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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS MÉDICAS, ODONTOLÓGICAS Y DE LA SALUD INVESTIGACIÓN CLÍNICA EXPERIMENTAL EN SALUD BIOQUÍMICA CLÍNICA “VARIANTES GÉNICAS DE MOLECULAS ADAPTADORAS EN LEUCEMIA” TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS PRESENTA: LUIS ALEJANDRO FILIO BRISEÑO TUTORA: Dra. MARTHA ESTHELA PÉREZ RODRÍGUEZ Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Médicas, Odontológicas y de la salud MÉXICO, D.F. Marzo 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Dr. AARÓN DOMÍNGUEZ LÓPEZ SECRETARIO: Dr. ADRIÁN OCHOA LEYVA VOCAL: Dra. MARTHA ESTHELA PÉREZ RODRÍGUEZ VOCAL: Dr. FAUSTO SÁNCHEZ MUÑOZ VOCAL: Dr. MARCO ANTONIO VELASCO VELÁZQUEZ El lugar donde se realizó la Tesis fue el laboratorio de Histocompatibilidad de la Unidad de Investigación Médica en Inmunología, CMN-SXXI; el proyecto tiene el número de registro: R-2014-785-032. El trabajo recibió el apoyo financiero: FIS/IMSS/PROT/MD14/1350 Agradecimientos Al posgrado en Ciencias Médicas, Odontológicas y de la Salud, especialmente al Campo del Conocimiento: ICES - Bioquímica Clínica; UNAM. Al CONACYT, por la beca de Maestría (No. de becario: 481461). A la Coordinación de Investigación en Salud del IMSS, por las becas correspondientes a Becario de Investigación I y II (No. de matrícula: 99096703). A mi tutora, la Dra. Martha E. Pérez Rodríguez; así como el resto de los miembros del comité tutor. Al personal que colaboró en el desarrollo de este proyecto de la Unidad de Investigación Médica en Inmunología, Banco Central de Sangre y el servicio de Hematología de la UMAE Hospital de Especialidades CMN-SXXI. Agradecimientos a título personal Primero que nada, me es grato agradecer nuevamente a mi alma máter, la UNAM, así como a la Facultad de Química, por permitirme llevar mi formación académica y humana a un nuevo nivel. Gracias a este Posgrado, a la Dra. Marta Menjívar y su grupo de trabajo, a mis profesores y compañeros de generación; por todo el esfuerzo que imprimimos juntos durante el transcurso de la Maestría. Agradezco a la Dra. Martha Pérez, por recibirme en su laboratorio y por su guía y apoyo profesional. Además sé que sus consejos y regaños me serán muy útiles por el resto de mi vida. También, le agradezco a los compañeros y maestros que me apoyaron en la realización de la Tesis, principalmente Paulina y Julián que se convirtieron en verdaderos amigos. Así como a los químicos del laboratorio de HLA: Julio César, Araceli, América y Ricardo, que siempre me aconsejan y reciben cálidamente. El más importante de los agradecimientos es para mí mamá, a quien le debo todo en esta vida. Incluyendo a mi hermano, los tres juntos formamos la mejor familia que podría querer. Asimismo, agradezco tener a mi mamá Tita y mi papá, que sé que me cuidan desde el cielo todos los días. Por último, le agradezco a Dios por todas las dichas y satisfacciones que me permite alcanzar, como lo es la culminación de este ciclo. Dedicatoria Le dedico este trabajo con mucho amor a Nora Karen Olascoaga, esperando que sea una fuente de inspiración y aliento para que superes los retos que próximamente enfrentarás; creo en ti y en nosotros. ÍNDICE Tema Página 1. Resumen - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 2. Abstract - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 3. Índice de abreviaturas - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 3 4. Lista de figuras, gráficas y tablas - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 5 5. Introducción 5.1 Leucemia s agudas 5.1.1 Epidemiología de las leucemias agudas - - - - - - - - - - - - - 6 5.1.2 Clasificación de las leucemias agudas - - - - - - - - - - - - - 8 5.1.3 Etiología de las leucemias agudas - - - - - - - - - - - - - - - - - - 10 5.2 Moléculas adaptadoras - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - 12 5.2.1 DAP10 5.2.1.1 Estructura y señalización de DAP10 - - - - 13 5.2.1.2 Receptores acoplados y funciones de DAP10 - - - - 14 5.2.2 DAP12 5.2.2.1 Estructura y señalización de DAP12 - - - - 18 5.2.2.2 Receptores acoplados y funciones de DAP12 - - - - 20 5.3 DAP10 y DAP12 en leucemias agudas - - - - - - - - - - - - - - - - - - 25 5.4 Variantes génicas de DAP10 y DAP12 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 26 6. Justificación - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30 7. Hipótesis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 31 8. Objetivos 8.1 General 8.2 Particulares - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 31 9. Materiales y métodos 9.1 Población de estudio - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 32 9.2 Material biológico y extracción de ADN - - - - - - - - - - - - - - - - - - 33 9.3 Genotipificación por PCR en tiempo real - - - - - - - - - - - - - - - - - - 34 9.4 Análisis estadístico - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 35 10. Resultados 10.1 Características de la población de estudio - - - - - - - - - - - - - 36 10.2 Frecuencias alélicas y genotípicas - - - - - - - - - - - - - - - - - - 37 10.3 Desequilibrio de ligamiento y frecuencias haplotípicas - - - 44 11. Discusión - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 46 12. Conclusiones - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - 52 13. Perspectivas - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - 52 14. Anexos - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - 53 15. Bibliografía - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - 56 1 1. Resumen La leucemia es actualmente la principal neoplasia hematológica en México y su desarrollo depende de diversos factores, como una inmunovigilancia deficiente. En las vías de señalización involucradas destacan las moléculas adaptadoras DAP10 y DAP12; ambas presentan variantes génicas que pueden alterar su función. Por lo tanto, se seleccionaron seis diferentes polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de estas moléculas, con base en sus frecuencias génicas y las posibles modificaciones a nivel de proteína. Se analizó si existe una asociación entre los SNP seleccionados y la predisposición a leucemia aguda. Para ello, en 111 pacientes adultos con leucemia linfoide aguda, 70 con leucemia mieloide aguda y 362 donadores sanos se realizó un ensayo de discriminación alélica, mediante PCR en tiempo real utilizando sondas Taqman® para los SNP: rs11880605, rs33964243 y rs149774048, propios de DAP10, así como para rs77782321, rs14714 y rs1802029, presentes en DAP12. Se determinaron las frecuencias alélicas, genotípicas y haplotípicas, el equilibrio Hardy-Weinberg, el desequilibrio de ligamiento y la razón de momios. En rs11880605, rs149774048, rs77782321 y rs14714 solo se observó el alelo ancestral y el genotipo correspondiente en todaslas muestras estudiadas, lo que indica una presión selectiva sobre estas variantes, mientras que en rs33964243 y rs1802029 la frecuencia del alelo menor no sobrepasa el 3% en casos y el 5% en controles. Estas frecuencias no habían sido establecidas previamente en un grupo de mestizos mexicanos que residen en el Valle de México y son similares a las reportadas en mexicanos de Los Ángeles California, EUA. Sin embargo, bajo ninguna circunstancia los valores de asociación de alelos, genotipos o haplotipos resultaron significativos para la predisposición a leucemia. Así, concluimos que en nuestra población los SNP analizados no son factores de riesgo o protección para leucemias agudas. Palabras clave: DAP10, DAP12, SNP, leucemia aguda. 2 2. Abstract Leukemia is currently the main hematologic malignancy in Mexico and its development depends on several factors including a deficient immunesurveillance. In the signaling pathways involved, stand out the adaptors molecules DAP10 and DAP12; both show genic variants in their sequences that can alter its function. Therefore, six different single nucleotide polymorphisms (SNP) of these molecules were selected, with basis in their genic frequencies and the possible modifications at protein level. Then we analyzed whether a relationship exists between the selected SNP and the predisposition to acute leukemia. For this, in 111 adult patients with acute lymphoblastic leukemia, 70 with acute myeloid leukemia and 362 healthy donors we conducted a trial of allelic discrimination by Real-time PCR, using Taqman® probes of the SNPs: rs11880605, rs33964243 and rs149774048, corresponding to DAP10, as well as rs77782321, rs14714 and rs1802029, present in DAP12. The allelic, genotypic and haplotypic frequencies, the Hardy-Weinberg equilibrium, the linkage disequilibrium and the Odd Ratios were determined. In rs11880605, rs149774048, rs77782321 and rs14714 only the ancestral allele and the respective genotype were observed in all the samples studied, which indicates a selective pressure for these variants, whereas in rs33964243 and rs1802029 the minor allele frequency is not superior to the 3% in cases and the 5% in controls. These frequencies had not been previously established in a Mexican mestizo group that resides in the Valley of Mexico and are similar to those reported in Mexicans of Los Angeles CA, USA. However, under any circumstance the association values of alleles, genotypes or haplotypes resulted significant for leukemia predisposition. Thus, we conclude that in our population the analyzed SNPs are not risk or protection factors for acute leukemia. Keywords: DAP10, DAP12, SNP, acute leukemia. 