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I UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA REGULADORA DE LA APOPTOSIS (ARP2) T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS P R E S E N T A: Q.F.B. Enrique Navarro Vidal TUTOR: DR. JAIME MAS OLIVA INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR MÉXICO, D. F. JUNIO 2013 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. II ÍNDICE CONTENIDO PÁGINA PRESENTACIÓN 1 RESUMEN 2 ABSTRACT 3 INTRODUCCIÓN 4 ANTECEDENTES 20 TRABAJO EXPERIMENTAL-PRIMERA SECCIÓN 21 Hipótesis 21 Objetivo general 21 Objetivos específicos 22 Material y métodos 23 Resultados 36 Discusión 53 TRABAJO EXPERIMENTAL-SEGUNDA SECCIÓN 57 Objetivo general 57 Objetivos específicos 57 Análisis previo 58 Material y métodos 59 Resultados 72 Discusión 93 DISCUSIÓN GENERAL 97 CONCLUSIONES GENERALES 99 PERSPECTIVAS GENERALES 100 BIBLIOGRAFÍA 102 ABREVIATURAS 109 APÉNDICE 114 1 PRESENTACIÓN Según la Organización Mundial de la Salud, el cáncer de próstata es el cáncer con mayor incidencia y la principal causa de muerte relacionada a cáncer en México. A nivel mundial, en cuanto a enfermedades por cáncer, ocupa el segundo lugar en incidencia y el sexto lugar en mortalidad. En nuestro grupo de investigación se identificó y reportó por primera vez a ARP2, una proteína pro-apoptótica con características similares a las de un canal permeable a Ca2+. La expresión de ARP2 promueve la entrada sostenida de Ca2+ extracelular induciendo la apoptosis en células de cáncer de próstata hormona- independiente (LNCaP). La presente tesis consta de una introducción, antecedentes, discusión, conclusiones, perspectivas y bibliografía general. Sin embargo, el trabajo experimental se encuentra dividido en dos secciones y cada una de estas contiene su respectiva metodología, resultados y discusión. En la primera sección del trabajo experimental se evaluó la función de ARP2, específicamente el efecto pro-apoptótico de esta molécula en células de cáncer de próstata andrógeno-independientes y células CHO transfectadas con el arp2 cDNA. Se realizaron estudios de localización subcelular, mostrando una asociación de ARP2 a la membrana plasmática. De tal manera que los resultados obtenidos en esta tesis en combinación con los resultados obtenidos previamente en nuestro grupo de investigación, que consistieron en la caracterización electrofisiológica y funcional de esta proteína, muestran que ARP2 posee características similares a las de un canal permeable a Ca2+ localizado en la membrana plasmática. Por lo tanto, ARP2 se ha propuesto como una molécula blanco de gran interés en el control del cáncer de próstata en sus etapas más agresivas. En este punto, el estudió de ARP2 tomó un nuevo y atractivo interés: su caracterización estructural. ARP2 tiene una homología del 99% con un fragmento que corresponde al 18% de Prp8, una proteína importante en el ensamblaje del esplaiceosoma. A partir de este hecho surgió la idea de que ARP2 como un fragmento de Prp8 y bajo condiciones específicas relacionadas a la muerte celular programada, adquiere una función alternativa conformando un canal involucrado en la entrada sostenida de Ca2+. De tal manera que los estudios de estructura molecular nos permitirían obtener información acerca del proceso de re-estructuración que sufre esta proteína, al liberarse de su contexto inicial como parte de Prp8 para después incorporarse a la membrana plasmática como un canal permeable a Ca2+. Por este motivo nos dimos a la tarea de establecer la metodología para la sobreexpresión y purificación de ARP2, lo cual constituye la segunda sección del trabajo experimental de esta tesis. En esta sección describimos la primera fase en el proceso para la obtención de la estructura molecular de ARP2. La siguiente etapa, como el trabajo a futuro de esta investigación, será la aplicación de técnicas como la cristalografía de rayos X o la resonancia magnética nuclear, para la resolución de la estructura molecular de ARP2. 2 RESUMEN El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte en el mundo asociada a la aparición de células cancerosas andrógeno-independientes, generando un fenotipo celular con alta resistencia a la activación de la apoptosis y promoviendo la metástasis. Tomando en cuenta que las células andrógeno- independientes pueden activar la apoptosis al incrementar su concentración de calcio intracelular, nuestro grupo de investigación llevó a cabo la identificación y caracterización electrofisiológica de un canal permeable a Ca2+ activado durante la apoptosis en células LNCaP andrógeno-independientes. A partir de este estudio, hemos descrito la clonación y caracterización de ARP2 (apoptosis regulated protein 2), una molécula similar a un canal iónico asociado a influjos letales de Ca2+ en ovocitos de Xenopus laevis. Los estudios correspondientes a la primera parte de esta tesis muestran células LNCaP andrógeno-independientes y células derivadas de ovarios de hámster chino (CHO) transfectadas con arp2 cDNA y subsecuentemente inducidas a la apoptosis durante la expresión de ARP2. Para evaluar el proceso de muerte en estas células se realizaron ensayos de viabilidad celular mediante la reducción de MTT y por el método de exclusión con azul de tripano. Se midió la actividad de las caspasas 3 y 7 en células transfectadas con arp2 cDNA, detectando la fase efectora del proceso apoptótico. El análisis de localización subcelular mediante microscopia confocal muestra a ARP2 localizada en el retículo endoplásmico, la cual eventualmente migra hacia la membrana plasmática durante el proceso de apoptosis. En base a estos resultados, proponemos a ARP2 como un nuevo canal catiónico, expresado de novo u originado del esplaiceosoma, involucrado en la entrada Ca2+ extracelular manteniendo en progreso la fase efectora de la apoptosis. En la segunda parte de este trabajo, se establecieron las condiciones y la metodología para la sobreexpresión y purificación de ARP2, como una primera fase en los esfuerzos conducentes a la cristalización y obtención de la estructura 3D de esta proteína. La sobreexpresión de ARP2 se llevó a cabo en las membranas celulares de la cepa de E. coli BL21 codon plus (DE3) RIL transformadas con el plásmido pCR T7/NT TOPO-arp2. La purificación de ARP2 se obtuvo utilizando diferentes técnicas de cromatografía de proteínas. La primera separación se realizó por afinidad niquel-6XHis “en batch”, en seguida se realizó una cromatografía de intercambio catiónico, afinidad a heparina y por último,se utilizó cromatografía de exclusión molecular. La proteína purificada se sometió a un análisis de identificación por LC-MS/MS. El resultado de este procedimiento corroboró la identidad de esta proteína. Finalmente, con el anticuerpo IgG anti-ARP2, observamos el incremento de la expresión de ARP2 en células de cáncer de próstata (LNCaP) inducidas a la apoptosis. Además, en los mismos experimentos detectamos una posible isoforma de ARP2 sobreexpresada en un periodo específico del proceso de apoptosis. Ambas proteínas poseen glicosilaciones que pueden ser importantes en la re-estructuración de ARP2 al adoptar la función como un canal de Ca2+, distinta a la que desempeña como parte de Prp8 en el esplaiceosoma. 3 ABSTRACT Prostate cancer is the second leading cause of death worldwide, closely associated to the emergence of androgen-independent cancer cells with the appearance of an apoptosis-resistant phenotype that ultimately overgrows and promotes metastatic events. Androgen-independent cells have been identified to increase the intracellular concentration of Ca2+ and trigger apoptosis. Accordingly, we have previously identified and electrophysiologically characterized a novel Ca2+-permeable channel activated during apoptosis in the androgen-independent lymphoid nodule prostate cancer cell line, LNCaP. In addition, we have described the cloning and characterization of this channel-like molecule named apoptosis regulated protein 2 (ARP2) associated to a lethal influx of Ca2+ in Xenopus oocytes. The present study shows LNCaP cells and Chinese hamster ovary cells (CHO) transfected with arp2 cDNA and the process it follows to induce apoptosis. In order to characterize this process, MTT and trypan blue cell viability assays were performed. Also caspase 3 and caspase 7 activities were measured in arp2 cDNA- transfected cells, and the effector phase of the apoptotic process detected. A subcellular localization study using confocal microscopy initially shows ARP2 localized to the endoplasmic reticulum to further migrate with time towards the plasma membrane while apoptosis progresses. Based on these results, we propose ARP2 as a novel cation channel, de novo expressed or possibly originated from the spliceosome, involved in the influx of extracellular Ca2+ that in turn ensures cell death after the activation of the apoptotic process. In the second part of this work, as a first step in efforts leading to crystallization and the elucidation of the 3D structure of ARP2, the conditions and methodology were established for the overexpression and purification of this protein. ARP2 overexpression was obtained in the cell membranes of E. coli BL21 codon plus (DE3) RIL transformed with the pCR-TOPO T7/NT-arp2 plasmid. ARP2 purification was obtained using different protein chromatography techniques. Protein separation was performed using first nickel-6XHis affinity "batch" then cation exchange chromatography, heparin-affinity chromatography and finally molecular exclusion chromatography. The purified protein was subjected to a LC-MS/MS identification and obtains a positive result. Finally, with the IgG antibody anti-ARP2, an increased expression of ARP2 in prostate cancer cells (LNCaP) induced to undergo apoptosis was observed. Furthermore, the same experiments detected a possible ARP2 isoform overexpressed in a specified period in the process of apoptosis. Both proteins have glycosylations that may be important for the re-structuring of ARP2 to adopt the function as a Ca2+ channel, acquiring a different function besides its role as part of Prp8 in the spliceosome . 