Papel-de-los-KCC-en-la-proliferacion-y-apoptosis-de-celulas-de-cancer

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
POSGRADO EN CIENCIAS 
BIOLÓGICAS 
 
 Facultad de Medicina 
 
 
 
PAPEL DE LOS KCC EN LA 
PROLIFERACIÓN Y APOPTOSIS DE 
CÉLULAS DE CÁNCER. 
 
 
 
 
 
 T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE 
 
MAESTRO(A) EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
(BIOLOGÍA EXPERIMENTAL) 
 
 P R E S E N T A 
 
 
ALMA ROSA ESCALONA GUZMÁN 
 
 
DIRECTOR(A) DE TESIS: DRA. VILMA MALDONADO LAGUNAS 
 
 
MÉXICO, D.F. SEPTIEMBRE, 2007 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
RECONOCIMIENTO 
 
 
 
 
 
 
 
Al Posgrado en Ciencias Biológicas. 
 
 
 
 
 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por otorgarme la beca de 
maestría No. 199269. 
 
 
 
 
 
A los miembros del Comité Tutoral: 
Dra. Vilma Maldonado Lagunas 
Dra. Ingeborg Becker Fauser 
Dr. Gerardo Gamba Ayala 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
 
Al Instituto Nacional de Cancerología por todas las facilidades otorgadas para la 
realización de este proyecto de maestría. 
 
 
Al laboratorio de Biología Molecular de la Subdirección de Investigación Básica y en 
particular a la Dra. Vilma Maldonado Lagunas por su dedicación, orientación y por 
haberme transmitido el compromiso hacia la investigación. 
 
 
Al Dr. Jorge Meléndez Zajgla, por permitirme trabajar, aprender y crecer 
académicamente en su laboratorio. 
 
 
En especial a todos los miembros del Jurado, a la Dra. Vilma Maldonado Lagunas, 
Dra. Ingeborg Becker Fauser, Dra. Martha robles Flores, Dr. Gerardo Gamba Ayala 
y Dr. Luis Felipe Jiménez García por brindarme un poco de su valioso tiempo para 
realizar acertadas observaciones a este trabajo de tesis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
 
 
Este trabajo se lo dedico de una manera muy especial a la persona a quien le debo 
la vida y me apoyo en todo lo que estuvo a su alcance, toda su vida. Se que habría 
sentido una gran satisfacción al verme llegar hasta aquí. A mi mamá. 
 
 
 
 
 
 
A mi esposo Ricardo Hernández García, porque es lo más importante en mi vida. 
 
 
 
A toda mi familia porque a pesar de tantos sucesos familiares, el estar con cada 
uno de ellos me dio tranquilidad y ánimo para continuar mi camino. 
 
 
 
A mis amistades en particular a la Bióloga Pilar Ramos Godinez por apoyarme en 
un momento muy difícil de mi vida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INDICE 
 
 
RESUMEN………………………………………………………………………..............................3 
INDICE DE FIGURAS……………………………………………………………………….………….5 
INTRODUCCION…………………………………………………………………………………………6 
I. REGULACION DEL VOLUMEN CELULAR…………….……………………………………6 
RVI por sus siglas en ingles, Regulatory Volume Increase………………………………...7 
RVD por sus siglas en ingles, Regulatory Volume Decrease……………………………….7 
AVD por sus siglas en ingles, Apoptotic Volume Decrease………………………………...7 
II. COTRANSPORTADORES DE POTASIO ACOPLADOS A CLORO………………8 
Árbol filogenético……………………………………………………………………………………........9 
Características generales………………………………………………………………………………..9 
Estructura……………………………………………………………………………………………………11 
Regulación…………………………………………………………………………………………………..11 
KCC3…………………………………………………………………………………………………………..15 
Características generales de KCC3………………………………………………………………...17 
III. APOPTOSIS……..…………………………………………………………………………………18 
Aspectos generales..........................................................................................18 
IV. PROLIFERACION…………………………………………………………………….............18 
Aspectos generales………………………………………………………………………………………18 
V. QUIMIOTERAPIA DE ENFERMEDADES NEOPLASICAS………………………..19 
Aspectos generales………………………………………………………………………………………19 
Cisplatino………………………………………………………………………………………………….…20 
VI. ESFEROIDES TUMORALES MULTICELULARES……………………………………21 
Aspectos generales……………………………………………………………………………………...21 
VIII. VIA DE NF-kB…………………………………………………………………………………..22 
Aspectos generales………………………………………………………………………………………22 
Vía de activación canónica de NF-kB………………………………………………………………24 
Vía de activación no canónica de NF-kB………………………………………………………….25 
JUSTIFICACION………………………………………………………………………………………..27 
ANTECEDENTES………………………………………………………………………………………..27 
HIPOTESIS………………………………………………………………………………………………..29 
OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………….29 
Objetivo general………………………………………………………………………………………....29 
Objetivos particulares……………………………………………………………………………………29 
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL…………………………………………………………………..30 
Estrategia experimental general…………………………………………………………………….30 
I. EXPRESION DE KCC3 EN CELULAS HeLa………….……………………………….…32 
II. CLONACION DE KCC3 ANTISENTIDO EN EL VECTOR pLXSN…….…….…34 
III. EXPRESION DE LA CONSTRUCCION EN CELULAS HeLa……………………39 
IV. PROLIFERACION CELULAR………………………………………………………………...39 
V. CLONOGENICIDAD……………………………………………………………………….………40 
VI. APOPTOSIS…………………………………………………………………………………………40 
VII. CULTIVOS TRIDIMENSIONALES….…………………………………………………..41 
IX. EXTRACCION DE PROTEINAS………………………………………………………….…41 
X. WESTERN BLOT………………………………………………………………………………..….42 
RESULTADOS………………………………………………………………………………………….…43 
I. EXPRESION DE KCC3 EN CELULAS HeLa…………………………………………..…43 
II. CLONACION DE KCC3 ANTISENTIDO EN EL VECTOR PLXSN……………..43 
III. MORFOLOGIA CELULAR…………………………………………………………………….45 
IV. PROLIFERACION CELULAR…………………………………………………………………46 
V. CLONOGENICIDAD………..……………………………………………………………………..47 
VI. APOPTOSIS………………………………………………………....................................49 
VII. CULTIVOS TRIDIMENSIONALES MULTICELULARES………………………..52 
VIII. NF-KB……………………………………………………………………………………………….53 
DISCUSION……………………………………………………………………………………………….54 
CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………..60 
PERSPECTIVAS..……………………………………………………………………………………….61 
REFERENCIAS………..…………………………………………………………………………………62 
INDICE DE FIGURAS 
 
Fig 1. Árbol filogenético de la familia de cotransportadores electroneutros de 
cationes cloro…………………………………………………………………………………………...16 
Fig 2. Topología propuesta para los KCCs…………………………………………….….....18 
Fig 3. Diagrama esquemático de la señalización del receptor IGF-1 el cual permite 
la regulación de la producción de KCC.………………………………………......21 
Fig 4. Aductos formados en la interacción de cisplatino con el ADN………………..28 
Fig 5. Miembros de la familia de NF-kB e IkB……………………………………………….31 
Fig 6. Vías que permiten la activación de NF-kB……………………………………………34 
Fig 7. Diagrama de flujo de la estrategia experimental………….………………………40 
Fig 8. Clonación del fragmento de KCC3 antisentido en el vector 
pLXSN..………………………………………………………………………………………………….…43 
Fig 9. Expresión de KCC3 en células HeLa………………….……………………………..…51 
Fig 10. Clonación de KCC3 antisentido en pLXSN………………………………………….52 
Fig 11. Western blot de KCC3…………………………………………………………………….53 
Fig 12. Las células HeLa con el antisentido de KCC3 muestran una morfología 
diferente…………………………………………………………………………………………………..54 
Fig 13. Disminución de la proliferación de células HeLa con antisentido de 
KCC3………………………………………………………………………………………………………..55 
Fig 14. Disminución de la clonogenicidad de células HeLa con KCC3 
antisentido………………………………………………………………………………………………..57 
Fig 15. Participación de KCC3 en la sensibilidad a apoptosis por cisplatino en 
células HeLa……………………………………………………………………………………………..59 
Fig 16. Morfología nuclear decélulas apoptóticas………………………………………….60 
Fig 17. Disminución de crecimiento en cultivo tridimensional de HeLa-KCC3 
antisentido……………………………………………………………………………………………..…61 
Fig 18. Expresión de NF-kB…………………………………………………………………………62 
 
 
 
