el AAP (Valdovinos-Flores & Gonsebatt, 2012), probablemente a través de la inducción del factor de transcripción Nrf2. Asimismo, un inhibidor competitivo de xCT, la sulfasalazina se utiliza ampliamente para tratar padecimientos como artritis reumatoide, enfermedad de Crohn y otras inflamaciones crónicas. Dado que el daño oxidante aumenta y se acumula con la edad el uso de este fármaco podría agravar el deterioro neurológico al impactar a un transportador que se expresa ampliamente en el SNC y que su expresión se asocia a la respuesta antioxidante. Es por ello que nos interesa estudiar el impacto de la inhibición de xCT en el SNC en un modelo murino para investigar si su administración se refleja en una disminución de GSH y en una modulación positiva de la respuesta antioxidante en distintas regiones del cerebro, hígado y riñón. 28 3. Hipótesis La sulfasalazina inhibe al transportador xCT y por tanto disminuirá la captación de cisteína afectando la capacidad de síntesis de GSH y por tanto de la respuesta antioxidante de diferentes órganos como cerebro, hígado y riñón. 4. Objetivo general Determinar el efecto de SAS sobre los niveles de GSH en presencia y ausencia de un agente oxidante inductor de la síntesis de GSH, en cerebro, hígado y riñón, 4.1 Objetivos particulares1 Determinar los niveles de GSH en corteza, estriado, hipocampo, cereblo, hígado y riñon , en ratones testigo, tratados con sulfasalazina y con sulfasalazina más AAP. 2 Determinar en los mismos tejidos el efecto de SAS, y SAS+AAP sobre la expresión de mRNA de xCT y su principal inductor Nrf-2 29 5. Material y métodos 5.1 Modelos biológicos y tratamientos El protocolo de investigación fue sometido y aprobado por el CICUAL (COMITÉ PARA EL CUIDADO Y USO DE ANIMALES DE LABORATORIO) del Instituto de Investigaciones Biomédicas. Se utilizaron 20 ratones machos de la cepa Balb-c, de 5 semanas de edad que fueron alimentados ad libitum, bajo condiciones de temperatura y humedad constantes y a periodos de luz/oscuridad de 12 horas. Los ratones fueron proporcionados por la Unidadd de Modelos Biológicos del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad Nacional Autónoma de México. Los animales se dividieron en 4 grupos de 5 ratones cada uno: Al primer grupo se le inyectó SAS 200 mg/kg, al segundo grupo AAP 200 mg/kg, al tercero SAS&AAP 200mg/kg de cada sustancia y un cuarto grupo control que recibió inyecciones del vehículo. La vía de administración, en todos los casos fue mediante inyección intraperitoneal (I.P.), 3 horas posteriores a la I.P.se sacrificaron los ratones. Las soluciones de SAS se prepararon en el momento, y se disolvio en DMSO ya que la sulfasalazina es hidrofóbica, entonces utilizamos el DMSO como vehículo. Llas soluciones de AAP se prepararon al momento con solución salina, a los grupos controles solo se les inyectó el vehículo (DMSO y solución salina). 5.2 Sacrificio y disecciones. Los ratones fueron sacrificados de acuerdo al protocolo establecido por el CICUAL, posteriormente se hizo una disección de hígado, riñones y cerebro, separando luego este 30 ultimo en cerebelo, corteza, estriado, hipocampo,. Una muestra de tejido se homogenizó en buffer A (KCl 154mM. DTPA 5mM. & K2PO4 .1M) en proporción 1:10,agregando posteriormente el mismo volumen de buffer B (HCl 40mM, DTPA 10mM, Acido ascórbico 20mM. Y TCA 10%). Se centrifugaron brevemente a 14000 x g por 30 m. y posteriormente se filtraron usando filtros de 40 µm para congelarlos a -70°C, para medir posteriormente (1 semana) los niveles de GSH. El resto de los tejidos se congelaron rápidamente usando hielo seco y se guardaron a -70°C hasta su análisis. 