4 INTRODUCCIÓN Apoptosis El estudio de la muerte celular comenzó con el trabajo pionero sobre el proceso de apoptosis realizado por Kerr y colaboradores (Figura 3-1). Hoy en día, la apoptosis es uno de los campos más importantes en la investigación biomédica. El concepto de apoptosis fue propuesto por primera vez en el trabajo de Kerr, basándose en una palabra griega que significa “caída de hojas” intentando describir una forma natural de la muerte celular en organismos pluricelulares (Kerr et al. 1972). En el año 2009, el comité de nomenclatura sobre la muerte celular propuso unificar criterios para la definición de doce modalidades de muerte celular, cuatro típicas y ocho atípicas (Kroemer et al. 2009). Las modalidades mejor caracterizadas de muerte celular son la apoptosis, autofagia, cornificación y necrosis. Actualmente, se ha documentado que la expresión génica es necesaria en la muerte celular por apoptosis y autofagia (Degterev et al. 2008). Por otro lado, se conoce muy bien que la señalización del Ca2+ está involucrada de manera crítica en la iniciación y ejecución de la muerte celular programada (Orrenius et al. 2003). La activación de la apoptosis es esencial para la homeostasis celular, manteniendo el correcto funcionamiento de los tejidos (Ellis et al. 1991; Nagata 1997). Sin embargo, más allá de la importancia de comprender el desarrollo y la homeostasis de los tejidos, la regulación molecular de la apoptosis se ha convertido en uno de los campos de la investigación biomédica con mayor interés, ya que es uno de los puntos clave en la evolución y tratamiento de enfermedades con gran importancia medica como es el cáncer, donde las células han adquirido resistencia a la activación de la apoptosis. Enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y Parkinson, son promovidas por una excesiva muerte celular por apoptosis, y para las cuales hoy en día no existen tratamientos (Fadeel, et al. 1999). Durante el proceso de apoptosis la célula presenta cambios rápidos que se reflejan en su estructura y metabolismo. La apoptosis se distingue de otros tipos de muerte celular en base a ciertas características morfológicas y procesos celulares que regulan este fenómeno. En las últimas décadas, desde la introducción de este término se ha avanzado mucho en el conocimiento de este proceso biológico desde el punto de vista morfológico y bioquímico. La función del Ca2+ en el proceso de la apoptosis es tan interesante como compleja, ya que regula una gran variedad de mecanismos en este proceso. Sin embargo, falta por describir muchos de los mecanismos específicos que controlan la homeostasis y el transporte de Ca2+, involucrados en las cascadas de activación de la apoptosis (Lehen'kyi et al. 2012). 5 Figura 3-1 John F. Kerr: Patólogo originario de Brisbane, Australia, quien introdujo el concepto de apoptosis en la literatura científica. Describió el proceso de muerte celular programada al que denominó "apoptosis" (Kerr et al. 1972). Este concepto es de fundamental importancia, ya que ha dado lugar a una gran cantidad de investigaciones que han producido avances generalizados en los procesos de enfermedad. Innumerables investigadores de todo el mundo se encuentran publicando artículos asociados a la apoptosis. 6 Características morfológicas y bioquímicas de la apoptosis La apoptosis, es la autodestrucción celular con el fin de mantener la integridad de un organismo pluricelular, esta se define como muerte celular programada tipo I, caracterizada por la formación de ampollas en la membrana plasmática, encogimiento celular o contracción citoplásmica, condensación de la cromatina nuclear (picnosis) y fragmentación del DNA nuclear (Alnemri et al. 1996; Nagata 1997; Nicholson et al. 1997; Thornberry et al. 1998). Posteriormente, la célula se separa en fragmentos contenidos por una membrana, denominados cuerpos apoptóticos, que son rápidamente reconocidos y engullidos por células vecinas o macrófagos. En este proceso, se llevan a cabo cambios bioquímicos importantes en la célula con el fin de facilitar el empaquetamiento de los cuerpos apoptóticos (Vaculova et al. 2008). De esta manera, el proceso de la apoptosispuede ser dividido en diferentes fases según el tipo de señalización, estas van desde el inicio del proceso hasta sus eventos finales como la fragmentación celular (Bursch et al. 1992; Savill et al. 1993; Thompson 1995) (Figura 3-2). En la mayoría de los tipos celulares el DNA se degrada produciendo fragmentos del tamaño de oligonucleosomas, y en el resto de los tipos celulares se producen fragmentos de DNA de mayor tamaño. La apoptosis se caracteriza también por una pérdida de la función mitocondrial (Kroemer et al. 2000). La mitocondria controla por lo menos tres mecanismos generales asociados a la apoptosis: 1) alteración de la fosforilación oxidativa, transporte de electrones, y producción de adenosina trifosfato (ATP), 2) liberación de moléculas que inician la activación de la familia de las caspasa, y 3) en general, interrupción del potencial oxido-reducción (redox) en la célula (Pesaresi et al. 2011). La etapa de ejecución de la apoptosis consiste en el correcto funcionamiento de varios sistemas enzimáticos que son activados a través de complejas vías de señalización. La actividad proteolítica de las caspasas constituye una de las bases bioquímicas en el fenotipo de apoptosis. Las caspasas constituyen una familia de proteasas que son sintetizadas como pro-enzimas con una actividad intrínseca muy baja, y por lo tanto se requiere de su activación ya sea por maduración proteolítica o por la interacción con un activador alostérico. Las pro-caspasas se dividen en dos grupos según el tamaño de su dominio activador, largo o corto. Las caspasas con pro-dominios largos, son -1, -2, -4, -5, -8, -9, - 10, -11, -12 y -13 que pertenecen al grupo de las caspasas iniciadoras. Las caspasas de dominio corto son -3, -6, -7 y -14, y pertenecen al grupo de las enzimas efectoras. La función efectora de las caspasas en la apoptosis se lleva a cabo mediante la escisión de un gran número de proteínas del citoesqueleto, citoplasma y núcleo. Ciertos componentes estructurales como las láminas nucleares y proteínas del citoesqueleto son digeridas por las caspasas, seguido por la condensación nuclear y formación de ampollas en la membrana plasmática. Los reguladores negativos de la apoptosis también son digeridos por las caspasas, inactivándolos o eventualmente produciendo fragmentos peptídicos que promueven la muerte celular programada (Stegh et al. 2001; Vaculova et al. 2008). 7 Figura 3-2. Eventos celulares durante las diferentes fases de apoptosis (modificado de Tapia-Vieyra et al. 2001). El reconocimiento eficaz de las células apoptóticas por los fagocitos requiere de una reorganización de la infraestructura y composición molecular de la membrana plasmática en la célula apoptótica. Es decir, la alteración de la distribución de los carbohidratos en la superficie celular promueve de manera preferente la unión de los macrófagos a las células apoptóticas. La pérdida de la asimetría de fosfolípidos en la membrana plasmática junto a la externalización de la fosfatidilserina (PS) facilita aún más el reconocimiento de las células apoptóticas por los macrófagos. La detección de células apoptóticas se realiza mediante la unión específica de Anexina-V a residuos de fosfatidilserina en la superficie celular, produciéndose un marcado fluorescente. Esta técnica permite la detección de células apoptóticas tanto in vitro como in vivo (Fadeel et al. 2010; Suzuki et al. 2010). Sin embargo, bajo condiciones de cultivo in vitro donde los fagocitos normalmente están ausentes, las células apoptóticas y sus fragmentos se lisan en un proceso similar a la necrosis. A esto se le denomina "necrosis secundaria" o "necrosis post- apoptosis" (Savill et al. 1993). 