RESUMEN 
Los KCCs forman parte de la familia SCL12 constituida por proteínas encargadas 
de transportar potasio y cloro en la célula durante diversos procesos celulares. A 
la fecha se han descrito cuatro miembros de esta familia (KCC1, KCC2, KCC3 y 
KCC4). En tejidos normales cada KCC tiene una distribución diferencial siendo el 
KCC1 el más ubicuo y el KCC2 tiene una expresión tejido específico ya que se 
expresa casi exclusivamente en tejido neural. Las funciones fisiológicas en las 
que participan son en la regulación del volumen celular, concentración de Cl- 
intracelular, regulación de K+ durante la isquemia en un infarto al miocardio y en 
el transporte transepitelial. 
Los mecanismos por los cuales las células tumorales regulan su metabolismo 
acelerado de proliferación y evaden la apoptosis no se conocen del todo. En este 
estudio se investigó la participación de KCC3 en la proliferación, clonogenicidad, 
apoptosis, formación de esferoides y su posible papel en la vía de NF-kB de 
células de cáncer cervicouterino HeLa. 
Se amplificó un fragmento de 662 pb a partir del cDNA de células HeLa utilizando 
oligonucleótidos específicos. El fragmento de PCR se clonó en el vector 
pTZ57R/T, se seleccionó una clona que tuviera el fragmento en antisentido y 
después se subclonó en el vector de expresión pLXSN. 
Células HeLa se transfectaron con el vector pLXSN o con pLXSN-KCC3 antisentido 
utilizando liposomas y se seleccionaron por 5 días con geneticina. 
Al realizar el análisis de proliferación se encontró que es menor en células HeLa 
que contienen niveles bajos de KCC3. 
Nuestros resultados demuestran que la inhibición de KCC3 también afecta la 
capacidad de clonogenicidad de las células. 
Así también las células HeLa-KKC3 antisentido fueron más sensibles a apoptosis 
inducida por cisplatino, un agente antineoplásico muy utilizado en la clínica. De 
manera interesante también encontramos que el inhibir KCC3 afecta la capacidad 
 8 
de formar esferoides tumorales multicelulares, es decir que las células crezcan en 
tercera dimensión. 
Se realizó un análisis preliminar de la vía de transducción posiblemente 
involucrada en el efecto de KCC3. Se determinaron los niveles de proteínas 
reguladoras del factor nuclear NF-kB y se encontró que estaban desreguladas en 
las células HeLa con niveles bajos de KCC3. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9 
ABSTRACT 
The KCCs are from the proteic family SCL12, which contains proteins involved in 
transport of potassium and chlorine ions in the cell during diverse cellular 
processes. To the date four members of this family have been described (KCC1, 
KCC2, KCC3 and KCC4). In normal tissues each KCC has a differential distribution 
where the KCC1 is the most ubiquitously expressed and the KCC2 has a tissue-
specific expresión, almost exclusively in neural tissue. The physiological functions 
where participate are the regulation of the cellular volume, concentration of 
intracellular Cl- ion, myocardial K+ loss during ischemia in a myocardic infarct and 
the transepithelial transport. 
The mechanisms through tumor cells regulate their accelerated metabolism of 
proliferation and evade the apoptosis are not know completely. In this study we 
investigate the participation of KCC3 in proliferation, clonogenicity, apoptosis, 
formation of spheroids and its possible role in the NF-kB pathway of 
cervicouterine cancer HeLa cells. 
First of all, a fragment of 662 bp was amplified from HeLa cells cDNA using 
specific primers. The PCR fragment was cloned in the vector pTZ57R/T, a clone 
containing the antisense fragment was selected and subcloned in the expression 
vector pLXSN. 
HeLa cells were liposome-transfected with the vector pLXSN or with antisense 
pLXSN-KCC3 and selected by 5 days with geneticine. 
After a proliferation analysis was found that HeLa cells proliferation rate is 
smaller in those with lower levels of KCC3. 
Our results demonstrate that the KCC3 inhibition also affects the capacity of 
clonogenicity of the cells. 
Furthermore, the antisense HeLa-KCC3 cells were more sensible to cisplatin, a 
very clinic-used antineoplasic agent. Interestingly, we also found that KCC3 
inhibition affects the capacity to form multicellular tumoral spheroids, that is, 
third-dimension growing capacity of cells. 
 10 
Also, we made a preliminary analysis of the transduction pathway possibly 
involved in the KCC3 effect. That was aimed by measuring levels of regulating 
protein of nuclear factor NF-kB pathway, finding that they were deregulated in 
the HeLa cells with low levels of KCC3. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 11 
 
INTRODUCCION 
 
I. REGULACION DEL VOLUMEN CELULAR 
La célula no puede vivir sin un balance apropiado de iones que cruzan su 
membrana celular. Las propiedades funcionales de las proteínas, expresión 
génica, cascadas de segundos mensajeros y la liberación de hormonas son 
extremadamente dependientes de la homeostasis iónica intracelular. Por lo 
tanto, las células utilizan múltiples mecanismos de transporte iónico tales como 
canales, cotransportadores e intercambiadores para mantener un balance iónico 
constante. Por esta razón, los consumidores primarios de energía en la célula son 
los mecanismos de transporte iónico (Bortner y Cidlowski, 2004). 
 
Una de las grandes interrogantes en los sistemas biológicos es cómo se regula la 
función de diversos elementos que componen un sistema, que puede estar 
integrado por miembros localizados en diversas células y tejidos, para montar 
una respuesta coordinada y coherente ante diversas perturbaciones fisiológicas. 
Un ejemplo es el mantenimiento de la homeostasis iónica intra y extracelular, 
involucrada en funciones que van desde la regulación del volumen celular, en 
cada célula, funciones de tipo célula o tejido específico, y funciones que implican 
la respuesta coordinada de una variedad de células y órganos. 
Las células mantienen un volumen celular constante a base de mantener el 
equilibrio osmolar con el medio exterior. En condiciones de homeostasis, la 
osmolaridad intracelular y la extracelular es la misma (alrededor de 290 
mOsm/Kg H2O). Cuando suceden cambios en la osmolaridad de alguno de los 
compartimentos, se produce un movimiento de agua a favor de su gradiente, 
con lo que el volumen celular aumenta o disminuye. La disminución de la 
osmolaridad extracelular se acompaña de un aumento en el volumen celular, 
mientras que el aumento en la osmolaridad extracelular se acompaña de 
encogimiento celular (De los Heros et al, 2006). 
 12 
La regulación del volumen celular es una función esencial acoplada a una 
variedad de procesos fisiológicos, tales como la proliferación, diferenciación y 
migración. 
Las células responden con aumento o reducción a la perturbación osmótica, pero 
después de activar un sistema de regulación de volumen bajo condiciones 
fisiológicas. Sin embargo, las células que pasan por apoptosis muestran una 
persistente reducción de volumen bajo condiciones fisiológicas normotónicas. En 
condiciones fisiopatológicas, las células pasan por un aumento o reducción de 
volumen sin mostrar regulación del volumen. 
 
RVI por sus siglas en ingles, Regulatory Volume Increase 
RVD por sus siglas en ingles, Regulatory Volume Decrease 
La actividad celular por sí misma causa fluctuaciones en la osmolaridad 
intracelular debido al transporte y al metabolismo de osmolitos. En condiciones 
anisotónicas, las células pueden regular su volumen después de un transitorio 
incremento o reducción osmótico,y la regulación del incremento de volumen 
(RVI por sus siglas en ingles, Regulatory Volume Increase) y la regulación del 
decremento de volumen (RVD por sus siglas en ingles, Regulatory Volume 
Decrease) son mantenidos por el flujo de agua dirigida principalmente por la 
entrada de NaCl y salida de KCl, respectivamente. 
 
AVD por sus siglas en ingles, Apoptotic Volume Decrease 
Por otra parte, la disminución celular es la característica más representativa de la 
apoptosis. El encogimiento celular apoptótico ocurre en dos etapas distintas: la 
primera fase comienza antes de la fragmentación celular o formación de los 
cuerpos apoptóticos y la segunda fase se asocia con la fragmentación celular. 
La fase de encogimiento temprano se denomina AVD el cual procede bajo 
condiciones normotónicas sin inducción del mecanismo de RVI, presumiblemente 
por activación de canales de K+ y/o Cl- (Bortner y Cidlowski, 2002, Okada et al, 
2001) 
 13 
Existe evidencia de que la inducción del AVD precede a la liberación de citocromo 
c, activación de caspasa-3 y a la fragmentación del ADN. Recientemente se ha 
demostrado que cuando la inducción de AVD es inhibida con bloqueadores de 
canales de Cl- o K+, una variedad de tipos celulares no muestran lo subsecuentes 
eventos morfológicos y bioquímicos de apoptosis. Estos datos indican que el AVD 
es un prerrequisito temprano a los eventos apoptóticos que permiten la muerte 
celular. 
 
II. Cotransportadores de potasio acoplados a cloro (KCC) 
Árbol filogenético 
Los KCCs pertenecen la familia de cotranspotadores electroneutros de cationes 
acoplados al transporte de cloro. Esta familia recibe la denominación de SLC12 
según la Human Genome Organization (HUGO). (Hediger et al, 2004) 
Está compuesta por siete genes claramente identificados que codifican para 
transportadores de membrana, de los cuales tres utilizan sodio (con o sin 
potasio) como el catión acoplado al transporte de cloro, mientras que los otros 
cuatro utilizan potasio como único catión acoplado al transporte de cloro. 
 
 
 14 
 
Fig 1. Árbol filogenético de la familia de cotransportadores electroneutros de 
cationes - cloro. Existen dos subfamilias. Una compuesta por tres genes que 
codifican para cotransportadores que utilizan sodio como catión para acoplarse al 
transporte de cloro (NCC, NKCC1 y NKCC2). La otra está compuesta por cuatro 
genes que codifican para cotransportadores que solo utilizan potasio como catión 
acoplado al cloro (KCC1 a KCC4). Los números en porcentaje indican el grado de 
identidad entre los diferentes miembros de la familia. 
 
Características generales 
Los cotransportadores electroneutros son transportadores secundarios que no 
hidrolizan ATP para su función, sino que dependen del gradiente generado por la 
bomba de Na+-K+-ATPasa para mover iones. Los KCCs translocan los iones desde 
adentro hacia fuera de la célula, siguiendo el gradiente favorable para el potasio. 
Se ha demostrado claramente que los KCCs se activan durante el aumento de 
volumen celular, con el objeto de disminuir la osmolaridad intracelular y así 
recuperar el volumen original (De los Heros et al, 2006) 
 15 
El mecanismo de los cotransportadores de K+-Cl- fue descrito por primera vez en 
glóbulos rojos de oveja bajas en potasio como una vía de salida de K+ activada 
por N-etilmaleimida (NEM) y un hinchamiento celular. 
Si bien las células rojas de los vasos permanecen como el primer modelo de 
tejido para esta clase de transportador iónico, poco después se reportó su 
existencia en neuronas, músculo liso vascular, endotelio, epitelio, corazón y 
músculo esquelético, proponiendo que la actividad de los cotransportadores K+-
Cl- cambia la concentración intracelular de Cl-. De esta manera la familia SLC12 
que esta formada por transportadores membranales establece la concentración 
de Cl- por debajo o arriba del equilibrio. Por lo tanto, esta es una de las mayores 
funciones de estos cotransportadores a nivel de fisiología celular. 
Otra función de los cotransportadores electroneutros catión-cloro es su papel 
como proteínas de membrana que participan en la regulación del volumen 
celular. Estos cotransportadores poseen una importante capacidad de flujo de 
iones, su activación es uno de los mecanismos que diversas células utilizan para 
ajustar su osmolaridad interna cuando se exponen a cambios de osmolaridad 
extracelular. Cuando las células son expuestas a un incremento en la 
osmolaridad del medio extracelular, el agua de la célula es reducido porque las 
moléculas de agua se mueven hacia el espacio en el cual el agua se encuentra 
disminuida; esto es seguido por una disminución significativa en el volumen 
celular. Para compensar las diferencias de osmolaridad entre el espacio extra e 
intracelular, diversos mecanismos son activados para incrementar la 
concentración iónica intracelular, y así reducir el gradiente del movimiento de 
moléculas de agua hacia afuera de la célula. Al contrario, cuando la célula es 
expuesta a una disminución de la osmolaridad extracelular, el gradiente 
nuevamente favorece el movimiento de moléculas de agua hacia adentro de la 
célula, resultando en un hinchamiento celular. Bajo estas circunstancias, las 
proteínas de membrana que permiten la salida de iones son activadas para 
liberar osmolitos de la célula, y así reducir el gradiente de movimiento del agua. 
Los cotransportadores K+-Cl- son algunas de las vías activadas bajo estas 
circunstancias. Los KCCs ayudan al decremento de la osmolaridad intracelular, 
 16 
así los cotransportadores K+-Cl- son proteínas de membrana que son activadas 
durante la regulación del decremento del volumen (RVD). 
Un tercer papel universal de los cotransportadores electroneutros es su 
importante participación en el movimiento de iones transepitelial. El único 
miembro de la familia que no esta relacionado con esta actividad es el KCC2, 
porque su expresión es específicamente en neuronas. 
Finalmente, un cuarto papel de los cotransportadores electroneutros es su 
participación en la concentración de cloro intraneural cualquiera de las dos arriba 
o debajo del equilibrio del potencial eléctrico. Esta función en fisiología neuronal 
es crítica para definir el tipo y la magnitud de respuesta a neurotransmisores 
como GABA. Los miembros de la familia relacionados con esta actividad son 
aquellos que se expresan en el SNC, como BSC2/NKCC1, KCC2 y KCC3. 
 