5.3 Medición de niveles de Glutatión. Los niveles de GSH y GSSG se midieron en los homogenados de los diferentes tejidos extraídos. El homogenado y las mediciones fueron realizadas mediante la metodología descrita por Senft et al.(2000). El ensayo fluorométrico de O-phthalaldehíde (Senft, Dalton, & Shertzer, 2000) fue adaptado a microplaca (Sigma- Aldrich). La fluorescencia se determinó con filtros de 365 nm de excitación y 430 nm de emisión en un Multidetector de Elisa DTX 800/880 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Los niveles de GSH y GSSG se expresan en nmol por g de tejido, para lo que se usó como referencia una curva estándar de GSH y GSSG (Sigma- Aldrich). El método de OPA, se basa en la formación de un derivado fluorescente, isoindol, para el caso del GSH. Para la determinación del GSSG en un primer paso se inhibe esta reacción y posteriormente el GSSG es reducido a GSH para la posterior derivación del isoindol con OPA. 5.4 Extracción de RNA total El RNA total se extrajo de 30-60 mg de cada uno de los tejidos anteriormente mencionados, mediante la técnica de Trizol de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). El 31 tejido de homogenizó en 1 ml. de Trizol, posteriormente se agregaron 200µl de cloroformo. El tejido se centrifugó a 12,000 x g por 15 minutos y posteriormente, la fase acuosa se precipitó con 500 µl de isopropanol y se centrifugó a 12,000 x g por 10 minutos. La muestra se lavó con 1 ml de etanol al 75% y se disolvió el pellet de RNA en agua libre de RNAsas y DNAsas. La concentración se determinó en un espectofotómetro nanodrop ND- 1000 y su pureza se comprobó con la relación 260/280 nm, considerando los límites del cociente entre 1.8 y 2 como una pureza adecuada para los experimentos posteriores. Para verificar la integridad del RNA se realizó una electroforesis en un gel de agarosa 1% con 0.5 µg de muestra en cada carril y el marcador 1kb plus (Invitrogen). El RNA presente en las muestras se identificó mediante una tinción con bromuro de etidio en un transiluminador. La integridad de las muestras de RNA se tomaron como buenas cuando se observan las bandas no degradadas de RNA ribosomal 18S y 28S 5.5 RT- PCR La síntesis del DNA Complementario (cDNA) se hizo a partir de 1 µg de RNA total, usando el oligo (dT)(Promega) y la transcriptasa reversa M-MLV RT (Promega). El RNA y 0.5 mg de oligo (dT) se incubaron por 5 m a 70°C, se colocaron el hielo y posteriormente se agregaron, buffer (1X), dNTPs (0.4mM.), 200 unidadesde M-ML V RT y agua libre de RNAsas/DNAsas hasta obtener un volumen de 25 µl, se mezclaron e incubaron 50 min a 37°C y 10 min a 50°C para inactivar la enzima. Finalmente, las muestras se guardaron a -20°C para su uso posterior. 32 5.6 PCR- tiempo real Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un Rotor-Gene Q (QIAGEN) con la mezcla de reacción del EXPRESS SYBR® GreenER q PCR Super mix with premixed ROX (Invitrogen). Las secuencias de oligos utilizadas se presentan en la fig. 9 . El detalle de los procedimientos realizados se explican en el ANEXO I Gen Oligonucleotido F Oligonucleotido Tm (°C) Conc. xCT AGC CAG TCG GTG ATA GCA AAG AGG GGG AAA AAC AAA ACA AGA C 60 1 Nrf 2 CAC CAG TGG ATC CGC CAG CTA TAT CCA GGG CAA GCG ACT CA 60 5 NTrk-1 AGG TGG CTG CTG GTA TGG T TCG CCT CAG TGT TGG AGA G 60 1 IkBα AAA TCT CCA GAT GCT ACC CGA GAG ATS ATG TCA GAC GCT GGC CTC CAA 60 1 B actina CCA GGT CAT CAC TAT TGG CAA CGA G TCT TTA CGG ATG TCA ACG TCA CAC T 60 6 GAPDH TGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT T CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC C 60 1 Figura. 9. Tabla con el gen, la secuencia de los oligos Forward y Reverse, la Tm y la concentración utilizada, siguiendo la matriz de oligos fig 22. 