8 Señalización de la apoptosis en células de mamífero Existen varias vías de señalización importantes en la activación de la apoptosis en células de mamífero (Figura 3-3). La apoptosis puede ser activada por diferentes estímulos: interacción de los “receptores de muerte” con su ligando, insuficiencia de factores de crecimiento, toxinas, estrés oxidativo, e influjos de Ca2+ a través de la membrana plasmática y/o la liberación de Ca2+ del retículo endoplásmico. Existen varias vías de señalización importantes en la activación de la apoptosis en células de mamífero. La vía extrínseca es mediada por la unión de un ligando a su receptor en la superficie celular (CD95, TNFR1), dando lugar a la formación del complejo de señalización de la apoptosis (DISC), lo que resulta en la activación de pro-caspasa 8 (Lavrik et al. 2012). La vía extrínseca tipo I consiste en la activación de la pro-caspasa 3 por parte de la caspasa 8, se activa la caspasa 3 la cual lleva cabo la degradación de proteínas blanco, evento característico del proceso de apoptosis. En la vía extrínseca tipo II la caspasa 8 digiere a la proteína Bid miembro de la familia Bcl-2, está a su vez coadyuva en la traslocación e inserción de las proteínas pro-apoptóticas Bax en la membrana mitocondrial externa (OMM). Esto produce la permeabilización de la OMM y la liberación de los factores pro-apoptóticos: citocromo c, factor activador de la apoptosis (Apaf-1) y pro-caspasa 9, que en presencia de dATP forman el complejo denominado apoptosoma. Esto se traduce en la activación de la pro-caspasa 9, lo que desencadena la cascada de activación de caspasas mediante la activación inicial de la pro-caspasa 3 (Muñoz et al. 2012; Würstle et al. 2012). En la vía intrínseca, las señales que activan la muerte celular actúan directa o indirectamente sobre la mitocondria liberando proteínas pro-apoptóticas provenientes del espacio intermembranal (Rimessi et al. 2008). Esta vía de muerte celular programada está controlada por las proteínas de la familia Bcl-2 (regulación de la liberación del citocromo c), el inhibidor de las proteínas de la apoptosis (IAP) (inhibición de las caspasas), el segundo activador mitocondrial de las caspasas (SMAC), y Omi (regulación negativa de las IAP). La vía intrínseca también puede operar a través de mecanismos independientes de caspasas. Estos consisten en la liberación de proteínas de la mitocondria, como son el factor de inducción de la apoptosis (AIF) y la endonucleasa G (EndoG), traslocandose hacia el núcleo. Los efectos que AIF produce sobre el núcleo incluyen la condensación de la cromatina y la producción de fragmentos de DNA de alto peso molecular. El papel de EndoG en la muerte celular todavía no está claro. Cuando el daño en el DNA es el responsable de la respuesta apoptótica, la caspasa que se activa inicialmente es la pro-caspasa 2. Su activación también conduce a la liberación de citocromo c y la formación del apoptosoma, aunque los mecanismos precisos de este proceso aun no son claros (Martinou et al. 2000; Verhagen et al. 2000; Parrish et al. 2001). 9 Activación de la apoptosis por la vía del retículo endoplásmico Las principales funciones del retículo endoplásmico en la célula son el almacenamiento de Ca2+ y parte importante en la señalización regulada por este ion, así como el plegado, modificación y separación de las proteínas recién sintetizadas. Las perturbaciones de cualquiera de estas funciones pueden dar lugar al denominado estrés de ER. El estrés prolongado en el retículo endoplásmico estimula la activación de pro-caspasa-12 (Huong et al. 2011). Esta enzima se localiza en la membrana del retículo endoplásmico, y es activada por calpaína durante el proceso estrés o en respuesta a la movilización del Ca2+ de los depósitos intracelulares. Una vez activada la caspasa-12 actúa sobre las caspasas efectoras llevándose a cabo la apoptosis. De esta manera, el estrés en el retículo endoplásmico causado por el vaciamiento o la alteración en los sistemas de transporte del Ca2+, se pueden vincular directamente con la activación de caspasas (Nakagawa et al. 2000). Ca2+ y apoptosisEl Ca2+ tiene un papel fundamental en muchos procesos fisiológicos, que van desde el proceso de fertilización hasta la regulación de los procesos tempranos durante el ciclo celular. Una vez que las células se diferencian y cumplen con su función, el Ca2+ regula una compleja serie de procesos como es la producción y gasto energético, transducción de señales, secreción, apoptosis, contracción muscular, quimiotaxis y plasticidad sináptica neuronal involucrada en el aprendizaje y la memoria (Berridge 2009; Berridge et al. 2003; Clapham 2007; Mikoshiba 2007). Por otra parte, las altas concentraciones de iones Ca2+ en la célula son tóxicas para ésta. Las células en reposo normalmente se mantienen a una baja concentración intracelular ([Ca2+]i) la cual oscila al alrededor de 100 nm. En solución salina normal puede difundir a través de la membrana plasmática hasta 40 m de Ca2+ hidratado en 1 s (Einstein 1905). Con el fin de utilizar el Ca2+ como un segundo mensajero, las células han “ideado” un ingenioso mecanismo que lleva a cabo la difusión lenta del Ca2+ y evita la citotoxicidad causada por este ion. De esta forma, la célula puede controlar las constantes elevaciones de [Ca2+]i en lapsos de tiempo cortos, que a menudo están relacionados a la señalización implicada en la regeneración celular (Berridge 1993; Clapham 2007; Rey et al. 2010). Para que se pueda desarrollar una señalización de Ca2+ rápida y eficaz, la célula utiliza una gran cantidad de energía que se traduce en mantener una diferencia de casi 20 000 veces entre la [Ca2+]i (~100 nm libre) y la extracelular (~1.2 mM). Para mantener esta diferencia en la concentración de Ca2+, la célula necesita quelar, compartimentar, o eliminar el Ca2+ del citoplasma (Clapham 2007). La célula posee una gran variedad de proteínas con afinidad a Ca2+ que va de nM a mM, estas amortiguan los cambios de la [Ca2+]i y regulan los procesos celulares a través de señalizaciones por este ion. 10 Figura 3-3. Vías generales de la muerte celular por apoptosis. La vía extrínseca es iniciada por la interacción del ligado con su receptor en la superficie de la célula (TNFR1, CD95, TRAIL) resultando en la formación del DISC (complejo de señalización para la inducción de la muerte celular, death-inducing signaling complex) y la activación de la caspasa-8. En la vía extrínseca tipo I la caspasa-8 activa a la caspasa-3, resultando en la digestión de proteínas y el inicio del proceso de apoptosis. En el tipo II, la caspasa-8 digiere a Bid, iniciando la apoptosis vía mitocondrial. Los procesos posteriores consisten en la liberación de proteínas pro-apoptóticas (citocromo c, Smac, Omi, AIF y EndoG) del espacio intermembranal de la mitocondria hacia el citosol a través de poros formados por Bax/Bak. Citocromo c, Smac y Omi participan en la cascada de activación de las caspasas, mientras que AIF y EndoG se traslocan hacia el núcleo, donde participan en la condensación de la cromatina y fragmentación del DNA. XIAP es un inhibidor citosólico de proteínas de la apoptosis, cuya actividad es bloqueada por Smac y Omi. 11 La desregulación de los gradientes de Ca2+ en la célula y por lo tanto la unión anómala del Ca2+ a ciertas proteínas puede provocar cambios conformaciones en estas, modificando sus propiedades bioquímicas y en consecuencia, modificando la función de estas moléculas (Westheimer 1987). Se ha demostrado que las vías de señalización reguladas por Ca2+ juegan un papel importante en la iniciación del cáncer, formación del tumor, progresión del tumor, metástasis, invasión y angiogénesis (Block et al 2010; Rizzuto et al. 2006; Saidak et al. 2009). El aumento de [Ca2+]i y por lo tanto el aumento de la concentración de Ca2+ intramitocondrial ([Ca2+]mito) activa mecanismos de permeabilización de la membrana mitocondrial que conducen a la apoptosis o incluso a la necrosis (Rizzuto et al. 2006; Rizzuto et al. 2003). Por otro lado, la liberación de Ca2+ de los depósitos intracelulares en el retículo endoplásmico (ER) puede conducir a una [Ca2+]i capaz de promover la apoptosis. En contraste, el decremento de la capacidad para llenar los depósitos de Ca2+ intracelular y por lo tanto, la incapacidad para liberar grandes cantidades de Ca2+ de estos depósitos, está estrechamente asociado con la resistencia a la activación de la apoptosis (Rizzuto et al. 2003; Pinton et al. 2006). Es por esto que las moléculas que promueven la liberación de Ca2+ de los depósitos intracelulares han mostrado tener un papel pro-apoptótico muy importante (Figura 3-4) (Mattson et al. 2003). No hay duda que la muerte celular pertenece a una de las numerosas funciones celulares en las que el Ca2+ ejerce un papel regulador complejo y por otro lado, se conoce muy bien que el incremento descontrolado de la [Ca2+]i en muchos tipos celulares activa el proceso de apoptosis (Sattler et al. 2000). Cáncer de próstata y apoptosis Según la Organización Mundial de la Salud, el cáncer de próstata es el cáncer con mayor incidencia y la principal causa de muerte relacionada a cáncer en México. A nivel mundial, en cuanto a enfermedades por cáncer, ocupa el segundo lugar en incidencia y el sexto lugar en mortalidad. Además, de manera desalentadora, los casos de incidencia y mortalidad continúan en aumento cada año (Siegel et al. 2012). La primera etapa del cáncer de próstata depende de andrógenos para el crecimiento y supervivencia. En este momento, la terapia de ablación de andrógenos puede ser eficaz en la regresión del tumor mediante la activación de la apoptosis. Por lo tanto, la activación de este proceso puede proporcionar una forma de protección contra la carcinogénesis (Kiess et al. 1998). Debido a que la mayoría de los agentes quimioterapéuticos actuales inducen la muerte celular por mecanismos distintos a la apoptosis, el aumento de este proceso en el cáncer proporcionaría una opción terapéutica muy útil (Fulda et al. 2004). Sin embargo, en estadios avanzados donde se generan células andrógeno-independientes, actualmente no existe ningún tratamiento exitoso (Figura 3-5). Las células andrógeno-independientes están asociadas con la aparición de nuevos fenotipos celulares que se caracterizan por la inhibición de la apoptosis y proliferación celular aberrante. 12 Figura 3-4. Regulación espacio-temporal de la señalización de Ca2+. Todas las señales de Ca2+ son una combinación de cuatro parámetros. Localización subcelular: membrana plasmática en la secreción, mitocondria en la regulación metabólica, nucleó para la trascripción, etc. Duración: microsegundos para exocitosis, u horas para fertilización. Frecuencia: baja para la secreción, y repetitiva para apoptosis. Amplitud: baja para proliferación, y alta para apoptosis. Por ejemplo, las oscilaciones de Ca2+ citoplásmico activan la proliferación a través de la traslocación de NFAT al nucleó. En cambio, una elevación sostenida de la concentración de Ca2+ mitocondrial puede promover la apoptosis. Puntos negros: Ca2+, N: núcleo, ER: retículo endoplásmico, M: mitocondria (modificado de Flourakis et al. 2009). 