Estructura 
 
 
 
Fig 2. Topología propuesta para los KCCs. Tienen un asa localizada entre el 
dominio transmembranal 5 y 6, con cuatro posibles sitios de glicosilación 
(Gamba, 2005). 
 
La identificación de los genes fue posible por medio de la estrategia in silico que 
se basó en la identificación de secuencias en el Genebank. 
 17 
Los cotransportadores de K+ acoplados a Cl- se dividen en 2 subfamilias: una 
compuesta por KCC1 y KCC3 con ∼ 75% de identidad, y la otra por KCC2 y KCC4 
con ∼ 72%. La identidad entre ambas subfamilias es de ∼ 65%. (Gamba G., 
2005). Los cuatro KCCs difieren en aminoácidos de sus dominios 
transmembranales y en la distribución de los sitios de posible fosforilación en el 
dominio carboxilo y amino terminal (Shen et al, 2000). 
 
Regulación 
La actividad de los KCCs es regulada por fosforilación la cual esta asociada con 
la inactivación de la proteína, mientras que la desfosforilación con el incremento 
en la función del cotransportador (De los Heros et al, 2006 y Gamba, 2005). 
 
El aumento del volumen celular, las concentraciones intracelulares altas de Cl- y 
la presencia de proteínas fosfatasas, estimulan el transporte a través de los 
KCCs, pero inhiben a los transportadores de Na-K-Cl. Por el contrario, la 
disminución del volumen celular, las concentraciones bajas de Cl- intracelular y la 
presencia de inhibidores de las proteínas fosfatasas que promueven la 
fosforilación, producenel efecto contrario. En esta vía de señalización, se ha 
propuesto que el aumento del volumen celular y/o los cambios en la 
concentración de cloro intracelular, regulan la función de una cinasa intracelular 
que a su vez regula la función de los cotransportadores electroneutros. La 
identidad de dicha cinasa, queda aún por determinarse. Sin embargo, existen 
evidencias de diferentes laboratorios de investigación que sugieren que una 
nueva familia de serinas/treonina cinasas, denominadas WNK, podrían ser las 
cinasas que regulan y coordinan la función de los cotransportadores 
electroneutros (Gamba, 2005). 
 
Garzón Mudvi et al, 2006 reportaron que principalmente de KCC2 y KCC3 son 
inhibidos por la WNK4 por mecanismos que requieren su actividad catalítica. 
 
 18 
Por otra parte, Di Fulvio M. et al, 2003, proponen que la cascada de señalización 
de NO/sGC/cGMP/PKG es capaz de regular la expresión de KCC3a y KCC3b en 
cultivos primarios de células de músculo liso vascular. 
 
La región entre los aminoácidos 929-1043 rica en serinas y prolinas del dominio 
C–terminal de KCC2 le confieren una actividad constitutiva en condiciones 
isotónicas, característica particular de este KCC. Esta actividad no es inhibida por 
fosfatasas de serina treonina, lo que propone que el transporte iónico en 
condiciones isotónicas es activado por mecanismos distintos al de condiciones 
hipotónicas (Mercado et al, 2006). 
La eliminación de ocho aminoácidos en el dominio C-terminal de KCC1 inhibe su 
función pero continúa la acumulación del polipéptido, la expresión en la 
superficie membranal y carece de un fenotipo dominante negativo. La 
eliminación de 46 aminoácidos en el dominio N-terminal disminuye su función y 
la eliminación del aminoácido 89 o 117 (∆N117) inhibe su función, sin embargo 
continúa la acumulación del polipéptido y la expresión en la superficie 
membranal y muestra un fenotipo de dominante negativo que requiere la 
presencia del dominio citoplasmático C-terminal. ∆N117 también tiene inhibición 
dominante negativo para KCC1 y KCC3 de humano y baja potencia para KCC4 de 
ratón y KCC2 de rata (Casula et al, 2001). 
El promotor de KCC1 carece de caja TATA y está compuesto por un elemento 
iniciador (InR) y un elemento promotor río abajo (DPE), estos elementos se 
encuentran principalmente en Drosophila y raramente en promotores de genes 
de mamíferos. Por medio de análisis mutacionales se ha demostrado que ambos 
sitios InR y DPE son críticos para la actividad del promotor (Zhou et al, 2004). 
El factor de crecimiento parecido a la insulina tipo 1 (IGF-1) incrementa la 
actividad y expresión de ARNm de los KCCs (KCC1, KCC3 y KCC4) de una manera 
dosis dependiente con respecto al tiempo en paralelo con el incremento de la 
regulación del decremento de volumen en células de cáncer de ovario y cervical. 
El tratamiento con IGF-1 induce a la fosfatidilinositol - 3 - cinasa y activa la 
 19 
cascada de proteínas cinasas activadas por mitógenos, permitiendo la activación 
de Akt y la regulación de la cinasa ½ (Erk1/2) regulada por señal extracelular, 
respectivamente. La activación de las vías de señalización de la proteína cinasa 
activada por mitógenos Erk1/2 y la fosfatidilinositol - 3 - cinasa son necesarias 
para la biosíntesis de KCCs bajo el estímulo de IGF-1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig 3. Diagrama esquemático de la señalización del receptor IGF-1 el cual 
permite la regulación de la producción de KCCs (Shen et al, 2004). 
 
 
También se ha reportado un aumento en la expresión, proliferación e invasión de 
KCC3 y KCC4 en células de cáncer de mama estimuladas con IGF-1 (Hsu et al, 
2007). 
Existen evidencias que proponen a la familia de fosfatasas de serina treonina PP-
1 como posibles activadores de los cotransportadores K-Cl (Franceschi et al, 
2006). 
El tratamiento con factor de crecimiento de plaquetas (PDGF), regula 
positivamente el ARNm de KCC1 y negativamente el de KCC3 en cultivos 
primarios de células de músculo liso vascular (VSMCs). Se ha propuesto que esta 
activación involucra las vías de señalización del fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3-K) 
 20 
y PP-1. Además de que PI3-K ha sido reconocido como un mediador importante 
en la transducción de señales intracelulares de diferentes funciones celulares, 
incluyendo la proliferación celular, mediando vías de señalización mitógenas 
(Zhang et al, 2005) 
 
KCC3 
Tiene 77% y 73% de identidad con KCC1 y KCC2 respectivamente. Este nuevo 
gen fue localizado en el cromosoma humano 15q13-14 y se expresa en diversos 
tejidos como cerebro, riñón e hígado. Existen dos isoformas, una larga 
correspondiente a KCC3a y otra corta o KCC3b. 
El análisis de Northern blot mostró que KCC3a se expresa en cerebro, riñón, 
músculo, pulmón y corazón, mientras que el transcrito de KCC3b es más 
abundante en riñón que en cualquier otro tejido. De manera interesante, existen 
diversos sitios potenciales de fosforilación para PKC dentro de los 51 aminoácidos 
presentes en KCC3a que no están presentes en KCC3b. 
 
Como se mencionó anteriormente, KCC3a y KCC3b difieren en lo largo y en la 
secuencia del dominio amino terminal debido a la existencia de dos exones 1 
alternativos, denominados 1a y 1b. Cuando son expresados en el sistema de 
ovocitos de X. laevis, ambas isoformas inducen un fuerte mecanismo de 
reabsorción de 86Rb+ dependiente de Cl- que fue observado sólo cuando los 
ovocitos fueron incubados en hipotonicidad. Las consecuencias funcionales de los 
dos diferentes exones 1 no han sido bien establecidas. 
La caracterización inicial de KCC3 fue realizada por Hiki et al. (1999) en KCC3b. 
Las investigaciones muestran que cuando las células HEK 293 se usaron como 
sistema de expresión, KCC3b fue funcional bajo condiciones isotónicas, poco 
activado por NEM pero sin activación por hinchamiento celular. Race et al. 
(1999) también usó células HEK 293 para expresar KCC3a clonado de una 
biblioteca de cDNAs de placenta humana y observaron una escasa activación 
bajo condiciones hipotónicas. Ellos realizaron un análisis de cinética del 
 21 
transportador iónico y obtuvieron un valor de Km de K+ y Cl- extracelular de 9.5 
± 1.4 y 51 ± 9 mM, respectivamente. La afinidad de K+ fue más baja que la que 
mostró KCC1 y similar a la de KCC2, mientras que la afinidad por Cl- fue 
significativamente diferente con respecto a los valores para KCC1 y KCC2 
(Gamba, 2005). 
Donadores de Oxido nítrico (NO) y la proteína cinasa G (PKG) estimulan la 
expresión del RNAm de KCC1 y KCC3 en células del músculo liso vascular (Di 
Fulvio et al, 2003). 
 
 
 
 22 
 
 
Características generales de KCC3 
 
Proteína/Nombre del gen en el 
humano 
KCC3/SLC12A6 
Tamaño (aa) 
 
1150 
Masa Molecular (kDa) 
 
KCC3a 127, KCC3b 122 
Distribución tisular y expresión 
celular 
Amplia 
KCC3a (larga) cerebro, riñón, músculo, 
pulmón y corazón. 
KCC3b (corta) riñón. 
SW480, A459, HeLa, SiHa, CasKi 
Cromosoma en el humano 
 
15q14 
Patología 
 
Síndrome de Andermann 
Características del ratón knockout Déficit sensorimotor, neuropatías 
periféricas 
Hipertensos 
Clonado 
 
Humano y ratón 
 
 
(De los Heros et al, 2006, Gamba 2005, Rust et al, 2006 y Uyanik et al, 2006).
23 
 
 
III. APOPTOSIS 
Aspectos generales 
El tipo de muerte celular conocido como apoptosis o muerte celular programada, es 
el proceso en el cual las células se autodestruyen sin desencadenar reacciones de 
inflamación ni dejar cicatrices en los tejidos. La apoptosis es por tanto considerada 
como una muerte natural fisiológica, resultando en un mecanismo de eliminación de 
células no deseadas, dañadas o desconocidas y que desempeña un papel protector 
frente a posibles enfermedades. 
Interesantemente, estas características de muerte celular que definen la apoptosis, 
no necesariamente ocurren en todos los tipos celulares.Sin embargo un rasgo 
universal de la apoptosis es la disminución del volumen celular. 
 