33 6.Resultados 6.1 Niveles de GSH . Los niveles de GSH medidos después de 3 horas de tratamiento fueron diferentes para cada región. La corteza y el cerebelo no tuvieron diferencias significativas en ninguno de los tratamientos (Fig. 10 y 11); sin embargo, en el caso del estriado los tratamiendos con SAS y con SAS+AAP redujeron significativamente los niveles de GSH un 35 y 40% respectivamente. (Fig. 12). En el hipocampo SAS y SAS+AAP también redujeron significativamente los niveles de GSH entre 45 y 65% (Fig. 13) respectivamente . Lo que muestra una mayor sensibilidad en estas dos regiones a estos fármacos. En los riñones se observó una diferencia significativa sin embargo, contra lo esperado, se incrementó en un 50% el contenido de GSH con el tratamiento con AAP. En los demás tratamientos no se encontraron cambios significativos en los niveles de GSH. En el hígado, se observó una disminución significativa de GSH, en los animales que recibieron el tratamiento con AAP, de aproximadamente 35%. Asimismo, se observó una diferencia significativa entre los tratamientos con SAS y APP, sin embargo en el tratamiento con SAS+AAP no se presentodiferencia significativa con respecto al control. 34 n m o le s / g ra m o d e c o rt e z a C o n tr o l S AS AAP S AS y AAP 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 Fig. 10. GSH en corteza de ratones Balb/C, expuestos a SAS 200mg/kg, AAP 200 mg/kg y SAS y AAP 200mg/kg. ANOVA de una vía, post hoc Tukey ** p<0.001, * p<0.05 Fig. 11. GSH en cerebelo de ratones Balb/C, expuestos a SAS 200mg/kg, AAP 200 mg/kg y SAS y AAP 200mg/kg. ANOVA de una vía, post hoc Tukey ** p<0.001, * p<0.05 n m o le s G S H / g c e r e b e lo C o n tr o l S AS AAP S AS y AAP 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 35 n m o le s G S H / g e s tr ia d o C o n tr o l S AS AAP S AS y AAP 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 ** * Fig. 12. GSH en estriado de ratones Balb/C, expuestos a SAS 200mg/kg, AAP 200 mg/kg y SASyAAP 200mg/kg. ANOVA de una vía, post hoc Tukey ** p<0.001, * p<0.05 n m o le s G S H / g h ip o c a m p o C o n tr o l S AS AAP S AS y AAP 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 * ** * Fig. 13 GSH en hipocampo de ratones Balb/C, expuestos a SAS 200 mg/kg, AAP 200 mg/kg y SASyAAP 200 mg/kg ANOVA de una vía, post hoc Tukey ** p<0.001, * p<0.05 36 n m o le s G S H / g r iñ ó n C o n tr o l S AS AAP S AS y AAP 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 * Fig. 14. GSH/g en riñon de ratones Balb/C, expuestos a SAS 200 mg/kg, AAP 200 mg/kg y SASyAAP 200 mg/kg ANOVA de una vía, post hoc Tukey ** p<0.001, * p<0.05 n m o le s G S H / g d e h íg a d o C o n tr o l S A S A A P S A S y A A P 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 1 0 0 0 0 ** * Fig. 15. GSH en hígado de ratones Balb/C, expuestos a SAS 200 mg/kg, AAP 200 mg/kg y SASyAAP 200 mg/kg. ANOVA de una vía, post hoc Tukey ** p<0.001, * p<0.05 6.2 Integridad de RNA Se realizó la extracción del RNA de los diferentes tejidos (hígado, riñon, cerebelo, hipocampo, estriado y corteza) de los ratones Balb/c. A continuación se muestra una imagen representativa de la integridad del RNA (Fig. 16). Se pueden observar las bandas 37 correspondientes a las fracciones ribosomales 28S y 18S, lo que comprueba la integridad del RNA de las muestras; Para todos los experimentos se utilizó solo RNA que presentaban la calidad aquí mostrada en la fig. 16 Fig. 16 Gel de agarosa al 1%, con marcador 1 kB plus, que muestra la integridad del RNA extraído. Se observan bandas ribosomales 28s y 18s 38 6.3. Efecto sobre el