13 Figura 3-5. El cáncer de próstata y su evolución después de la terapia por la eliminación de andrógenos. CEA: células de epitelio apical, CEB: células de epitelio basal, CML: células de musculo liso, CNE: células neuroendocrinas (modificado de Flourakis et al. 2009). La diferenciación y proliferación celular desregulada junto con la supresión de la apoptosis proporciona las condiciones para el crecimiento anormal de tejido, que finalmente puede convertirse en una expansión descontrolada e invasiva de células malignas. Específicamente, la sobreexpresión de Bcl-2 impide a las células iniciar el proceso de la apoptosis en respuesta a una serie de estímulos, y su expresión se asocia con un pronósticodesfavorable en el cáncer de próstata y colon (Williams 1991). Algunos agentes quimioterapéuticos citostáticos y/o citotóxicos, son comúnmente utilizados en el tratamiento de diferentes tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata andrógeno-independiente (Isaacs 1999). Sin embargo, estos agentes frecuentemente conducen a la muerte de las células cancerosas únicamente cuando la proliferación celular se encuentra en progreso, y las células cancerosas que no están proliferando en el momento del tratamiento resisten el efecto de estos agentes citotóxicos. Esto se basa en el hecho de que las células tienen tiempo suficiente para reparar el daño celular que podría haber ocurrido antes del siguiente ciclo celular. Aun mas, se sabe que la mayoría de las células de cáncer de próstata (> 90%) no se encuentran en proliferación activa y por lo tanto son resistentes a la quimioterapia citotóxica estándar. De esta manera, se necesita urgentemente algún tipo de terapia citotóxica que pueda inducir la muerte de células andrógeno-independientes de cáncer de próstata, sin que estas deban estar en proliferación activa (Isaacs 1999). 14 La ablación de andrógenos, en células prostáticas cancerosas andrógeno-dependientes no proliferantes provoca la muerte celular programada, un proceso dependiente de energía. Como ya se describió, este proceso implica la fragmentación de DNA produciendo multímeros nucleosomales, el cual es catalizado por enzimas dependientes del Ca2+ nuclear. En contraste, las células andrógeno-independientes de cáncer de próstata no son inducidas a la muerte celular programada por la ablación de andrógenos. Una manera de explicar la incapacidad de la ablación de andrógenos para inducir la apoptosis en las células andrógeno-independientes de cáncer de próstata, es que este procedimiento no permite el aumento constante de la [Ca2+]i (Isaacs 1999). Este fenómeno puede apoyar la idea de que las células andrógeno- independientes de cáncer de próstata pueden ser inducidas a la muerte programada si se produce un aumento sostenido de la concentración de calcio citoplásmico por medios diferentes al hormonal. Inductores de la apoptosis mediante el aumento de la concentración de Ca2+ intracelular La ionomicina es un ionóforo poliéter quelante de calcio y cadmio en forma de ácidos dibásicos (Nakajima et al. 2011; Liu et al. 1978). Su lugar de acción se encontró inicialmente a nivel de los depósitos internos de Ca2+ (Morgan et al. 1994), induciendo la elevación de la [Ca2+]i de tres a seis veces por encima su concentración basal. Si esta concentración se mantiene durante más de 12 horas, se produce la muerte celular. Estas observaciones identifican al Ca2+ intracelular como un blanco potencial en la terapia contra las células andrógeno-independientes del cáncer de próstata (Martikainen et al. 1991). Se conoce desde hace mucho tiempo, que el Ca2+ se acumula en el retículo endoplásmico a través de la función de la ATPasa de Ca2+ de retículo sarcoplásmico y endoplásmico, resultando en un equilibrio importante en la regulación de muchas funciones. El tratamiento de células andrógeno- independientes de cáncer de próstata de rata y de humano con tapsigargina (TG), un sesquiterpeno - Lactona que inhibe selectivamente la ATPasa de Ca2+ de retículo sarcoplásmico y endoplasmático, traduciéndose en un aumento importante de la [Ca2+]i a pocos minutos de exposición. Posterior a este evento, se produce un influjo secundario de Ca2+, iniciándose el proceso de apoptosis, dentro de las primeras 6 a 12 h. Por lo tanto, la TG induce la muerte celular programada en células andrógeno- independientes de cáncer de próstata, y este proceso depende fundamentalmente de una elevación sostenida de la [Ca2+]i (Huang et al. 2011; Furuya et al. 1994). 15 Moléculas involucradas en la señalización del Ca2+ como blancos terapéuticos en el cáncer de próstata En las células normales la concentración de Ca2+ es altamente regulada por diferentes mecanismos: compartamentalización de este ion en el retículo endoplásmico y la mitocondria; concentración citoplásmica regulada por la ATPasa de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) y el retículo endoplásmico; distribución del Ca2+ desempeñada por elementos del citoesqueleto; y en términos de temporalidad como es la oscilación, frecuencia, amplitud y duración de los gradientes de Ca2+ (Berridge et al. 2003; Rizzuto et al. 2006). Es precisamente este último aspecto, el que juega un papel clave en el control de las células cancerosas. Una de las moléculas encargadas de mantener la [Ca2+]i dentro de los niveles fisiológicos, son la ATPasa de Ca2+ de retículo sarco-endoplásmico (SERCA), bombeando el Ca2+ hacia el interior del retículo endoplásmico. El mecanismo de bombeo de SERCA se lleva a cabo por el intercambio de una gran cantidad de protones por dos iones de Ca2+ hidrolizado una molécula de ATP. Por otro lado, la ATPasa de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) intercambia protones por el intercambio/eliminación de un ion Ca2+, hidrolizando una molécula de ATP. El intercambiador Na+/Ca2+ (NCX), excreta de la célula un ion Ca2+ e introduce tres iones Na+. El intercambiador Na+/Ca2+-K+ (NCKX), excreta de la celula, co-transportando un ion K+ y un ion Ca2+ e introduce cuatro iones Na+, despolarizando la membrana plasmática mediante este mecanismo. De esta manera, PMCA se encarga de regular la [Ca2+]i en tiempos prolongados, mientras que NCX y NCKX poseen un ritmo mucho más rápido en el intercambio de iones, manteniendo la [Ca2+]i dentro de los niveles fisiológicos (Hilgemann et al. 2006). Los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (CaV) son proteínas que llevan a cabo el trasporte de Ca2+ más rápido (Tabla 3-1). Cada canal CaV transporta cerca de un millón de iones Ca2+ por segundo, de tal manera que pueden aumentar la [Ca2+]i más de 10 veces en algunos milisegundos. El cambio en el potencial de membrana “abre” estos canales, permitiendo la entrada de Ca2+ hacia el citoplasma. En presencia de una [Ca2+] extracelular normal (~100 nm) los canales CaV son permeables a este ion de manera selectiva (Gouaux et al. 2005; Long et al. 2005). Sin embargo, cuando el Ca2+ externo es removido, estos canales de Ca2+, pasan de ser ion-selectivos a ion-no selectivos permitiendo la entrada de Na+ y K+ a través de la membrana plasmática (Gerke et al. 2005). Por lo tanto, uno de los principales blancos terapéuticos consiste en alterar selectivamente la actividad de canales o bombas de Ca2+, específicamente, mediante un cambio en la actividad de estas moléculas. Por ejemplo, la inhibición de las moléculas dependientes de Ca2+, involucradas en las vías tumorigénicas como son las vías implicadas en la proliferación celular. Otra posibilidad es alterar la expresión de los canales y bombas de Ca2+ en las células cancerosas, por ejemplo, disminuir la expresión de PMCA, la cual se encuentra sobreexpresada en éstas, de tal forma que la [Ca2+]i podría aumentar activando las vías de muerte celular y/o interrumpir el ciclo celular. 16 Tabla 3-1. Lista de canales de Ca2+ implicados en el proceso de apoptosis. Los nombres IUPHAR están subrayados y enseguida otros nombres encontrados en la literatura. Las flechas hacia arriba y hacia abajo indican incremento o decremento de la expresión o actividad, respectivamente. ND: no determinado (modificada de Lehen'kyi et al. 2011). Canales permeables a Ca2+ P2X Los receptores P2X tienen una amplia distribución tisular, y participan en una gran variedad de procesos fisiológicos como son la modulación de la contractilidad y ritmo cardiaco, modulación del tono vascular, hipersensibilidad de estímulos inocuos, contracción de los vasos deferentes durante la eyaculación, etc. Se ha demostrado que el ATP es almacenado dentro de vesículas secretoras, y únicamente en respuesta a estímulos específicos pareceinteractuar con los receptores purinérgicos (receptores P2) (Murgia et al. 1992). En base a la potente inhibición del ATP en el crecimiento de varios tipos de células tumorales, la administración de AMP y/o ATP a murinos portadores de tumores, ha mostrado dramáticos efectos citostáticos y citotóxicos sobre las células de cáncer (Lustig et al. 1993). Esta actividad anticancerosa está relacionada con la activación de purinoreceptores P2X7, anteriormente llamados Familia Subfamilia Nombre IUPHAR, otros nombres Papel en apoptosis Cys-loop, catiónico nAChR 7 ND Purinérgico P2X P2X5/11 ND P2X7 ↓ Resistencia a Apoptosis Voltage-gated Ca2+ (Cav) Cav1 (L-type) Subunit ND ND Cav2 Cav2.3, 1E, R-type ND Cav3 (T-type) Cav3.1, 1G ND Cav3.2, 1H ↑ Resistencia a Apoptosis SOC Orai/STIM Orai1/STIM1 ↓ Resistencia a Apoptosis TRP TRPC TRPC1, TRP1 ↑ Resistencia a Apoptosis TRPC3, TRP3 ND TRPC4, TRP1, CCE ND TRPC6, TRP1 ND TRPV TRPV1, VR1, OTRPC1 ND TRPV6, ECaC, Cat1, Cat-L ↑ Resistencia a Apoptosis TRPM TRPM1, MLSN1 ND TRPM2, TRPC7, LTRPC2, KNP3, EREG1 ↓ Resistencia a Apoptosis TRPM7, TRP-PLIK, LTRPC7, ChaK(1) ND TRPM8, Trp-p8, CMR1, LTrpC6 ND 17 P2Z, y que han mostrado tener un papel importante en la regulación de la muerte celular por apoptosis (Khakh et al. 2006). Por otra parte, el ATP aparentemente induce la muerte celular en timocitos, hepatocitos, y varias líneas de células linfocíticas mediante el aumento de la [Ca2+]i (Abbracchio et al. 1994). La actividad anti-neoplásica del ATP fue demostrada por primera vez en el trabajo de Rapaport en 1983 (Rapaport 1983) quien demostró que la adición exógena de ATP a células de cáncer de páncreas y de colon inhibe el crecimiento celular causando la detención del ciclo celular en la fase S. Estudios posteriores demostraron el efecto anti-neoplásico de nucleótidos extracelulares en el cáncer colorectal, leucemia, cáncer de esófago, células escamosas de cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer de cuello uterino y melanoma, así como del cáncer de próstata y vejiga (White et al. 2006). Canales permeables a Ca2+ TRP Los canales permeables a Ca2+ son los principales candidatos como las moléculas responsables de la regulación de la homeostasis de este ion en las células de cáncer de próstata. Por esto es de gran interés el estudio y revisión de la superfamilia de los canales catiónicos-receptor de potencial transitorio (TRP), que incluyen un amplio espectro de canales que participan en la mediación de una gran variedad de señales sensoriales inducidas por receptores. Los canales TRP se clasifican en seis familias: TRP-C (Canonical), -V (Vanilloide), -M (Melastatin), -ML (Mucolipina), -P (Policistina) y -A (proteína Ankyrin transmembranal). La estrategia de la activación de canales permeables a Ca2+ en la membrana plasmática ha sido adoptada en el control de células LNCaP de cáncer de próstata utilizando mentol como un activador de TRPM8 (Mahieu et al. 2007). El mecanismo universal de señalización para la activación de la entrada de Ca2+ a la célula, es a través de la liberación de Ca2+ de los depósitos intracelulares en el retículo endoplásmico. Los receptores acoplados a proteína G (GPCR), principalmente los subtipos Gq/11, activan la fosfolipasa Cβ (PLCβ) y por otro lado, los receptores tirosina-cinasa (TKR) puede activar la fosfolipasa Cγ (PLCγ). Ambas lipasas catalizan la reacción donde se produce inositol trifosfato (InsP3) y diacilglicerol (DAG) a partir de PIP2. El InsP3 interacciona con el canal iónico-receptor de InsP3 (InsP3R) presente en el retículo endoplásmico, produciendo un flujo de Ca2+ hacia el citoplasma, resultando en un aumento de la [Ca2+]i, que va de ~100 nm a ~1 M, durante varios segundos (Berridge 2009; Lewis 2003; Mikoshiba 2007; Prakriya et al. 2006). El InsP3R activado permite un flujo de salida de Ca2+ del retículo endoplásmico hasta su vaciamiento. Sin embargo, la PMCA en la membrana plasmática bombea Ca2+ hacia el exterior de la célula lo suficientemente rápido para evitar que la [Ca2+]i aumente considerablemente. Unos segundos después del vaciamiento de los depósitos internos de Ca2+, son activados los mecanismos de entrada de Ca2+ a través de los canales TRP (Putney 2005). Este mecanismo se denomina entrada de Ca2+ operada por depósitos internos (store-operated Ca2+ entry, SOCE) (Parekh et al. 2005; Putney 2005). Uno de estos mecanismo es la activación de una conductancia considerada como lenta y baja, pero altamente selectiva a Ca2+, a la que 18 se le denomina corriente activada por la liberación de Ca2+ (calcium-release activated calcium current, ICRAC) (Parekh et al. 1997). Entrada de calcio operada por los depósitos internos (Orai1-STIM1) En los últimos años, una combinación de estudios permitió la identificación de una proteína de membrana plasmática denominada Orai1 o CRACM1. Orai1/CRACM1 es una proteína de 33 kDa expresada ampliamente en la membrana plasmática, posee 4 dominios transmembranales y sin homología (en su secuencia) con otros canales iónicos (Feske et al. 2006; Vig et al. 2006; Vig et al. 2006). STIM1 es una proteína membranal de 77 kDa localizada en la membrana de retículo endoplásmico, y funciona como un sensor de los niveles de Ca2+ en este orgánulo. Se ha propuesto un modelo muy simple para el mecanismo de activación de la SOCE, y esta consiste principalmente en la agrupación de STIM1, posterior a la depleción de los depósitos internos, en esta región cercana del retículo endoplásmico a la membrana plasmática, el C-terminal citoplásmico de STIM1 interactúa con Orai1 activando la entrada de Ca2 + a través de este molécula (Lewis 2007) (Figura 3-6). Flourakis y cols. demostraron que Orai1 es uno de los principales componentes en la entrada de Ca2+ operada por los depósitos internos (SOCE) en las células de cáncer de próstata humano (Flourakis et al. 2010). Células LNCaP andrógeno-independientes, se transfectaron con Orai1, posteriormente se sometieron a la privación de andrógenos y exposición a TG, esto restableció las corrientes de calcio operadas por los depósitos internos y a su vez el ritmo normal en la activación de la apoptosis. De esta manera, se estableció que Orai1 tiene un papel fundamental en la activación de la apoptosis, independientemente de los inductores. Por otra parte, el silenciamiento de esta molécula puede generar fenotipos resistentes a la apoptosis en células de cáncer de próstata. 19 Figura 3-6. Principales canales de Ca2+ y mecanismos generales implicados en la activación de la muerte celular programada. El canal de Ca2+ operado por los depósitos internos Orai1 ha sido identificado recientemente como una molécula importante en la inducción de la apoptosis en células LNCaP andrógeno-independiente. ARP2 posee características similares a las de un canal iónico permeable a Ca2+ que promueve el proceso de apoptosis en células LNCaP andrógeno-independientes. El incremento sostenido de la [Ca2+]i hasta cerca de 1 M promueve el secuestro de este ion por la mitocondria, resultando en la liberación de factores apoptogénicos (Figura 3-3) como citocromo c, factor inductor de la apoptosis (AIF), pro-caspasa-9, Smac/DIABLO y endonucleasa G. Estas moléculas conforman el apoptosoma, que a su vez activa las caspasas-3, -6 y -7, involucradas en la degradación de proteínas y DNA. 20 ANTECEDENTES Teniendo en cuenta que el aumento sostenido de la [Ca2+]i es considerado como una consecuencia del influjo de calcio a través de la membrana plasmática (Martikainen et al. 1991; Furuya et al. 1994), ha sido muy importante evaluar el papel de estos mecanismos en células de cáncer de próstata. En este sentido, nuestro grupo de investigación (Gutiérrez et al. 1999), utilizando dos inductores diferentes de laapoptosis: ionomicina y eliminación del suero, demostró la activación de un canal catiónico permeable a Ca2+ no selectivo de 23 pS de conductancia en células de cáncer de próstata andrógeno-independientes (LNCaP). Este canal se caracterizó mediante registros simultáneos de la [Ca2+]i y actividad del canal iónico realizando ensayos electrofisiológicos de patch clamp en un modelo de célula única. Estos estudios revelaron que este canal de Ca2+ no requiere despolarización de la membrana para su activación, no se activa durante el reposo ni durante el primer incremento de la [Ca2+]i. Sin embargo, la actividad de este canal se hizo evidente durante el segundo incremento de [Ca2+]i. Posteriormente, también en nuestro grupo de investigación, en células LNCaP se llevó a cabo la identificación y clonación de un canal de Ca2+ al que se denominó proteína reguladora de la apoptosis (ARP2) (Tapia-Vieyra et al. 2005). La inyección de arp2 mRNA en ovocitos de Xenopus laevis produjo un influjo letal de Ca2+ a través de la membrana plasmática induciendo la muerte prematura de los ovocitos mediante apoptosis. El arp2 cDNA tiene un peso molecular de 1.3 kb y muestra una homología del 99% con un segmento que corresponde al 18% de la secuencia completa del factor de corte y empalme del RNA, Prp8 (Luo et al. 1999). Cabe mencionar que en las regiones de los extremos -N y -C de arp2 cDNA, existen segmentos correspondientes a canales de entrada capacitativa htrp3 (Zhu et al. 1996). Los estudios mostrados en la primera sección de la presente tesis, están dirigidos a la caracterización funcional de ARP2, en donde se evidencia que esta proteína posee características similares a las de un canal iónico permeable a Ca2+, y que muy probablemente tiene como papel principal la activación y/o mantenimiento del proceso apoptótico. Hemos considerado que la caracterización estructural de ARP2 es una base importante para comprender los mecanismos moleculares de esta proteína. Esto motivó el trabajo de la segunda sección de esta tesis, en la cual establecimos una metodología para la sobreexpresión y purificación de ARP2 con el fin de obtener la cristalización y resolución de la estructura terciaria de esta proteína. 