IV. PROLIFERACION 
Aspectos generales 
Una célula se reproduce llevando a cabo una secuencia ordenada de 
acontecimientos en los cuales duplica su contenido y luego se divide en dos. Este 
ciclo de duplicación y división, conocido como ciclo celular, es el mecanismo esencial 
mediante el cual todos los seres vivos se reproducen. 
En cada ciclo de división la célula tiene que replicar su ADN. La mayoría de las 
células también aumentan y duplican todo su contenido. Durante la fase M los 
cromosomas replicados se segregan (mitosis) en núcleos separados y la célula se 
divide en dos (por citocinesis). La otra parte del ciclo conocida por interfase es 
mucho más larga. Este período de crecimiento continuo comprende la fase S, en la 
cual tiene lugar la replicación del ADN, y dos lapsos de tiempo, las fases G1 y G2 
entre la fase S y la fase M. 
Durante la progresión del ciclo celular, la célula cambia constantemente de volumen: 
acumula sustratos en el citosol, las proteínas y el ADN son sintetizados por 
duplicado. El crecimiento celular, mitosis y la migración celular perturban el volumen 
24 
celular. Los cambios de volumen ocurren particularmente durante la fase G1/S y 
alrededor de la fase M (Kunzelmann, 2005 y Pucci et al, 2000). 
 
 
Factores que difieren entre apoptosis y proliferación: 
 
Apoptosis Proliferación 
 
Sustratos Sustratos 
Activación de receptores de muerte Exposición a suero 
Activación de caspasas Estimulación mitogénica 
[K+]i [K+]i 
pHi pHi 
Disminución celular Aumento celular 
Activación de canales Activación de canales 
Equilibrio de Ca2+ Oscilación de Ca2+ 
(Kunzelmann, 2005). 
 
V. Quimioterapia de enfermedades neoplásicas 
Aspectos generales 
Los fármacos para cáncer fueron descubiertos por medio de un largo análisis de 
químicos sintéticos y productos naturales contra tumores de sistemas animales, 
principalmente leucemias murinas. Los agentes descubiertos en las primeras dos 
décadas de quimioterapia del cáncer (1950-1970) interactúan con el ADN y sus 
precursores, inhibiendo la síntesis de material genético o causando daño irreparable 
al ADN. 
 25 
Es esencial entender la cinética del ciclo celular para utilizar agentes antineoplásicos. 
Muchos de los citotóxicos más potentes actúan dañando al ADN. Su toxicidad es 
mayor durante la fase S, o síntesis del ADN del ciclo celular, mientras que otros 
bloquean la formación del huso mitótico en la fase M. Estos agentes tienen actividad 
sólo contra las células que están en el proceso de división (Brunton et al, 2001). 
 
El fármaco utilizado en este estudio es: 
Cisplatino 
 
 
 
El cisplatino es utilizado en el tratamiento de muchas maligniscencias que incluyen 
cáncer de testículo, ovario, vejiga, cervicouterino, cabeza, nuca y pulmón. 
El cisplatino es una molécula relativamente polar y es dependiente de 
transportadores de membrana específicos (Huang y Sadée, 2006). 
Una vez que entra en la célula, la concentración de cloro baja a ≈ 20 mM y el 
fármaco pasa por una hidratación para formar especies activas cargadas 
positivamente que posteriormente interaccionan con nucleófilos celulares. 
Muchos componentes celulares que tienen sitios nucleofílicos como el ADN, ARN, 
proteínas, fosfolípidos de membrana, microfilamentos del citoesqueleto y moléculas 
que contienen grupos tiol reaccionan con el cisplatino. Aproximadamente el 1% del 
cisplatino intracelular interacciona con el ADN nuclear formando una variedad de 
aductos como los siguientes: 
 
 26 
 
Fig 4. Aductos formados en la 
interacción de cisplatino con el ADN. 
a) intercatenarios 
b) 1-2 intracatenarios 
c) 1-3 intracatenarios 
d) Proteína - ADN 
Estos aductos distorsionan el ADN 
induciendo pérdida de la estabilidad de 
la doble hélice. 
 
 
 
Por lo tanto, el cisplatino se une al ADN mitocondrial, interactúa con los fosfolípidos 
y fosfatidilserina en la membrana, interrumpe el citoesqueleto y afecta la 
polimerización de actina. 
El cisplatino arresta el ciclo celular específicamente en la fase G2 y M de varios tipos 
celulares en proliferación. El mecanismo citotóxico principal del cisplatino es el daño 
el ADN y una subsiguiente inducción de apoptosis (Bortner, 2005, González et al, 
2001 y Wang y Lippard, 2005). 
 
VI. Esferoides Tumorales Multicelulares 
Aspectos generales 
En la investigación biomédica el cultivo tradicional in vitro de células cancerosas en 
monocapa (cultivos bidimensionales), ha brindado una enorme gama de resultados 
con respecto al comportamiento y respuesta celular a diversos agentes terapéuticos. 
Sin embargo, dichos resultados son muchas veces contradictorios cuando se escalan 
a nivel clínico. A diferencia de los tumores, los cultivos en monocapa son 
esencialmente homogéneos en cuanto al estado nutricional, tensión de oxígeno, 
estado proliferativo, pH y eliminación de productos de desecho. La estructura 
 27 
tridimensional nativa de los carcinomas gobierna numerosas interacciones 
autócrinas y parácrinas relacionadas a la progresión del tumor. Estas interacciones 
no pueden ser recreadas en el modelo de cultivo en monocapa, en donde los 
contactos célula-célula están disminuidos y pierden la heterogeneidad asociada con 
un tumor sólido. Este problema se ha resuelto, en parte, con el uso de nuevos 
modelos en cultivo que semejan la intrincada y compleja red tridimensional de las 
células en un organismo. Holtfreter, al final de la década de los setenta y 
posteriormente Moscona, instrumentaron el cultivo celular tridimensional de 
fibroblastos de ratón. Posteriormente, Sutherland los utilizó en la evaluación de la 
eficacia de fármacos terapéuticos utilizando células humanas de cáncer. 
Estos cultivos, denominados esferoides tumorales multicelulares (MTS, del inglés: 
Multicellular Tumor Spheroids), tienen una complejidad intermedia entre los cultivos 
bidimensionales in vitro y los tumores sólidos in vivo. Los MTS presentan una 
compleja red organizada con interacciones tridimensionales célula-célula y célula-
matriz extracelular (uniones tipo Gap, desmosomas y E-caderina, principalmente), 
por lo que cada célula individual está expuesta a diferentes condiciones de espacio y 
de disponibilidad de nutrientes (Gallardo et al, ). 
 
VII. VIA DE NF-KB 
Aspectos generales 
Desde hace 20 años del descubrimiento del factor nuclear kB (NF-kB) se han 
establecido una serie de paradigmas en base a su función. Estas incluyen un papel 
clave en la respuesta inflamatoria e inmune. Dentro de estos contextos, NF-kB 
estimula la función celular inmune y actúa de manera proinflamatoria induciendo la 
expresión de citocinas, quimiocinas y sus receptores. Sin embargo, cuando es 
activado en este contexto, NF-kB inhibe la muerte celular programada estimulando 
la transcripción de genes antiapoptóticos. Estos aspectos acerca de la función de 
NF-kB son indudablemente centrales para el entendimiento del comportamiento de 
esta familia de factores de transcripción, y además también proveen una base para 
la intervención terapéutica de enfermedades inflamatorias y cáncer basadas en la 
 28 
inhibición de NF-kB. Sin embargo, los análisis sobre la función de NF-kB revelan un 
esquema mucho más complejo. NF-kB aparentemente muestra comportamientos 
contradictorios. Por ejemplo muchos estudios puntualizan una función promotora de 
tumores para las subunidades de NF-kB, y también existen evidencias para 
funciones supresoras de tumores (Perkins y Gilmore, 2006). 
La familia de NF-kB (o Rel) consiste en cinco miembros, incluyendo p65 (RelA), c-
Rel, RelB, p50 y p52. Estos se caracterizan por tener en su dominio amino terminal 
de aproximadamente 300 aminoácidos un dominio de homología Rel (RHD), el cual 
incluye dominios de unión al ADN, de dimerización y señal delocalización nuclear 
(NLS). Las proteínas de NF-kB se presentan como homodímeros o heterodímeros. 
Tres miembros, p65, c-Rel y RelB contienen un dominio de transactivación (TAD) en 
la región carboxilo terminal que se requiere para la activación transcripcional, pero 
la TAD esta ausente en los otros dos miembros p50 y p52 y por lo tanto el 
homodímero p50:p52 funciona como un represor de NF-kB. p50 y p52 son 
codificados como precursores de p105 y p100 y corresponden a la mitad del dominio 
amino terminal de estos precursores respectivamente (Xiao, 2004). 
La composición del dímero NF-kB puede variar dependiendo el tipo celular, la 
naturaleza del estímulo o el lapso de tiempo después de la exposición inicial al 
estímulo. Dado que las subunidades de NF-kB son expresadas en todos los tipos 
celulares y existen cientos de activadores, el número de contextos diferentes en los 
cuales un dímero de NF-kB puede inducirse es enorme. Por lo tanto, las funciones 
del complejo NF-kB pueden variar dependiendo del contexto en el que se encuentre 
(Perkins y Gilmore, 2006). 
La familia de los inhibidores de kB (IkB) están agrupados de acuerdo a su homología 
estructural, en gran parte por sus contadas repeticiones de ankirina las cuales son 
esenciales para la actividad IkB y la unión al RHD de las proteínas de NF-kB, y 
consiste en siete miembros: IkBα, IkBβ, IkBγ, IkBε, Bcl-3, p105 y p100. El número 
de repeticiones de ankirina varía de cinco (IkBα), a seis (IkBβ) y siete (IkBγ, IkBε, 
Bcl-3, p105 y p100). Con la excepción de Bcl-3, que contiene un dominio de 
transactivación (TAD) y es funcional en núcleo, todos los otros miembros de la 
 29 
familia de los IkB carecen de TAD y son funcionales en el citoplasma. p105 y p100 
son los precursores de p50 y p52, respectivamente. 
 