mensajero de xCT En la corteza, los animales controles expresaron niveles significativamente más elevados de RNAm de xCT que en los animales que recibieron los tratamientos farmacológicos (Fig.17). No observamos diferencias en los niveles de RNAm entre los grupos de ratones tratados. En el caso de la expresión de RNAm de Nrf2, IkBa y NTrK1 se observa una tendencia a la disminución pero no se encontraron diferencias significativas entre los grupos. El cerebelo no observamos ninguna tendencia (Fig.18) En el estriado no se presentaron diferencias significativas en ninguno de los tratamientos establecidos, como puede verse en la Fig. 16 A,B,C y D. Sin embargo, se puede observar una tendencia positiva a la inducción del RNAm de Nrf2, especialmente con el tratamiento de SAS+AAP. El hipocampo de ratón mostró una diferencia muy significativa en el nivel de mensajero de xCT con el tratamiento con SAS+AAP, y en el tratamiento con SAS no fue estadísticamente significativo, sin embargo se puede apreciar una tendencia y tiene un valor muy cercano a 0.05 como se ve en la Fig. 20 A. La expresión de los demás genes no parece haber sido modulada por los tratamientos en esta región. 39 Fig. 17 Expresión de RNAm en corteza de ratón 3 horas post tratamiento. A) xCT, B) Nrf 2,C) IkBα, D) NTrk 1 ANOVA de una vía post hoc Tukey ** p<0.001, * p<0.05. 40 Fig. 18 Expresión de RNAm en cerebelo de ratón 3 horas post tratamiento. A) xCT, B) Nrf 2,C) IkBα, D) NTrk 1 ANOVA de una vía post hoc Tukey ** p<0.001, * p<0.05. 41 Fig. 19 Expresión de RNAm en estriado de ratón 3 horas post tratamiento. A) xCT, B) Nrf 2,C) IkBα, D) NTrk 1 ANOVA de una vía post hoc Tukey ** p<0.001, * p<0.05. 42 Fig. 20 Expresión de RNAm en hipocampo de ratón 3 horas post tratamiento. A) xCT, B) Nrf 2,C) IkBα, D) NTrk 1 ANOVA de una vía post hoc Tukey ** p<0.001, * p<0.05. 43 7.Discusión 7.1 Niveles de GSH Los niveles de GSH cambiaron dependiendo del tratamiento y del tejido. En el hígado se observó una disminución significativa de GSH solo en el tratamiento con acetaminofén, probablemente debido al consumo del metabolito generado por CYP2E1, de manera similar a lo observado anteriormente (Limón-Pacheco et al.,2016). Sin embargo, el tratamiento con sulfasalazina no mostró disminuir el GSH celular probablemente por que xCT tiene una expresión baja en el hígado y además, puede obtener L-Cys a través de la ruta de la transulfuración, lo cual disminuiría la participación xCT en este tejido (Fig. 21). En el riñón se observó un aumento significativo en los niveles de GSH por el tratamiento con AAP. Este efecto se puede deber a una síntesis aumentada de GSH o a la activación de la glutatión reductasa. De todas maneras, se observa una respuesta antioxidante en este tejido al aumentar el nivel de GSH. Esto resulta interesante a la luz de observaciones previas en el grupo de trabajo en donde una dosis mayor de AAP (300 mg/kg de peso) disminuyen los niveles de GSH en riñón y en el hígado de ratones (Limón Pacheco et al., 2016). En cambio, la dosis utilizada en este reporte (200 mg/kg) disminuye los niveles de GSH en hígado, pero parece estimular la síntesis de GSH o la actividad de la glutatión reductasa en los riñones. Es importante señalar que algunos autores señalan a la SAS como un fármaco que puede llegar a provocar hepatotoxicidad y fallas renales (Boyer, Li, Fyda, & Friedman, 1989; Dwarakanath, Michael, & Allan, 1992; Heidari et al., 2016) así como casos clínicos (Masood, Sharma, Nijjar, & Krenzer, 2016) pero en este caso parece que los resultados encontrados se deben a la temporalidad del trabajo, ya que en un trabajo crónico con SAS 44 el hidago sí mostró