3 3. Índice de abreviaturas ADN Ácido DesoxirriboNucleico BCR Receptor de células B (del inglés B Cell Receptor) CD Cúmulo de diferenciación (del inglés Cluster of Differentiation) CMV Citomegalovirus (del inglés CytoMegaloVirus) DC Célula dendrítica (del inglés Dendritic Cell) DAP10 ADNX-Activating Protein of ~10 kiloDaltons DAP12 ADNX-Activating Protein of ~12 kiloDaltons Grb2 Growth factor receptor-bound protein 2 HLA Antígenos leucocitarios humanos (del inglés Human Leukocyte Antigen) HCST Hematopoietic Cell Signal Transducer H-W Hardy-Weinberg IC Intervalo de Confianza IL Interleucina (del inglés InterLeukin) ITAM Motivo inmunoreceptor de activación basado en tirosina (del inglés Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) IARC Agencia internacional para la investigación del Cáncer (del inglés International Agency for Research on Cancer) KIR Receptores tipo inmunoglobulina de la célula NK (Del inglés Killer Cell immunoglobulin-like Receptor) KO Nocaut (del inglés knock-out) LD Desequilibrio de ligamiento (del inglés Linkage Desequilibrium) LLA Leucemia Linfoide Aguda LMA Leucemia Mieloide Aguda MAF Frecuencia del alelo menor (del inglés Minor Allele Frequency) MAPK Protein cinasas activadas por mitógenos (del inglés Mitogen Activated Protein Kinases) MIC Cadenas relacionadas a moléculas de MHC de clase I (del inglés Mayor histocompatibility complex class I-Chains related) NCBI Centro Nacional de Biotecnología e Información (del inglés National Center for Biotechnology Information) NCR Receptor de citotoxicidad natural (del inglés Natural Cytotoxicity Receptor) 4 NF-κB Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de células B activadas (del inglés Nuclear Factor kappa light chain enhancer of activated B cells) NK Célula “Asesina natural” (del inglés Natural Killer) NKG2 Familia de receptores NK del grupo 2 (del inglés Natural Killer Group 2) NKp Natural Killer cell P-related protein OMS Organización Mundial de la Salud pb Pares de bases PI3K Fosfoinositol 3-cinasa (del inglés Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-Kinase) PCR Reacción en cadena de la polimerasa (del inglés Polymerase Chain Reaction) PLC Fosfolipasa (del inglés PhosphoLiPase) PLOSL Osteodisplasia poliquística lipomembranosa con leucoencefalopatía esclerosante (del inglés Polycystic Lipomembranous Osteodysplasia with Sclerosing Leukoencephalopathy) RM Razón de Momios SH2 Dominio SH2 (del inglés Src Homology 2) SMD Síndrome MieloDisplásico SNP Polimorfismos de un solo nucleótido (del inglés Single Nucleotide Polymorphism) Src Dominio Src (por Sarcoma) TCR Receptor de células T (del inglés T Cell Receptor) TGF Factor de crecimiento transformante (del inglés Transforming Growth Factor) TNF Factor de necrosis tumoral (del inglés Tumor Necrosis Factor) TLR Receptor tipo Toll (del inglés Toll-Like Receptor) TYROBP Tyrosine-kinase Binding Protein UTR UnTranslated Región Zap-70 Zeta-chain Associated Protein kinase of 70kDa 5 4. Lista de figuras, gráficas y tablas Figura 1. Complejo NKG2D/DAP10 en células efectoras humanas 14 Figura 2. DAP12 acoplado a NKG2C 19 Figura 3. DAP12 acoplado a TREM2 19 Figura 4. Desequilibrio de ligamiento en región cromosómica 19q.13.12 27 Figura 5. Polimorfismos candidatos en genes y proteínas DAP10 y DAP12 29 Figura 6. Amplificación y fluorescencia con el uso de sondas TaqMan® 34 Gráfica 1. Número de muertes por leucemia en México del 2001 al 2010 7 Gráfica 2. Edad promedio de pacientes y sus respectivos controles, por género 36 Gráfica 3. Frecuencias alélicas de rs11880605 en diferentes poblaciones 41 Gráfica 4. Frecuencias genotípicas de rs11880605 en diferentes poblaciones 41 Gráfica 5. Frecuencias alélicas de rs33964243 en diferentes poblaciones 41 Gráfica 6. Frecuencias genotípicas de rs33964243 en diferentes poblaciones 42 Gráfica 7. Frecuencias alélicas de rs77782321 en diferentes poblaciones 42 Gráfica 8. Frecuencias genotípicas de rs77782321 en diferentes poblaciones 43 Gráfica 9. Frecuencias alélicas de rs1802029 en diferentes poblaciones 43 Gráfica 10. Frecuencias genotípicas de rs1802029 en diferentes poblaciones 44 Tabla 1. Receptores asociados a DAP10 16 Tabla 2. Receptores asociados a DAP12 20 Tabla 3. SNP candidatos en DAP10 y DAP12 29 Tabla 4. Descripción por edad y género de los diferentes grupos de estudio 36 Tabla 5. Frecuencias de SNP de DAP10 y DAP12 en LLA y controles 37 Tabla 6. Frecuencias de SNP de DAP10 y DAP12 en LMA y controles 38 Tabla 7. Variables por genotipo de rs33964243 y rs1802029 en grupos de estudio 39 Tabla 8. Frecuencias haplotípicas observadas en pacientes y sus controles 45 Anexo 1. Variantes génicas de DAP10 53 Anexo 2. Variantes génicas de DAP12 54 6 5. Introducción 5.1 Leucemias agudas Las leucemias son neoplasias malignas de las células hematopoyéticas, donde comúnmente una estirpe celular con determinado estadio de maduración presenta proliferación oligoclonal y expansión incontrolada. En las leucemias agudas, la población se conforma predominantementede células inmaduras (blastos) que progresan rápidamente y dependiendo de la línea afectada estas se pueden dividir grosso modo en leucemias linfocíticas agudas (LLA) y leucemias mieloides agudas (LMA). 5.1.1 Epidemiología de las leucemias agudas Epidemiología en el mundo A nivel global, la leucemia ha mostrado un ligero aumento en sus tasas de incidencia y una disminución en sus índices de mortalidad en los últimos 30 años. Aunque se presenta casi diez veces menos en niños, la leucemia es el tipo de cáncer más frecuente con cerca del 30% de los casos, de acuerdo con datos de la International Agency for Research on Cancer (IARC, 2012). Las leucemias agudas tienen una incidencia de dos a cuatro casos por cada 100,000 habitantes en países de primer mundo (Crespo, 2010). La LLA corresponde a más de dos tercios de los casos (75%) en infantes, con incidencias de 20 a 35 pacientes por millón de habitantes y sus tasas de curación y sobrevivencia a largo plazo son de 95% y 80% respectivamente, en contraste con los adultos, cuyas tasas de supervivencia generalmente no exceden el 40%, y aunque hasta el 80% alcanza remisión completa en la primera terapia de inducción, esta resulta de corta duración (Foà, 2011; Onciu, 2009; Rowe, 2010). Por su parte, la LMA corresponde al 30% de las leucemias en mayores de edad y tiende a afectar personas de edad avanzada, siendo poco común en menores de 45 años. Lamentablemente sus tasas de sobrevida a cinco años son cercanas al 15% y disminuyen aún más con la edad (Deschler & Lübbert, 2006). 7 Epidemiología en México El diagnóstico y documentación en zonas marginadas o de difícil acceso obstaculiza la caracterización de la leucemia en nuestro país. Pese a ello, se sabe que las neoplasias hematológicas son responsables del 15 al 20% de todos los tumores malignos (Curado et al., 2011; Secretaria de Salud, 2011) y dentro de este grupo el primer lugar corresponde a la leucemia, llegando a ser la principal neoplasia en niños (tasas de morbilidad de 7.5 y de mortalidad de 3.6 por cada 100,000 habitantes) y segunda causa de muerte general; mientras que en adultos actualmente ocupa el octavo puesto, con 5.6% de los casos (morbilidad de 5.7 y mortalidad de 4.3 por cada 100 mil habitantes) (Tirado et al., 2007; Fajardo et al., 2011). Organizaciones como el Registro Nacional de Neoplasias Malignas (RNEH) y el Registro Mexicano de Enfermedades Hematológicas (REMEDEH) tienen resultados poco actualizados o insuficientes, por lo que el proyecto Globocan de la IARC, que reporta índices de prevalencia, incidencia y mortalidad en diferentes naciones, provee información de interés como la que se muestra en la Gráfica 1. Gráfica 1. Número de muertes por leucemia en México del 2001 al 2010 Fuente: Globocan, IARC 2012. En la gráfica se observa que el número de muertes por leucemia en México muestra un ligero aumento en la última década, a diferencia del panorama internacional. Las leucemias que se diagnosticaron con mayor frecuencia en este periodo, tanto en adultos como en niños, fueron las agudas (1.3 casos de LLA y 8 0.7 casos de LMA por cada 100,000 habitantes) (Gonzalez et al., 2012); datos que remarcan la importancia de estas neoplasias en el territorio nacional. 