 
 
 
 
Fig 5. Miembros de la familia de NF-kB e IkB (Xiao, 2004). 
 30 
 
Vía de activación canónica de NF-kB 
La activación rápida y translocación nuclear de NF-kB citoplásmico que sigue 
después de la degradación de su inhibidor IkBα como resultado de la fosforilación de 
la IkBα por la actividad del complejo IkB cinasa (IKK), es a menudo referido como 
vía clásica o canónica. 
En esta vía, el complejo IKK consiste primariamente de dos subunidades cinasas 
catalíticas (IKKα y IKKβ) y múltiples copias de una subunidad regulatoria, IKKγ, la 
cual es requerida para la integración de la señal de las cinasas y proteínas asociadas 
al receptor. La activación de la vía canónica ocurre en respuesta a citocinas 
inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral (TNF-α) y la interleucina-1, 
comprometiendo a los receptores de células-T y en respuesta a infecciones 
bacterianas y exposición a agentes tales como lipopolisacaridos (LPS). Estos 
estímulos inducen una serie de modificaciones de los componentes del complejo 
IKK, que incluyen ubiquitinación y fosforilación de IKKγ y fosforilación de dos 
residuos de serina en IKKβ. IKKβ entonces fosforila a IkBα la cual se ubiquitiniza y 
es degradada en el proteasoma. La liberación del dímero NF-kB permite su 
translocación al núcleo, su unión a la secuencia kB y transcripción de genes. 
Vía de activación no canónica de NF-kB 
Algunos activadores de NF-kB, tales como la estimulación de CD40 y el receptor de 
linfotoxina-β, factor activador de células-B de la familia TNF y lipopolisacáridos 
activan la vía no canónica o alternativa de NF-kB. La vía no canónica procede vía 
activación de la cinasa activadora de NF-kB (NIK), el cual a su vez activa a un 
dímero IKKα, el cual entonces fosforila a la subunidad de NF-kB p100 (NF-kB2) 
induciendo su proceso proteolítico a p52. El carboxilo terminal de p100 contiene las 
repeticiones de ankirina que se encuentran en las proteínas IkB que funcionan como 
señal de localización citoplásmica. El proceso de p100 a p52 resulta en la activación 
del complejo que contiene esta subunidad, el cual en muchas circunstancias consiste 
en el heterodímero p52/RelB. Diferentes combinaciones de subunidades de NF-kB 
 31 
pueden traslaparse pero difieren en su especificidad de unión al ADN. El 
heterodímero p52/RelB tiene como blanco elementos distintos a kB. De esta 
manera, el estímulo que activa ambas vías canónica y no canónica permite 
diferentes mezclas de las subunidades del complejo NF-kB, resultando en la 
activación de un espectro diferente de promotores y amplificadores (Perkins y 
Gilmore, 2006). 
 
 
 
 32 
 
Fig 6. Vías que permiten la activación de NF-kB (Xiao, 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 33 
B. Alternative NF-K B pathway (Non-ca nonical pa thwoy) 
Cytokines 
LT ~ U. ll,H F/Hl~·s and C D.iOL 
Jq_l 
IKKd 
E pi 
e,, 
~ 
c. 
o -;.., 
u 
';;l N ..., ,r, 
~ lKB ~ 
Cytokinl'S: BA 1-'l-'/ BI~ < 
Chcmokin(', : BLC, SLC, Sn F- 1, El .C 
l,ymphoid Or~uno~cnes i~ Gcnl"'II : l' NAd, Gly(AM· l 
 
 
 
JUSTIFICACION 
La proliferación celular y apoptosis son dos procesos determinados por la 
homeostasis celular. Una de las características de la biología celular tumoral es el 
fracaso del control del ciclo celular o la pérdida de la inhibición de división por 
contacto. Las células tumorales pueden proliferar ilimitadamente; por lo tanto, la 
inhibición de la proliferación inhibe la tumorigénesis. 
KCC3 se expresa en células de cáncer y se ha reportado que modifica la 
proliferación e invasión celular, pero no se sabe si tiene efecto sobre otros procesos 
implicados en cáncer como resistencia a antineoplásicos y apoptosis por lo que en 
este proyecto se investigó la participación de este cotransportador en la capacidad 
clonogénica y sensibilidad a apoptosis de células de cáncer HeLa, por medio de una 
secuencia antisentido, la cual promete ser una terapia útil para vencer la resistencia 
tumoral a diferentes fármacos (Vidal et al, 2005). 
 
 
ANTECEDENTES 
Debido a las múltiples funciones fisiológicas de los KCCs en el riñón, SNC y otros 
órganos, se ha propuesto que la variación en la función o expresión de estos genes 
está relacionada en la patofisiología humana (Gamba, 2005). 
No existen reportes realizados en la línea celular de cáncer cervicouterino HeLa, sin 
embargo en SiHa los reportes demuestra la participación que KCC3 pudieran tener 
en la regulación de la proliferación e invasión de células tumorales. Estas células 
usualmente tienen un metabolismo, mitosis, proliferación y migración acelerada 
comparada con las células normales, todos estos procesos biológicos tienen efectos 
sobre la homeostasis del volumen celular. Bajo esta observación, Shen et al. 2000 
analizaron la actividad y expresión de KCC3 en varios tipos celulares epiteliales 
cervicales humanos con diferente grado de potencial tumorigénico. Ellos observaron 
 34 
que el KCC3 de las células epiteliales de cervix humano normales se encontraba 
poco activo en condiciones fisiológicas normales y su actividad aumentaba en un 
5% ante un estrés hipotónico. Sin embargo, la magnitud de la expresión de KCC3 en 
células de cáncer cervical SiHa fue significativamente mayor ante los cambios 
hipotónicos. Utilizaron oligonucleótidos específicos para transcribir el ARNm de 
KCC3, lo identificaron por RT-PCR y confirmaron por digestión, lo que indica que la 
carcinogénesis cervical está acompañada de la sobreexpresión del ARNm y el 
incremento de la actividad de KCC3. Además observaron que al inhibir a KCC3 con 
inhibidores de fosfatasas, también inhiben el proceso de RVD y al poner inhibidores 
de cinasas estimularon la activación de KCC3. Por lo tanto, concluyen que KCC3 
juega un papel muy importante en la regulación del volumen de células de cáncer 
cervicouterino y que su actividad es modulada por una cascada de fosforilación. Y 
proponen que este tipo de cotransportador trabaja sinérgicamente con una red de 
sistemas encargados de regular el volumen en células de cáncer cervicouterino 
humano. 
PosteriormenteShen et al. 2001 decidieron estudiar los mecanismos moleculares y 
celulares de la regulación y función de KCC3 en células tumorales, utilizaron como 
sistema de expresión la línea celular NIH/3T3 7-4 establemente transfectada con 
cDNA de KCC3. Observaron que en células de endotelio vascular el ARNm de KCC3 
es sobreexpresado bajo el estímulo del factor de crecimiento endotelial vascular y 
que las células transfectadas proliferaban más que las normales, además que el 
ácido alkanoico (DIOA; un inhibidor de KCC) inhibía este efecto. Analizaron por 
citometría de flujo si KCC3 realmente tenía algún efecto sobre el ciclo celular y 
encontraron que un 33% de las células transfectadas con KCC3 estaban en la fase 
G2/M y un 15% las tratadas con DIOA. Al mismo tiempo, estudiaron la fosforilación 
de las cinasas Rb y cdc2, dos reguladores que controlan la progresión del ciclo 
celular por medio de los puntos de restricción de la fase G1 a S y de G2 a M, 
respectivamente, en las células transfectadas con KCC3 la fosforilación de Rb 
aumentó y la de cdc2 disminuyó y lo contrario en las tratadas con DIOA. Por lo 
 35 
tanto concluyen que KCC3 participa de una manera importante en la regulación de 
la progresión del ciclo celular. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 36 
 
HIPOTESIS 
 
Si KCC3 participa en la evasión de apoptosis de células HeLa entonces su 
inhibición sensibilizará a las mismas a este tipo de muerte ante agentes 
antineoplásicos. 
 
 
 
Objetivo general 
 
Determinar el efecto de KCC3 en la sensibilidad a apoptosis en células HeLa. 
 
 
Objetivos particulares 
 
1. Determinar la expresión de KCC3 en células HeLa. 
 
2. Inhibir los niveles de KCC3 en células Hela por medio de antisentido. 
 
3. Determinar la participación de KCC3 en la proliferación y capacidad 
clonogénica. 
 
4. Analizar el efecto de KCC3 en la apoptosis inducida con cisplatino. 
 
5. Estudiar el efecto de KCC3 en cultivos tridimensionales multicelulares. 
 
6. Analizar la participación de NF-kB en las células con KCC3 antisentido. 
 
 
 37 
 
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 
 
Estrategia experimental general 
 
La expresión de KCC3 en células de cáncer cervicouterino HeLa fue determinada por 
la técnica de RT-PCR. 
Con la finalidad de analizar el efecto de KCC3 se utilizó una secuencia antisentido, la 
cual fue clonada en vectores que permitieron su expresión en células de cáncer 
cervicouterino HeLa. 
Para estudiar la participación de KCC3 en la proliferación se cultivaron células HeLa 
y HeLa-KCC3 antisentido a un 10% de confluencia y al tercer día de cultivo se midió 
su viabilidad celular con tinción de cristal violeta. En cuanto a su capacidad 
reproductiva se realizó un ensayo de clonogenicidad en ambas líneas celulares antes 
mencionadas. 
Con la finalidad de determinar su sensibilidad a apoptosis se utilizó cisplatino como 
inductor de este tipo de muerte, para lo cual las células fueron sembradas a un 50% 
de confluencia y 18 h después del estímulo se midió su viabilidad celular con tinción 
de cristal violeta. 
Posteriormente para estudiar la participación de KCC3 en la formación de esferoides, 
se realizaron cultivos tridimensionales. 
Y finalmente para analizar la participación de NF-kB en estas células, se realizaron 
ensayos de Western blot para IkBα y Bcl-3 en ambas líneas. 
 
 
 
 
 
 
 
 38 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Clonación en vectores de expresión 
para células de mamífero 
 RT/PCR: 
Amplificación del cDNA 
que codifica para KCC3 
Transfección de KCC3 antisentido en 
células HeLa 
Análisis de 
proliferación 
Ensayo de sensibilidad a 
apoptosis inducida por 
cisplatino 
Estudio de 
clonogenicidad 
Estudio en cultivos 
tridimensionales 
Análisis de 
NF-kB 
Extracción de RNAm de células HeLa 
 
 
Fig 7. Diagrama de flujo de la estrategia experimental. 
 
