Produccion-y-caracterizacion-de-una-exo-inulinasa-procedente-de-bacillus-amyloliquefaciens-con-actividad-sobre-fructanos-de-agave-tequilana-weber-variedad-azul-agavinas

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
‘‘Extracción y caracterización de una exo-
inulinasa procedente de Bacillus 
amyloliquefaciens con actividad sobre 
fructanos de Agave tequilana Weber variedad 
azul (agavinas)’’ 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
QUÍMICO DE ALIMENTOS 
 
 
P R E S E N T A: 
GERARDO PÉREZ RIVAS 
 
 
 
 
 
 
CIUDAD DE MÉXICO 
 
 
2016 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
JURADO ASIGNADO 
 
PRESIDENTE: Ruth Edith Martín Fuentes 
VOCAL: Oscar Hernández Meléndez 
SECRETARIO: Carmina Montiel Pacheco 
1er SUPLENTE: Carolina Peña Montes 
2do SUPLENTE: Genaro Jiménez Reyes 
 
 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
Laboratorio 314, conjunto E, Facultad de Química, Universidad 
Nacional Autónoma de México 
 
 
 
 
 
 
 
 
ASESOR DEL TEMA: 
Dra. Carmina Montiel Pacheco 
 
 
 
SUSTENTANTE: 
Gerardo Pérez Rivas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
Por el financiamiento del proyecto, 
al CONACyT (proyecto CB-167507), 
a la UNAM, a través de la DGAPA (PAPIIT IA-204415), 
y a la Facultad de Química (PAIP 5000-9153 y subprograma 127, 
‘‘formación básica en investigación’’) 
 
 
ÍNDICE DE CONTENIDO 
CAPÍTULO I. RESUMEN......................................................................................... 1 
CAPÍTULO II. INTRODUCCIÓN .............................................................................. 2 
CAPÍTULO III. ANTECEDENTES ........................................................................... 4 
3.1. AGAVE ......................................................................................................... 4 
3.1.1. Taxonomía ............................................................................................. 6 
3.1.2. Distribución ............................................................................................ 6 
3.1.3. Agave tequilana Weber variedad azul .................................................... 9 
3.1.3.1. Composición de Agave tequilana Weber variedad azul ................. 10 
3.1.4. Potencial biotecnológico del agave ...................................................... 11 
3.2. FRUCTANOS ............................................................................................. 12 
3.2.1. Inulinas, levanos y fructooligosacáridos (FOS) .................................... 12 
3.2.2. Fuentes de fructanos ............................................................................ 15 
3.2.3. Importancia de fructanos y fructooligosacáridos: propiedades y 
aplicaciones en la industria agroalimentaria ................................................... 17 
3.2.3.1. Funcionalidad como prebióticos .................................................... 18 
3.2.3.2. Prevención de infecciones por bacterias patógenas ...................... 18 
3.2.3.3. Prevención de cáncer de colon...................................................... 20 
3.2.3.4. Mejoramiento de absorción de minerales ...................................... 20 
3.2.3.5. Otras propiedades de los fructooligosacáridos .............................. 20 
3.2.3.6. Aplicaciones en la industria agroalimentaria .................................. 21 
3.2.3.7. Aplicaciones alternativas ............................................................... 22 
3.3. ENZIMAS .................................................................................................... 22 
3.3.1. Inulinasas ............................................................................................. 24 
CAPÍTULO IV. JUSTIFICACIÓN ........................................................................... 27 
CAPÍTULO V. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS............................................................ 28 
5.1. HIPÓTESIS ................................................................................................. 28 
5.2. OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 28 
5.3. OBJETIVOS PARTICULARES ................................................................... 28 
 
 
CAPÍTULO VI. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................... 29 
6.1. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ................................................................ 29 
6.2. MATERIALES ............................................................................................. 30 
6.3. METODOLOGÍA ......................................................................................... 31 
6.3.1. Identificación de la cepa ....................................................................... 31 
6.3.1.1. Preparación de medio de cultivo .................................................... 32 
6.3.1.2. Inoculación e incubación de la cepa .............................................. 32 
6.3.1.3. Caracterización morfológica colonial de la cepa ............................ 33 
6.3.1.4. Caracterización microscópica de la cepa ...................................... 33 
6.3.1.5. Identificación de la cepa por métodos moleculares ....................... 34 
6.3.2. Determinación de actividad enzimática ................................................ 37 
6.3.2.1. Obtención de fracciones celulares con actividad enzimática ......... 37 
6.3.2.2. Concentración de la fracción del sobrenadante ............................. 38 
6.3.2.3. Evaluación de actividad enzimática ............................................... 38 
6.3.2.3.1. Reacción enzimática de hidrólisis de agavina ......................... 38 
6.3.2.3.2. Determinación de carbohidratos por la técnica de cromatografía 
en capa fina (TLC) .................................................................................. 40 
6.3.2.3.3. Determinación de carbohidratos reductores por la técnica del 
ácido 3,5-dinitrosalisílico (DNS) .............................................................. 40 
6.3.2.3.4. Determinación de carbohidratos por la técnica de cromatografía 
líquida de alta eficiencia (High Performance Liquid Cromatography, HPLC)
 ................................................................................................................ 41 
6.3.2.3.5. Determinación de proteína por la técnica de Bradford ............ 43 
6.3.3. Determinación de peso molecular de fracción proteica con actividad 
enzimática ...................................................................................................... 43 
6.3.3.1. Separación de fracciones proteicas: electroforesis en gel de 
poliacrilamida .............................................................................................. 43 
6.3.3.2. Identificación de fracción proteica asociada a la actividad enzimática: 
zimograma .................................................................................................. 44 
CAPÍTULO VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................... 46 
7.1. IDENTIFICACIÓN DE LA CEPA ................................................................. 46 
7.1.1. Caracterización morfológica colonial de la cepa .................................. 46 
 
 
7.1.2. Caracterización microscópica de la cepa ............................................. 47 
7.1.3.Identificación de la cepa por métodos moleculares .............................. 49 
7.2. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ..................................... 51 
7.2.1. Determinación de actividad de hidrólisis de agavina ............................ 51 
7.2.1.1. Estudio del efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad 
enzimática de las fracciones crudas ........................................................... 51 
7.2.1.2. Estudio del curso temporal de la reacción enzimática ................... 53 
7.2.1.3. Estudio del efecto de la concentración proteica sobre la actividad 
enzimática .................................................................................................. 55 
7.2.1.4. Estudio del efecto del contenido proteico en el medio de reacción 
sobre la actividad enzimática ...................................................................... 57 
7.2.1.5. Estudio del efecto de la presencia de proteasas sobre la actividad 
enzimática .................................................................................................. 58 
7.2.1.6. Estudio de la termoestabilidad y su efecto sobre la actividad 
enzimática .................................................................................................. 59 
7.2.1.7. Estudio del efecto de diferentes sustratos tipo fructano sobre la 
actividad enzimática ................................................................................... 61 
7.2.2. Identificación de posible actividad de fructosil transferasa ................... 62 
7.2.2.1. Evaluación de reacción enzimática en medio acuoso utilizando 
fructosa como sustrato ............................................................................... 62 
7.2.2.2. Evaluación de reacción enzimática en medios orgánicos utilizando 
fructosa como sustrato ............................................................................... 63 
7.3. DETERMINACIÓN DE PESO MOLECULAR DE FRACCIÓN PROTEICA 
CON ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ........................................................................ 65 
CAPÍTULO VIII. CONCLUSIONES ....................................................................... 67 
CAPÍTULO IX. PERSPECTIVAS ........................................................................... 69 
CAPÍTULO X. REFRENCIAS ................................................................................ 70 
CAPÍTULO XI. ANEXOS ....................................................................................... 77 
11.1. ANÁLISIS DE VARIANZAS (ANOVA)....................................................... 77 
11.2. DISTRIBUCIONES t DE STUDENT.......................................................... 78 
11.3. CROMATOGRAMAS DE HPLC ............................................................... 79 
 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura 1. Estrutura de fructanos tipo (a) inulina, (b) levano, (c) neoinulina y (d) 
neolevano (Arrizón & col., 2014). .......................................................................... 12 
Figura 2. Estructura de fructanos ramificados tipo (a) gramiano y (b) agavina (López 
& Mancilla M., 2007). ............................................................................................. 13 
Figura 3. Consecuencias de la ingesta de fructanos como prebióticos: los 
prebióticos son utilizados selectivamente por los probióticos, los cuales los 
fermentan para producir ácidos grasos de cadena corta (SCFAs), presentando 
mejoras en el hospedero (Huazano G. & López, 2013). ....................................... 19 
Figura 4. Diagrama de estrategia experimental para el presente trabajo. ............ 29 
Figura 5. Características coloniales de la cepa 12GeP en medio de cultivo sólido 
después de (a) 24 y (b) 48 h de crecimiento. ........................................................ 46 
Figura 6. Observaciones sucesivas de una preparación húmeda de la cepa 12GeP, 
observada con un objetivo 60X mediante microscopía de campo claro. ............... 47 
Figura 7. Observación microscópica de una preparación fija de la cepa 12GeP 
tratada con tinción de Gram, observada con un objetivo 100X por microscopía de 
campo claro. .......................................................................................................... 48 
Figura 8. Observaciones microscópicas de una preparación de la cepa 12GeP 
tratada con glutaraldehído, observada con objetivos (a) 5,000X, (b) 10,000X, (c) 
15,000X, (d) 16,000X y (e) 20,000X por microscopía electrónica de barrido (SEM).
 .............................................................................................................................. 48 
Figura 9. Amplicones asociados a la cepa 12GeP observados por electroforesis en 
gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio y revelado con luz UV. .................... 49 
Figura 10. Secuencia de bases obtenida por Laragen Inc. para el ARNr 16S 
asociado a la cepa 12GeP (A=adenina, T=timina, G=guanina, U=uracilo). .......... 50 
Figura 11. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de las fracciones 
celulares crudas asociadas a la cepa de Bacillus amyloliquefaciens. ................... 52 
Figura 12. Efecto del pH sobre la actividad enzimática de las fracciones celulares 
crudas asociadas a la cepa de Bacillus amyloliquefaciens. .................................. 52 
 