5.1.2 Clasificación de las leucemias agudas Las leucemias agudas se catalogan con base en diferentes sistemas. El primero de ellos fue desarrollado por un consorcio Franco-Americo-Británico, por lo que se le denominó clasificación FAB (Bennett et al., 1976) y esta basado principalmente en características morfológicas: LLA-L1: Correspondiente a precursores de células B afectados (65-70%) LLA-L2: Concerniente a precursores de linfocitos T (25-30%) LLA-L3: Las células afectadas son similares al linfoma de Burkitt (5-10%) LMA-M0: Mieloblástica mínimamente diferenciada o sin diferenciación LMA-M1: Mieloblástica sin maduración LMA-M2: Mieloblástica con maduración LMA-M3: Promielocítica o LMA-M3 hipergranular (75%) o LMA-M3 microgranular (25%) LMA-M4: Mielomonocítica o LMA-M4eo: Mielomonocítica con eosinofilia LMA-M5: Monocítica o LMA-M5a: Monocítica sin diferenciación (monoblástica) o LMA-M5b: Monocítica con diferenciación LMA-M6: Eritroide LMA-M7: Megacarioblástica Aunque la clasificación FAB es ampliamente aceptada tiene diversas limitantes, por ello en la clínica también se utiliza la clasificación por inmunofenotipo (Huh & Ibrahim, 2000) para leucemias linfoides agudas: LLA de células B (75%) o LLA pro-B (10%) 9 o LLA B común (50%) o LLA pre-B (10%) o LLA de células B maduras (linfoma de Burkitt) (5%) LLA de células T (25%) o LLA pre-T (5-10%) o LLA de células T maduras (15-20%) LLA de linaje mixto, leucemia aguda bifenotípica o de linaje ambiguo Mientras que para leucemias mieloides agudas una clasificación robusta y que se mantiene constantemente actualizada fue propuesta por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con las siguientes categorías (Harris et al., 1997): LMA con anormalidades genéticas LMA con displasia multilinaje LMA y SMD asociados al tratamiento LMA no categorizada Leucemias agudas de linaje ambiguo El primero de estos grupos tiene a su vez diversas subpoblaciones con traslocaciones o inversiones cromosómicas, como LMA t(8,21)(q22;q22), LMA inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q22), LMA M3 t(15;17)(q22;q11-12), etc. El grupo de LMA con displasia involucra variedades mieloides que comúnmente se producen debido a la evolución de un síndrome mielodisplásico (SMD) o mieloproliferativo en LMA (Malcovati & Cazzola, 2013). La LMA y el SMD asociados al tratamiento son complicaciones de terapias citotóxicas para tratar tumores y otras condiciones no malignas. Finalmente, el grupo de LMA no caracterizada es similar a la clasificación FAB e incluye además variedades poco comunes como leucemia basófila aguda, panmielosis con fribrosis aguda, sarcoma mieloide (cloroma o sarcoma granulocítico) y proliferaciones mieloides relacionadas con el síndrome de Down, como la mielopoyesis anormal transitoria (leucemia transitoria). 10 5.1.3 Etiología de las leucemias agudas Las leucemias tienen una etiología multifactorial, por lo que difícilmente puede encontrarse una causa específica para su origen en cada paciente. Diversos estudios han señalado factores del medio ambiente, así como la propia herencia del individuo, como aspectos que contribuyen en su desarrollo. Aunado a esto, la presencia de un solo factor de riesgo puede no ser suficiente para desencadenar la enfermedad, como lo sugiere la hipótesis de la leucemogénesis de Greaves. Reafirmando esta teoría, se han reportado leucemias con rearreglos cromosómicos característicos que requieren disrupciones moleculares adicionales para convertirse en neoplasias integras, aunque las causas no han sido dilucidadas (Zhu et al., 2014). Factores de riesgo externos Entre los elementos del medio implicados en el desarrollo de leucemias agudas se encuentran la exposición a diversos agentes químicos (óxido de etileno, formaldehido, benceno, etc.) radiaciones ionizantes y campos electromagnéticos (Noshchenko et al., 2002). También, el uso de fármacos mielotóxicos (fenilbutazona, cloranfenicol), alquilantes (ciclofosfamida, clorambucil, etc.) y con platino (cisplatino) está asociado con un riesgo aumentado de padecer SMD y posteriormente LMA. De igual forma, inhibidores de topoisomerasa II (mitoxantrona, doxorrubicina, etc.) se relacionan al desarrollo de LMA sin padecer previamente un SMD. Por otro lado, la infección con el virus 1 de la leucemia/linfoma de células T (HTLV-1) puede causar un tipo raro de LLA-T. El virus de Epstein-Barr (EBV) también se ha relacionado con una forma de LLA. Factores de riesgo internos o genéticos Diversas enfermedadescongénitas presentan una elevada frecuencia de leucemias agudas. Cromosomopatías como el síndrome de Down (Hasle et al., 2000), la anemia de Fanconi, el síndrome de Bloom o la ataxia-telangiectasia (Taylor, 2001) desarrollan comúnmente LLA, mientras que en trastornos mieloproliferativos crónicos como la policitemia vera, la trombocitemia esencial o la mielofibrosis idiopática se produce LMA fácilmente. 11 Por otro lado, es bien sabido que determinadas alteraciones cromosómicas y genéticas son factores de riesgo en leucemias agudas. La traslocación más importante, por su valor pronóstico, es la t(9;22)(q34;q11) o cromosoma Filadelfia (Ph), que afecta de forma negativa la sobrevida de pacientes con LLA adultos (25%), pediátricos (5%) y con LMA (>2%). Otras alteraciones que otorgan mal pronóstico en LLA son la t(1,19) PBX1-E2A, la t(4,11)(q21;q23) MLL-AF4 (Daniel et al., 2009), la hipodiploidia <44, las trisomías 8 o 21 y la monosomía 7 (Wetzler et al., 1999). Por el contrario la t(12;21)(p12;q21) ETV6/RUNX1 (TEL/AML1) confiere un buen pronóstico; en LLA-T actúa de forma favorable la t(10,14) HOX11-TCRα y en general la hiperdiploidia de 51 o más cromosomas es un factor positivo. En LLA L3 existe una relación entre una variedad de translocaciones del protooncogén c-myc y el locus del gen de las inmunoglobulinas, que producen un fenotipo con buena respuesta a los tratamientos. Mientras que en LMA, tenemos alteraciones a favor como la t(8,21) (Peterson & Zhang, 2004), la Inv(16) o t(16,16) y la t(15,17). Entre los cambios desfavorables se encuentran la inserción +8, las deleciones -5q y -7, la t3 o inv3, la t(6,9), anomalías en 11q23 y cambios complejos en varios cromosomas. En cuanto a genes específicos asociados con el desarrollo de leucemias agudas para LLA se han descrito principalmente factores y cofactores de transcripción: TP53, IKZF1, IKZF2, PAX5 (Joshi et al., 2014), TCF3, MYC, Rb1, HOX11/11L2 (Ballerini et al., 2002); reguladores del ciclo celular y apoptosis: inhibidores de ciclinas (p14, p15, p16, p21), caspasas (2 y 3) y procaspasas (2, 3, 7, 8, 9, Apaf-1) (Faderl et al., 1999; Svingen et al., 2000); así como protooncogenes: Bcl-2 (Uckun, 1997), RAS, NRAS, KRAS, FLT3, CRLF2, NF1 (Teitell & Pandolfi, 2009). En LMA se han reportado genes como FLT3 (Smith et al., 2005), EVI1 (Lugthart et al., 2008), c-KIT, el gen supresor WT-1 (Weisser et al., 2005), BAALC (Baldus et al., 2003), GATA2 (Celton et al., 2014) o el oncogen ERG que regula diferenciación y que también se asocia en LLA-T (Marcucci et al., 2005); la expresión de la glucoproteína-P induce resistencia a fármacos quimioterapéuticos, por lo que igualmente resulta desfavorable. Por otro lado, pacientes solo con cambios en los genes NPM1 o CEBPA parecen tener un mejor 12 pronóstico (Mueller & Pabst, 2006). La diversidad de genes implicados en el desarrollo de leucemias agudas permite suponer que otras moléculas, como las adaptadoras, puedan asociarse con estas neoplasias, debido a sus funciones. 5.2 Moléculas adaptadoras Las moléculas adaptadoras son componentes de las vías de señalización, que vinculan los estímulos provenientes de receptores sin actividad intrínseca o proteínas transductoras con otras entidades en citosol, como pueden ser proteínas moduladoras, de anclaje, de andamiaje, amplificadoras o integradoras. La transmisión de información se lleva a cabo mediante actividad cinasa en las moléculas adaptadoras, que consiste en la transferencia del fosfato terminal de una molécula de ATP (adenosin trifosfato) al grupo hidroxilo de una tirosina, serina o treonina. Esta fosforilación permite la creación de sitios de unión entre elementos involucrados, que a su vez se activan, permitiendo así la formación de señales de transducción en cascada (Johnson & Lapadat, 2002). Para llevar a cabo sus funciones, las moléculas adaptadoras de citosol presentan en su estructura los dominios SH2 (Src homology 2) y SH3; el dominio SH2 es capaz de interactuar con aminoácidos fosforilados mientras que SH3 lo puede hacer con motivos ricos en prolina. A manera de ejemplo, en los mecanismos de inflamación y apoptosis podemos encontrar proteínas adaptadoras de este tipo, como FADD (Fas-associated protein with death domain) o MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88), respectivamente. Por su parte, la mayoría de adaptadoras que se encuentran embebidas en membrana contiene residuos de transducción activadores ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif), que consisten en un duplicado de la secuencia consenso: YxxL/I, separada entre sí por seis a 12 residuos (Isakov. 1997) y que participa en la señalización de diversos receptores como TCRs (T cell receptor), BCRs (B cell receptor) y FcRs. Los motivos ITAM se encuentran conservados en más de 20 diferentes receptores mieloides (Ivashkiv, 2009) además de otras moléculas como CD79 y las adaptadoras CD3δ, FcεRIγ y DAP12. 13 5.2.1 DAP10 DAP10 (ADNX-activation protein of ~10 kDa), también conocida como KAP10 (Kinase associated protein of ~10 kDa) o PIK3AP (Phosphoinositide-3- kinase adaptor protein) es una molécula adaptadora transmembranal tipo 1 (presenta su dominio N-terminal en región extracelular y su dominio C-terminal en la parte intracelular) que se expresa como homodímero en células NK (Natural Killer), la mayoría de células NKT, algunas subpoblaciones de linfocitos Tγδ y linfocitos T CD8+. En humanos también se ha reportado su expresión en linfocitos T CD4+ bajo circunstancias patológicas (Groh et al., 2003; Allez et al., 2007; Hüe et al., 2004) y determinados estudios señalan su presencia en queratinocitos (Sakaguchi et al., 2014), mastocitos derivados de médula ósea (Kumagai et al., 2003; Anfossi et al., 2003) y osteoclastos inmaduros (Inui et al., 2009). 