21 TRABAJO EXPERIMENTAL PRIMERA SECCIÓN La expresión de ARP2, una proteína con características similares a un canal permeable a Ca2+, induce la apoptosis en células LNCaP andrógeno- independientes y células CHO HIPÓTESIS ARP2 constituye un canal permeable a Ca2+ con un papel importante en el proceso de apoptosis. Por lo tanto, la transfección de arp2 cDNA probablemente permitirá la expresión transitoria de ARP2 con localización en la membrana plasmática e inducirá la apoptosis en células prostáticas con fenotipo canceroso. OBJETIVO GENERAL Inducir a la apoptosis células LNCaP andrógeno-independientes y células CHO transfectadas con arp2 cDNA localizando a ARP2 en la membrana plasmática. 22 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Construcción de plásmidos para la expresión de ARP2 en células de mamífero, con el fin de llevar a cabo estudios de caracterización funcional y localización subcelular. Transfección de arp2 cDNA en células LNCaP andrógeno-independientes y células CHO. Evaluar la expresión transitoria de ARP2 en estas líneas celulares mediante inmunoensayos tipo western blot. Evaluar la muerte celular en células LNCaP y CHO transfectadas con arp2 cDNA mediante ensayos de MTT y exclusión con azul de tripano. Cuantificar la actividad de caspasas 3 y 7 en células CHO transfectadas con arp2 cDNA, mediante el uso de un sustrato específico fluorescente (Z-DEVD-AFC). Determinar la localización subcelular de ARP2 como una proteína de fusión con eGFP en células CHO transfectadas con el arp2-egfp cDNA utilizando microscopia confocal 23 MATERIAL Y MÉTODOS Líneas celulares Las líneas celulares que se utilizaron para los experimentos en la presente tesis fueron obtenidas de American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, U.S.A.). Las utilizadas en esta sección de trabajo experimental se describen a continuación. Cepas de Escherichia coli para la propagación de DNA plasmídico El hospedero más extensamente usado en la síntesis de DNA recombinante es la bacteria gram-negativa Escherichia coli. Esta bacteria puede crecer en una variedad de medios de cultivo poco costosos y obtener una producción óptima de DNA plasmídico. Por esta razón, en la primera sección de este trabajo se utilizaron las cepas de E. coli XL1-Blue y DH5 para la propagación del DNA recombinante. XL1-Blue Esta cepa le concede un color azul-blanco a las colonias con plásmidos recombinantes una característica excelente en los procedimientos de clonación rutinaria y en los cuales se puede utilizar vectores plasmídicos y lambda. DH5 Estas células son ideales para la clonación de manera rutinaria de vectores plasmídicos ya que le confieren un color azul o blanco a las colonias en placas con medio selectivo conteniendo Blue-gal o X- gal, respectivamente. Las preparaciones en la propagación de plásmidos es de alta calidad, es decir, la cantidad de DNA plasmídico en las muestras es elevada y existe bajo índice de mutabilidad en la secuencia de dichos plásmidos. Las células se pueden transformar con plásmidos de alto peso molecular (mayores de 30 kb). 24 Líneas células de mamífero utilizadas LNCaP La línea celular de cáncer de próstata andrógeno-independiente, LNCaP clon FGC fue aislada en 1977 por JS Horoszewicz, et al., a partir de una aspiración con aguja de biopsia del ganglio linfático de la supraclavicular izquierda de un varón de 50 años de edad, de raza blanca (tipo de sangre B+) con diagnóstico confirmado de carcinoma metastásico de próstata. Estas células responden a la 5-alfa- dihidrotestosterona (modulación del crecimiento y producción de fosfatasa ácida). Las células no producen una monocapa uniforme, sino que crecen en racimos que se deben disgregar mediante la preparación de uno o varios subcultivos. Las células no se adhieren con fuerza a la superficie de las cajas de cultivo su crecimiento es lento, por lo cual no llegan a confluencia y acidificación del medio rápidamente (Horoszewicz et al. 1983; Gibas et al. 1984). CHO La línea celular de ovario de hámster chino CHO (Cricetulus griseus) se derivó como un subclon de la línea celular CHO madre, iniciada a partir de una biopsia de un ovario de un hámster chino adulto realizada por TT Puck en 1957. Estas células requieren prolina en el medio para su crecimiento (Puck et al. 1958). Preparación de las células competentes Las células de E. coli a trasformar, ya sea para la propagación de DNA plasmídico o expresión de proteínas recombinantes, fueron crecidas en 5 mL de medio LB con los antibióticos necesarios (según la cepa y el plásmido utilizado) durante 12 h a 37 °C y agitación de 260 rpm. De este cultivo se tomaron 200 L y se inocularon en 10 mL de medio LB con los antibióticos, estos cultivos se incubaron a 37 °C con agitación de 260 rpm hasta alcanzar una absorbancia de 0.5 a 550 nm. Una vez obtenida la absorbancia requerida, el cultivo se llevó a agua-hielo durante 10 min y se centrifugó a 5000 x g durante 12 min a 4 °C. Posteriormente, la pastilla se resuspendió en 3.2 mL de solución TFBI fría (Acetato de potasio 30 mM, pH 5.8, RbCl 100 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 50 mM, glicerol 15%) esterilizado por filtración, llevándose nuevamente a agua hielo durante 15 min. Pasado el tiempo de incubación, el cultivo se centrifugó a 5000 x g durante 12 min a 4 °C, el sobrenadante se desecho y la pastilla se resuspendió en 0.8 mL de TFBII frio (MOPS 10 mM, pH 6.5, RbCl 10 mM, CaCl2 75 mM, glicerol 15%) esterilizado por filtración, y se incubó durante 15 min en agua-hielo.Finalmente, la suspensión de células se distribuyó en alícuotas de 50 L y se almacenaron a -70 °C para su uso posterior. 25 Transformación de las células competentes Las células se descongelaron lentamente en hielo a una temperatura de 4 °C aproximadamente. Posteriormente, en un tubo de 1.5 mL estéril se mezcló la suspensión celular con 100 ng del plásmido que se trate (1-25 ng/L) o bien 10 L de la reacción de ligación. Las alícuotas se incubaron en hielo durante 30 min, pasado este tiempo, las células fueron sometidas a un choque térmico de 42 ºC durante 90 s, e inmediatamente después se sumergieron en hielo por 5 min. A continuación se añadió 350 L de medio SOC (bactotriptona 2%, extracto de levadura 0.5%, NaCl 0.05%, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glucosa 20 mM), se incubó durante 1 h a 37ºC y agitación de 300 rpm para la recuperación de las bacterias. Se recuperaron las células por centrifugación a 800 rpm durante 3 min y fueron sembrados 100 L de las células en placas de LB-agar con los antibióticos de selección, e incubadas durante 12 h a 37 ºC para el crecimiento selectivo de colonias bacterianas conteniendo el plásmido de interés. Mantenimiento a corto plazo de células transformadas Las cepas bacterianas de Escherichia coli se sembraron en placas de LB-agar con los antibióticos de selección requeridos durante 12 h a 37 °C. La resiembra de estas células se hizo de la misma manera cada 15 días. Las placas se mantuvieron a 4 °C durante su almacenaje. Mantenimiento a largo plazo de células trasformadas Se inocularon 5 mL de medio LB con una sola colonia bacteriana conteniendo el plásmido de interés, obtenida de las placas con LB-agar selectivo. Los cultivos fueron incubados por un periodo de 12 h a 37 °C con agitación constante de 260 rpm. Una vez cumplido el tiempo de incubación se tomó 0.5 mL del cultivo y se agregó a 1 mL de glicerol estéril en criotubos, los cuales se colocan a -80 °C durante 24 h. Posteriormente, las alícuotas se colocaron en un tanque de nitrógeno para su almacenaje final. 26 Análisis de ácidos nucleicos Cuantificación de DNA La cuantificación del DNA consiste en registrar el espectro de absorción en la región de 200 a 300 nm. Una unidad de absorbancia a 260 nm equivale a 50 g/mL de DNA de cadena doble, igual que en el DNA genómico. La pureza de DNA se verificó con el coeficiente de 260/280 nm que debe de ser cercano a 1.8. Valores por debajo de 1.8 nos indica contaminación con proteínas y por arriba nos indica contaminación por RNA. Se tomaron 498 L de H2O y se colocaron en una celda, después se colocó en el espectro para medir la absorbancia y se calibró a cero, una vez realizada la calibración se añadieron 2 L de la solución del plásmido de concentración desconocida y se mezclan con el H2O y se tomó la lectura a las dos longitudes de onda, después se realizó el cálculo para saber la concentración de DNA que se tiene en la solución con las relación antes mencionada. . Análisis de DNA por electroforesis en geles de agarosa La electroforesis horizontal en geles de agarosa se ha utilizado como método habitual de análisis de DNA. El entramado molecular del gel de agarosa es el principal factor de la separación. De esta manera, las moléculas de pequeño tamaño avanzan más rápidamente a través del gel. Existen diferentes tipos de agarosa y se pueden utilizar a diferentes concentraciones. Preparación de geles de agarosa Se pesó la cantidad de agarosa correspondiente y se disolvió por calentamiento en TAE 1X el cual se obtuvo a partir de un stock de TAE 50X (Tris base 242 g, acido acético glacial 57.1 mL y EDTA 0.5 M, pH 8.0). Posteriormente se dejó enfriar hasta alcanzar una temperatura inferior a 50 °C, se vertió la solución en el molde del gel, al cual se le colocó un peine para formar los pozos. Durante este paso, se evitó la formación de burbujas y se dejó solidificar de 20 a 30 min. Finalmente el gel se colocó dentro de la cámara de electroforesis con 300 mL de amortiguador de corrida TAE 1X o hasta cubrir completamente el gel. 27 Electroforesis de DNA Las muestras sujetas a electroforesis, se mezclaron 1:1 v/v con amortiguador de carga (0.25% azul de bromofenol, 0.25% de cianol xileno FF y glicerol 30% en agua). De esta mezcla se cargaron de 10 a 20 L de muestra por pozo. Se cargó 1 g de marcador de peso molecular en un pozo aparte. Posteriormente se aplicó un campo