 
Figura 13. Curva temporal de reacción enzimática de la fracción del sobrenadante 
asociado a la cepa de Bacillus amyloliquefaciens: producción de fructosa 
cuantificada por la técnica de DNS. ...................................................................... 54 
Figura 14. Curvas temporales de reacción enzimática de la fracción del 
sobrenadante asociado a la cepa de Bacillus amyloliquefaciens: (a) consumo de 
agavina y (b) producción de fructosa cuantificados por HPLC. ............................. 55 
Figura 15. Efecto de los procesos de concentración proteica sobre la actividad 
enzimática de la fracción del sobrenadante asociado a la cepa de Bacillus 
amyloliquefaciens. ................................................................................................. 56 
Figura 16. Efecto de la concentración proteica en el medio sobre la actividad 
enzimática de la fracción del sobrenadante asociado a la cepa de Bacillus 
amyloliquefaciens. ................................................................................................. 57 
Figura 17. Efecto del uso de inhibidor de proteasa sobre la actividad enzimática de 
la fracción del sobrenadante asociado a la cepa de Bacillus amyloliquefaciens. .. 59 
Figura 18. Efecto de la termoestabilidad sobre la actividad enzimática de la fracción 
del sobrenadante asociado a la cepa de Bacillus amyloliquefaciens. ................... 60 
Figura 19. Efecto del uso de inulina y levano como sustrato sobre la actividad 
enzimática de la fracción del sobrenadante asociado a la cepa de Bacillus 
amyloliquefaciens. ................................................................................................. 61 
Figura 20. Prueba de reacción enzimática de fructosil transferasa en medio acuoso, 
llevada a cabo a pH (a) 5 y (b) 8 para la fracción del sobrenadante asociado a la 
cepa de Bacillus amuloliquefaciens. ...................................................................... 63 
Figura 21. Prueba de reacción enzimática de fructosil transferasa en medio 
orgánico, (a) acetonitrilo:agua (80:20), (b) acetato de butilo:agua (80:20) y (c) 
acetato de etilo:agua (80:20), llevada a cabo a pH 8 para la fracción del 
sobrenadante asociado a la cepa de Bacillus amyloliquefaciens. ......................... 64 
Figura 22. Aproximación de peso molecular de la enzima con actividad de hidrólisis 
sobre agavina, asociada al sobrenadante de la cepa de Bacillus amyloliquefaciens: 
comparación de (a) marcador de peso molecular (ColorBurst Electrophoresis 
Marker M.W. 8,000-220,000, SIGMA), (b) fracciones proteicas separadas por 
 
 
electroforesis, (c) zimograma revelador de actividadenzimática hidrolítica sobre 
agavina. ................................................................................................................. 66 
Figura 23. Cromatogramas de reacción enzimática a tiempos de 0 y 20 min. ..... 80 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
Tabla 1. Principales usos de importancia socioeconómica y agroecológica del 
Agave. ..................................................................................................................... 4 
Tabla 2. Principales especies del género Agave y su distribución en los estados del 
territorio mexicano. .................................................................................................. 7 
Tabla 3. Composición del Agave tequilana Weber variedad azul. ........................ 10 
Tabla 4. Composición de carbohidratos en Agave tequilana Weber variedad azul.
 .............................................................................................................................. 10 
Tabla 5. Contenido aproximado de fructanos en diversas especies vegetales. .... 16 
Tabla 6. Clasificación internacional de las enzimas. ............................................. 23 
Tabla 7. Especies microbianas productoras de endo- y exo-inulinasas. ............... 25 
Tabla 8. Reactivos utilizados durante el proceso experimental. ........................... 30 
Tabla 9. Composición de medio de cultivo con agavina como única fuente de 
carbono, utilizado para crecimiento de la cepa 12GeP ......................................... 32 
Tabla 10. Preparación de mezcla de reacción para una PCR .............................. 35 
Tabla 11. Programación del termociclador para llevar a cabo la PCR .................. 36 
Tabla 12. Preparación de reacciones para evidenciar actividad enzimática y sus 
respectivos controles. ............................................................................................ 39 
Tabla 13. Preparación de minigel al 10% de acrilamida ....................................... 44 
Tabla 14. Parámetros de dos análisis de secuencia del ARNr 16S asociado a la 
cepa 12GeP. ......................................................................................................... 50 
Tabla 15. ANOVA empleando actividad enzimática como variable de respuesta y la 
etapa de concentración proteica como fuente de variación. ................................. 77 
Tabla 16. ANOVA empleando actividad enzimática como variable de respuesta y 
concentración proteica como fuente de variación. ................................................ 77 
Tabla 17. Comparación de Tukey entre los distintos tratamientos (concentración 
proteica). ............................................................................................................... 78 
Tabla 18. Prueba t de Student para dos muestras independientes, utilizando como 
variable el sustrato de la reacción ......................................................................... 78 
Tabla 19. Prueba t de Student para dos muestras independientes, utilizando como 
variable la presencia o ausencia de inhibidor de proteasa. ................................... 79 
 
 
 
 
 
 
ABREVIATURAS 
°C Grado Celsius 
ADN Ácido desoxirribonucléico 
ANOVA* Analysis of Variance 
ARNr Ácido ribonucléico ribosomal 
ATCC* American Type Culture Collection 
BLAST* Basic Local Alignment Search Tool 
BSA* Bovin Serum Albumin 
CAM* Crassulacean Acid Metabolism 
CFR* Code of Federal Regulations 
CH3COO- Acetato 
CH3COOH Ácido acético 
CH4 Metano 
cm Centímetro 
CME* Center for Microbial Ecology 
CO2 Dióxido de carbono 
CTAB* Cetyl trimethyl ammonium bromide 
DNS* Dinitrosalisylic acid 
dNTP's* Deoxynucleotides 
DP* Degree of polimerization 
EC number* Enzyme Commission number for enzymes 
EDTA* Ethylenediaminetetraacetic acid 
EUFIC* European Food Information Council 
FDA* Food and Drug Administration 
FOS Fructooligosacáridos 
g Gramo 
GBM Grado biología molecular 
GRAS* Generally Recognized as Safe 
h Hora 
H2 Hidrógeno 
H2PO4- Fosfato monobásico 
H2SO4 Ácido fosfórico 
HPO42- Fosfato dibásico 
kDa Kilodalton 
L Litro 
m Metro 
mg Miligramo 
g Microgramo 
MgCl2 Cloruro de magnesio 
min Minuto 
mL Mililitro 
L Microlitro 
 
 
mm Milímetro 
m Micrómetro 
mM Milimolar 
mol Micromol 
MW* Molecular Weight 
NaCl Cloruro de sodio 
NaOH Hidróxido de sodio 
NOM Norma Oficial Mexicana 
pb Pares de bases 
PCR* Polymerase Chain Reaction 
Psi* Pounds-force per sqare inch 
rpm Revoluciones por minuto 
s Segundo 
SCFA's* Short Chain Fatty Acids 
SDS* Sodium dodecyl sulfate 
SDS-PAGE* Sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamide gel electrophoresis 
SEM* Scanning Electron Microscopy 
SST Sacarosa-sacarosa fructosiltransferasa 
T Temperatura 
Taq-polimerasa Polimerasa de Thermus aquaticus 
TEMED* Tetramethylethylenediamine 
TLC* Thin Layer Chromatography 
TRIS tris(hidroximetil)aminometano 
TTC* Triphenyltetrazolium chloride 
U Unidades internacionales 
UFC Unidades Formadoras de Colonia 
UV Ultravioleta 
v0 Velocidad inicial 
VLDP* Very Low Density Lipoprotein 
 
*: Abreviatura del inglés 
 
 
 
1 
CAPÍTULO I. RESUMEN 
Los residuos generados por la industria tequilera, y específicamente las pencas de 
Agave tequilana Weber variedad azul, pueden ser aprovechados debido a su 
importante contenido de fructanos ramificados. Dichos fructanos ramificados 
(agavinas) pueden ser aprovechados por algunas cepas microbianas como principal 
fuente de carbono e inducir la producción de enzimas de interés, como inulinasas que 
actúen en agavinas, de las cuales existen pocos estudios. Estas enzimas son de 
especial interés debido a que, utilizando agavinas como sustrato, se pueden obtener 
productos de valor agregado como fructosa y/o fructooligosacáridos; ambos de 
importancia en la industria de alimentos: el primero por su aplicación para la 
elaboración de jarabes de alta fructosa y el segundo por las propiedades funcionales 
que posee como prebiótico. 
Se estudió una cepa de Bacillus amyloliquefaciens, así como una exo-inulinasa 
extracelular proveniente de dicha cepa. La enzima no se purificó; durante todo el 
estudio se trabajó con la fracción del sobrenadante, únicamente concentrada. 
La cepa fue caracterizada morfológicamente, tanto colonial como microscópicamente, 
observándose estreptobacilos Gram positivos con un largo de aproximadamente 1.3 
m, con posible movilidad tipo ‘‘swarming’’. El crecimiento de la cepa para la 
producción de inulinasas se llevó a cabo utilizando un medio de cultivo con agavina 
como única fuente de carbono, incubándose a 37 °C durante 48 h. Por otro lado, las 
condiciones de reacción enzimática para obtener la mejor actividad (7.14 U/mg) fueron 
de 35 °C, pH 8, utilizando 10 g de proteína por mL y calculando actividad enzimática 
después de 20 minutos de reacción. Después de calentamiento a 50 °C durante 30 
min se observó la pérdida de aproximadamente el 40% de actividad. Finalmente se 
determinó el peso molecular de la enzima responsable de la hidrólisis de agavina, 
resultando entre 100 y 220 kDa, determinado por SDS-PAGE y zimografía. 
 