una disminución en los niveles de GSH (Erik Castillo datos no publicados). Sin embargo, es importante decir que la vía de administración de la SAS en estos trabajos fue oral, por lo que en el tracto digestivo, la SAS puede ser sustrato de las bacterias azoreductasas. Cuando la sulfasaliza pasa por el sistema digestivo es metabolizada por estos microorganismos, lo que disminuye la cantidad de sulfasalazina total y aumenta la de sus metabolitos potencialmente tóxicos. De esta manera, las farmacocinéticas diferentes de la vía oral y la vía intraperitoneal podría explicar las diferencias entre nuestros resultados y los trabajos de Heidairi y Boyer. 45 Fig. 21. Expresión de xCT en diferentes órganos evaluados según datos generados por RNAseq, microarreglo y SAGE, tomado de Gene card 2017 http://www.genecards.org/cgi- bin/carddisp.pl?gene=SLC7A11#expression En los tratamientos orales, no se puede saber con exactitud cual sustancia fue la causante del efecto reno y hepatotóxico, sin embargo los resultados de los niveles de GSH sugieren que podría ser uno de los metabolitos el que ocasione el estrés oxidante en hígado y riñón. En el hipocampo y estriado se observó una disminución significativa de los niveles de GSH (Fig.12 y 13) en tratamientos con SAS y SAS + AAP algunos autores presentan datos que demuestran que xCT se encuentra expresado de manera basal en hipocampo y estriado (Alshehri, Althobaiti, & Sari, 2017; Dang et al., 2017), lo que lo hace un blanco más suseptible a la inhibición farmacológica por SAS. Los resultados aquí presentados sugieren que estas dos estructuras dependen xCT para hacer la entrada de cisteína, en contraste con el cerebelo y la corteza que parecen no tener una dependencia significativa a xCT, sin embargo no se puede descartar la opción de que la cinética de su respuesta sea diferente y por tanto lo observado en los niveles de GSH sea causa de una respuesta para compensar la inhibición de xCT o que esas regiones no tienen una dependencia tan alta del transportador, para lo cual sería interesante hacer experimentos a diferentes tiempos de exposición para poder tener un mejor panorama de cual es la reacción de estas zonas, en eperimentos posteriores se observó que en exposiciones cronicas la corterza sí se vio afectada a nivel GSH (Erik Castillo datos no publicados) El cerebro no presentó una respuesta al tratamiento con AAP en ninguna de sus regiones. Limón et. al. (2016) sugiere que el AAP no es metabolizado en cerebro debido a que no expresa el CYP2E1, lo que evita que forme el metabolito que es reactivo con GSH, lo cual podría explicar lo observado en este trabajo. 46 7.2 Expresión de RNAm de xCT, Nrf2, IkBα y NTrK 1 Los resultados mostrados en la Fig. 13 y 20 A, sugieren que en hipocampo cuando los niveles de GSH se ven disminuidos, se induce la transcripción del mensajero de xCT y ello aumentaría la importación del aminoácido limitante en la síntesis de novo de GSH. En presencia de estrés oxidante se induce la transcripción de xCT y su presencia en la membrana provoca un aumento de glutamato extracelular (Nelson-Mora et al., 2018), causado por el intercambio 1:1 de cistina y glutamato. Sin embargo en este estudio, este comportamiento fue evidente en el hipocampo pero no así en el estriado donde si bajaron los niveles de GSH (Fig. 12) pero no se observó aumento en el mensajero de xCT (Fig. 19 A), aunque se observa una tendencia a un aumento en la expresión del factor de transcripción Nrf2, que podría modular positivamente a xCT posteriormente. Para demostrar esta propuesta sería necesario realizar un curso temporal más prolongado. Los niveles de GSH no variaron en la