eléctrico de 80-150 volts para movilizar el DNA por el entramado del gel. El campo eléctrico se interrumpió cuando el marcador azul de bromofenol llegó a 2/3 de la longitud del gel. Tinción de geles de agarosa Para poder observar las bandas de DNA separadas se sumergió el gel en una solución de bromuro de etidio 0.5 g/mL por no más de 10 min. A continuación se lavó con agua destilada durante 10 min. Finalmente las bandas de DNA se observaron al transiluminar el gel con luz ultravioleta. Obtención de DNA plasmídico por el método de lisis alcalina La purificación de los plásmidos se realizó de acuerdo con las instrucciones del Kit QIAGEN (Qiagen Midiprep Handbook), Reacción de PCR para la obtención de arp2 cDNA Se realizó la amplificación de arp2 cDNA, clonado en el vector pCR 4Blunt-TOPO4 (Invitrogen); mediante una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando como iniciador sentido el siguiente oligonucleótido: 5´-TGACAGTGATGCGGGAGAAGG-3´ y un oligonucleótido antisentido degenerado: 5´- TGYTCKMGCAAAYTTCCAYTC-3´, el cual corresponde a una región de la familia de las proteínas Trp. Las condiciones bajo las cuales se llevó a cabo la reacción de PCR fueron las siguientes: un ciclo de desnaturalización a 94 °C por 5 min, 30 ciclos a 94 °C por 45 s, 65 °C por 45 s, 72 °C por 2 min; y un ciclo a 72 °C por 10 min. Las concentraciones de los reactivos fueron las siguientes: Molde (pCR 4Blunt- TOPO-arp2) 70 ng/L, amortiguador 10X, MgCl2 25 mM, dNTPs 10 mM, oligonucleótidos cada uno de 20 picoM (Tapia-Vieyra et al. 2005). Las cantidades usadas de cada reactivo para la reacción de PCR fueron: Molde 4 L, H2O 14.2 L, buffer 2.5 L, MgCl2 1.7 L, dNTPs 0.3 L, oligo FW 1 L, oligo RV 1 L, Total 25 L. 28 Construcción del plásmido pcDNA3.1 ARP2-2 V5-His Para la reacción de ligación se utilizó 4L del producto de reacción de PCR y 1 del vector pcDNA 3.1/V5-His-Topo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). La mezcla de reacción se incubo durante 5 min a temperatura ambiente e inmediatamente se procedió a la transformación de las células competentes. De las células transformadas con la reacción de ligación se obtuvieron 5 colonias, las cuales crecieron en placas de medio selectivo con ampicilina. Estas colonias se inocularon en medio LB líquido con 100 g/mL de ampicilina a 37 °C y agitación de 300 rpm durante 12-16 h. Una vez que se obtuvo la confluencia deseada en el cultivo, se purificaron los 5 plásmidos por el método de lisis alcalina. Se realizaron digestiones de restricción dobles con las enzimas HindIII y NotI. La mezcla de digestión fue incubada a 37 °C por 1 h. Una vez transcurrido el tiempo las muestras de DNA se sometieron a una separación por electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Además se realizaron digestiones con las enzimas EcoRV, BamHI y HindIII para saber si el inserto se encuentra en fase. Construcción de pcDNA3.1 ARP2-2-eGFP V5-His El vector pEGFP-N1 (Clontech, Mountain View, CA, USA) permite la expresión de la proteína verde fluorescente mejorada (eGFP). Se liberó el inserto egfp cDNA del plásmido pEGFP-N1 utilizando las enzimas de restricción XhoI y XbaI. El egfp cDNA se insertó en el extremo 3’ del arp2 cDNA, en los sitios XhoI y XbaI del plásmido pcDNA3.1 ARP2-2 V5-His, obteniendo el plásmido pcDNA3.1 ARP2-2-eGFP V5-His. Los DNAs plasmídicos fueron secuenciados usando un secuenciador automático ABIPRISM 310 Genetic Analyzer de Perkin-Elmer Applied Biosystems (IBT, UNAM) que permite secuenciar DNA de diferentes tipos utilizando técnicas de electroforesis capilar. Cultivo de células de mamífero Propagación de células LNCaP El medio de cultivo base para esta línea celular es RPMI-1640. Para un medio de cultivo completo, se incorporó suero fetal bovino (SFB) (Wisent Inc., Quebec, Canadá) a una concentración final del 10%. Una atmosfera con dióxido de carbono (CO2) 5% a una temperatura de 37 °C. Los cultivos se mantuvieron a una concentración celular entre 1 x 104 y 2 X 105 células/cm2 bajo las condiciones antes mencionadas. La relación de los subcultivos puede ser de 1:3 a 1:6. La renovación de medio se realizó por lo menos dos veces por semana. Conservación: las células se resuspendieron en medio de cultivo completo suplementado con DMSO 5% (v/v). Temperatura de almacenamiento: nitrógeno líquido en fase de vapor. 29 Propagación de células CHO El medio de cultivo medio base para esta línea celular es F-12K. Para un medio de cultivo completo, se incorporó suero fetal bovino (SFB) a una concentración final del 10%. Una atmosfera con dióxido de carbono (CO2) 5% a una temperatura de 37 °C. La relación de los subcultivos puede ser de 1:4 a 1:8. La renovación medio se realizó una o dos veces para cada subcultivo. Conservación: las células se resuspendieron en medio de cultivo completo suplementado con DMSO 5% (v/v). Temperatura de almacenamiento: nitrógeno líquido en fase de vapor. Preparación de subcultivos Se retiró y desechó el medio de la caja de cultivo o Petri. Se enjuagó brevemente la capa de células con 5-8 mL de PBS estéril y se retiró por aspiración. Se añadió 2.5 mL de Tripsina 0.25% w/v-EDTA 0.53 mM a la caja de cultivo y se observaron las células bajo un microscopio hasta que la capa de células se dispersa, por lo general entre 5 y 15 min. Para evitar la formación de grumos se evitó agitar las células golpeando o sacudiendo la caja Petri mientras se lleva a cabo la dispersión de las células. Las células difíciles de separar de la superficie de la caja se colocaron a 37 °C para facilitar el proceso. Se añadió 2.5 mL de medio de cultivo completo y se aspiraron las células pipeteando con suavidad. Se colocaron en un tubo de 15 mL, se centrifugaron a 300 x g por un min y el sobrenadante se aspiró con vacío. La pastilla celular se resuspendió en 100 L de medio el cual se distribuye en una caja de cultivo con 10 mL de medio completo y para más de una caja de cultivo se procede tomando en cuenta la misma relación. Transfección de células LNCaP andrógeno-independientes y CHO La transfección es el proceso por el cual se puede introducir DNA foráneo dentro de una célula eucarionte. Este proceso puede ser realizado por medio de diferentes técnicas, nosotros utilizamos una técnica liquida, por medio de liposomas. Las células LNCaP y CHO se transfectaron con el plásmido pcDNA3.1 ARP2-2 V5-His y pcDNA3.1/V5-His-TOPOlacZ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) para la expresión transitoria de ARP2-V5 y galatosidasa-V5, respectivamente. De manera alternativa, las dos líneas celulares que se utilizaron se transfectaron con el plásmido vacio (pcDNA3.1-V5-His). Las células CHO se transfectaron con los plásmidos pEGFP-N1 y pcDNA3.1 ARP2-2-eGFP V5-His para la expresión de eGFP y ARP2-eGFP, respectivamente. Las transfecciones se realizaron con lipofectamina 2000 obtenida del estuche pcDNA3.1/V5-His TOPO TA Expression Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). El plásmido y los liposomas son mezclados de tal manera que el plásmido de expresión es encapsulado 30 dentro del liposoma. Por último el liposoma-plásmido se fusiona con las células, introduciéndose el DNA al citoplasma. Se colocaron de 2-5 x105 células en pozos de 35 mm a un volumen de 2 mL de medio de cultivo suplementado con suero fetal bovino incubando a 37 ºC y 5% de CO2 hasta alcanzar un 60-70% de confluencia. Se prepararon las siguientes soluciones: Solución A: Diluir 1-2 µg del DNA plasmídico a transfectar en 100 µL de medio DMEM/F12 o RPMI 1640 sin SFB. Solución B: Diluir de 2-25 µL de lipofectamina en 100 µL de medio DMEM/F12 o RPMI 1640 sin SFB. Las soluciones A y B fueron mezcladas e incubadas a temperatura ambiente durante 30 min. Las células fueron lavadas con 2 mL de medio DMEM/F12 o RPMI 1640 sin SFB. Se agregaron 0.8 mL de medio DMEM/F12 o RPMI 1640 sin suero al tubo de la mezcla AB (lipofectamina-DNA). Se mezcló y extendió la suspensión en los pozos de 35 mm. Estas células se incubaron por 24 h a 37 ºC y 5% de CO2. Al término de este periodo de incubación se reemplazó el medio de cultivo. Las células transfectadas fuero lavadas con verseno y lisadas a diferentes tiempos de post-transfección con un buffer de la siguiente composición: NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, aprotinina 1 g/mL, PMSF 1 mM, benzamidina 5 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8.0. Se almacenaron alícuotas de células transfectadas a -70ºC durante 16 h y posteriormente se trasladaron a -270 °C para su uso a largo plazo. Una vez obtenidas todas las muestras celulares a los diferentes tiempos (16, 24, 48 y 72 h), se cuantificó la concentración de proteína y se sometieron a una separación SDS-PAGE. Análisis de proteínas Cuantificación de la concentración de proteína La cuantificación de proteína total se realizó mediante el método colorimétrico Micro BCATM Protein Assay Reagent Kit. Este sistema utiliza ácido bicinconínico (BCA) para detectar el ión cuproso Cu+1, cuando Cu+2 es reducido por las proteínas en un ambiente alcalino. La reacción produce un complejo con dos moléculas de BCA y una del ión (Cu1+) virando la solución a una coloración púrpura, la cual es detectable a 562 nm. Se preparó la curva estándar de ocho puntos por duplicado en una placa de ELISA utilizando una concentración conocida de albúmina sérica bovina en cada uno de estos puntos. En la respuesta lineal de la curva de BSA se interpolaron los valores de absorbancia leídos de las muestras problema. 