 
2 
CAPÍTULO II. INTRODUCCIÓN 
Después del almidón, los fructanos son los polisacáridos de mayor abundancia en la 
naturaleza, encontrados en diversas variedades de plantas. La inulina es un fructano 
lineal que consiste de unidades de fructofuranosa unidas por enlaces -(2→1), con un 
residuo de glucopiranosa terminal. Por otro lado, las levanas son fructanos lineales 
consistentes por unidades de fructofuranosa unidas por enlaces -(2→6), con un 
residuo de glucopiranosa terminal. Ambos tipos de fructanos están constituidos por 
hasta 100 residuos de fructofuranosa (Kango & Jain, 2011). 
Los fructooligosacáridos (FOS) están constituidos por 3 a 10 unidades de residuos de 
fructofuranosa, principalmente, pero pueden tener una molécula de glucopiranosa en 
su estructura. El papel de la inulina y los FOS en la alimentación humanaha quedado 
de manifiesto al establecer su clara relación con el mantenimiento de la microbiota 
intestinal: dado su carácter soluble, las inulinas cumplen el papel de fibra soluble en la 
alimentación, mientras que los FOS funcionan como prebióticos al ser asimilados de 
manera selectiva por Bifidobacterium y Lactobacillus de la microbiota (Huazano G. & 
López, 2013). 
Tanto inulinasas como levanasas son fructofuranosil hidrolasas producidas por una 
amplia variedad de microorganismos, capaces de hidrolizar inulinas y levanas, 
respectivamente. Poseen dos tipos de actividad: exo (que hidrolizan en enlaces 
terminales, produciendo unidades de fructofuranosa) y endo (que hidrolizan en enlaces 
dentro de la molécula, produciendo FOS) (Kango & Jain, 2011). 
La cosecha de agave en México tiene importancia industrial debido a las numerosas 
bebidas fermentadas y destiladas obtenidas de una amplia variedad de especies 
existentes en el país y, más recientemente, debido a la demanda de jarabes de 
fructosa de agave y algunos derivados funcionales. Las plantas de agave acumulan 
entre 13% y 17% (w/w) en peso fresco de fructanos, similar a la cantidad encontrada 
en la raíz de achicoria (15.2 a 20.5% en peso fresco), la principal fuente de inulina en 
 
 
3 
la actualidad. Mientras la inulina presente en la achicoria consiste en fructofuranosas 
unidas por enlaces -(2→1), los fructanos presentes en el agave, particularmente en 
Agave tequilana, poseen un grado de polimerización de 3 a 29 con un importante 
número de uniones -(2→6) entre fructofuranosas, además de uniones -(2→1) y 
unidades de glucopiranosa dentro de la molécula del fructano; así, los fructanos de 
agave (agavinas) son clasificados como estructuras hiperramificadas, diferentes a la 
inulina o a las levanas (López & col., 2003). 
Debido al importante potencial industrial de las inulinasas, el presente proyecto busca 
obtener enzimas que generen FOS y/o fructosa de una fuente alternativa a la raíz de 
achicoria: la planta de agave, endémica del territorio mexicano, de donde se extraen 
los fructanos ramificados (agavinas) para su hidrólisis enzimática mediada por 
microorganismos. Existen pocos estudios acerca de inulinasas que hidrolicen 
fructanos de agave, por lo que la determinación de condiciones de actividad 
inulinolítica máxima es parte también de este trabajo. 
 
 
 
4 
CAPÍTULO III. ANTECEDENTES 
3.1. AGAVE 
En México, el agave tiene una importancia económica debido a sus numerosas 
aplicaciones industriales en la producción de bebidas, alimentos, biocombustibles, 
fructanos y producción de fibras. Tiene además otros usos: alimenticio, medicinal, 
material de construcción, religioso, textil y decorativo (tabla 1) (Narváez Z. & Sánchez 
T., 2009). La especie de Agave con mayor importancia económica en el país es Agave 
tequilana Weber variedad azul, mejor conocida como Agave azul (Nava C. & col., 
2014). Sin embargo, existen aproximadamente 200 especies distintas del género 
Agave. 
Tabla 1. Principales usos de importancia socioeconómica y agroecológica del Agave. 
Uso Producto Parte de la planta utilizada 
Alimenticio Azúcar 
Guisos 
Envoltura de barbacoa 
Mixiotes 
Chinicuiles 
Tortillas 
Pan de pulque 
Miel 
Piña 
Flor y/o fruto 
Hojas 
Hojas 
Hojas 
Flor + nixtamal 
Piña 
Piña 
Bebidas Aguamiel, pulque, mezcal, tequila, sotol, vinagre, 
jarabe 
Piña 
Agrícola Evita erosión 
Composta (ferilizante) 
Planta completa 
Composta de hojas 
Forraje Para bovinos, caprinos y porcinos Hojas, flores, inflorescencia 
Construcción Cercas 
Tejas para el techo 
Canales de recolección de agua de lluvia 
Materiales compuestos: termoplásticos o resinas 
termofílicas 
Hojas 
Hojas 
Hojas 
Fibras 
Fibras Cestas, cepillos, ropa Fibras de las hojas y raíces 
 
 
5 
Medicinal Antiinflamatorio 
Útil en casos de anemia 
Hojas 
Miel y pulque 
Ornamental Accesorios: anillos y aretes 
Decoración navideña 
Arcos florales 
Semillas 
Planta completa 
Hojas 
Doméstico Jabón y detergente 
Vasos y contenedores de líquidos 
Agujas 
Hojas y raíces 
Hojas 
Espinas 
Otros Industria química y farmacéutica: medicamentos 
Productos de celulosa: papel 
Producción de etanol, celulosa y glucósidos 
Hojas, raíces y semillas 
Hojas 
Hojas (pulpa y residuos fibrosos) 
Cita: García H. y col., 2010 
Las plantas de agave están compuestas principalmente de dos partes: largas hojas 
con espinas y una parte llamada ‘‘piña’’ (U.S. Patente nº US2002/0119217A1, 2002). 
La Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación 
(SAGARPA) reportó que, en 2009, los estados mexicanos con mayor producción de 
Agave fueron: Jalisco con 6.59 x 105 ton/año, seguido por Oaxaca con 3.06 x 105 
ton/año y Nayarit con 1.18 x 105 ton/año (Nava C. & col., 2014). Las hojas o ‘‘pencas’’ 
de Agave son consideradas como un residuo poco explotado. Actualmente existe un 
interés industrial de aprovechar la planta completa, no solamente la piña; el empleo de 
residuos alimenticios que aparentemente no poseen ningún valor agregado es la 
materia prima para la industria biotecnológica. 
Cuando se utilizan fuentes naturales como materia prima de un proceso, siempre 
deben tomarse en cuenta programas de conservación e impacto ambiental 
(sustentabilidad), los cuales deberían ayudar a incrementar el entendimiento de las 
interacciones del ambiente con las especies. Estos aspectos tienen como principal 
objetivo el mantener los residuos dentro de la capacidad de asimilación del sistema, 
cosechar a una tasa compatible con la capacidad de regeneración de recursos 
naturales renovables y desarrollar sustitutos renovables para los recursos no 
renovables (Baena G., 2005). 
 
 
6 
3.1.1. Taxonomía 
El Agave era sagrado para la población azteca del México prehispánico, cuyo nombre 
en náhuatl es Metl. Charles Linneo le dio el nombre de Agave, palabra derivada del 
griego ‘‘noble’’ y del latín ‘‘admirable’’; este nombre le fue dado debido a la capacidad 
de estas plantas de crecer predominantemente en ambientes áridos, a pesar de que 
se les puede encontrar en otro tipo de ecosistemas (Gentry, 2004). 
El género Agave pertenece al orden Asparagales y a la familia Agavaceae, con más 
de 200 especies y 47 categorías intraespecíficas. Se ha reportado que en territorio 
mexicano se encuentran aproximadamente el 75% de las especies de Agave (García 
M. A., 2002). Existen otros reportes que clasifican al género Agave dentro de 12 
secciones con 82 especies, 21 especies y 23 variedades. Los géneros Yucca y Aloe 
son confundidos generalmente con el género Agave. Agave y Yucca difieren en su 
ecología reproductiva; son monocárpico y policárpico respectivamente (el 
monocarpismo hace referencia a un único episodio reproductivo vegetal antes de la 
muerte, mientras que policarpismo hace referencia a varios), además de que el Agave 
es un género de 7-10 millones de años, en contraste con Yucca, de 100 millones de 
años y menos especies (Good A. & col., 2006). 
Las especies reportadas de Agave de mayor influencia por su alta productividad son: 
A. utahensis, A. vilmoriniana, A. deserti, A. fourcroydes, A. sisilana, A. lechuguilla, A. 
salmiana, A. tequilana y A. mapisaga. La mayoría de estas especies son utilizadas 
para producir distintas fibras, lazos y jabones (Davis & col., 2011); sin embargo, A. 
tequilana es utilizado en la producción de tequila, mientras que A. salmiana y A. 
mapisaga son utilizados en la producción de pulque, ambas bebidas alcohólicas de 
importancia en la cultura mexicana (Alfaro R. & col., 2007). 
3.1.2. Distribución 
Las plantas del género Agave son perennes; es decir, que su tiempo de vida es mayor 
a dos años. El metabolismo que poseen, así como sus características fisiológicas y 
 
 
7 
morfológicas, les permiten sobrevivir bajo condiciones extremas; se les puede 
encontrar en planicies, llanuras, montañasy acantilados, incluyendo lugares 
montañosos con una altitud considerable. Las plantas del género Agave suelen crecer 
en suelos con pH neutro o ligeramente alcalino (Black & Osmond, 2003). 
El metabolismo utilizado por las plantas de este género es conocido como 
‘‘metabolismo ácido de las crasuláceas’’ (CAM, por sus siglas en inglés); estas plantas 
disminuyen el consumo y transpiración total de agua debido a que la absorción de CO2 
ocurre durante la noche, mientras que la asimilación de azúcares por fotosíntesis 
ocurre durante el día. Las especies de Agave poseen una baja demanda de nutrientes 
y un uso eficiente del agua, el cual es seis veces mayor que el de algunas especies 
C3 (Black & Osmond, 2003). 
México es el área con mayor diversidad de agaves en el mundo. De un total de 210 
especies, 159 pueden ser encontradas en territorio mexicano, de las cuales 119 son 
especies endémicas, es decir, solo son encontradas en este territorio. La mayoría de 
las especies de Agave se distribuyen principalmente hacia el occidente, centro, y sur 
de México, a lo largo de la Sierra Madre Occidental, el Eje Volcánico Transversal y la 
Sierra Madre del Sur. Son 14 las especies que se emplean en términos comerciales, 
ocho se usan en forma local y seis más se utilizan ocasionalmente. Agave angustifolia 
es la de mayor uso, cuya distribución abarca desde Sonora hasta Chiapas. A partir de 
las poblaciones locales de Agave angustifolia se domesticó el Agave tequilana y el 
Agave fourcroydes. Las especies utilizadas regionalmente y sus usos en bebidas 
alcohólicas se presentan en la tabla 2 (García M. A., 2002). 
Tabla 2. Principales especies del género Agave y su distribución en los estados del territorio mexicano. 
Región (Estado) Especie Uso como bebida 
Sonora Agave angustifolia 
Agave rhodacantha 
Agave shrevei 
Agave bovicornuta 
Agave colorata 
Bacanora (mezcal) 
Bacanora (mezcal) 
Mezcal 
Mezcal 
Mezcal 
 