 39 
I. Expresión de KCC3 en células HeLa 
Para analizar la expresión de KCC3 en células HeLa, se realizó la técnica de RT/PCR. 
La extracción de RNA se realizó con la técnica de TRIZOL, de GIBCO BRL. Número 
de catálogo 15596. Las células se lisó directamente del cultivo, para lo que se 
adicionó 1 ml de Trizol y 200 µl de cloroformo, se agitó vigorosamente por unos 
segundos y se incubó durante 10’ a 4°C, posteriormente se centrifugó a 8000 rpm 
durante 10’ a 4°C, donde se formaron dos fases, la inferior (fenol-cloroformo) de 
color rosa y la superior incolora acuosa que contenía el RNA. 
La fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo donde se precipitó con isopropanol 
durante 10’ a 4°C, se centrifugó a 8000 rpm durante 20' a 4°C, se lavó con etanol al 
70%, y se resuspendió en 20-40 µl de agua DEPC (libre de RNAsas). Para 
determinar su concentración se cuantificó a una absorbancia de 260/280 nm en un 
espectrofotómetro (Jenway Genova). 
 
RT 
Para analizar el transcrito de KCC3, se realizó la técnica de conversión de RNA a 
cDNA mediante retrotranscripción con la enzima transcriptasa reversa, seguida de la 
amplificación del cDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa con 
oligonucleótidos específicos, se realizó un ensayo semicuantitativo y se utilizó un 
termociclador (Mastercycler personal, eppendorf). 
La retrotranscripción se realizó de a cuerdo al Kit ThermoScript RT-PCR System. 
Invitrogen. Número de catálogo 11146-016. 
Se utilizó 5µg de RNA, 0.5 µl de oligonucleótido dT, 0.5 µl de dNTPs y se aforó a 5 
µl con agua DEPC. Se incubó durante 5’ a 65°C, se adicionó 1 µl de buffer para RT 
10X, 2 µl de Mg, 1 µl de DTT y 0.5 µl de RNAsa OUT, se incubó durante 2’ a 42°C y 
se adicionó 0.5 µl de RT, posteriormente se incubó durante 50’ a 42°C y 15’ a 70°C, 
se adicionó 0.5 µl de RNAsa, se incubó durante 20’ a 37°C y se adicionó 10 µl de 
agua DEPC. 
 
 
 40 
 
PCR 
Una vez obtenido el cDNA, se utilizó oligonucleótidos específicos (5’ – 3’ GAC 
CTGSGTCAGAACTCCATCAC y 3’ -5’ GATTCCTTGAGTGCGTCATCACTG) para su 
amplificación mediante PCR. 
La PCR se realizó con el kit AmpliTaq Gold. Applied Biosystems. Número de catálogo 
L00027-01. 
La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen de 25 µl, el cuál 
contenía: 2.5 µl de buffer para PCR 10X, 2 µl de oligonucleótidos (uno sentido y el 
otro antisentido), 1 µl de dNTPs, 0.25 µl de enzima Taq, 0.5 µl de cDNA y se aforó a 
25 µl con agua estéril. Las condiciones de ciclaje para la amplificación de KCC3 
fueron: 30 ciclos de tres pasos cada uno; activación de la taq a 95°C – 10’, 
desnaturalización a 95°C – 30’’, alineamiento de oligonucleótidos a 55°C – 30’’ y la 
extensión a 72°C – 5’. Finalmente, el producto de PCR se analizó en un gel al 1% de 
agarosa en TAE 1X. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 41 
 
 
II. Clonación de KCC3 antisentido en el vector pLXSN 
 
A)
Ligación con pTZ57R/T
B)
Transformación
C)
Lisis alcalina
D)
Escalar cultivo y 
Extracción de 
plásmido
E)
Digestión
F)
Extracción de KCC3 de 
pTZ57R/T
G)
Purificación de KCC3
H)
Digestión de pLXSN
I)
Ligación con 
KCC3
J)
Transformación
K)
Escalar cultivo y 
Extracción de 
plásmido
A)
Ligación con pTZ57R/T
B)
Transformación
C)
Lisis alcalina
D)
Escalar cultivo y 
Extracción de 
plásmido
E)
Digestión
F)
Extracción de KCC3 de 
pTZ57R/T
G)
Purificación de KCC3
H)
Digestión de pLXSN
I)
Ligación con 
KCC3
J)
Transformación
K)
Escalar cultivo y 
Extracción de 
plásmido
A)
Ligación con pTZ57R/T
B)
Transformación
C)
Lisis alcalina
D)
Escalar cultivo y 
Extracción de 
plásmido
E)
Digestión
F)
Extracción de KCC3 de 
pTZ57R/T
G)
Purificación de KCC3
H)
Digestión de pLXSN
I)
Ligación con 
KCC3
J)
Transformación
K)
Escalar cultivo y 
Extracción de 
plásmido
 
Fig 8. Clonación del fragmento de KCC3 antisentido en el vector pLXSN (ver detallesen cada inciso). 
 
A continuación se describe la metodología de la clonación ilustrada en la Fig 8. 
A) Ligación de KCC3-pTZ57R/T 
Se utilizó 4 µl de un producto de PCR para KCC3, 3 µl del vector pTZ57R/T 
Fermentas InsT/AcloneTM PCR Product Cloning Kit, 3 µl de buffer de ligación 3X, 3 µl 
de PEG, 1 µl de T4 DNA ligasa, se aforó a 30 µl y se dejó toda la noche a 16°C. 
 
 42 
 
B) Transformación 
Se sembró 20 µl de bacterias competentes DH5α en 2 ml de medio C, se incubó 
durante 2 h a 37°C a 200 rpm, se recolectó por centrifugación y se lavó con 
solución-T (cantidades iguales de solución A + solución B), se resuspendió en 
solución-T, se adicionó 6 µl de ligación, se incubó durante 10’ a 4°C, después 
durante 45’’ a 42°, por último se plaqueó en LB con ampicilina 50 mg/ml y se incubó 
toda la noche a 37°C. 
Para la ligación y transformación se utilizó el Kit Rapid DNA Ligation and 
Transformation Fermentas. Número de catálogo 1432. 
 
C) Lisis alcalina 
Se realizó un análisis con lisis alcalina para comprobar que el plásmido realmente 
entró en las bacterias para lo cual se tomaron las colonias positivas para la 
transformación y se sembró en 1 ml de medio LB con ampicilina y se incubó durante 
toda la noche a 37°C a 200 rpm. 
Se guardaron alícuotas de 100 µl a temperatura ambiente y lo demás se centrifugó 
durante 10’ a 5000 rpm, se resuspendió en 25-50 µl solución desnaturalizante 
(Sambrook y Russell, 2001), se incubó durante 5’ a 37°C y 5’ a 4°C. Finalmente se 
centrifugó durante 5’ a 8000 rpm y se analizó en un gel al 0.8% de agarosa en TAE 
1X. 
Las colonias en las que el plásmido entró pesaban más y por lo tanto corrieron 
menos en el gel, bajo este criterio se seleccionaron las colonias. 
 
D) Escalar cultivo y extracción del plásmido 
Se tomó 50 µl de bacterias con vector, se sembraron en 50 ml de medio LB con 
ampicilina y se incubó durante toda la noche a 37°C a 200 rpm. 
Midiprep 
Se tomó una alícuota de 800 µl de este cultivo y se le adicioó 200 µl de glicerol al 
50% estéril y se guardó a -70°C. 
 43 
El resto se centrifugó durante 15’ a 3800 rpm a 4°C, se lavó con agua desionizada, 
se resuspendió en 180 µl de solución I (glucosa 50mM, tris-HCl pH 8.0 25mM, EDTA 
pH 8.0 10mM, esterilizado en autoclave y almacenado a 4°C) y se aforó a 720 µl, la 
solución se pasó a una caja petri de 65 mm sobre hielo y se adicionó 1500 µl de 
solución IIA (SDS 1% almacenado a temperatura ambiente) más 30 µl de solución 
IIB (NaOH 10N). Después se adicionó 1100 µl de solución III (60ml de acetato de 
potasio 5M, 11.5ml de ácido acético glacial y 28.5 ml de agua destilada, almacenado 
a 4°C) se agitó con la punta de la pipeta en círculos sin pipetear, se recolectó la fase 
acuosa y se adicionó 0.6 volúmenes de isopropanol, se incubó durante 10’ a 
temperatura ambiente, se centrifugó durante 10’ a 8000 rpm a 4°C y se elimino el 
sobrenadante. Se resuspendió en 600 µl de TE y 200 µl de LiCl 8M, se mezcló bien, 
se centrifugó durante 5’ a 10 000 rpm a 4°C y se recuperó el sobreanadante. 
Posteriormente se adicionó 600 µl de isopropanol, se mezcló bien y se centrifugó 
durante 5’ a 10000 rpm a 4°C, se desechó el sobrenadante y se lavó con etanol al 
70%. Se adicionó TE y RNAsa y se incubó durante 30’ a 37°C. Se adicionó 
cloroformo-fenol-isoamilico, se centrifugó y se tomó la fase acuosa, se adicionó 0.1 
volumen de acetato de sodio 3M y tres volúmenes de etanol al 100% e incubó 
durante 10’ a -20°C. Luego se centrifugó a 4°C, se desechó el sobrenadante, se lavó 
con etanol al 70% y se resuspendió en TE. Para determinar su concentración se 
cuantificó a una absorbancia de 260/280 nm en un espectrofotómetro (Jenway 
Genova). 
(Lisis alcalina con SDS: Midipreparación de a cuerdo a Sambrook J. and Russell D., 
2001.) 
 
E) Digestión de pTZ57/RT – KCC3 
Para analizar el sentido en el que el fragmento de KCC3 entró en el vector, el 
plásmido se digirió con enzimas de restricción y su orientación se determinó de 
acuerdo a los sitios de corte de la enzima. 
Se adicionó en un tubo eppendorf de 0.5 ml lo siguiente: 0.5 µg del plásmido, 3 µl 
de buffer 10X No.4, 0.5 µl de SmaI y se aforó a 30 µl con agua. Posteriormente se 
 44 
incubó durante 3 h a 25°C y se analizó en un gel al 1% de agarosa en TAE 1X 
donde se identificó los fragmentos de acuerdo al marcador de peso molecular de 
1kb. 
 
F) Extracción del fragmento de KCC3 de pTZ57R/T 
El fragmento de KCC3 se extrajo del vector pTZ57/RT con enzimas de restricción. 
Se adicionó en un tubo eppendorf de 0.5 ml lo siguiente: 3 µl de buffer 10X “2”, 1 µl 
de BamHI y 1 µl de EcoRI, 10 µg de plásmido y se aforó a 30 µl con agua. Se 
incubó durante 3 h a 37°C y se dejó toda la noche a temperatura ambiente. Por 
último se analizó en un gel al 1% de agarosa en TAE 1X donde se identificó el 
fragmento de KCC3 de acuerdo al marcador de peso molecular de 1kb. 
 