corteza, mientras que los niveles de mensajero en todos los tratamientos mostraron una tendencia a la baja, que fue significativa con respecto a la expresión del RNAm de xCT. Estos datos sugieren que esta región es afectada de manera diferente por los tratamientos farmacológicos por lo menos a este tiempo y concentraciones No se observaron cambios en los demás genes estudiados. Estudios previos encuentran una correlación entre Nrf2 y xCT en respuesta a estrés oxidante y Nrf 2 (Habib et al., 2015; Nandar, Neely, Unger, & Connor, 2013) puede ser inducido en presencia de estrés oxidante (Chen et al., 2017) (Albarran-Ponce 2017), sin embargo la acción directa de Nrf 2 como inductor de xCT ocurre cuando se trasloca al núcleo al disociarse de Keap 1. xCT puede estar modulado por otros factores de transcripción. (Patel, Kharkar, & Nandave, 2015) menciona varios, y Nrf 2 es uno de los principales por su 47 estrecha relación con los sitios ARE, sin embargo también menciona algunos como eIF2 el cual modula la traducción, ATF 4 que responde a bajos niveles de ámino ácidos, NF-kB que responde cuando se inducen procesos inflamatorios (el cual evaluamos al medir los niveles de IkBα), AP 1 que responde a transcripción, HIF que es sensible a hipoxia, el cambio de niveles de AMP cíclico, que ocurre cuando disminuyen los niveles de ATP o bajos niveles energéticos, y factores de crecimiento como NGF (el cual evaluamos al medir los niveles de NTRK1), EGF. Dado que los niveles de NTRK1 e IkBα no se vieron modulados en ninguno de los tejidos ni de los tratamientos se puede sugerir que la respuesta inmediata del hipocampo pudo venir de otro estimulo que no sean los anteriores mencionados. La sulfasalazina al ser un fármaco que tiene una gamma amplia de blancos celulares, se podrían estar activando otras vías de señalización y modular la transcripción de xCT. 7.3 Implicaciones de la inhibición de xCT. La inhibición de xCT por efecto de la sulfasalazina disminuyó los niveles de GSH en hipocampo y estriado, dos estructuras importantes en el aprendizaje y la memoria, así como en la coordinación motora respectivamente. Tenemos evidencias de que la sobreexpresión de xCT en hipocampo se asocia a un incremento de los niveles de glutamato extracelular (Nelson-Mora et al., 2018). En nuestro caso, no medimos los niveles de glutamato extracelular, pero es de esperar que la inhibición de xCT por sulfazalasina, disminuya los niveles de glutamato extracelular, muestran que si se pierde el sistema xCT bajan los niveles de glutamato extracelular (De Bundel et al., 2011), lo que afecta las sinapsis glutamatérgicas y provoca que se pueda ver afectada la memoria espacial por disminución en los niveles de glutamato extracelular en el hipocampo. En este trabajo, encontramos una disminución importante de los niveles de GSH a las 3 horas de tratamiento. describen que 48 la inhibición del sistema Xc- puede causar la desincronizacion de la red neuronal (Conn & Pin, 1997), al disminuir la cantidad de Glu y esto a su vez resultar en un aumento en los síntomas de la esquizofrenia. Uno de los problemas de estudiar al sistema Xc- como blanco farmacológico es su doble acción en la síntesis de novo de GSH y su actividad antiporte que puede modificar los niveles de glutamato extracelular. Por otra parte, la sobreexpresión de xCT puede llevar a las células neuronales a la excitotoxicidad. Se ha demostrado que en relación con la esclerosis multiple, xCT juega un rol negativo, ya que el glutamato liberado por este transportador provoca excitotoxicidad de oligodendrocitos y su muerte (Domercq et al., 2007; Jourdain et al., 2007). En otras enfermedades como