 
8 
Tamaulipas Agave americana protamericana 
Agave montium-sancticaroli 
Vino – mezcal 
Vino – mezcal 
San Luis Potosí – Zacatecas Agave salmiana crassispina 
Agave tequilana 
Mezcal 
Mezcal 
Durango Agave duranguensis 
Agave angustifolia 
Agave bovicornuta 
Agave maximiliana 
Mezcal 
Mezcal 
Mezcal 
Mezcal 
Jalisco Agave tequilana Weber var. azul 
Agave maximiliana 
Agave valenciana 
Agave angustifolia 
Agave rhodacantha 
Tequila 
Raicilla (mezcal) 
Raicilla (mezcal) 
Licor de agave 
Licor de agave 
Michoacán Agave cupreata 
Agave inaequidens 
Agave aff. tequilana 
Licor de agave 
Licor de agave 
Licor de agave 
Guerrero Agave cupreata 
Agave angustifolia 
Mezcal 
Mezcal 
Puebla Agave potatorum 
Agave marmorata 
Agave angustifolia 
Agave salmiana salmiana 
Licor de agave 
Licor de agave 
Licor de agave 
Pulque 
Oaxaca Agave angustifolia 
Agave rhodacantha 
Agave potatorum 
Agave seemanniana 
Agave marmorata 
Agave karwinskii 
Agave americana var. americana 
Agave americana var. oaxacencis 
Mezcal 
Mezcal 
Mezcal 
Mezcal 
Mezcal 
Mezcal 
Mezcal 
Mezcal 
Chiapas Agave americana 
Agave salmiana 
Licor de agave 
Licor de agave 
 
 
 
9 
‘‘Mezcal’’ es el nombre común otorgado a las bebidas obtenidas de la destilación de 
los mostos fermentados de las piñas cocidas del maguey, o agave. Entre 28 y 39 
especies de agaves han sido empleadas tradicionalmente para la elaboración de 
mezcal en al menos 26 estados de la República Mexicana. Existen, por tanto, gran 
cantidad de mezcales según la especie o combinación de especies y los instrumentos 
y procesos de elaboración que cambian de una región a otra: tequila, bacanora, raicilla, 
minero, de pechuga, tobalá, tuche y tuxca son solo algunos nombres locales de los 
mezcales. Las diferencias en los procesos están dadas por los recipientes usados para 
la fermentación, la destilación y el reposo (barro, madera, troncos, cueros, vidrio, roca 
y cobre) y los aditivos (carne, frutas, insectos y especias), de acuerdo con cada 
tradición (Illsley & Larson, 2012). 
3.1.3. Agave tequilana Weber variedad azul 
El Agave tequilana Weber variedad azul es una de las plantas más importantes en 
México debido a su valor económico, utilizándose como materia prima en la 
elaboración de ‘‘tequila’’, bebida destilada resultante de la fermentación de azúcares 
de dicho agave. El uso de agaves para la producción de bebidas data desde la época 
prehispánica, usándose en ritos ceremoniales; sin embargo, no fue hasta la llegada de 
los españoles, quienes trajeron consigo el conocimiento de la destilación, que la bebida 
se transformó en el tequila actual (Cedeño C., 1995). 
El proceso de elaboración de tequila comprende 4 etapas. En la primera, la piña del 
agave es cocida para hidrolizar los polímeros, principalmente fructanos, en azúcares 
fermentables. La segunda etapa consiste en la extracción de azúcares mediante 
molienda, obteniéndose el jugo de agave, que puede ser mezclado con azúcares de 
otras fuentes. La tercera etapa, y la más importante, consiste en la fermentación, en la 
cual los azúcares son transformados en etanol y otros compuestos como ésteres y 
ácidos orgánicos. Éstos, junto con otros compuestos generados durante el cocimiento 
dan las características de sabor al tequila. En la última etapa, el mosto fermentado es 
sometido a destilación, obteniéndose tequila blanco. Después de las cuatro etapas es 
 
 
10 
requerido un proceso de maduración, llevado a cabo en barriles de roble; para tequila 
reposado el tiempo de maduración es de mínimo 2 meses, mientras que para tequila 
añejado el tiempo mínimo es de un año (Cedeño C., 1995). Las especificaciones que 
debe tener una bebida de tipo ‘’mezcal’’ para ser considerada como tequila están 
contenidas en la NOM-006-SCFI-2012, la cual debe seguirse por los productores de 
tequila para asegurar un producto final de calidad. 
Agave tequilana Weber variedad azul se caracteriza por extenderse de forma radial 
con hojas largas y angostas; puede presentar diversos tamaños que van desde 1.7 a 
2 m de altura y hasta 1.5 m de ancho, disminuyendo su tamaño significativamente 
cuando florecen. Las hojas suelen ser rígidas, de 90 a 140 cm de largo y de 8 a 12 cm 
de ancho, excluyendo el área de los dientes; poseen la característica de ser lineales-
lanceoladas de color azul o azul verdoso (Valenzuela Z., 2003). 
3.1.3.1. Composición de Agave tequilana Weber variedad azul 
La planta de Agave tequilana Weber variedad azul es importante no solo por su uso 
como materia prima en el proceso de elaboración de tequila, sino también por la 
singularidad de su composición, la cual es resumida en las tablas 3 y 4. 
Tabla 3. Composición del Agave tequilana Weber variedad azul. 
 Piña y base de la penca (%) Penca, zona media (%) 
Carbohidratos 22.3 – 22.7 9.0 
Proteína 1.4 – 1.4 0.35 
Fibra dietética insouluble 5.9 – 7.1 6.8 
Minerales 1.7 – 1.9 0.7 
Materia seca 31 – 31.5 17.4 
Cita: Praznik & col., 2002 
Tabla 4. Composición de carbohidratos en Agave tequilana Weber variedad azul. 
 Piña y base de la penca (%) Penca, zona media (%) 
Monosacáridos (Glu, Fru) Ausentes 5.2 
Sacarosa 0.5 – 1.3 9.3 
 
 
11 
Fructooligosacáridos DP 3 – 10 35 – 43 60 
Fructanos DP 11 - 60 56 - 64 30 
Cita: Praznik & col., 2002 
Los FOS presentes en las plantas de Agave tequilana Weber variedad azul han sido 
reportados como ramificados. Esta característica, única en los FOS presentes en estas 
plantas, ha llevado a nombrarlos como ‘‘agavinas’’ (López & col., 2003). Debido a la 
singular composición de fructanos en las plantas de esta especie, se ha investigado el 
potencial uso de ésta como sustrato para la producción de enzimas de importancia 
comercial. 
3.1.4. Potencial biotecnológico del agave 
Una característica muy importante de las plantas del género Agave es su alto 
contenido de carbohidratos solubles, los cuales pueden ser procesados para 
transformarlos en azúcaresfermentables y éstos ser transformados a etanol mediante 
la acción de diversos microorganismos (Caspeta & col., 2014). 
Las plantas del género Agave poseen un importante contenido de materia 
lignocelulósica, principalmente en las hojas. Se han desarrollado diversos 
procedimientos para obtener estos materiales, algunos de los cuales han resultado 
tener potencial como biomateriales aplicables en la industria farmacéutica (Ruiz & col., 
2011). A pesar de la dificultad que conlleva la degradación de materia lignocelulósica, 
existen diversos microorganismos capaces de llevar a cabo dicha acción mediante el 
uso de enzimas celulasas (de Siqueira & col., 2010). 
El género Agave es una importante fuente de fructanos, por lo que se ha buscado una 
aplicación biotecnológica: producción de enzimas que degraden dichos fructanos. 
Existen muchas especies microbianas capaces de producir dichas enzimas, desde 
bacterias hasta levaduras y hongos, las cuales son utilizadas en la industria alimentaria 
para la producción de jarabes de alta fructosa o de FOS a partir de fructanos de agave 
(Ávila F. & col., 2011). 
 
 
12 
3.2. FRUCTANOS 
Los fructanos son polímeros compuestos principalmente de fructofuranosa y un 
residuo de glucopiranosa; son polimerizados a partir de una molécula de sacarosa, por 
lo que comúnmente sólo existe un residuo de glucosa en el polímero. Son polímeros 
ampliamente distribuidos en la naturaleza, siendo producidos por una gran variedad 
de organismos; este polímero no se encuentra en el reino animal (Arrizón & col., 2014). 
3.2.1. Inulinas, levanos y fructooligosacáridos (FOS) 
Los fructanos pueden diferenciarse por el grado de polimerización, la presencia de 
ramificaciones, el tipo de enlace entre las unidades de fructofuranosa adyacentes y la 
posición de los residuos de glucopiranosa. Existen dos clases estructurales de 
fructanos: inulinas y levanos. Sin embargo, existen 4 clases más que podrían 
denominarse como subcategorías: neoseries, tanto de inulinas como de levanos, 
graminianos y agavinas (figuras 1 y 2) (Ulloa & col., 2010). 
 
Figura 1. Estrutura de fructanos tipo (a) inulina, (b) levano, (c) neoinulina y (d) neolevano (Arrizón & 
col., 2014). 
 