5.2.1.1 Estructura y señalización de DAP10 DAP10 es una proteína con un peso molecular de 9.49 kDa y su punto isoeléctrico se encuentra a pH = 8,63. Consta de 93 aminoácidos, aunque también se ha reportado una isoforma de 92 aminoácidos. En su estructura presenta un péptido señal que abarca del aminoácido 1 al 19; una región extracelular mínima sin capacidad de unión a ligando con dos cisteínas altamente conservadas en las posiciones 39 y 41 que forman puentes disulfuro entre cadenas. En la región transmembranal resalta un ácido aspártico (D57) esencial para acoplarse a su principal receptor: NKG2D (Wu et al., 1999; Feng et al., 2006; Garrity et al., 2005). La región intracelular presenta un motivo de señalización tipo YxxM (posición 86- 89) que al ser inducido en células efectoras produce una serie de reacciones de fosforilación, que culminan en la secreción de citocinas proinflamatorias como INFγ (interferón gamma) y TNFα (tumor necrosis factor), además de gránulos citotóxicos que contienen perforinas y grandzimas. Una vez que se traduce, DAP10 sufre una glucosilación que es fundamental para la asociación y expresión estable del complejo NKG2D/DAP10 en membrana (Park et al., 2011). 14 Figura 1. Complejo NKG2D/DAP10 en células efectoras humanas (Modificado de: Nausch & Cerwenka, 2008) El motivo YxxM de DAP10 puede interactuar con la subunidad p85 de PI3K (fosfoinositol 3-cinasa) o Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2) (Figura 1). Al ser fosforilado, PI3K lleva a la producción de PIP3 (fosfatidilinositol trisfosfato) que facilita a su vez el reclutamiento de otras moléculas como PLCγ (fosfolipasa gamma) y Vav1, un factor importante en la reorganización de actina y microtubulos, cuya deficiencia detiene por completo la citotoxicidad mediada por DAP10 (Cella et al., 2004). Por otro lado, Grb2 forma un complejo con Vav1 y Sos (Son of sevenless), e interactúa con PLCγ2 y SLP76 (leukocyte phosphoprotein of 76kDa) culminando en la activación de la vía MAP2K/ERK (mitogenactivated protein kinases/extracellular-signal-regulated kinase) (Billadeau et al., 2003; Watzl & Long, 2010). También se ha observado que el eje NKG2D lleva a una activación diferencial de NF-κB (nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells) en linfocitos T CD8+ de ratón (Whitman & Barber, 2014). 5.2.1.2 Receptores acoplados y funciones de DAP10 DAP10 se asocia principalmente con el receptor NKG2D, formando un complejo hexamérico compuesto de un homodímero NKG2D unido a un par de homodímeros de DAP10 (Garriti et al., 2005). El complejo sufre regulación a la 15 alza por las interleucinas (IL): IL-2, IL-12 y en mayor medida IL-15 (Park et al., 2011; Sugita et al., 2010); la causa parece ser una estimulación sinérgica, ya que el receptor de IL-15 comparte la vía PI3K (Horng et al., 2007). Por el contrario, la expresión de NKG2D y DAP10 es regulada a la baja por sustratos como IL-21 (Burgess et al., 2006), TGF- β1 (transforming growth factor beta 1) (Park et al., 2011), VIP (vasoactive intestinal peptide) (Wang et al., 2013) y el factor de transcripción HMBOX1 (Wu et al., 2011). Niveles elevados de TGF- β1 se han reportado en pacientes con infección persistente del virus de hepatitis B (Sun et al., 2012) y diversos tipos de cáncer (pulmón, colorrectal, etc.) (Lee et al., 2004) por lo que la actividad citotóxica de NKG2D y DAP10 se encuentra comprometida en dichas patologías; en las neoplasias la causa parece ser una interacción entre células cancerígenas y macrófagos asociados a tumor (fenotipo M2), a través del antígeno tumoral STn (disacárido de ácido siálico y N-acetilgalactosamina) y el receptor Siglec-15/DAP12, respectivamente (Takamiya et al., 2013). Aunado a esto, al interactuar con sus ligandos NKG2D y DAP10 sufren un aumento en su endocitosis y degradación (Roda & Reyburn, 2009) que regula la actividad citotoxica de un nicho especifico; otra función que controla esta respuesta consiste en la eliminación de células NK activadas por parte de otras células NK; la causa de este fenómeno es la trogocitosis que se ha descrito en las sinapsis ligando- NKG2D, así la célula NK adquiere y presenta en su superficie antígenos tumorales provenientes de su célula blanco, que son señales activadoras para células “hermanas” en la periferia (Nakamura et al., 2013). En ratas y ratones, los ortólogos de DAP10 y DAP12 también pueden unirse a otros receptores como NKG2A/CD94 y NKG2C/CD94; en ambos el acoplamiento depende de CD94, a diferencia de lo que sucede en humanos (Saether et al., 2011). De forma similar, se ha descrito en células NK de ratón que los receptores Ly49H y Ly49D pueden interactuar tanto con DAP10 como con DAP12, aunque se debate si esta unión promiscua es necesaria para tener una inmunidad optima contra células infectadas con mCMV (mouse CytomegaloVirus) (Orr et al., 2009; Tassi et al., 2009). 16 Todos los receptores con los que DAP10 puede llegar a interactuar en humanos y ratones se muestran en la tabla 1. Tabla 1. Receptores asociados a DAP10 Gen Proteína Ligando Células donde se expresa HUMANO KLRK1 NKG2D MICA, MICB, ULBP Células T, NK AGER AGER, RAGE Múltiples ligandos Queratinocitos SIRPB1 SIRPβ-1 Desconocido Mastocitos leucémicos AF251705 (cd300d) LMIR2, MAIR-II, DIgR1, CLM4 Desconocido Mastocitos inmaduros CLEC5A MDL-1 Dengue Virus Osteoclastos inmaduros RATÓN Klrk1 NKG2D Rae-1, H60, Mult1 Células T, NK Klrd1/Klrc1 CD94/NKG2A Qa-1b Células NK Klrd1/Klrc2 CD94/NKG2C Qa-1b Células NK Klra4 Ly49D H-2D Células NK Klra8 Ly49H mCMV m157, H-2D Células NK Función citotóxica de DAP10 En humanos, Los ligandos de NKG2D son las moléculas MIC-A (Mayor Histocompatibility Complex class I-chains related-A), MIC-B y la familia de proteínas ULBP (Unique long 16-binding protein), los cuales se expresan en células bajo condiciones de estrés señalando el papel biológico de NKG2D y DAP10 en la defensa contra tumores, infecciones intracelulares y enfermedades autoinmunes (Hyka & Phillips., 2006). Al respecto, se sabe que DAP10 permite transmitir señales de activación citotóxica enérgicas (NK) o moderadas (TCD8+) (Gilfillan et al., 2002); de hecho, el uso de células T CD8+ activadas, que presentan una mayor expresión de NKG2D/DAP10 en membrana, es considerada actualmente como una terapia biológica contra el cáncer (Ames & Murphy, 2014); como evidencia, un estudio en donde se realizó la transducción de la población 17 “cytokine-induced killer cells” con diferentes receptores anti-CD19 quiméricos determino que la molécula anti-CD19/DAP10 tiene un efecto citotóxico considerable contra blastos de LLA-B (Marin et al., 2007). También, el diseñó de una proteína quimérica: NKG2D/DAP10/CD3δ que al ser transfectada en células NK humanas aumenta la expresión de NKG2D en membrana, en concordancia con un aumento en la actividad citotóxica in vitro contra diversas líneas de tumores sólidos y leucemias, superior a la de células NK activadas convencionales (Chang et al., 2013). Del mismo modo, se ha descrito que la ausencia de DAP10 disminuye la actividad citotóxica de TCD8+ contra M. tuberculosis (Hessmann et al., 2011). Resultados contradictorios se han descrito en un estudio con ratones DAP10 knock-out (KO), lo que se observó fue un aumento en la actividad citotóxica de células NKT y una mayor producción de IL-2 por parte de células T reguladoras, lo que en conjunto llevo a una eliminación eficiente de injertos sinténicos de melanoma (Hyka et al., 2007). También, en líneas tumorales y células cancerígenas humanas que NKG2D/DAP10 interactúa de forma autocrina con ligandos solubles de MICA (Groh et al., 2002), induciendo así la activación de vías de tumorigénesis y propiciando un aumento en él metabolismo oxidativo (Benitez et al., 2011). Estos resultados contradictorios indican que aún no se comprenden plenamente los mecanismos en los que DAP10 participa. Otras funciones de DAP10 Mediante la inducción de la vía PI3K, NKG2D/DAP10 participa en la formación de células T CD8+ de memoria, al promover su sobrevivencia en una fase intermedia entre la activación y la diferenciación terminal (Wensveen et al., 2013). Otros receptores que presuntamente se asocian a DAP10 en humanos participan en procesos como crecimiento, proliferación e inclusive actividad inhibidora. Por ejemplo, RAGE (receptor for advanced glycation end products) está involucrado en la patogénesis de enfermedades inflamatorias, degenerativas e hiperproliferativas, como cáncer, diabetes o Alzheimer (Sakaguchi et al., 2014). En 18 el caso del receptor MDL-1, se ha propuesto la existencia de un complejo trímerico MDL-1/DAP12/DAP10, que regula positivamente osteoclastogénesis (Inui et al. 2009). Por su parte, se ha reportado en la línea RBL-2H3 (mastocitos leucémicos) que el receptor SIRPβ-1 puede asociarse tanto a DAP10 como a DAP12, aunque el acoplamiento con DAP12 induce la producción de serotonina y TNFα, mientras que la unión con DAP10 únicamente coestimula la actividad efectora del adaptador FcεRIγ (Anfossi et al., 2003). 5.2.2 DAP12 DAP12 (ADNX-activation protein of ~12 kDa) o KARAP (Killer activating receptor associated protein) es otra molécula adaptadora transmembranal tipo 1 que también se expresa como homodímero, aunque lo hace en células tanto de estirpe mieloides como linfoides, las cuales son: células dendríticas (DCs), DCs plasmacitoides (pDCs), neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos, macrófagos (Mᴓs), células de la microglia, osteoclastos, células NK, NKT y linfocitos Tγδ. Asimismo, se ha descrito su presencia en niveles bajos en células B, y en algunas subclases de linfocitos T CD4+ y T CD8+ (Lanier, 2009). 