elAlzheimer se asocia la presencia de β amiloide con los principales efectos neurodegenerativos del desorden (Giulian et al., 1995; McDonald, Brunden, & Landreth, 1997; Meda et al., 1995) , y a su vez se asocia la liberación de glutamato por el sistema xCT con la presencia de β amiloide de manera dosis dependiente (Qin et al., 2006), sugiriendo este aumento como la causa principal de la neurotoxicidad en microglia por la activación de NMDA que provoca entrada masiva de Ca y daño mitocondrial. En el caso de la enfermedad de Parkinson, se ha demostrado que la principal vía de degeneración de las neuronas dopaminérgicas es por la excitotoxicidad debido a altos niveles de glutamato exitatorio en estriado, lo cual indicaría que, como sugieren los resultados de este trabajo una inhibición de xCT podría ayudar a disminuir la liberación de glutamato, sin embargo, el GSH al ser un antioxidante clave en el sistema nervioso central, también parece participar de manera importante en la protección contra este padecimiento (Schulz, Lindenau, Seyfried, & Dichgans, 2000). La inhibición de xCT disminuiría los niveles de glutamato extracelular y por consiguiente la excitotoxicidad. Sin embargo al mismo tiempo podría disminuir los niveles de GSH y conducir a la muerte de estas 49 neuronas por estrés oxidante. Un trabajo interesante de Massie et. al. (2017) muestra que las neuronas dopaminérgicas de los ratones knockout para xCT presentan un efecto protector a diferencia de los ratones normales contra la 6 hidroxi dopamina, que es uno de los principales compuestos para provocar los efectos de la enfermedad de Parkinson en ratones. Por otro lado, se ha demostrado que los ratones knockout para xCT no sufren ningún tipo de disminución en los niveles de GSH (De Bundel et al., 2011), lo que sugiere que en el caso de la anulación del gen, el sistema podría utilizar a otros transportadores para lidiar con la demanda de cisteína, tales como el acarreador de aminoácidos exitatorios (EAAC 1), el sistema alanina serina cisteína (ASC) o incluso el sistema Xag que es similar a xCT pero dependiente de aspartato, sin embargo aún hay mucha discusión de si el reclutamientos de estos otros transportadores se puede dar de manera natural o solo cuando la expresión del gen se elimina por completo. Sería interesante investigar si también se puede llegar a ese resultado por la inhibición farmacológica, así como que tan prolongados deben ser los tiempos de inhibición de xCT para que el sistema compense el transporte de cisteína con estos otros transportadores. Por último, si la inhibición prolongada de xCT disminuye GSH como lo observado de manera aguda en este trabajo, ello podría tener consecuencias severas a largo plazo tanto en hipocampo como estriado, ya que haría que estas estructuras fueran más susceptibles a la presencia de especies reactivas. De ahí la importancia de entender el comportamiento de xCT, EAAC 1 y ASC en varias situaciones farmacológicas para evitar afectar los niveles de GSH en estas regiones fundamentales para la memoria, el aprendizaje y la coordinación motora. 50 8. Conclusiones La inhibición de xCT por SAS inhibió la captura de cisteína y por tanto la síntesis de GSH en hipocampo y estriado lo que apoya la idea de que xCT tiene un papel fundamental en hipocampo y estriado en la respuesta antioxidante mediada por GSH. Regiones como el cerebelo y la corteza no cambian sus niveles de GSH por SAS en estas condiciones, lo que sugiere que no tienen una dependencia tan grande de xCT como el hipocampo y el estriado para la síntesis del tripéptido o al menos a estos tiempos. El tratamiento con SAS moduló positivamente la transcripción