 
13 
 
Figura 2. Estructura de fructanos ramificados tipo (a) gramiano y (b) agavina (López & Mancilla M., 
2007). 
Las inulinas son polímeros lineales; consisten de residuos de fructofuranosa unidas 
por enlaces -(2→1) con un residuo de glucopiranosa terminal (figura 1a). Este tipo de 
fructanos se encuentran principalmente en plantas, donde poseen una función de 
reserva energética (Tian, 2013). El grado de polimerización (DP, que indica el número 
promedio de residuos de monómero, fructofuranosa en este caso) de las inulinas 
puede ser de hasta 200, pero también puede ser muy bajo (Kango & Jain, 2011). Por 
ejemplo, se ha encontrado que el mayor DP en inulina corresponde a la proveniente 
de Cynara scolimus, mejor conocida como ‘‘alcachofa globo’’, mientras que el DP 
promedio en la mayoría de las especies es de 10 a 30, tal como el de las inulinas 
provenientes de alcachofa (Helianthus tuberosus) o de la raíz de achicoria (Chicorium 
intybus) (Ulloa & col., 2010). 
Los levanos son, al igual que las inulinas, polímeros lineales; consisten de residuos de 
fructofuranosa unidas por enlaces -(2→6) con un residuo de glucopiranosa terminal 
(figura 1b) (Tian, 2013). El DP de las levanas es muy diverso dependiendo de la fuente; 
 
 
14 
se ha encontrado un DP de aproximadamente 10,000 en levanos producidos por 
Zymomonas mobilis (Andersone & col., 2004), pero en plantas el DP es menor, de 
máximo 150 en especies de la familia Poaceae (Ulloa & col., 2010). 
Existe otro tipo de fructanos conocidos como neo-series, sean de inulina o de levano, 
dependiendo del tipo de enlace entre los residuos de fructofuranosa, cuyo residuo de 
glucopiranosa se encuentra en una posición central (figuras 1c y 1d) (Olvera & col., 
2007). Este tipo de fructanos se encuentra comúnmente en especies de las familias 
Alliaceae y Asparagaceae, como en cebolla (Allium cepa) y espárrago (Asparagus 
officinalis) (Ulloa & col., 2010); también se encuentran en la mayoría de las especies 
del género Agave (López & Mancilla M., 2007). 
Otro tipo adicional de fructanos presenta la característica de contar con ambos tipos 
de enlaces, tanto -(2→1) como -(2→6), resultando en un polímero ramificado 
conformado principalmente por residuos de fructofuranosa y un residuo de 
glucopiranosa terminal (figura 2a). Estos fructanos son comunes en pastos y cereales 
de la familia Poaceae, conocidos comúnmente como gramíneas o poáceas, por lo que 
son denominados graminianos (Chacón V., 2006). De manera similar existen las 
agavinas, que deben su nombre a que son encontadas en varias especies del género 
Agave, de entre las que destacan Agave tequilana y Agave Veracruz (Ulloa & col., 
2010). Las agavinas cuentan tanto con enlaces -(2→1) como -(2→6) entre residuos 
de fructofuranosa, tratándose de un polímero ramificado; lo que las diferencia de los 
graminianos es la posición de la glucopiranosa, la cual se encuentra en una posición 
central (figura 2b) (López & Mancilla M., 2007). 
Los FOS son oligómeros de fructanos, constituídos por tan solo 2 a 10 residuos de 
fructofuranosa en su estructura, y pueden ser clasificados de la misma manera que los 
fructanos, por el tipo de enlaces entre fructofuranosas, por la posición de la 
glucopiranosa en la estructura o por las ramificaciones que posea (Ulloa & col., 2010). 
 
 
15 
En las plantas, el proceso de síntesis de fructanos se lleva a cabo mediante la acción 
de al menos dos enzimas. En una primera etapa, la sacarosa-sacarosa 
fructosiltransfersa (SST) se encarga de iniciar el proceso al incorporar un residuo de 
fructofuranosa a una molécula de sacarosa, formando un trisacárido denominado 1-
ketosa. En una segunda etapa, mediante una enzima del grupo fructosiltransferasa, se 
añaden más residuos de fructofuranosa al trisacárido, dando lugar a fructanos de 
mayor peso molecular (Olvera & col., 2007). 
3.2.2. Fuentes de fructanos 
Los fructanos, y más explícitamente las inulinas, son compuestos orgánicos 
fundamentalmente de origen vegetal. Sin embargo, también existen fructanos muy 
específicos de origen bacteriano e incluso fúngico (Chacón V., 2006). 
Existen aproximadamente 36,000 especies diferentes de plantas que contienen 
fructanos como carbohidratos de reserva. Las principales familias de plantas que 
incluyen fructanos en su composición son las familias Liliaceae, Amarillydaceae, 
Gramineae, Poaceae, Solanaceae y Compositae (Chacón V., 2006). 
Es común encontrar fructanos en alimentos tan comunes como el trigo, que de hecho 
es la principal fuente de fructanos en la dieta de los Estados Unidos. También es 
importante la cantidad de fructanos presentes en otros alimentos, tales como ajo 
(Allium sativum), cebolla, (Allium cepa), cebada, (Hordeum distichum, Hordeum 
tetrastichum, Hordeum hexastrichum), cacahuate (Arachis hypogaea), tomate 
(Lycopersicon esculentum), espárrago (Asparagus officinalis), puerro (Allium porrum) 
e incluso plátano (Musa sp.) (Flickinger & Fahey , 2002). No obstante, si de cantidades 
se trata, las principales fuentes de fructanos son la achicoria (Cichorium intybus), 
alcachofa (Cynara scolymus), alcachofa de Jerusalén (Helianthus tuberosus), 
alcachofa globo (Cynara cardunculus), yacón (Smallanthus sonchifolius) y dalia 
(Dahlia pinnata). Generalmente, el grado de polimerización de los fructanos presentes 
 
 
16 
en estas pantas es bajo (López M. & col., 2005). En la tabla 5 se presentan algunas 
especies vegetales y contenido de fructanos: 
Tabla 5. Contenido aproximado de fructanos en diversas especies vegetales. 
Planta Fructanos (% en producto fresco) 
Achicoria (Cichorium intybus) 16-25 
Ñame (Dioscorea sp.) 19-20 
Topinambur o papa de Jerusalén (Helianthustuberosus) 14-19 
Agave (Agave sp.) 13-17 
Diente de león (Taraxacum officinale) 12-15 
Ajo común (Allium sativum) 9-16 
Yacón (Smallanthus sonchifolius) 3-19 
Alcachofa (Cynara scolymus) 3-10 
Puerro (Allium porrum) 3-10 
Cebolla (Allium cepa) 2-6 
Espárrago (Asparagus afficinalis) 2-3 
Cita: Van Loo & col., 1995 
La inulina proveniente de la achicoria es la que brinda la mejor opción en cuanto a 
cantidad y calidad; de hecho, la mayor parte de la inulina extraída para su uso 
comercial proviene de la raíz de achicoria (López M. & col., 2005). Sin embargo, en 
recientes años se han estudiado nuevas fuentes de fructanos, entre los cuales 
destacan especies del género Agave. 
Los fructanos se extraen generalmente de los vegetales por molienda y solubilización 
en agua caliente. Posteriormente se trata el extracto con una mezcla de enzimas que 
incluye, entre otras, sacarasa, amilasa y maltasa para hidrolizar los carbohidratos 
presentes, menos los fructanos. Los azúcares resultantes se eliminan por lavado con 
etanol al 80%, o bien a través de elusión por una columna de intercambio iónico. Los 
fructanos obtenidos son tratados con una enzima purificada o inmovilizada si se 
desean transformar en fructanos de menor peso molecular, FOS (Chacón V., 2006). 
La hidrólisis enzimática se prefiere por sobre la ácida dados los mejores rendimientos 
y menores subproductos no deseados (de Moura & col., 2015). 
 
 
17 
3.2.3. Importancia de fructanos y fructooligosacáridos: propiedades y 
aplicaciones en la industria agroalimentaria 
La formulación de alimentos benéficos para la salud es una tendencia que se ha 
popularizado en la industria alimenticia debido a la fuerte relación demostrada que 
existe entre la comida que ingerimos y nuestra salud. Se han acumulado evidencias 
científicas del beneficio de algunos ingredientes alimenticios para la prevención de 
algunas enfermedades específicas (Sangeetha & col., 2005). Se consideran como 
alimentos funcionales aquellos alimentos que se consumen como parte de la dieta 
normal y contienen componentes biológicamente activos que ofrecen beneficios a la 
salud y reducen el riesgo de sufrir enfermedades (Ulloa & col., 2010). 
Un gran número de alimentos funcionales se han introducido al mercado de manera 
exitosa; muchos de ellos contienen ingredientes funcionales, tales como fibra dietética, 
oligosacáridos, polioles y fenoles, péptidos y proteínas, prebióticos y probióticos, 
antioxidantes, ácidos grasos poliinsaturados, entre otros. Se ha puesto singular 
atención en los oligosacáridos presentes en la dieta, específicamente en los FOS 
(Sangeetha & col., 2005). 
Entre los carbohidratos no digeribles (celulosa, almidón, FOS), los oligosacáridos 
presentan importantes características fisicoquímicas benéficas para la salud de quien 
los consume; por esta razón su aplicación como ingredientes funcionales ha ido en 
aumento (Qiang & col., 2009). Los FOS como ingredientes no digeribles pueden 
beneficiar al consumidor mediante la estimulación selectiva de crecimiento de 
bacterias benéficas en el intestino grueso; de esta forma se promueve un balance de 
la microflora intestinal y disminución de infecciones gastrointestinales (Roberfroid, 
2007). 
Las funciones benéficas causadas por los FOS en la dieta de los seres humanos puede 
resumirse de la siguiente forma: forman un gel viscoso en el intestino que disminuye 
la absorción de glucosa, provocando baja concentración de glucosa en sangre; su 
 