5.2.2.1 Estructura y señalización de DAP12 DAP12 se compone de 113 aminoácidos, aunque se reportan transcritos funcionalesde 112, 102 y 101 aminoácidos. Su peso molecular es de 12.18 kD y su punto isoeléctrico está a pH 8,55. Su estructura es similar a DAP10, al componerse de un péptido señal de 27 aminoácidos, una región extracelular con dos residuos de cisteína (posiciones 33 y 35) que permiten unir los homodímeros; una región transmembranal que presenta un ácido aspártico (posición 50) importante en la unión no covalente y estable con los diferentes receptores a los que esta molécula puede asociarse (Wei et al., 2013; Call et al., 2010; Feng et al., 2006); así como una región intracelular que contiene un motivo tipo ITAM (aminoácidos 91-105) (figuras 2 y 3). 19 Figura 2. DAP12 acoplado a NKG2C Figura 3. DAP12 acoplado a TREM2 (Tomadas de: Call et al., 2010) (Modificado de: Neumann & Daly, 2013) Las cinasas Src de los receptores asociados fosforilan los dominios ITAM de DAP12, esta reacción promueve un acoplamiento con los dominios SH2 de las moléculas Syk (spleen tyrosine kinase) y ZAP70 (zeta-chain-associated protein kinase of 70 kDa). El reclutamiento de estas cinasas a su vez moviliza diversos sustratos en citosol (Mócsai et al., 2010). Entre otros, la activación de Syk puede inducir la fosforilación de RelA (p65), componente central de la vía canónica de NF- kB (Bijli et al., 2008). Otro elemento que se activa es PLCγ, que de forma paralela genera DAG (diacilglicerol) y libera Ca2+. DAG a su vez actúa sobre PKC (protein cinasa C) y contribuye a la señalización de las MAPK; por su parte, la señal de calcio activa a la calcineurina fosfatasa (PPP3C) que induce al factor de transcripción NFAT (Nuclear factor of activated T-cells) y cinasas dependientes como CaMK (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase) y PTK2β (Protein tyrosine kinase 2 beta). CaMK y PTK2β contribuyen a la activación del factor CREB (cAMP response element-binding) (Ivashki, 2009; Lowell, 2011). En la señalización también se encuentran implicados Vav2 y Vav3, así como β-catenina, ya que se ha observado que su inhibición daña los efectos citotóxicos mediados por DAP12 (Cella et al., 2004), así como la proliferación de células mieloides (Otero et al., 2009), respectivamente. 20 5.2.2.2 Receptores acoplados y funciones de DAP12 La versatilidad de unión de DAP12 a diferentes receptores es considerable, con diferencias importantes entre especies. Por ejemplo, mientras que en humanos NKG2D solo se une a DAP10, en ratones y otros mamíferos (Fikri et al., 2007) NKG2D presenta una isoforma larga y otra corta, y en ambas tanto DAP10 como DAP12 son capaces de interactuar indistintamente (Rabinovich et al., 2006). Todos los receptores, tanto de humano de ratón, con los que esta molécula se une se presentan en la tabla 2. Tabla 2. Receptores asociados a DAP12 (Modificado de: Lanier, 2009) Gen Proteína Ligando Células donde se expresa HUMANO TREM-1 TREM-1 Desconocido Monocitos, Mᴓs, pDCs, neutrófilos, células microgliales TREM-2 Trem-2 LPS, otros desconocidos Monocitos, Mᴓs, DCs, células microgliales, osteoclastos CD300LB (CD300B) Trem-5, CLM7 Desconocido Monocitos, Mᴓs, DCs, granulocitos, mastocitos CD300LE (CD300E) IREM-2, CLM2 Desconocido Monocitos, DCs SIGLEC14 Siglec-14 Oligo a2-8-Neu5A Monocitos, pDCs, granulocitos SIGLEC15 Siglec-15 Neu5Ac2-6GalNAca Monocitos, Mᴓs SIGLEC16 Siglec-16 Desconocido Mᴓs, células microgliales CLEC5A MDL-1 Dengue Virus Monocitos, Mᴓs, neutrófilos, osteoclastos SIRPB1 Sirp-b1 Desconocido Monocitos, Mᴓs, DCs, neutrófilos, células microgliales, osteoclastos, mastocitos PILRB Pilrb Azucares o-sialisados Mᴓs, linfocitos B PSGL-1 Psgl-1 Selectinas Neutrófilos, células T KIR3DS1 CD158e2 HLA-Bw4 Células T, NK KIR2DS5 CD158g Desconocido Células T, NK KIR2DS1 CD158h HLA-Cw Células T, NK KIR2DS4 CD158i HLA-Cw Células T, NK 21 Tabla 2 Continuación. Receptores asociados a DAP12 Gen Proteína Ligando Células donde se expresa KLRD1/KLRC2 CD94/NKG2C HLA-E Células T, NK KIR2DS2 CD158j HLA-Cw Células T, NK KLRD1/KLRC3 CD94/NKG2E Desconocido Células T, NK NCR2 NKp44 Desconocido Células NK, IPCs (INF-producing cells) RATÓN Trem1 Trem-1 Desconocido Monocitos, Mᴓs, neutrófilos Trem2 Trem-2 Moléculas aniónicas DCs, células microgliales Trem3 Trem-3 Desconocido Osteoclastos AF251705 (cd300d) LMIR2, MAIR-II, DIgR1, CLM4 Desconocido Mᴓs, DCs, células B, mastocitos CD300b LMIR-5 Fosfatidilserina Mᴓs, DCs, granulocitos, mastocitos Siglech Siglec-H Desconocido pDCs, IPCs Siglec15 Siglec-15 Neu5Ac2-6GalNAca; Neu5Ac(α)2–3Galß1-4Glc Osteoclastos Clec5a MDL-1 Desconocido Mᴓs, DCs Sirpb1 Sirp-b1 Desconocido Neutrofilos, monocitos, Mᴓs, células microgliales Pilrb Pilr-b CD99, azucares o-sialisados DCs, células NK Cd200r3 CD200R3 (Lb) CD200 Mastocitos Cd200r4 CD200R4 (La) CD200 Células mieloides, NK Klra4 Ly49D H-2D Células NK Klra8 Ly49H mCMV m157, H-2D Células NK Klra12 Ly49L Desconocido Células NK Klra16 Ly49P H-2D, mCMV m04, H2-L Células NK Klra18 Ly49R H2-D, H2-L Células NK Klra21 Ly49U Desconocido Células NK Klra23 Ly49W H-2D, H2-K, H2-L, RT1-A1 Células NK Klrk1 NKG2D-S Rae-1, H60, Mult1 Células T, NK KLRD1/KLRC2 CD94/NKG2C Qa-1b Células NK 22 Al observar los diferentes receptores con los que DAP12 es capaz de interactuar es comprensible su implicación en diferentes funciones como son: Citotoxicidad DAP12 originalmente se identificó como una pequeña proteína que coinmunoprecipitaba con ciertos receptores activadores de las familias KIR (Killer cell immunoglobulin-like receptor), NKG2 (Natural Killer Group 2) y NCR (Natural Cytotoxicity Receptor) en células NK humanas y de ratón (Olcese et al., 1997). Una de las primeras investigaciones que utilizó ratones DAP12 KO notó una disminución en la citotoxicidad de células NK contra células tumorales (Tomasello et al., 2000). Posteriormente, en un modelo murino donde se inhibió tanto el gen de DAP10 como de DAP12 observó una disminución actividad citotóxica de células NK y linfocitos T CD8+ previamente activados (Karimi et al., 2005). Maduración y proliferación DAP12 participa en la maduración de células mieloides. Algunos de los primeros trabajos que analizaron esta función realizaron la transfección de la línea M1 murina con una proteína DAP12 no funcional; y en consecuencia al estimular la molécula no se observó diferenciación (Aoki et al., 2002); también se determinó la expresión de los receptores acoplados a DAP12: TREM-1 y MDL-1, así como el propio adaptador, en monocitos CD14+, y no así en células inmaduras de médula CD34+. De forma similar la expresión de estas moléculas fue mayor en tejidos adultos en comparación a los fetales (Gingras et al., 2002). Por otro lado, utilizando animales KO para DAP12 o FcRγ se demostró que la señalización mediada por motivos ITAM es fundamental en el desarrollo de osteoclastos (Mócsai et al., 2004); los receptores que se unen a DAP12 y que participan en este proceso son MDL-1, Siglec-15 y TREM-2, lo cual se determinó al bloquear su activación, y como resultado se observaron osteoclastos en menor cantidad, con desordenes morfológicos (citoesqueleto disfuncional, mononucleares) y daño en su habilidad transmigratoria a través de la barrera de osteoblastos (Paloneva et al., 2003, Inui et al., 2009; Ishida et al., 2012; Otero et al., 2009). 23 Inflamación Esta función de DAP12 también es propia de linaje mieloide y tiene como principales receptores implicados a TREM-1 y MDL-1 (Bakker et al., 1999; Hamerman et al., 2009) ya que su sobreestimulación ha sido vinculada con el desarrollo de choque séptico (Bouchon et al., 2001). Al respecto, en un modelo murino se indujo daño hepático, para propiciar la infiltración de células inmaduras que expresaran MDL-1, que se activaron ex vivo y posteriormentese observó la secreción de TNFα y óxido nítrico, lo que produjo choque letal en los animales (Cheung et al., 2011). Adicionalmente, se ha implicado a MDL-1 con respuestas exacerbadas (producción de TNF, IL-1, IL-6 e IL-17A) en macrófagos, neutrófilos y osteoclastos inmaduros presentes en articulaciones inflamadas (Joyce et al., 2010). En artritis reumatoide se ha demostrado que los niveles de expresión de estos receptores correlaciona con el grado de inflamación, por lo que se propone su bloqueo como terapia en estos pacientes (Chen et al., 2014; Chen et al., 2015). En el caso del receptor PILRβ/DAP12, en un modelo de ratones infectados con T. goondi, que presentan inflamación crónica, se ha descrito que la ausencia de señales activadoras para PILRβ pueden inducir una mayor producción de IL-27 e IL-10 por parte de distintas células mieloides y linfoides, lo que incrementa la supervivencia ante la infección (Tato et al., 2012). Migración En cuanto a movilidad, se ha observado que la unión de selectina-E con la integrina PSGL-1, señaliza, vía DAP12 o FcεRIγ, induciendo rodamiento leucocitario (Zarbock et al., 2008). Esta unión también lleva a una activación parcial de la intregrina β2 en la superficie de neutrófilos y macrófagos, que se une a ICAM-1 presente en células epiteliales. En células DAP12/FcεRIγ doble negativo la activación mediada por estas integrinas es defectuosa (Mócsai et al., 2006). Otro estudio determinó que DAP12 se requiere para el reclutamiento de macrófagos alveolares a pulmón, en respuesta al humo de cigarrillo. El humo induce la liberación de CCL2, que podría ser posible ligando del receptor TREM2, que también se une a al adaptadora DAP12 (Koth et al., 2010). 