G) Purificación de KCC3 
Se corrió en un gel al 1% de agarosa en TAE 1X, marcador de peso molecular de 
100 pb, 3 y 27 µl de la digestión de KCC3-pTZ57R/T, se cortó la banda de KCC3 
donde se cargaron 27 µl evitando su exposición a luz U.V y se utilizó el carril donde 
se cargó 3 µl como guía. Se adicionó 3 volúmenes de la solución QXI, se agitó 
vigorosamente e incubó durante 10’ a 50°C, se agitó vigorosamente cada 2’. Se lavó 
con 30 µl de QXII, después con 500 µl de QXI y por último con 500 µl de PE, se 
dejó secar durante 30’ a temperatura ambiente, se lavó con agua y se recolectó el 
sobrenadante donde se encontraba el fragmento de KCC3. Finalmente se analizó en 
un gel al 1% de agarosa enTAE 1X para comprobar su purificación. 
Esta técnica se realizó de acuerdo al instructivo del QIAEX II Gel Extraction Kit 
(150). Número de catálogo 20021. 
 
H) Digestión de pLXSN 
El vector de expresión en células de mamífero pLXSN se digirió de la misma manera 
que pTZ57R/T-KCC3 como se indica en el inciso F. 
 
 
 45 
I) Ligación de KCC3 con pLXSN 
Una vez que se obtuvó el fragmento de KCC3 purificado y en antisentido se procedió 
a la ligación con el vector pLXSN de la siguiente manera: se adicionó 1 µl de buffer 
de ligación, 1 µl de T4 DNA ligasa, 100 µg del vector pLXSN, 10 µg del inserto de 
DNA (KCC3) y se aforó a 10 µl con agua. Se incubó toda la noche a 16°C. 
 
J) Transformación 
Posteriormente se transformaron bacterias competentes DH5α para introducir este 
plásmido, después se realizó un análisis de las colonias positivas para la 
transformación con la finalidad de verificar la introducción del plásmido. Esto se 
realizó de la misma manera que para KCC3-pTZ57R/T como se indica en el inciso B. 
 
K) Escalar cultivo y extracción del plásmido 
Se propagó las bacterias que contenían el plásmido y una vez que se extrajo por 
medio de midiprep se digirió con EcoRI y BamHI. 
 
III. Expresión de la construcción en células HeLa 
Mantenimiento del cultivo celular 
Las células epiteliales de adenocarcinoma de cervix HeLa fueron cultivadas en medio 
mínimo esencial Eagle con 5% de suero bovino fetal en una atmósfera de 5% de 
CO2 a 37°C. 
 
Transfección celular 
Se sembró 250 000 células en una caja petri de 35 mm, al día siguiente se tripsinizó 
y se sembró 25 000 células en una placa de 48 pozos, después de 24 h se agregó 
medio sin suero y solución de transferencia (1.8 µl de Escort, 28.75 µl de medio sin 
suero y sin antibiótico y 0.5 – 1 µg de DNA. Se pipeteó durante 15’ a temperatura 
ambiente), se dejó de 5-6 h, se lavó con medio y se adicionó suero. Al día siguiente 
se cambió medio nuevo y se adicionó geneticina, y finalmente se dejó durante 5 
días para obtener clonas estables. 
 46 
 
IV. Proliferación celular 
Se tripsinizó y se sembró 12500 células HeLa en 250 µl de medio por pozo en una 
placa de 48 pozos, se cultivó durante tres días y se determinó su viabilidad celular 
con tinción con cristal violeta. Se realizólo mismo para células HeLa con KCC3 
antisentido. 
 
Tinción con cristal violeta 
Las células se fijaron con etanol al 70% durante 10’ a -20°C, se adicionó 200 µl del 
colorante cristal violeta al 0.1% en etanol al 40% durante 10’ a temperatura 
ambiente, la placa se enjuagó en agua, se dejó secar y se adicionó 250 µl de ácido 
acético glacial al 33% y por último se leyó a 570 nm en placas de 96 pozos en el 
lector de ELISA. 
 
V. Clonogenicidad 
Se tripsinizó y se sembró 500 células HeLa en la mitad de una placa de 96 pozos con 
200 µl de medio por pozo. En la otra mitad se sembraron células HeLa con KCC3 
antisentido. Se realizaron diluciones seriadas y se cultivó durante 4 días. Al final se 
analizó su viabilidad celular con cristal violeta. 
 
 
 
HeLa-pLXSN 
 
 
 
HeLa- 
pLXSN/KCC3 ant 
 
 
 47 
VI. Apoptosis 
Se tripsinizó y se sembró 30000 células HeLa en 250 µl de medio por pozo en una 
placa de 48 pozos. Se realizó lo mismo para células HeLa con KCC3 antisentido. Al 
día siguiente se adicionó cisplatino 40 µM y 18 h después se determinó la viabilidad 
celular con cristal violeta. 
Para analizar la morfología nuclear de células apoptóticas se sembró 500 000 células 
en cajas petri de 35 mm con cubreobjetos en el interior, se les dio el estímulo 
apoptótico, se fijó con etanol al 70%, se lavó con PBS 1X, se adicionó 2 µl de RNAsa 
y se incubó durante 2 h a 37°C, posteriormente se adicionó 5 µl de bromuro de 
etidio durante 10’ a temperatura ambiente, se lavó con PBS 1X y se fijó en 
portaobjetos con PBS 1X – glicerol, se dejaron secar durante 30’ y finalmente se 
tomó una fotografía en el microscopio de fluorescencia. 
 
VII. Cultivos tridimensionales multicelulares 
Se sembraron 1 millón de células en placas de 60 mm cubiertas con agarosa al 1% 
disuelta en medio de cultivo sin suero conteniendo 1 ml de medio DMEM con 5% de 
SFB, se mantuvieron una semana a 37°C en cámara humidificada con 5% de CO2. 
Después se transfirieron las cajas a una incubadora orbital a 100 rpm, a 37°C. 
Se les realizó cambio de medio fresco suplementado con 5% SFB cada 24 horas. A 
los siete días se les tomó una fotografía. 
 
VIII. Extracción de proteínas 
Se raspó las células de la caja de cultivo, el botón se lavó con PBS 1X, se 
resuspendió en 300 µl de buffer A (Hepes pH 7.5 10 mM, MgCl2 2M, KCl 15 mM, 
EDTA 0.1 mM y EGTA 0.1 mM) y se incubó durante 10’ a 4°C. Después se adicionó 
15 µl de NP40 10%, se centrifugó durante 5’ a 5000 rpm y se tomó el sobrenadante 
(proteínas citosólicas). 
Posteriormente se resuspendió el botón en 200 µl de buffer C (Hepes pH 7.5 25 mM, 
NaCl 400 mM, EDTA 1 mM y glicerol al 20%), se incubó durante 30’ a 4°C, se 
centrifugó durante 5’ a 5000 rpm y se tomó el sobrenadante (proteínas nucleares). 
 48 
 
Proteínas de membrana 
Se raspó las células con 1 ml de medio, se centrifugaron durante 10’ a 8000 rpm a 
4°C, se lavó con PBS 1X, se lisó con 300 µl de buffer de lisis (Tris HCl pH 7.4 10 
mM, NaCl 50 mM, EDtA 5 mM, Tritón x 100 al 1% y SDS 25%), se incubó durante 5’ 
a 4°C, se centrifugó durante 10’ a 14000 rpm y se tomó el sobrenadante (proteínas 
de membrana). 
 
IX. Western blot 
El gel de poliacrilamida al 12% se corrió durante 1h a 150 volts, se transfirió 
durante 15’ a 15 volts en una cámara de transferencia semi-seca, se bloqueó 
durante 1 h con leche (1.25 gr de leche en 25 ml de TBS-Tween) y se incubó con el 
anticuerpo primario (IkBα - Oncogene, Bcl-3 – Santa Cruz Bootechnolgy sc-13038 o 
α-Tubulina – Santa Cruz Biotechnology sc-8035) durante toda la noche a 4°C. 
Después se lavó con TBS-Tween durante 1 h cada 15’, se agregó el anticuerpo 
secundario en leche durante 1 h a temperatura ambiente, se lavó con TBS-Tween 
(1000 µl de Tween en 1L de TBS 1X) durante 2 h cada 10’ y finalmente se reveló. 
A diferencia de los Western blot anteriores, para KCC3 se utilizó un gel de 
poliacrilamida al 7.5%, se transfirió durante 30’ a 15 volts y se utilizó el anticuerpo 
de Novus Biologicals H00009990-A01. 
 
Análisis estadístico 
Para evaluar si existen o no diferencias significativas, a los resultados se les aplicó 
un análisis de varianza de una vía, utilizando el método de Dunnett con el programa 
estadístico KaleidaGraph versión 3.6. 
 
 
 
 
 
 49 
RESULTADOS 
 
 
I. Expresión de KCC3 en células HeLa 
 
Para analizar la expresión de KCC3 en células HeLa se realizó un RT-PCR, para lo 
cual se utilizaron oligonucleótidos que generan un fragmento de 662 pb de KCC3, y 
como control de carga se amplificó el gen constitutivo de gliceraldehído fosfato 
deshidrogenasa. En la siguiente figura se puede observar que las células HeLa sí 
expresan KCC3. 
 
 
KCC3
GAPDH
662 pb
400 pb
KCC3
GAPDH
662 pb
400 pb
 
 
Fig 9. Expresión de KCC3 en células HeLa. Se extrajo ARN de células HeLa y se 
realizó la RT-PCR para detectar la expresión de KCC3. 
 
 
II. Clonación de KCC3 antisentido en el vector pLXSN 
 
Para realizar la clonación de KCC3 antisentido en el vector de expresión pLXSN se 
utilizó un producto de PCR de este gen, posteriormente se introdujo en un vector de 
amplificación (pTZ57R/T), el cual se digirió con la enzima de restricción SmaI y de 
acuerdo a los sitios de corte se comprobó el sentido del inserto, lo cual se corroboró 
en un gel de agarosa al 1% en TAE 1X con un marcador de peso molecular de 1kb. 
Posteriormente se extrajo el inserto (KCC3 antisentido) de este vector con EcoRI y 
BamHI para finalmente se insertó en el vector de expresión para células de 
 50 
mamífero (pLXSN) el cual se digirió previamente con las mismas enzimas con las 
que se sacó de pTZ57R/T. 
 