 
18 
aporte calórico es bajo; son no cariogénicos, mejoran el ambiente intestinal y modifican 
la microbiota de tal manera que predominen bacterias benéficas y no patógenas; 
estimulan la absorción de ciertos minerales, tales como calcio, magnesio y hierro 
(Qiang & col., 2009). De tal manera, el consumo de FOS puede reducir el riego de 
enfermedades gastrointestinales, cardiovasculares y podría evitar cáncer de colon y 
obesidad (Arrizón & col., 2014). 
3.2.3.1. Funcionalidad como prebióticos 
El uso de los FOS como prebióticos se debe a la singular característica de que no son 
digeridos ni absorbidos hasta llegar al intestino grueso, por lo que son considerados a 
su vez como fibra dietética, donde inducen la fermentación y estimulan selectivamente 
el crecimiento de bacterias benéficas (Bifidobacterium y Lactobacillus) (Qiang & col., 
2009). 
3.2.3.2. Prevención de infecciones por bacterias patógenas 
El tracto gastrointestinal es un complejo ecosistema en el que habitan 
aproximadamente 1011 UFC (unidades formadoras de colonias) por gramo de materia 
intestinal. Esta enorme población bacteriana juega un papel muy importante en la 
nutrición y salud del hospedero. La microbiota en el colon fermenta materia orgánica 
que no puede ser digerida en el intestino delgado; esto incluye polisacáridos no 
digeribles como el almidón o los fructanos, así como algunos aminoácidos y proteínas. 
Los principales productos de la fermentación de fructanos en el colon son ácidos 
grasos de cadena corta (SCFAs), principalmente ácido acético (C2:0), ácido propiónico 
(C3:0) y ácido butírico (C4:0); sin embargo, otros productos pueden ser ácido láctico, 
ácido succínico y etanol, los cuales solamente funcionan como intermediarios en el 
proceso de fermentación y no son acumulados significativamente en el colon. La 
fermentación de fructanos también produce gases como CO2, CH4, H2, además de 
calor. Un incremento en la síntesis de SCFAs propicia un ambiente de acidez en el 
intestino, ambiente poco favorable para la colonización de bacterias patógenas. La 
 
 
19 
producción de SCFAs es afectada por diversos factores, incluyendo la fuente del 
sustrato, en particular, la composición química del sustrato fermentable, la cantidad de 
sustrato disponible, la composición de la microbiota intestinal, así como las 
interacciones de competitividad y/o cooperatividad entre diferentes géneros 
bacterianos (figura 3) (Huazano G. & López, 2013). 
 
Figura 3. Consecuencias de la ingesta de fructanos como prebióticos: los prebióticos son utilizados 
selectivamente por los probióticos, los cuales los fermentan para producir ácidos grasos de cadena 
corta (SCFAs), presentando mejoras en el hospedero (Huazano G. & López, 2013). 
La mayoría de los SCFAs son absorbidos en distintas regiones del colon. Una vez 
absorbidos son metabolizados de tres maneras distintas: (1) las células epiteliales de 
la primera sección del intestino grueso (ciego) utilizan ácido butírico (C4:0) como 
principal fuente de energía y mantenimiento; (2) los hepatositos metabolizan ácido 
butírico (C4:0) y propiónico (C3:0) residual utilizándolos en gluconeogénesis; (3) los 
miocitos generan energía a partir de la oxidación de ácido acético (C2:0) residual 
(Huazano G. & López, 2013). 
Se ha demostrado que los fructanos de agave, específicamente de Agave tequilana 
Weber variedad azul, con un DP de entre 3 y 22, estimulan el crecimiento de los 
géneros Bifidobacterium y Lactobacillus, más que otros fructanos. Adicionalmente, se 
ha demostrado también que los fructanos procedentes de dicha especie de agave 
producen en su mayoría ácido acético (C2:0) y ácido láctico como producto de 
fermentación por bacterias probióticas. Por último, se ha demostrado que los fructanos 
ramificados, específicamente las agavinas, producen una mayor cantidad de ácidos 
como productos de fermentación en comparación con fructanos lineales, que producen 
menos (Urías S. & col., 2008). 
Prebióticos
•Fructanos
Microbiata 
intestinal
•Bifidobacterium
•Lactobacillus
Productos de 
fermentación
•Ácidos grasos 
de cadena corta 
(SCFAs): acético 
(C2:0), 
propiónico 
(C3:0), butírico 
(C4:0)
Disminución de pH
•Efectos 
benéficos para 
el hospedero
•Codiciones 
adversas para 
bacterias 
patógenas
 
 
20 
3.2.3.3. Prevención de cáncer de colon 
El cáncer colorrectal es una de las causas más frecuentes de muerte en poblaciones 
de paísesdesarrollados donde predomina la ‘‘dieta Western’’, alta en grasas y 
proteínas. Sin embargo, algunos ingredientes alimenticios pueden ser incluidos en la 
dieta para contrarrestar los factores causantes de dicho cáncer; uno de estos 
ingredientes puede ser la fibra dietética, y más específicamente, fructanos tipo inulina 
(Pool Z., 2005). 
Los fructanos son fermentados por la microbiota intestinal, produciendo SCFAs, entre 
los cuales destaca el ácido butírico (C4:0), el cual actúa como un agente antitumoral, 
induciendo la apoptosis en células cancerosas del colon, pero no en células epiteliales 
(Ruemmele & col., 2003). 
3.2.3.4. Mejoramiento de absorción de minerales 
La principal acción que relaciona a los FOS con un mejoramiento en la absorción de 
minerales es la fermentación por bacterias probióticas, las cuales convierten a los 
prebióticos en SCFAs, disminuyendo el pH en el íleon (segmento final del intestino 
delgado) y creando un ambiente favorable para la solubilidad de los minerales. 
Adicionalmente, se ha observado hipertrofia en el ciego (primera sección del intestino 
grueso), la cual aumenta el volumen donde los minerales no absorbidos en el íleon 
pueden acumularse; como consecuencia, hay un importante incremento en la 
concentración de minerales solubles (Yu Wang & col., 2010). 
3.2.3.5. Otras propiedades de los fructooligosacáridos 
Las propiedades fisicoquímicas y biológicas de los FOS son tales que tienen muchas 
implicaciones que trascienden su naturaleza de fibra dietética o de prebiótico, y que 
son de importancia en la salud humana (Chacón V., 2006). 
 
 
21 
El consumo de FOS evita la aparición de lesiones intestinales ulcerativas, siendo el 
tratamiento de corto tiempo basado en la ingesta de FOS y probióticos, una de las 
mejores terapias para la inflamación asociada a la colitis ulcerativa activa (Borruel, 
2007). 
El consumo de FOS, los cuales son considerados de muy bajo nivel calórico (1.6 a 2.7 
kcal/g), ayuda a la prevención de arterioesclerosis, enfermedades cardiovasculares e 
hipertrigliceridemia, enfermedades asociadas a las dietas hipercalóricas (Chacón V., 
2006). Al consumir FOS suele darse una reducción en los niveles de triglicéridos, 
colesterol y lipoproteínas. La hipotrigliceridemia se explica por el descenso en el 
plasma sanguíneo de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, por sus siglas en 
inglés), ya que los FOS inhiben la capacidad de interesterificación del palmitato hacia 
triacilgliceroles, reduciéndose como resultado la lipogénesis hepática (Marquina & 
Santos, 2003). 
3.2.3.6. Aplicaciones en la industria agroalimentaria 
Desde un punto de vista legal, los fructanos se consideran como macronutrientes e 
ingredientes, no como aditivos, que deben declararse en el etiquetado de alimentos 
como inulina. Ni la FDA (Food and Drug Administration) ni el EUFIC (European Food 
Information Council), autoridades reguladoras de ingredientes y aditivos alimentarios 
en Estados Unidos y en la Unión Europea respectivamente, consideran a los fructanos 
como aditivos; sin embargo, la FDA, a través de su CFR (Code of Federal Regulations), 
capitulo 21, considera a la inulina como un ingrediente GRAS (Generally Recognized 
as Safe). 
Los principales usos de los fructanos son como sustitutos no cariogénicos e 
hipocalóricos de edulcorantes como la sacarosa o la sucralosa (Golob & col., 2004). 
En alimentos de humedad muy elevada, especialmente en productos de heladería y 
otros derivados lácteos, así como en embutidos, los fructanos adoptan una textura y 
una palatabilidad muy similar a la de la grasa (Murphy, 2001; Özer & col., 2005). 
 
 
22 
En el caso de los edulcorantes, la libertad de sustitución es más limitada dado que el 
dulzor de la inulina es de apenas el 30% generado por la sacarosa, razón por la cual 
la sustitución suele ser parcial, especialmente con edulcorantes fuertes (acesulfame 
K, aspartame, sucralosa), con los cuales por lo general existe sinergia (Chacón V., 
2006; Gallagher & col., 2003; Brennan & col., 2004). 
Los fructanos también son conocidos por su capacidad de estabilizar espumas y 
emulsiones en su estado hidratado (Murphy, 2001). La inulina, además se caracteriza 
por formar geles acuosos que tienden a ser cada vez menos plásticos a medida que 
aumenta su concentración (Bot & col., 2004). 
3.2.3.7. Aplicaciones alternativas 
Se le han dado otros usos a los fructanos además de los ya mencionados, 
principalmente a la inulina. Entre ellos destacan el uso de ésta como sustrato de 
hidrólisis para la producción de fructosa o etanol; no obstante, los métodos aún no 
compiten con los procesos actuales de obtención de dichos productos. 
Existe un interés especial en el uso de fructanos provenientes de Agave tequilana 
Weber variedad azul (agvinas), los cuales poseen una estructura ramificada, distinta a 
las inulinas. Los FOS obtenidos de agavinas poseen un mejor efecto prebiótico que 
los FOS obtenidos de inulinas, traduciéndose en un mejor efecto de prevención de 
infección por bacterias patógenas gastrointestinales, mejor efecto preventivo en contra 
de cáncer de colon y mejor absorción de minerales. Además, de los fructanos de agave 
también se pueden obtener fructosa y etanol, aplicables a la industria de alimentos y 
energía, respectivamente (Caspeta & col., 2014). 
3.3. ENZIMAS 
La vida, tal y como la conocemos, depende de la existencia de ciertos catalizadores 
específicos y poderosos: las enzimas. Prácticamente toda reacción bioquímica es 
 
 
23 
catalizada por alguna enzima. Todas las enzimas son proteínas (pero no todas las 
proteínas son enzimas); muchas de ellas requieren de complementos no proteicos, 
coenzimas o cofactores, para su actividad catalítica. Las enzimas pueden clasificarse 
de acuerdo a la reacción bioquímica que catalicen (tabla 6) (Lehninger & col., 2005). 
Tabla 6. Clasificación internacional de las enzimas. 
Grupo Tipo de reacción catalizada 
EC 1 (Oxidoreductasas) Transferencia de electrones (iones hidruro o átomos de H) 
EC 2 (Transferasas) Transferencia de grupos funcionales (metilo, acilo, amino, fosfato) 
EC 3 (Hidrolasas) Hidrólisis (transferencia de grupos funcionales hacia el agua) 
EC 4 (Liasas) Adición de grupos funcionales a dobles enlaces o formación de dobles 
enlaces por remoción de un grupo funcional 
EC 5 (Isomerasas) Transferencia de grupos funcionales entre una misma molécula 
EC 6 (Ligasas) Formación de enlaces C-C, C-S, C-O o C-N por reacciones de 
condensación asociadas a ruptura de ATP 
Cita: Lehninger & col., 2005. 
Toda enzima posee también un código numérico, denominado ‘‘EC number’’ (Enzyme 
Commission number), el cual funciona como un sistema de nomenclatura, asociando 
una serie de números dependiendo de la reacción que catalice una enzima dada 
(Lehninger & col., 2005). 
Las enzimas son catalizadores realmente efectivos; pueden aumentar la velocidad de 
una reacción en factores desde 105 hasta 1017. Las reacciones catalizadas 
enzimáticamente se caracterizan por la formación de un complejo entre el sustrato y 
la enzima (complejo enzima-sustrato); esta unión se lleva a cabo en un sitio de la 
enzima, conocido como ‘‘sitio activo’’. La función de las enzimas se debe a que éstas 
disminuyen la energía de activación de una reacción específica, aumentando 
consecuentemente la velocidad a la que ésta se lleva a cabo, pero sin modificar el 
cambio de energía libre; es decir, las enzimas catalizan una reacción reversible en 
ambas direcciones (Lehninger & col., 2005). 
 