24 Actividad inhibidora La activación de los receptores NKp44/DAP12 o siglec-H/DAP12 en IPCs (células productoras de interferón) humanas o de ratón respectivamente, inhibe la producción de INFα; que normalmente secretan estas células en respuesta a estímulos con oligonucleótidos CpG (Fuchs et al., 2005; Blasius et al., 2006). Resultados similares se han observado en macrófagos, DCs y células B. En macrófagos con el gen de DAP12 bloqueado los estímulos con ligandos para TLRs (Toll-like receptors) llevaron a una mayor producción de IL-6 e IL-12 en comparación con células Wild Type (Hamerman et al., 2005). Aunado a esto, la activación de TREM-2/DAP12 inhibe la producción de TNF por parte de estas células, que es secretado en respuesta a estímulos en TLRs y FcRs (Hamerman et al., 2006); la activación y maduración de macrófagos con LPS o INFγ in vitro abate la expresión de TREM-2, acabando con la inhibición (Turnbull et al., 2006). En el caso de DCs, al inhibir la expresión de TREM-2, DAP12 o FcεRIγ, se observa una mayor maduración fenotípica y funcional en respuesta a ligandos de TLRs; y en consecuencia, se induce un aumento en la proliferación y activación de linfocitos T (Sumpter et al., 2011; Chu et al., 2008; Ito et al., 2012). Esta maduración exacerbada es perjudicial, como se ilustra en un modelo de infección pulmonar con influenza; aquí, ratones con deficiencia en DAP12 sucumbieron a la infección como resultado de una inmunopatología descontrolada, asociada con un aumento de células T CD4+, activadas a su vez por DCs mutadas en DAP12 (McCormick et al., 2011). También en ratones con trasplante de hígado, la ausencia de DAP12 produce una maduración exacerbada de DCs que conduce al rechazo agudo del injerto (Yoshida et al., 2014). Mientras que en células B deficientes en DAP12, se observa una proliferación aumentada al inducir sus BCRs con anti-IgM o CpGs. El mismo efecto sucede al silenciar el receptor MAIR-II. El complejo MAIR-II/DAP12 parece reclutar el dominio SH2 de la fosfatasa SHIP-1 (inositol polyphosphate 5- phosphatase) después de la estimulación del BCR y así regula negativamente la respuesta de estas células (Nakano-Yokomizo et al., 2011). 25 5.3 DAP10 y DAP12 en leucemias agudas Como se menciona dentro de la descripción de sus funciones, DAP10 y DAP12 participan en los mecanismos de diversos padecimientos. Sin embargo, las leucemias agudas destacan en cuanto a su relación con estas moléculas adaptadoras. El primero de estos antecedentes es similar al estudio del 2002 de Groh y colegas, ya que se observó en células efectoras de pacientes con leucemia un aumento significativo en la expresión de ligandos solubles de MICA, lo que puede influir de forma negativa en la expresión del complejo NKG2D/DAP10 y alterar la citotoxicidad antitumoral (Salih et al., 2003). En células NK de pacientes con LMA también se ha descrito una menor expresión de receptores activadores, como NKG2D/DAP10 y NKG2C/DAP12; adicionalmente se ha reportado en estos pacientes una ausencia de determinados ligandos citotóxicos en un porcentaje elevado de células tumorales; hechos que en conjunto pueden llevar también a una inadecuada inmunovigilancia (Sanchez et al., 2011). Además, en células de pacientes con LMA se ha reportado una menor expresión del factor de transcripción PU.1 en comparación con donadores sanos. Esté factor actúa sobre el promotor de MDL-1, por lo que la expresión de este receptor que se acopla a DAP12 se inhibe proporcionalmente, lo que podría derivar en una menor tasa de maduración de blastos mieloides (Batliner et al., 2011). Otro estudio en la línea leucémica KG1a y blastos de pacientes con LMA reportó que al estimular dichas células con TNFα se produce actividad citotóxica contra progenitores mieloides, que a su vez exhiben ligandos para receptores citotóxicos acoplados a DAP10 y DAP12; este fenómeno podría explicar parcialmente porque la hematopoyesis normal se encuentra comprometida en estos padecimientos (Guilloton et al., 2005). De forma similar, Chen y colaboradores observaron en leucemia de linfocitos grandes granulares (un tipo de leucemia crónica asociada con autoinmunidad) que células tumorales CD8+ tienen actividad lítica sobre células endoteliales y sinoviales sanas, y que tienen una expresión elevada de los receptores NKG2D, NKp46 y Nkp30. Adicionalmente, ellos diseñaron células malignas doble negativo DAP10/DAP12 y observaron una actividad citotóxica reducida, por lo que concluyeron que la inhibición dirigida de 26 estas moléculas en células neoplásicas puede ser un blanco terapéutico para patologías autoinmunes (Chen et al., 2009). 5.4 Variantes génicas de DAP10 y DAP12 A nivel genómico, las moléculas adaptadoras DAP10 y DAP12 son codificadas por los genes HCST (Hematopoietic cell signal transducer) y TYROBP (Tyrosine-kinase binding protein), respectivamente. Ambos genes se encuentran adyacentes en la región cromosómica 19q13.12 con orientación transcripcional opuesta, comprendiendo junto a otras moléculas (SIGLEC, CD66, etc.) el llamado LCR (leukocyte receptor complex) extendido (Barrow & Trowsdale, 2008). Ortólogos de DAP10 y DAP12 se han descrito en el genoma de diferentes especies de mamíferos (Homo sapiens, Pan troglodytes, Bos taurus, etc.), anfibios (Xenopus tropicalis) y peces (Danio rerio) (Lanier, 2009; Call et al., 2010); características que resaltan su importancia en la homeostasis celular. El gen de DAP10 se compone de 1,791 pares de bases (pb) divididos en cuatro exones que corresponden a los diferentes dominios de la proteína (péptido señal, región extracelular, transmembranal e intracelular) y se han reportado en su secuencia 92 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y dos deleciones de acuerdo con la información más reciente de la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information); de las 94 variantes el 17% se encuentra en regiones codificantes y solo nueve de ellas presentan una frecuencia del alelo menor (MAF) superior al 1% (Anexo 1). Por su parte, el gen de DAP12 tiene una longitud de 4,115 pb, constade cinco exones y hasta el momento se reportan un total de 183 SNP y 17 deleciones; el 20.5% de estas mutaciones se localiza en exones y el 18% exhibe una MAF superior a 0.01 (Anexo 2), lo que puede ser indicativo de una mayor variación génica en comparación con DAP10. Además, DAP10 y DAP12 presentan desequilibrio de ligamiento (LD) con valor de r2=1 (de Bakker et al., 2005), en una región que abarca todo el gen de DAP10, así como la región UTR-3´ (untranslated region), el exón 5 y parte del intron 4 de DAP12 (HapMap). Los loci involucrados son el rs11878547, localizado 27 en región intergénica; el rs8106495 presente en DAP10, y las variantes rs1802029, rs8113524 y rs8110231 pertenecientes a DAP12 (Figura 4). Figura 4. Desequilibrio de ligamiento en región cromosómica 19q.13.12 (Obtenido y modificado de Haploview® ver. 4.1) En cuanto a la asociación entre alelos y patologías, ninguna de las variantes génicas de DAP10 ha sido descrita, mientras que en DAP12 los rs104894732, rs386833839, rs386833840, rs386833841 y rs386833842 conciernen en la enfermedad Nasu-Kahola o PLOSL (osteodisplasia poliquística lipomembranosa con leucoencefalopatía esclerosante); un desorden recesivo donde se presentan lesiones quísticas en hueso con características de osteoporosis, así como perdida de materia blanca en cerebro, lo que produce susceptibilidad a fracturas y demencia respectivamente, pudiendo llegar a ser fatal. La principal causa de este padecimiento son diferentes mutaciones en DAP12 o el receptor TREM-2, que afectan la correcta maduración de osteoclastos y células microglíales (Paloneva et al., 2003). En el caso de DAP12, inicialmente se encontró en pacientes de origen finlandés una deleción de 5,265 pb flanqueada por secuencias Alu idénticas, que abarca desde la región promotora de DAP12 hasta el exón 4. Adicionalmente se encontró una deleción en el exón 3 28 (rs386833840) que provoca un corrimiento en el marco de lectura, produciendo un codón de paro prematuro, lo que genera una proteína no funcional (Paloneva et al., 2000). Un estudio posterior en pacientes japoneses reveló una nueva mutación (rs104894732) con pérdida de función que modifica el primer aminoácido (metionina), impidiendo la traducción de DAP12 (Kondo et al., 2002). Posteriormente, se reportó un caso con un paciente homocigoto para dos mutaciones distintas, la deleción del exón 3 y una nueva mutación de perdida de función en el exón 4 (rs386833842), que de igual forma produce un codón de paro prematuro (Kuroda et al., 2007). Los estudios de asociación del genoma completo o GWAS (Genome-wide association study) tampoco han señalado como marcador significativo algún SNP presente en DAP10, mientras que rs3817624, rs8113524 y rs1802029 de DAP12 se han asociado con los niveles de colesterol en suero (en población británica) (Strachan et al., 2007) y de hemoglobina glucosilada (Soranzo et al., 2010), así como en diversos males como el síndrome de Parkinson (Fung et al., 2006), el choque isquémico (Matarin et al., 2006) y la degeneración macular relacionada a la edad (Klein et al., 2005), de acuerdo a la base de datos GWASCentral. Las funciones de DAP12 permiten comprender una posible relación con cualquiera de estas alteraciones, aunque ninguno de los polimorfismos mencionados modifica la secuencia de aminoácidos del adaptador; rs3817624 y rs8113524 se localizan en intrones y rs1802029 en región UTR-3´, por lo que presumiblemente este último SNP actúa sobre los niveles de expresión de DAP12. Además, entre rs8113524 y rs1802029 existe LD con valor de r2=1 (rombos negros, ver Figura 4), por lo que la asociación de alguno de estos locus puede ser efecto secundario del LD. Elegir solo algunas de las variantes de DAP10 y DAP12 para un estudio resulta complicado. Sin embargo, características previamente mencionadas como son el hecho de poder alterar la secuencia de aminoácidos y la función de la proteína, una MAF superior al 1%, presentar LD y encontrarse asociado en alguna enfermedad nos permitieron llegar a la elección de SNP candidatos para el presente proyecto, como se muestra en la tabla 3 y se ilustra en la figura 5. 