31 Electroforesis de proteínas El método de separación electroforética se basa en la migración diferencial de las moléculas en solución a través de un campo eléctrico. Este método es de amplia aplicación en la biología molecular, específicamente en la purificación y caracterización de proteínas y estudios de ácidos nucleicos. La velocidad de migración o movilidad electroforética de las moléculas en el campo eléctrico depende de su intensidad, del tamaño, forma y carga neta de las moléculas, así como de la fuerza iónica y temperatura del medio en el que se desplazan. Actualmente, el soporte más frecuentemente utilizado para separar electroforéticamente proteínas, es el gel de poliacrilamida. Estos geles se forman por la polimerización de largas cadenas de monómeros de acrilamida unidas covalentemente en presencia de bisacrilamida que actúa como agente entrecruzador. La polimerización se inicia por la presencia de radicales libres que se forman al reaccionar el persulfato de amonio con el catalizador TEMED. Geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) Inicialmente este sistema fue desarrollado por Laemmli (1970) y modificado por Thomas y Komberg (1978). En este tipo de electroforesis tanto el soporte (gel) como el buffer de corrida contienen SDS, un agente tensoactivo o desnaturalizante. Finalmente, todas las proteínas desnaturalizadas se encuentran solubilizadas y cargadas negativamente por la unión del SDS, la cantidad de SDS que se asocia a una proteína es aproximadamente proporcional a su peso molecular. Así, este método electroforético permite estimar el peso molecular aparente (MWap) de una proteína en relación al peso molecular de proteínas estándar. El protocolo para la preparación de geles para SDS-PAGE es el siguiente: 1. El tamaño del gel fue de 13 x 12.5mm y espesores de 0.75 o 1.5 mm segúnlos requerimientos. Las placas y peines se lavaron con agua, se secaron y se desengrasaron con etanol y luego fueron secados al aire. 2. Las soluciones utilizadas se encuentran en la tabla que se muestra más adelante. 3. Primero, se prepara el gel separador y se vierte entre las placas de vidrio, se deja reposar en posición vertical hasta que polimerice. El oxígeno es un inhibidor de la polimerización, por esta razón se añade suavemente etanol al 70% hasta cubrir el gel en la parte superior. Al polimerizar el gel se elimina el etanol, se añade el gel empacador y se colocan el peine, se deja polimerizar y se retira el peine. 4. El amortiguador de electroforesis: consiste de: Tris 0.6% (0.05M), glicina 2.88% (0.38M), y SDS 0.1%, pH 8.3 (el pH no requiere ser ajustado). 32 Gel Concentrador Soluciones Concentration Final Acrilamida 30%-Bisacrilamida 0.8% 5 - 0.13% Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 0.125 M SDS 10% 0.1% Agua Completar volumen PA 10% 0.1% TEMED 0.1% Gel Separador Soluciones Concentration Final Acrilamida 30%-Bisacrilamida 0.8% 15 -7.5% Tris-HCl 1.5 M, pH 6.8 0.75 M SDS 10% 0.1% Agua Completar volumen PA 10% 0.1% TEMED 0.05% 5. Las muestras se preparan con amortiguador de Laemmli: Tris 0.0625 M, SDS 2%, glicerol 10%, - mercaptoetanol 5% y azul de bromofenol 0.1% utilizado para observar el frente de corrida electroforética. El amortiguador de muestra o Laemmli tiene dos funciones, por un lado desnaturalizar a las proteínas, y por otro lado cargarlas negativamente, ya que el SDS se une a los dominios hidrofóbicos y forma micelas con carga negativa. Finalmente, las proteínas se terminan de desnaturalizar en presencia de -mercaptoetanol a 100 °C durante 3 min. 6. Condiciones del desarrollo electroforético: La polaridad del sistema electroforético es de polo negativo (parte superior) a polo positivo (parte inferior). La mejor condición de electroforesis es manteniendo el voltaje constante y para evitar el sobrecalentamiento se puede colocar a 4 °C. 7. El efecto del gel empacador es que toda la muestra ingrese en forma simultánea al gel separador, esto se produce a consecuencia de la diferencia de potencial entre el gel separador (pH 8.3) y el gel empacador (pH 6.8). 33 Análisis por inmunoensayo tipo western blot Las proteínas ARP2 y -Gal expresadas de forma transitoria en células LNCaP y CHO (transfectadas con el arp2 cDNA y lacZ cDNA, respectivamente) poseen un epitope V5 en el extremo carboxilo terminal que sirve para la inmunodetección de éstas utilizando un anticuerpo primario anti-V5 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Después de mantener en cultivo a las células por 16, 24, 48 y 72 h, se resuspendieron y lisaron en un amortiguador con la siguiente composición, Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, aprotinina 1 g/mL, PMSF 1 mM, benzamidina 5 mM. La cuantificación de proteína se realizó con ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, U.S.A.). La electro-transferencia de proteínas se realizó en membranas de nitrocelulosa de 0.45 m (Trans-Blot Transfer médium BIO- RAD, Hercules, CA, USA). La membrana se bloqueó por 1 h a 37 °C utilizando un amortiguador de bloqueo [Tris-salino (TBS), pH 7.6 (Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 100 mM, tween 20 al 0.1% v/v, leche descremada al 2.5% w/v)]. Se colocó el anticuerpo monoclonal primario anti-V5 de ratón a una dilución 1:5000 en solución de bloqueo y se incubó 12 h a 4 °C. Se realizaron tres lavados de 15 min con solución de bloqueo a 37 °C. La membrana se incubó 2 h a 37 °C con el anticuerpo secundario anti-ratón (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) a una dilución 1:5000 en solución de bloqueo. La membrana se lavó con TBS-Tween 0.1% tres veces durante 15 min a 37 °C y un cuarto lavado con TBS bajo las mismas condiciones. Para verificar que la cantidad de proteína es la misma en todos los carriles de la membrana, esta se incubó con un anticuerpo anti--actina (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). La visualización se realizó mediante detección quimioluminiscente ECL (Pierce, Rockford, IL, USA) exponiendo tiempos de 5 y 10 min sobre placas-radiográficas (Kodak Rochester, NY, USA). Ensayo de viabilidad mediante la inhibición de la reducción de MTT Las células CHO se mantuvieron en medio de cultivo suplementado con suero (control negativo), mientras que las células apoptóticas se obtuvieron mediante la eliminación del suero (control positivo). Las células se colocaron en placas de 96 pozos a una densidad final de 2 x 104 células/pozo y mantuvieron en cultivo por 16, 24, 48 y 72 h. Enseguida, se añadió a cada pozo 30 L de una solución stock de MTT (Sigma-Aldrich, St Louis, U.S.A) en medio de cultivo, hasta una concentración final de 0.5 mg/mL del reactivo. Las placas se mantuvieron en incubación durante 4 h para la formación de cristales de formazán, una sal producto de enzimas mitocondriales a partir de MTT, los cuales se solubilizaron con la adición de un amortiguador de lisis (SDS 20%, N,N-dimetilformamida 50%, pH 3.7). Las placas se mantuvieron en incubación durante 12 h, al término se midió la absorbancia a 570 nm en un lector de microplacas. Los experimentos se realizaron de manera independiente por triplicado y los valores reportados son expresados en porcentaje de viabilidad con respecto al control sin tratamiento. 34 Ensayo de viabilidad celular con azul de tripano Los tiempos de incubación para las células LNCaP fueron 16, 24, 48, 72, 96 y 120 h, mientras que para las células CHO fueron 16, 24, 48 y 72 h. Las células se sometieron a la tinción con azul de tripano 0.1% v/v. Las células se colocaron en cámaras de Neubauer. Se cuantificaron un total de 300 células para cada muestra bajo microscopio óptico de campo claro (Motic). Los experimentos se realizaron de manera independiente por triplicado y los valores reportados son expresados en porcentaje de viabilidad con respecto al control sin tratamiento. Actividad de caspasas 3 y 7 El ensayo se realizó en células CHO, utilizando placas de 3 x 105 células/pozo. Se evaluó la actividad de caspasas 3 y 7 en células sin tratamiento, inducidas a la apoptosis mediante la eliminación de suero del medio, en células transfectadas con arp2 cDNA (transfección con el plásmido pcDNA3.1 ARP2-2 V5-His) y en un control positivo obtenido del estuche utilizado para el ensayo. Las células evaluadas se mantuvieron en cultivo por 16, 24, 48 y 72 h, bajo las condiciones descritas. Las células se lavaron con PBS y se resuspendieron y lisaron mediante cuatro ciclos de congelado y descongelado en un amortiguador con la composición HEPES 10 mM, pH 7.0, b-glicerofosfato 40 mM, NaCl 50 mM, MgCl2 2 mM. En seguida, las muestras se centrifugaron por 30 min a 15 800 x g. De cada una de las muestras, se diluyeron 20 g de proteína en un volumen final de 1000 L del amortiguador indicado para este ensayo, (HEPES 50 mM, sucrosa 10%, CHAPS 0.1%, DTT 10 mM) suplementado con Z-Asp-Glu-Val- Asp-7-amino-4-trifluorometilcumarina (Z-DEVD-AFC), un sustrato fluorogénico de las caspasas 3 y 7. Las muestras fueron incubadas por 10 min a 30 °C, la fluorescencia fue medida en un espectrómetro de luminiscencia según el protocolo de Molecular Probes, con una longitud de onda de excitación fue de 365 nm y una longitud de onda de emisión de 505 nm. La máxima absorbancia se detectó a una longitud de onda de 488 nm. De la misma manera se midió la fluorescencia en muestras blanco, libres de extracto celular, para determinar el ruido de las muestras. Los experimentos se realizaron de manera independiente por triplicado y los valores reportados son expresados en porcentaje de viabilidad con respecto al control sin tratamiento. 35 Microscopia confocal y de contraste de interferencia diferencial (DIC) Las células CHO se transfectaron con el plásmido pEGFP-N1
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