 
24 
La temperatura afecta a las reacciones catalizadas por enzimas de manera similar que 
a las reacciones convencionales; al aumentar la temperatura, la energía de las 
moléculas permite que la reacción se lleve a cabo a mayor rapidez. Sin embargo, las 
enzimas, a determinada temperatura pierden su conformación, es decir, se 
desnaturalizan, impidiendo por completo la catálisis de lareacción. Es por esta razón 
que toda enzima posee una temperatura recomendada de trabajo a la cual no se 
desnaturalice y se lleve a cabo la catálisis (Lehninger & col., 2005). 
Otro parámetro que afecta a las enzimas es el pH. El pH afecta la ionización de 
residuos de aminoácidos del sitio activo que pueden estar involucrados en la unión del 
sustrato o puede afectar la ionización de residuos de aminoácidos implicados en la 
estabilidad de la enzima; la primera afecta directamente a la actividad enzimática, 
mientras que la segunda la afecta indirectamente al estar relacionada con la 
estabilidad proteica (Lehninger & col., 2005). 
3.3.1. Inulinasas 
Existen dos procesos enzimáticos para la síntesis de FOS: (1) la hidrólisis enzimática 
de fructanos y (2) la síntesis enzimática a partir de sacarosa. La primera es llevada a 
cabo por hidrolasas, mientras que la segunda es mediada por transferasas (Arrizón & 
col., 2014). Por otro lado, la síntesis enzimática de fructosa es llevada a cabo mediante 
hidrólisis de diversos sustratos, principalmente del almidón obtenido de maíz. Sin 
embargo, la obtención de jarabes de alta fructosa a partir de almidón requiere la acción 
de tres enzimas: -amilasa y gluco-amilasa y gluco-isomerasa. 
Las inulinasas son fructofuranosil hidrolasas producidas por una amplia variedad de 
organismos, incluyendo plantas, bacterias, hongos y levaduras. La hidrólisis de inulina 
puede llevarse a acabo por la acción de dos enzimas: endo y/o exo-inulinasas. Las 
exo-inulinasas (E.C. 3.2.1.80) actúan en los extremos de la inulina, hidrolizando 
enlaces -(2→1), produciendo unidades de fructofuranosa, siendo capaces de 
continuar con la hidrólisis hasta alcanzar la glucopiranosa en el extremo opuesto de la 
 
 
25 
inulina. Por otro lado, las endo-inulinasas (E.C. 3.2.1.7) actúan sobre los enlaces -
(2→1) internos de la inulina, produciendo FOS de diversos tamaños. Los productos 
obtenidos por la hidrólisis de inulina pueden ser aplicados para la producción de 
jarabes de alta fructosa o de FOS de diversos tamaños (Kango & Jain, 2011). 
Existen gran cantidad de estudios relacionados con la búsqueda de inulinasas, sean 
endo o exo, puesto que ambas son de interés por la producción de fructosa y/o FOS, 
respectivamente (tabla 7). Sin embargo, existen muy pocos reportes de inulinasas que 
actúen en fructanos ramificados, como las agavinas, cuyos FOS ramificados poseen 
un mejor efecto prebiótico comparado con FOS lineales, como se menciona en la 
sección 3.2.3.1. 
Tabla 7. Especies microbianas productoras de endo- y exo-inulinasas. 
Fuente de la 
enzima Tipo de enzima 
T 
(°C) pH Actividad Referencia 
Aspergillus niger 
20OSM 
Endo-inulinasa 
extracelular, 
purificada 
55 5 1158 U/mg (Skowronek & Fiedurek, 2006) 
Aspergillus niger 
ATTC 20611 
Endo-inulinasa 
extracelular, 
purificada 
50 6.5 3199 U/mL (Dinarvand & col., 2012) 
Bacillus 
amyloliquefaciens 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
cruda 
30 7.2 0.123 U/mL (Gavrailov & Ivanova, 2014) 
Bacillus 
amyloliquefaciens 
Levanosacarasa 
extracelular 
purificada 
37 6 438 U/mg (Tian & Karboune, 2012) 
Bacillus 
amyloliquefaciens 
ATTC 23350 
Levanosacarasa 
intracelular 
purificada 
parcialmente 
30 6 35 U/mg (Tian & col., 2014) 
Bacillus cereus 
Be9 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
cruda 
40 7 57.1 U/mg (Ghadbaan & Aldeen, 2015) 
Bacillus polymyxa 
29 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
cruda 
35 7 37.5 U/mL (Zherebtosov & col., 2002) 
Bacillus polymyxa 
722 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
cruda 
35 7 722 U/mL (Zherebtosov & col., 2002) 
 
 
26 
Bacillus smithi T7 
Endo-inulinasa 
extraceluar, 
purificada 
70 4.5 135.22 U/mL (Gao & col., 2009) 
Bacillus sp. SG7 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
cruda 
60 6.5 223.85 U/mL (Ivanova & Gavrailov, 2014) 
Bacillus subtilis 
68 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
cruda 
35 7 38.94 U/mL (Zherebtosov & col., 2002) 
Candida sp. LEB-
13 
Endo-inulinasa 
extracelular, 
purificada 
65 4 55.2 U/mL (Hernalsteens & Maugeri, 2008) 
Cryptococcus sp. 
LEB-V2 
Endo-inulinasa 
extracelular 65 4 
124.8 
U/mg (Maugeri & Hernalsteens, 2008) 
Debaryomyces 
occidentalis 
ATTC 26077 
Endo-inulinasa 
extracelular, 
purificada 
50 5.6 0.3 U/mL (Álvaro B. & col., 2007) 
Kluyceromyces 
marxianus NCYC 
587 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
cruda 
30 6.8 735 U/mL (Makino & col., 2009) 
Kluyveromyces 
marxianus YS-1 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
purificada 
50 5.5 413 U/mg (Singh & col., 2007) 
Pichia 
guilliermondii 
2E00048 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
cruda 
60 6 61.5 U/mL (Gong & col., 2007) 
Saccharomyces 
sp. 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
cruda 
50 4.5 0.128 U/mg (Garuba & Onilude, 2012) 
Streptomyces sp. 
CP01 
Exo-inulinasa 
extracelular, 
purificada 
55 6 290.2 U/mg (Laowklom & col., 2012) 
Xanthophyllomyc
es dendrorthous 
ATTC MYA-131 
Endo-inulinasa 
extracelular, 
purificada 
65 5.6 0.7 U/mL (Linde & col., 2012) 
 
 
27 
CAPÍTULO IV. JUSTIFICACIÓN 
De las 159 especies de agave presentes en el territorio mexicano, destaca el Agave 
tequilana Weber variedad azul por su uso en la industria tequilera, la cual aprovecha 
los azúcares presentes en la piña, utilizándolos en los procesos de fermentación para 
la producción etanol. Sin embargo, de la totalidad de la planta, se desechan las pencas, 
generando un importante volumen de residuos de aproximadamente 3 mil 397.5 
millones de toneladas anuales (Sánchez, 2014). 
Los residuos generados por la industria tequilera, y específicamente las pencas de 
Agave tequilana Weber variedad azul, pueden ser aprovechados debido a su 
importante contenido de fructanos ramificados (tabla 4). Dichos fructanos ramificados 
(agavinas) pueden ser aprovechados por algunas cepas microbianas como principal 
fuente de carbono e inducir la producción de enzimas de interés, como inulinasas que 
actúen en agavinas, de las cuales existen pocos estudios. Estas enzimas son de 
especial interés debido a que, utilizando agavinas como sustrato, se pueden obtener 
productos de valor agregado como fructosa y/o fructooligosacáridos; ambos de 
importancia en la industria de alimentos: el primero por su aplicación para la 
elaboración de jarabes de alta fructosa y el segundo por las propiedades funcionales 
que posee como prebiótico. 
La cepa Bacillus amyloliquefaciens 12GeP, perteneciente a una colección de cepas 
capaces de utilizar agavina como única fuente de carbono aisladas en el laboratorio 
de trabajo, ha demostrado ser capaz de producir una exo-inulinasa. Tras la extracción 
y concentración de esta enzima se realizan diversos estudios para conocer la viabilidad 
de producción de fructosa y/o FOS, usando agavina como sustrato. 
 
 
 
28 
CAPÍTULO V. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 
5.1. HIPÓTESIS 
La cepa de trabajo, cultivada en medio con fructanos ramificados (agavinas) como 
única fuente de carbono, producirá enzimas con actividad inulinolítica. 
5.2. OBJETIVO GENERAL 
Caracterizar la actividad inulinolítica de una exo-inulinasa extraída de una cepa aislada 
de residuos de agave para la producción de compuestos de valor agregado (fructosa 
y/o fructooligosacáridos) a partir de fructanos ramificados. 
5.3. OBJETIVOS PARTICULARES 
 Identificar y caracterizar una cepa capaz de utilizar fructanos de agave (agavina) 
como única fuente de carbono. 
 Inducir la producción de inulinasas en un medio de cultivo con agavina como única 
fuente de carbono y aislar fracciones celulares con actividad enzimática de 
inulinasa. 
 Evaluar los efectos de la temperatura y el pH sobre la actividad de inulinasa. 
 Analizar la fracción proteica asociada a la actividad enzimática mediante técnicas 
de electroforesis y zimografía para conocer el peso molecular de la proteína.
 