29 Tabla 3. SNP candidatos en DAP10 y DAP12 Molécula SNP Región Principales criterios de selección DAP10 rs11880605 (CA) UTR 5´ La variante puede afectar la transcripción del gen. Su MAF es de 0.01, que es la mayor de algún SNP en esta región. rs33964243 (CT) Exón 2 Este cambio produce una mutación sinónima pero su MAF es de 0.15, que corresponde a la mayor variación de algún SNP presente en DAP10. rs149774048 (GA) Intron 2 Esta variante única en DAP10 modifica una de las bases implicadas en el splicing 5´entre los exones 2 y 3. DAP12 rs77782321 (GT) Exón 3 La variante produce una mutación de perdida de función (36(VL) en la región transmembranal de DAP12, cerca del sitio de interacción con receptores. rs14714 (AG) Exón 5 Esta mutación de perdida de función (103YH) afecta la el motivo ITAM de DAP12, por lo que el cambio puede generar una proteína sin actividad. rs1802029 (GT) UTR 3´ Este SNP presenta LD con otras cuatro variantes y se ha determinado como marcado en GWAS1. (1: Soranzo et al., 2010; Fung et al., 2006; Matarin et al., 2006; Klein et al., 2005) Figura 5. Polimorfismos candidatos en genes y proteínas DAP10 y DAP12 (Modificado de: Marusina et al, 2008 y Lopez et al, 2008) 30 6. Justificación En los últimos años los índices de incidencia y mortalidad por leucemia aguda se han incrementado en México. Esto puede deberse a la implementación de mejores métodos de diagnóstico y pronóstico, y aunado al panorama sombrío que enfrentan pacientes adultos con esta enfermedad, indica la necesidad de estudios novedosos con impacto directo en la clínica. Las leucemias tienen una etiología multifactorial, por lo que existen diversos factores genéticos implicados en su desarrollo. DAP10 y DAP12 son proteínas adaptadoras que participan en inmunovigilancia y diferenciación, y se encuentran fuertemente vinculadas en los mecanismos fisiopatológicos de dichas neoplasias hematológicas. Además, estas moléculas presentan variantes en su secuencia génica, por lo que cabe la posibilidad de que determinados polimorfismos puedan asociarse en LLA y LMA. Para el estudio, se seleccionaron tres diferentes SNP de DAP10 que pueden alteran su expresión (rs11880605), su estructura proteica (rs149774048) o simplemente funcionar como marcadores informativos (rs33964243). De forma similar, en DAP12 las variantes analizadas pueden influir en su funcionalidad (rs77782321, rs14714) o encontrarse implicadas previamente como factores de riesgo en otros padecimientos (rs1802029). Se espera encontrar biomarcadores de utilidad y comprender más sobre las leucemias agudas. 31 7. Hipótesis Los polimorfismos de un solo nucleótido rs11880605, rs33964243, rs149774048, rs77782321, rs14714 y rs1802029 de las moléculas adaptadoras DAP10 y DAP12 pueden asociarse con la predisposición al desarrollo de leucemias agudas. 8. Objetivos 8.1 General Identificar si los polimorfismos de un solo nucleótido rs11880605, rs33964243, rs149774048, rs77782321, rs14714 y rs1802029 de las moléculas adaptadoras DAP10 y DAP12 pueden asociarse con la predisposición al desarrollo de leucemias agudas. 8.2 Particulares I. Tipificar los SNP de DAP10: rs11880605, rs33964243 y rs149774048; en pacientes con leucemia linfoide aguda, pacientes con leucemia mieloide aguda y sus respectivos controles. II. Tipificar los SNP de DAP12: rs77782321, rs14714 y rs1802029; en pacientes con leucemia linfoide aguda, pacientes con leucemia mieloide aguda y sus respectivos controles. III. Determinar las frecuencias alélicas, genotípicasy haplotípicas de los SNP rs11880605, rs33964243 y rs149774048 de DAP10; así como rs77782321, rs14714 y rs1802029 de DAP12 en pacientes con leucemia linfoide aguda, pacientes con leucemia mieloide aguda y población adulta mexicana del valle de México. 32 9. Materiales y métodos 9.1 Población de estudio Pacientes Se capturaron 111 adultos con diagnóstico clínico de LLA y 70 con LMA, que acudieron al servicio de Hematología de la Unidad Médica de Alta Especialidad-Hospital de Especialidades, Centro Médico Nacional Siglo XXI (CMN-SXXI). Criterios de inclusión Tener 18 años o más al momento del diagnóstico. Ascendencia de dos o más generaciones nacidas en México. Criterios de exclusión Desarrollo de leucemia relacionado con factores externos (v.g.: exposición a radiaciones, tratamiento mieloablativo, etc.). Diagnóstico de alguna enfermedad de tipo autoinmune (diabetes, espondiloartropatías) u otro tipo de cáncer. Pertenecer a un grupo cerrado de población mexicana. El tamaño de muestra se calculó respecto a una frecuencia de alelo menor del 10%, con una Razón de Momios (RM) de 3.0, confianza del 95%, poder del 80% y α de 0.05; utilizando el software “Power and Sample Size Calculation” versión 3.0.43. (Dupont & Plummer, 1998) Así, se estableció que se requieren 102 pacientes por grupo y una relación de 1:2 con los controles. Controles Se captaron 362 sujetos sanos que asistieron como donadores al Banco Central de Sangre, CMN-SXXI. Se dividieron en dos grupos con la finalidad de estar pareados por edad y género con los pacientes de LLA y LMA. 33 Criterios de inclusión Mayores de edad Ascendencia de dos o más generaciones nacidas en México. Criterios de exclusión Relación cosanguínea con otro individuo perteneciente al grupo de pacientes o controles. Pertenecer a un grupo cerrado de población mexicana. - Criterios de eliminación de muestras de pacientes y controles Muestra insuficiente. ADN degradado o con poca concentración. Muestra con resultados incompletos de genotipificación. 9.2 Material biológico y extracción de ADN De cada paciente se tomaron 6 mL de sangre venosa periférica, anticoagulada con EDTA. Para los controles se tomó el tubo de muestra que se utiliza en el análisis del grupo sanguíneo (aproximadamente 4 mL de sangre con EDTA). Después de su obtención, las muestras se transportaron en frío y cubiertas al laboratorio de Histocompatibilidad de la Unidad de Investigación Médica en Inmunología, CMN-SXXI para su procesamiento. En todas las muestras se efectuó la separación del plasma (para crear un banco que sea de utilidad en posibles estudios futuros) y la extracción del ADN por una microtécnica de precipitación por salado (Miller et al. 1988). Brevemente, la técnica consiste en la lisis de eritrocitos y leucocitos, posteriormente se precipitan proteínas utilizando una solución salina saturada y finalmente el material genético se separa, precipita y resuspende. La concentración y calidad del ADN obtenido se evaluó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop1000 (Thermo Scientific). La integridad del ADN se determinó por electroforesis en geles de agarosa al 0.8% con Tris-Borato-EDTA. 34 Las muestras que cumplieron una relación A260/A280 de 1.8-1.9 y no se encontraban degradadas se diluyeron a 200 ng/µl para su estudio. 9.3 Genotipificación de DAP10 y DAP12 por PCR en tiempo real Los polimorfismos fueron tipificados por discriminación alélica mediante PCR (Polymerase chain reaction) en tiempo real, utilizando sondas TaqMan®. De forma concisa, en 20 µL de reacción se colocaron 25 ng de material genético, 1X de TaqMan Genotyping Master Mix® y 1X de TaqMan Genotyping Assay® (figura 6). La amplificación fue realizada en un termociclador Step One RT-PCR system (Applied Byosistems®) bajo las siguientes condiciones: - Desnaturalización inicial: 95 °C/ 10 minutos - 30 ciclos de: Desnaturalización: 95 °C / 15 segundos Alineación y extensión: 60 °C / 1 minuto - Extensión final: 60°C durante 30 segundos Figura 6. Amplificación y fluorescencia con el uso de sondas TaqMan® (Modificado de: Applied Biosystems StepOneTM and StepOnePlusTM. Real-Time PCR Systems. Genotyping Experiments, Getting Started Guide) 35 La técnica se fundamenta en el uso de dos tipos de sondas, específicas y complementarias a la región génica donde se encuentra un SNP de interés, de modo que cada una de ellas reconoce un alelo diferente. Las sondas tienen acoplado en su región 5´ diferentes fluoróforos (VIC® o FAMTM), cuya fluorescencia es sofocada debido a la presencia de un “apagador” (TAMRATM) en la región 3´. Durante la fase de extensión de la PCR, la enzima Taq polimerasa presenta actividad exonucleasa sobre aquellos fluorocromos que se encuentren hibridados al templado de ADN. En consecuencia, el fluoróforo se libera y emite su fluorescencia característica; al repetir los ciclos la fluorescencia se incrementa de manera proporcional a la amplificación de dicho alelo. 9.4 Análisis estadístico Se realizó un análisis descriptivo de los grupos por edad y género. Con base en estas variables se compararon pacientes y controles utilizando la prueba t de student para muestras independientes. Las frecuencias alélicas, genotípicas y haplotipicas de los pacientes se compararon con su respectivo grupo control. También se analizaron las combinaciones de genotipos de DAP10 y DAP12. Las diferencias fueron evaluadas estadísticamente mediante la prueba de Chi cuadrada (χ2) y la prueba exacta de Fisher en tablas de contingencia de 2x2, usando el programa estadístico EpiInfoTM 7 (CDC, USA). Los valores de p menores a 0.05 deben ser corregidos por el número de especificidades estudiadas para obtener una p corregida (pc). En caso de que el valor continúe siendo menor a 0.05 el resultado se consideraría estadísticamente significativo. El vigor de asociación se determinó calculando la RM con un intervalo de confianza (IC) del 95%. La inferencia y el análisis del LD, el equilibrio Hardy-weinberg (H-W) y los haplotipos se realizó con el programa HaploView versión 4.1 (Barret et al. 2005). 