de xCT en el hipocampo posiblemente en respuesta a la disminución en los niveles de GSH. 51 9. Perspectivas En este trabajo estudiamos la acción de SAS en diferentes regiones del cerebro algunas muy relacionadas con el aprendizaje o enfermedades crónico neurodegenerativas tales como el hipocampo y el estriado. La SAS es un fármaco indicado en EU y Europa para el tratamiendo de algunas enfermedades inflamatorias como colitis y artritis que requieren de tratamientos prolongados o crónicos. El consumo diario de este medicamento podría tener consecuencias a nivel del SNC. Los resultados sugieren que el cerebelo y la corteza no presentan afectación en los biomarcadores utilizados en este trabajo, en estos tiempos de exposición a SAS, sin embargo con un tratamiento crónico se podría buscar si realmente afecta o hay otros transportadores que se activan para compensar la inhibición constante de xCT y mantener los niveles de GSH. Desde otro enfoque, también hace falta estudiar la vía de administración oral de la SAS ya que es la que se utiliza y que genera metabolitos que podrían modular la biodisponibilidad del fármaco y presentar efectos que podrían tener en el SNC. Un estudio de este tipo puede tener un alto impacto en el desarrollo futuros tratamientos para enfermedades neurodegenerativas (Enfermedad de Parkinson, Alzheimer) en las cuales la liberación de glutamato por xCT parece tener un rol negativo por la excitotoxicidad que puede llegar a provocar. 52 9. Referencias Alshehri, F. S., Althobaiti, Y. S., & Sari, Y. (2017). Effects of Administered Ethanol and Methamphetamine on Glial Glutamate Transporters in Rat Striatum and Hippocampus. J Mol Neurosci, 61(3), 343-350. doi:10.1007/s12031-016-0859-8 Boyer, D. L., Li, B. U., Fyda, J. N., & Friedman, R. A. (1989). Sulfasalazine-induced hepatotoxicity in children with inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 8(4), 528-532. Bridges, R. J., Natale, N. R., & Patel, S. A. (2012). System xc(-) cystine/glutamate antiporter: an update on molecular pharmacology and roles within the CNS. 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HOLD 95 °C 5’ CYCLING 95 °C 10’’, 60°C 20’’; 40 Ciclos MELT 65-95 °C Las diferencias en la expression génica entre grupos se calcula usando los Ct (que es el ciclo en el cual la fluorecensia comienza a aumentar a un nivel detectable, y da inicio al crecimiento exponencial de la misma flueresencia a ese momento se le conoce como Threshold cycle), de los amplicones del gen de interés normalizados con los valores de Ct de los amplicones del gen constitutivo (doble delta Ct). Este es un método comparativo que involucra la comparación de los valores de Ct de las muestras con un calibrador y por último se normaliza con un gen constitutivo. Esos valores se calculan de la siguiente manera. ΔΔCt= ΔCt muestra- ΔCt referencia ΔCt muestra= ΔCtgen de interés- ΔCt gen constitutivo Es el valor de la muestra normalizada ΔCt referencia= ΔCt muestra – ΔCt calibrador 60 Es el valor de la muestra normalizada con el gen constitutivo, menos el valor del calibrador normalizado con el gen constitutivo. Se utilizó una matriz de oligonucleótidos (Fig. 22) para determinar las concentraciones adecuadas de los oligonucleótidos Figura 22. Matriz de oligonucleótidos donde F1, F2 y F3 las concentraciones 5,3,1 mM del oligonucleótido Forward y R1,R2 y R3 las concentraciones 5,3,1,mM del oligonucleótido Reverse Portada Índice Resumen 1. Introducción 2. Justificación 3. Hipótesis 4. Objetivos 5. Material y Métodos 6. Resultados 7. Discusión 8. Conclusiones 9. Perspectivas Referencias Anexo
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