 
29 
CAPÍTULO VI. MATERIALES Y MÉTODOS 
6.1. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 
 
Figura 4. Diagrama de estrategia experimental para el presente trabajo. 
Crecimiento de cepa
Medio conagavina (única fuente de carbono)
Identificación de la cepa
Identificación 
morfológica cultural y 
microscópica
Identificación por 
métodos moleculares
Obtención de fracciones 
enzimáticas
Evaluación de actividad de 
fructosilhidrolasa
Evaluación del efecto de la 
temperatura y el pH sobre la 
actividad enzimatica
Selección de la fracción del 
sobrenadante
Evaluación de actividad de 
fructosilhidrolasa
Estudio de curva temporal de 
reacción enzimática
Evaluación del efecto de la 
concentración proteica
Evaluación del efecto del 
contenido proteico
Evaluación del efecto de la 
termoestabilidad proteica
Evaluación del efecto de 
presencia de proteasas
Evaluación de actividad de 
transferasa
Evaluación del efecto de 
sustratos tipo fructano 
Evaluación del efecto de 
medios orgánicos
Estudio de la fracción proteica
Separación de fracciones 
proteicas
Identificación de fracción 
proteica asociada a la actividad 
inulinolítica
 
 
30 
6.2. MATERIALES 
Tabla 8. Reactivos utilizados durante el proceso experimental. 
Reactivo Proveedor 
acetato de butilo Sigma-Aldrich 
acetato de etilo Sigma-Aldrich 
acetato de sodio J.T. Baker 
acetona MEYER 
acetonitrilo Sigma-Aldrich 
ácido 3,5-dinitrosalisílico Sigma-Aldrich 
ácido acético glacial ReProQuiFin 
ácido clorhídrico 37% Sigma-Aldrich 
ácido sulfúrico 95-98% MEYER 
acrilamida Sigma-Aldrich 
agar Sigma-Aldrich 
agarosa de bajo punto de fusión Invitrogen 
agavina Biotrendy 
agua destilada CONQUIMEX 
albúmina sérica bovina ‘‘BSA’’ Sigma-Aldrich 
amortigudor GoTaq Flexi 5X Promega 
azul de Coomasie R-250 Sigma-Aldrich 
bisacrilamida Sigma-Aldrich 
bromofenol Sigma-Aldrich 
bromuro de etidio Sigma-Aldrich 
bromuro de hexadeciltrimetilamonio ‘‘CTAB’’ Probiotek 
butanol Sigma-Aldrich 
cloroformo Química Barsa 
cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio ‘‘TTC’’ Sigma-Aldrich 
cloruro de magnesio 25 mM Thermo Scientific 
cloruro de potasio J.T. Baker 
cloruro de sodio J.T. Baker 
cristal violeta Sigma-Aldrich 
dodecil sulfato de sodio ‘‘SDS’’ Sigma-Aldrich 
etanol 96% FERANDELH 
etilendiamintetraacético tetrasódico J.T. Baker 
extracto de levadura Sigma-Aldrich 
fenol grado biología molecular Sigma-Aldrich 
fosfato dibásico de potasio J.T. Baker 
fosfato monobásico de potasio J.T. Baker 
fructosa Sigma-Aldrich 
glicerol J.T. Baker 
glicina Sigma-Aldrich 
hidróxido de sodio Alyt 
inulina Nekutli 
 
 
31 
isopropanol Sigma-Aldrich 
levano sintetizado por el grupo de trabajo del Dr. Agustín 
López Mungía, IBT, UNAM 
lisozima Sigma-Aldrich 
lugol Sigma-Aldrich 
mercaptoetanol Sigma-Aldrich 
mezcla de DNTP’s 2 mM Thermo Scientific 
orcinol Sigma-Aldrich 
persulfato de amonio Sigma-Aldrich 
proteinasa N de Bacillus subtilis Sigma-Aldrich 
reactivo de Bradford BIO-RAD 
safranina Sigma-Aldrich 
sulfato de amonio Cosmopolita 
sulfato de magnesio Sigma-Aldrich 
sulfito de sodio J.T. Baker 
GoTaq DNA polimerasa Promega 
tartrato de sodio y potasio Sigma-Aldrich 
tetrametiletilendiamina ‘‘TEMED’’ Sigma-Aldrich 
tris(hidroximetil)aminometano ‘‘TRIS’’ Sigma-Aldrich 
 
6.3. METODOLOGÍA 
Las metodologías empleadas pueden agruparse en tres grupos: (1) para la 
identificación de la cepa, (2) para la caracterización de la actividad enzimática y (3) 
para la identificación de la fracción proteica asociada a la actividad enzimática. 
6.3.1. Identificación de la cepa 
Se trabajó con una cepa aislada de residuos de agave, conservada en glicerol a -80 
°C en un ultracongelador (REVCO Value Chest Freezer ULT-390-3-A30, Thermo 
Scientific). Dicha cepa, antes de su caracterización fue denominada como ‘‘cepa 
12GeP’’. 
 
 
32 
6.3.1.1. Preparación de medio de cultivo 
Dependiendo del estudio que se fuera a realizar, se prepararon dos medios de cultivo: 
líquido o sólido (tabla 9); la composición del medio fue estudiada en un trabajo previo 
al presente (Robert R., 2013). 
Tabla 9. Composición de medio de cultivo con agavina como única fuente de carbono, utilizado para 
crecimiento de la cepa 12GeP 
Ingrediente Proporción (%m/V) 
Agavina 0.5 
Extracto de levadura 0.5 
Sulfato de amonio 0.1 
Fosfato dibásico de potasio 0.1 
Cloruro de potasio 0.05 
Sulfato de magnesio 0.05 
Agar (sólo en medio sólido) 2 
 Cita: Robert R., 2013. 
Una vez preparado el medio, la esterilización se llevó a cabo en una autoclave (HA-
300MW autoclave, HIRAYAMA), a 121 °C y 15 psi durante 15 minutos. 
6.3.1.2. Inoculación e incubación de la cepa 
La activación de la cepa 12GeP conservada en glicerol a -80 °C se realizó tomando 
100 L e inoculando en 5 mL de medio de cultivo con agavina como única fuente de 
carbono. El medio fue incubado a 37 °C (WIS-30 Precise Shaking Incubator, Wisd 
Laboratory Instruments) durante 24 h a 120 rpm, condiciones reportadas como las 
mejores para el crecimiento de la cepa 12GeP (Vargas G., 2015); después del tiempo 
de crecimiento se obtuvo el preinóculo. A partir de 1 mL ó 30 mL de pre-inóculo se 
inocularon medios con volúmenes de 30 y 500 mL respectivamente, incubando a 37 
°C (WIS-30 Precise Shaking Incubator, Wisd Laboratory Instruments) durante 48 h a 
120 rpm. 
 
 
33 
La inoculación en medio sólido se llevó a cabo utilizando la técnica de estriado en placa 
(Ramírez & col., 2006), incubándose a 37 °C (WIS-30 Precise Shaking Incubator, Wisd 
Laboratory Instruments). 
6.3.1.3. Caracterización morfológica colonial de la cepa 
La caracterización colonial de la cepa 12GeP se llevó a cabo mediante la observación 
de colonias aisladas en un medio sólido con 24 h de incubación, tomando en cuenta 
las características de forma, color y consistencia de las colonias, reportadas por 
Ramírez & col. (2006). 
6.3.1.4. Caracterización microscópica de la cepa 
La caracterización microscópica de la cepa 12GeP se realizó utilizando tres técnicas 
de microscopía distintas: microscopía de campo claro con preparación húmeda y 
preparación fija con tinción de Gram, y microscopía electrónica de barrido (Scanning 
Electron Microscopy, SEM por sus siglas en inglés). 
Para una preparación húmeda se empleó una gota de muestra del medio de cultivo 
líquido con crecimiento de 24 h de la cepa 12GeP, la cual se colocó en un portaobjetos 
y se cubrió cuidadosamente con un cubreobjetos (Ramírez & col., 2006). 
Posteriormente se realizó la observación al microscopio (BX40, Olympus), con el 
objetivo 60X para observar la morfología y capacidad de movilidad. 
Para una preparación fija se necesitó de una gota de muestra del medio de cultivo 
líquido con crecimiento de 24 h de la cepa 12GeP. Se aplicó la tinción de Gram 
(Ramírez & col., 2006) para observar al microscopio (BX40, Olympus) la morfología y 
agrupación de las células, así como para inferir la composición de la pared celular y 
diferenciarla como Gram positiva o negativa. 
Para la observación microscópica por SEM fue necesaria una preparación especial de 
la muestra: se tomó una muestra de 1 mL de medio de cultivo líquido con crecimiento 
 
 
34 
de 24 h de la cepa 12GeP y se centrifugó a 6000 rpm durante 10 min, el pellet fue 
resuspendido en glutaraldehído en una proporción 1:1 y se dejó reposar durante 24 h 
para fijar las células. Posteriormente se centrifugó a 600 rpm durante 10 min y se retiró 
el glutaraldehído para ser sustituido con buffer de fosfatos 100 mM a pH 7.4, se 
centrifugó una vez más a 6000 rpm durante 10 min y se removió la fase acuosa, 
sustituyéndola con tetraóxido de osmio y dejándose reposar durante 12 h. Luego de la 
espera se centrifugó y se retiró el tetraóxido de osmio, realizando lavados sucesivos, 
de 15 minutos cada uno, con etanol absoluto a diferentes concentraciones (30, 40, 50, 
70, 80, 90 y 100% V/V), después de lo cual se centrifugó a 6000 rpm durante 10 min y 
el pellet fue secado con CO2 en su punto crítico (31 °C, 73.76 bar). Finalmente, el pellet 
seco fue disgregado en un pin de carbono y recubierto con carbono y oro. Una vez 
preparada,