36 10 . Resultados 10.1 Características de la población de estudio Las características de edad y género para los grupos de pacientes con LLA, LMA y sus respectivos controles se muestran en la tabla 4 y la gráfica 2; como se observa, en ningún caso hay diferencias significativas entre grupos. Tabla 4. Descripción por edad y género de los diferentes grupos de estudio LLA (n=111) Controles (n=222) LMA (n=70) Controles (n=140) Edad en años (media + DE) 29.59 + 9.29 30.24 + 9.17 36.01 + 10.88 36.37 + 10.48 Masculino n (frecuencia) 63 (56.76%) 126 (56.76%) 39 (55.71%) 78 (55.71%) Femenino n (frecuencia) 48 (43.24%) 96 (43.24%) 31 (44.29%) 62 (44.29%) n: número de pacientes o controles, DE: Desviación estándar Gráfica 2. Edad promedio de pacientes y sus respectivos controles, por género 37 10.2 Frecuencias alélicas y genotípicas La frecuencia alélica y genotípica de cada SNP de DAP10 y DAP12 bajo estudio en pacientes con LLA y sus respectivos controles se ilustra en la tabla 5. En ninguna situación los resultados de asociación resultaron significativos. Tabla 5. Frecuencias de SNP de DAP10 y DAP12 en LLA y controles Alelos LLA Controles Genotipos LLA Controles SNP n (frecuencia) n (frecuencia) DAP10 rs11880605 C 222 (1.00) 444 (1.00) CC 111 (1.00) 222 (1.00) A 0 (0.00) 0 (0.00) CA 0 (0.00) 0 (0.00) AA 0 (0.00) 0 (0.00) rs33964243 T 216 (0.97) 432 (0.97) TT 105 (0.95) 210 (0.95) C 6 (0.03)a 12 (0.03) TC 6 (0.05)b 12 (0.05) CC 0 (0.00) 0 (0.00) rs149774048 G 222 (1.00) 444 (1.00) GG 111 (1.00)222 (1.00) A 0 (0.00) 0 (0.00) GA 0 (0.00) 0 (0.00) AA 0 (0.00) 0 (0.00) DAP12 rs77782321 G 222 (1.00) 444 (1.00) GG 111 (1.00) 222 (1.00) T 0 (0.00) 0 (0.00) GT 0 (0.00) 0 (0.00) TT 0 (0.00) 0 (0.00) rs14714 A 222 (1.00) 444 (1.00) AA 111 (1.00) 222 (1.00) G 0 (0.00) 0 (0.00) AG 0 (0.00) 0 (0.00) GG 0 (0.00) 0 (0.00) rs1802029 T 219 (0.99) 437 (0.98) TT 108 (0.97) 215 (0.97) G 3 (0.01)c 7 (0.02) TG 3 (0.03)d 7 (0.03) GG 0 (0.00) 0 (0.00) a: RM 1.0 (IC 95%: 0.37-2.70), p > 0.05 b: RM 1.0 (IC 95%: 0.37-2.74), p > 0.05 c: RM 1.2 (IC 95%: 0.30-4.57), p > 0.05 d: RM 1.2 (IC 95%: 0.30-4.62), p > 0.05 38 La frecuencia alélica y genotípica de cada SNP de DAP10 y DAP12 en estudio en pacientes con LMA y sus respectivos controles se ilustra en la tabla 6. Bajo ninguna situación los resultados de asociación resultaron significativos. Tabla 6. Frecuencias de SNP de DAP10 y DAP12 en LMA y controles Alelos LMA Controles Genotipos LMA Controles SNP n (frecuencia) n (frecuencia) DAP10 rs11880605 C 140 (1.00) 280 (1.00) CC 70 (1.00) 140 (1.00) A 0 (0.00) 0 (0.00) CA 0 (0.00) 0 (0.00) AA 0 (0.00) 0 (0.00) rs33964243 T 137 (0.98) 273 (0.98) TT 67 (0.96) 133 (0.95) C 3 (0.02)a 7 (0.02) TC 3 (0.04)b 7 (0.05) CC 0 (0.00) 0 (0.00) rs149774048 G 140 (1.00) 280 (1.00) GG 70 (1.00) 140 (1.00) A 0 (0.00) 0 (0.00) GA 0 (0.00) 0 (0.00) AA 0 (0.00) 0 (0.00) DAP12 rs77782321 G 140 (1.00) 280 (1.00) GG 70 (1.00) 140 (1.00) T 0 (0.00) 0 (0.00) GT 0 (0.00) 0 (0.00) TT 0 (0.00) 0 (0.00) rs14714 A 140 (1.00) 280 (1.00) AA 70 (1.00) 140 (1.00) G 0 (0.00) 0 (0.00) AG 0 (0.00) 0 (0.00) GG 0 (0.00) 0 (0.00) rs1802029 T 139 (0.99) 276 (0.99) TT 69 (0.99) 136 (0.97) G 1 (0.01)c 4 (0.01) TG 1 (0.01)d 4 (0.03) GG 0 (0.00) 0 (0.00) a: RM 1.2 (IC 95%: 0.30-4.60), p > 0.05 b: RM 1.2 (IC 95%: 0.29-4.69), p > 0.05 c: RM 2.0 (IC 95%: 0.22-18.2), p > 0.05 d: RM 2.0 (IC 95%: 0.22-18.5), p > 0.05 39 En las tablas 5 y 6 se puede apreciar que en la variante rs33964243 de DAP10 la frecuencia del alelo C es del 3% en LLA y 2% en LMA, al igual que en sus respectivos controles. El genotipo CC no se observó en ningún caso y TC tuvo frecuencias del 5% en LLA y sus controles, y del 4% en LMA adversus el 5% en sus controles. De manera similar, el polimorfismo rs1802029 de DAP12 tuvo frecuencias del alelo G del 1% en LLA y 2% en sus controles, mientras que en LMA y sus controles también fueron del 1%. El genotipo GG no se presentó y TG tuvo frecuencias de 3% en LLA, 1% en LMA y 3% en ambos grupos de controles. En el resto de los SNP estudiados solo un alelo y un genotipo se presentó en el 100% de las muestras: C y CC para rs11880605, G y GG en rs149774048, G y GG en el caso de rs77782321, así como A y AA en rs14714. Posteriormente, se realizó una comparación entre la edad y el género de los grupos bajo estudio con los genotipos de las variantes rs33964243 y rs1802029. Los resultados se muestran en la tabla 7. Tabla 7. Variables por genotipo de rs33964243 y rs1802029 en grupos de estudio Genotipo LLA Controles LMA Controles rs33964243 Edad en años (media + DE) TT TC 29.47 + 9.36 31.66 + 8.36 29.89 + 9.20 31.00 + 6.73 35.32 + 10.52 51.33 + 8.02 * 36.54 + 10.46 33.29 + 11.65 Relación F / M n TT TC 44 / 61 4 / 2 91 / 119 5 / 7 29 / 38 2 / 1 59 / 74 3 / 4 rs1802029 Edad en años (media + DE) TT TG 29.60 + 9.35 29.33 + 8.08 30.15 + 9.15 33.00 + 10.21 35.68 + 10.60 59 36.32 + 10.51 38.00 + 10.68 Relación F / M n TT TG 47 / 62 2 / 1 91 / 124 5 / 2 30 / 39 0 / 1 62 / 74 0 / 4 n: número de pacientes o controles, DE: Desviación estándar. * Prueba de t para muestras independientes <0.05 40 En la tabla 7 podemos observar diferencias estadísticamente significativas entre los genotipos TT y TC del rs33964243 y la edad en los pacientes con LMA; sin embargo no podemos atribuirle relevancia ya que el genotipo TC solo estaba presente en tres muestras, por lo tanto necesitaríamos aumentar la cantidad de heterocigotos para observar si las diferencias se mantienen. En cuanto al género en individuos heterocigotos para ambos SNP, observamos una tendencia a que se presenten más mujeres que hombres; nuevamente necesitaríamos ampliar la muestra para poder asegurar que existe una relación entre la variable y los polimorfismos de estas analizados. Por otro lado, la frecuencia alélica y genotípica de estos polimorfismos no había sido reportada previamente en una población mexicana residente del Valle de México, por lo que se comparó con otras poblaciones analizadas por el proyecto de los 1000 genomas. La información corresponde a los SNP rs11880605 (gráficas 3 y 4), rs33964243 (gráficas 5 y 6), rs77782321 (gráficas 7 y 8) y rs1802029 (gráficas 9 y 10). En las gráficas de la 3 a la 10 las frecuencias corresponden al grupo control (CTR) (n=362), población residente de Los Ángeles, EUA con ancestría mexicana (MXL); población indígena de Puerto Rico (PUR); población indígena de Medellín, Colombia (CLM); población indígena de Lima, Perú (PEL); población residente de Utah, EUA con ancestría del norte y oeste de Europa (CEU); población indígena de Finlandia (FIN); población indígena de Inglaterra y Escocia (GBR); población ibérica de España (IBS), población indígena del valle de Toscana, Italia (TSI); población con ancestría africana de Barbados (ACB); población con ancestría africana del suroeste de EUA (ASW); indígenas Luhya de Webuye, Kenia (LWK); indígenas Yoruba de Ibadan, Nigeria (YRI); indígenas Mende de Sierra Leona (MSL); indígenas de Gambia (GWD); indígenas Esan de Nigeria (ESN); población residente de Xishuangbanna, China con ancestría Dai (CDX); población residente de Beijing, China con ancestría Han (CHB); población de la zona meridional de China (CHS); población indígena de Tokio, Japón (JPT) y población residente de la ciudad de Kinh in Ho Chi Minh, Vietnam (KHV). 41 Gráfica 3. Frecuencias alélicas de rs11880605 en diferentes poblaciones Gráfica 4. Frecuencias genotípicas de rs11880605 en diferentes poblaciones En las gráficas 3 y 4 se observa que el polimorfismo rs11880605 se ha detectado únicamente en poblaciones negras, así como puertorriqueños y colombianos, mientras que en el resto de las poblaciones no se ha reportado. Gráfica 5. Frecuencias alélicas de rs33964243 en diferentes poblaciones 42 Gráfica 6. Frecuencias genotípicas de rs33964243 en diferentes poblaciones En cuanto a las gráficas 5 y 6, correspondientes al rs33964243 de DAP10, observamos que las frecuencias de los controles son similares principalmente a las que presentan los mexicanos de Los Ángeles, con la diferencia de que ellos sí exhiben el genotipo CC. El resto de grupos americanos y caucásicos en general tienen frecuencias parecidas, a excepción de los colombianos y puertorriqueños, mientras que en los grupos africanos y asiáticos existe una mayor discrepancia, e inclusive el alelo menor puede ser T para la población de Gambia. Gráfica 7. Frecuencias alélicas de rs77782321 en diferentes poblaciones 43 Gráfica 8. Frecuencias genotípicas de rs77782321 en diferentes poblaciones En las gráficas 7 y 8, propias del SNP rs77782321 de DAP12 observamos que el alelo menor no se presenta en nuestro grupo de estudio ni en otras poblaciones americanas (CLM, PEL) y africanas (ASW, LWK, MSL, GWD, ESN); en el resto de los grupos el alelo aparece en pequeña proporción (MXL y PUR por América, CEU, FIN, GBR, IBS y TSI por Europa y ACB y YRI por África); y solo en las poblaciones asiáticas tiene una frecuencia mayor. Gráfica 9. Frecuencias alélicas de rs1802029 en diferentes poblaciones Mientras que en las gráficas
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