 
 
kcc3
3767 bp
SLC12A6FragmrentoA
kcc3
3767 bp
SLC12A6FragmrentoA
250 pb
3000 pb
163 pb
3385 pb
250 pb
3000 pb
163 pb
3385 pb
 
 
plxsnKCC3ANTISENTIDO
6550 bp
CDS 1
LTR 1
LTR 2
INSERTAR
KCC3ANTIDEPTZ
Misc Signal 1
Variation 1
 
 
ApaI (1826)
BamHI (2337)
EcoRI (1645)
XcmI (1875)
HindIII (2684)
Sac I (626)
Bam HI (1308)
Eco RI (616)
Xcm I (846)
Hin dIII (1344)
ptz57R/Tkcc3antisenbueno
3539 bp
insrtar
kcc3antisen
Fig 10. Clonación de KCC3 antisentido en pLXSN. Se amplificó un fragmento de 
662 pb de HeLa. Se clonó en pTZ57R/T y se digirió con SmaI. Fragmentos esperados 
 51 
en clona antisentido: 3385 y 163 pb. El inserto se liberó con EcoRI y BamHI. Finalmente 
se insertó en pLXSN. 
 
Para saber si realmente funcionaba el KCC3 antisentido, se realizó un Western blot de 
proteínas de membrana de células HeLa y de HeLa transfectadas con la secuencia 
antisentido de KCC3. Como control de carga se utilizó un gel teñido con azul de 
comassie y como se observa en la figura 11, la cantidad de proteína es muy similar y el 
Western blot muestra la disminución de KCC3. 
HeLa Wt KCC3- Wt KCC3-
122-127 KDa
HeLa Wt KCC3- Wt KCC3-
122-127 KDa
 
 
Fig 11. Western blot de KCC3. Se lisaron células HeLa y HeLa-KCC3 antisentido y 
se corrió un gel de poliacrilamida y se tiño con azul de comassie como control de 
carga (A), se corrió otro gel pero este si se transfirió y se reveló (B). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 52 
III. Morfología celular 
 
Una vez transfectadas las células HeLa con el antisentido de KCC3 se observó una 
morfología diferente comparadas con las transfectadas con el vector vacío. En la 
siguiente figura se muestra una fotografía de las dos líneas celulares con las que se 
trabajó, en la cual se observa un aumento en el tamaño y multinúcleos en las células 
con KCC3 antisentido. 
 
HeLa-KCC3 antisentidoHeLa-WT HeLa-KCC3 antisentidoHeLa-WT
 
Fig 12. Las células HeLa con el antisentido de KCC3 muestran una 
morfología diferente. Microscopía de luz invertida a 40X. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 53 
IV. Proliferación celular 
 
Para analizar la proliferacióncelular de las dos líneas en estudio, se sembró en cajas 
de 48 pozos a una confluencia de 10%, después de tres días de cultivo se realizó la 
técnica de cristal violeta. Como se muestra en la figura 12 se observa una 
disminución significativa en la proliferación de células con KCC3 antisentido. Las 
células con pLXSN-KCC3 antisentido tienen 69.7 ± 1.7 % de viabilidad celular. 
 
0
0.5
1
1.5
2
HeLa-WT HeLa-KCC3
V
ia
bi
lid
ad
 c
el
ul
ar
*
 
 
Fig 13. Disminución de la proliferación de células HeLa con antisentido de 
KCC3. Análisis de la proliferación celular por medio de la técnica de cristal violeta. 
Las células fueron cultivadas al 10% de confluencia y analizadas al tercer día de 
cultivo, se realizó una t-student con una p = 0.0002886. 
 
 
 
 
 
 
 54 
V. Clonogenicidad 
 
Para saber si KCC3 afectaba la capacidad reproductiva de las células se realizó un 
ensayo de clonogenicidad en el cual se evaluó la capacidad de las células de crecer 
en un medio adverso, debido a que se siembran en diluciones seriadas y esto hace 
que vaya disminuyendo el número de células conforme avanzan las diluciones 
entonces las células crecen a muy baja confluencia y sin la influencia de secreciones 
por parte de células adyacentes. Después de 5 días de cultivo se determinó su 
viabilidad con la técnica de cristal violeta. Como se muestra en la figura 13 las 
células con KCC3 antisentido tienen una disminución significativa en su capacidad 
proliferativa en comparación con las control lo que se puede observar en las 
primeras seis columnas analizadas por densitometría. Las columnas 8-11 no 
mostraron una diferencia significativa por densitometría así que se contaron las 
colonias y se observó una diferencia aunque no fue significativa. 
Al observar que la clonogenicidad se veía afectada por KCC3, se analizó también la 
sensibilidad a apoptosis de estas células. 
 
H
eLa w
t 
H
eLa KC
C
3ants
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
H
eLa w
t 
H
eLa KC
C
3ants
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
H
eLa w
t 
H
eLa KC
C
3ants
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
 
 
 
 
 55 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 9 10 11 12 8 9 10 11 12 8 9 10 11 12 
Fig 14. Disminución de la clonogenicidad de células HeLa con KCC3 
antisentido. Las células HeLa fueron cultivadas durante 4 días y posteriormente 
fueron procesadas con cristal violeta. Fueron analizadas por densitometría y se les 
 56 
realizó un análisis estadístico. Se determinó el número de colonias y los datos fueron 
graficados. 
 
VI. Apoptosis 
 
Para confirmar que la muerte celular que se observó en estas células realmente 
fuera apoptosis, se realizó la técnica de tinción nuclear con bromuro de etidio, para 
lo cual se sembró células a 40% de confluencia en cajas petri de 35 mm con un 
cubreobjetos en el interior, se trataron con cisplatino 40 µM y después de 18 h se 
fijó con etanol al 70%, se trató con RNAsa y se tiñó con bromuro de etidio (este 
agente se intercala entre los pares de bases y es el responsable de la fluorescencia 
del núcleo) y finalmente se observaron al microscopio de fluorescencia. En la figura 
14 se observan fotografías de estas tinciones nucleares, donde se aprecia la 
fluorescencia en los núcleos tratados con cisplatino, lo que nos indica que estas 
células están muriendo por apoptosis debido a que la condensación nuclear es una 
de las principales características de la apoptosis y por tal condensación el núcleo 
fluórese. 
 
 
 
 57 
Testigo Tratadas
HeLa
HeLa-KCC3
Testigo Tratadas
HeLa-WT
Testigo Tratadas
HeLa
HeLa-KCC3
Testigo Tratadas
HeLa-WT
 
Fig 15. Morfología nuclear de células apoptóticas. Fotografías de microscopía 
de fluorescencia 40X de células apoptóticas tratadas con cisplatino 40 µM a las 18 h, 
y teñidas con bromuro de etidio. 
 
Para analizar el efecto de KCC3 antisentido en la sensibilidad a apoptosis se utilizó 
cisplatino como inductor de este tipo de muerte celular, para lo que se sembró 
células a un 20% de confluencia, al día siguiente se adicionó cisplatino 40 µM 
(concentración a la cual se alcanza al IC50 en esta línea celular) y después de 18 h 
se determinó la viabilidad celular con cristal violeta. En la figura 15 se observa que 
las células con KCC3 antisentido tienen una mayor sensibilidad a apoptosis por 
cisplatino. Las células WT o con el vector vacío tenían un 45.17 ± 4.73 % de 
viabilidad celular mientras que las células con KCC3 antisentido solo un 27.64 ± 2.58 
%, lo cual indica que KCC3 esta participando de alguna manera en la sensibilidad a 
apoptosis inducida por este antineoplásico. 
 58 
0
20
40
60
80
100
120
Testigo HeLa-WT HeLa-KCC3
%
 V
ia
bi
lid
ad
 c
el
ul
ar
*
*
 
Fig 16. Participación de KCC3 en la sensibilidad a apoptosis por cisplatino 
en células HeLa. Análisis de sensibilidad a apoptosis por medio de la técnica de 
cristal violeta. Las células fueron cultivadas al 40% de confluencia y tratadas con 
cisplatino 40 µM por 18 h. Los datos se normalizaron respecto a sus controles. La 
diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0.0001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 59 
VII. Cultivos tridimensionales multicelulares 
 
Una vez que se determinó que KCC3 participaba en la sensibilidad a apoptosis de 
células HeLa, se analizó su participación en la formación de esferoides, para lo cual 
se realizaron cultivos tridimensionales multicelulares de ambas líneas celulares y 
como se observa en la figura 16, las células con el antisentido de KCC3 mostraron 
un menor tamaño de esferoides lo cual nos indica que KCC3 es importante para la 
formación de tumores de células HeLa. 
 
 
Fig 17. Disminución de crecimiento en cultivo tridimensional de HeLa-KCC3 
antisentido. Microscopia de luz (40X) de esferoides de células HeLa (A) y HeLa-
KCC3 antisentido (B). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 60 
VIII. NF-kB 
 
Para analizar la participación de KCC3 en la vía de señalización de NF-kB, se sembró 
células con KCC3 antisentido y WT, una vez que se llegó al 100% de confluencia se 
lisó y se extrajo proteínas citosólicas y nucleares, para posteriormente realizar 
ensayos de Western blot para IkBα y Bcl-3 y así determinar si NF-kB estaba 
involucrada en los efectos de KCC3 relacionados a la carcinogénesis de células HeLa. 
En la figura 17 se observa una mayor expresión de IkBα en citoplasma y núcleo de 
células con KCC3 antisentido y que Bcl-3 se expresa más en citoplasma de células 
con KCC3 antisentido mientras que en núcleo no se observó diferencia. 
 
Bcl-3
α-Tubulina
IkBα
A B C D
Bcl-3
α-Tubulina
IkBα
Bcl-3
α-Tubulina
IkBα
Bcl-3
α-Tubulina
IkBα
A B C D
 
 
Fig 18. Expresión de NF-kB. Análisis de IkBα y Bcl-3 en células HeLa y HeLa con 
KCC3 antisentido por Western blot, A- proteínas citosólicas de HeLa, B- citosólicas 
de HeLa-KCC3 antisentido, C- proteínas nucleares de HeLa y D- nucleares de HeLa-
KCC3 antisentido. 
 
 
 
 
 
 
 
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DISCUSION 
Las células de cáncer usualmente tienen un metabolismo, mitosis, proliferación y 
migración acelerados, estas actividades perturban significativamente la homeostasis 
del volumen celular. El mantenimiento del volumen celular es una propiedad 
fundamental de las células de mamíferos, y todas las células poseen mecanismos 
para regular su volumen durante cambios osmóticos. Por lo tanto, se ha propuesto 
que algunos mecanismos benéficos para el crecimiento y la metástasis son 
desarrollados durante el proceso de transformación maligna (Shen et al, 2000). 
Nosotros estamos interesados en estudiar la participación de KCC3 en