Validacion-de-un-metodo-analtico-por-cromatografa-de-lquidos-de-alta-resolucion-clar-para-determinar-carbamazepina-en-plasma-y-su-comparacion-con-la-determinacion-por-cmia

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 FACULTAD DE QUÍMICA 
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR 
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA 
RESOLUCIÓN (CLAR) PARA DETERMINAR 
CARBAMAZEPINA EN PLASMA Y SU 
COMPARACIÓN CON LA DETERMINACIÓN POR 
CMIA 
TESIS
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 
 PRESENTA: 
 OSCAR GUERRERO GARDUÑO 
 MÉXICO, D.F. AÑO 2014 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
PRESIDENTE: M. en C. LAURO MISAEL DEL RIVERO RAMÍREZ 
VOCAL: M. en C. LOURDES BEATRIZ MAYET CRUZ 
SECRETARIO: Dra. NELLY NORMA CASTRO TORRES 
1er. SUPLENTE: M. en F. LUIS JESÚS GARCÍA AGUIRRE 
2° SUPLENTE: M. en C. KENNETH RUBIO CARRASCO 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO DE NEUROPSICOFARMACOLOGÍA 
INSTITUTO NACIONAL DE NEUROLOGÍA Y NEUROCIRUGÍA 
‘MANUEL VELASCO SUÁREZ’ 
ASESOR DEL TEMA: 
Dra. Nelly Norma Castro Torres ___________________________________
SUSTENTANTE: 
Oscar Guerrero Garduño _______________________________________
Agradecimientos: 
Con especial agradecimiento y dedicatoria por todo lo que soy al Ing. León 
Guerrero, mi padre. Te amo papá. 
A mi mamá y papá por ser la columna vertebral en mi formación tanto 
académica como personal, por los valores inculcados, por lo mismo estaré 
eternamente agradecido con ustedes. A mi familia. Los amo. 
A mi tía María por su apoyo en este trabajo como también lo ha sido en mi vida.
 A mi hermana, por soportar y/o aguantar mis arranques y forma de ser, pero 
aunque no lo sepas has sido mi modelo a seguir, es por eso que critico lo que 
pensaba no podría llegar. Te quiero. 
A mis amigos que me han acompañado desde hace mucho, Fermín, 
Elizabeth, Tania; amigos de toda la vida, Felipe, Bernardo, Uriel, Rosa María, Paola, 
Juan Carlos; aquellos amigos y amigas que tuve oportunidad de conocer en la 
Facultad de Química, por mencionar algunos: Josué, César, Manuel, Karina Y., Paty 
A.S., Ana María, Karina, Diana K., Ana Valeria, Blanca, Wendy, Maggie, Perla, 
Rubén, Norma, Karen, Erika J., Ivette, Janet, Lupita Medrano, Lupita Antonio, 
Nancy, mi gran ‘maiga’ Maricela (you know what i mean), Eli Yau, Pamela, Rosa J., 
Rosa Marina, Sayra Y., Viridiana, Mónica, Úrzula, Yeni, Psic. Beatriz Vázquez S., de 
todos ustedes, más los que seguramente me faltaron, me llevo el haberles conocido 
y aprendido de ustedes. 
A mis amigas de diversas facultades de la UNAM y otras universidades que 
tengo la oportunidad de conocer y tratar, Adriana y María Ramos Aguilar, Mahlí 
Jetzemani, Paola X., Yohevana. 
Muchísimas gracias por estar en el momento adecuado. 
A mis profesores durante la carrera, que aunque me fue pesada, sí se pudo: a 
la Dra. Perla Castañeda, a la QFB Lupita por apoyarme, a la Dra. Elia Brosla 
Naranjo Rodríguez, la profesora Honoria, al Dr. Fausto, a la profesora Georgina 
Maya Ruiz, M.C. Socorro Alpizar, por mencionar algunos. 
¡¡¡Gracias por sus conocimientos y sus palabras!!! 
Al laboratorio de Neuropsicofarmacología del Instituto Nacional de Neurología y 
Neurocirugía ‘Manuel Velasco Suárez’ por permitirme llevar a cabo en sus 
instalaciones este trabajo. 
A la Dra. Helgi por permitirme llevar a cabo mi tesis en el laboratorio a su cargo pero 
sobre todo por ser un modelo a seguir y a reconocer. ¡¡¡Muchas gracias!!! 
A la Dra. Nelly Norma Castro Torres a quien qué más puedo hacer si no es 
agradecerle la oportunidad de originar ésta tesis, de aceptarme en el protyecto, por 
entender y ayudarme a cambiar mis distracciones por atenciones, por las llamadas 
de atención, por enseñarme a ver lo que realmente es trabajar, y aunque falta 
mucho más por aprender sé que será increíble. 
 ¡¡¡Muchísisisisísimas gracias!!! 
A la Dra. Dinora González-Esquivel, por sus consejos, las pláticas literarias y otras 
más interesantes. ¡¡¡Gracias!!! 
A la Dra. Iliana González por sus sabias palabras, el conocimiento trasmitido cuando 
le preguntaba algo, incluso de los conciertos jajaja, las pláticas en el comedor fueron 
muy buenas. ¡¡¡Muchas gracias!!! 
A la Dra. Susana Rojas por insistirme a escribir la tesis en lugar de divagar en lo que 
hacía mientras el equipo funcionaba jeje, ¡¡¡Gracias!!! 
A la Dra. Francis, por regalar siempre una sonrisa al llegar al laboratorio, por 
alentarme a estar feliz a cada momento, que por lo mismo escribía chistes en el 
pizarrón del laboratorio. Igualmente le estoy agradecido. ¡¡¡Muchas muchas 
gracias!!! 
A mis amigos del laboratorio que aunque poco el tiempo yo los tengo y tendré 
presentes: Andrés, Rosa, Yadira, Nuria Lorena, Dayri, Cindy, Sebastián, Nayeli, 
Luisa y por supuesto al Sr. Héctor, gracias por hacer divertido el momento en el 
laboratorio. 
A Karina, Alberto así como Guillermo, por resolverme dudas e incluso llamarme la 
atención por algún descuido u olvido que cometiera, risas y breves pláticas 
musicales, invariablemente han sido parte de mi aventura llamada tesis dentro del 
laboratorio. Gracias. 
A la Facultad de Química de la gloriosa Universidad Nacional Autónoma de México 
por su formación, de ayudar a seguir moldeando mi forma de ser y de pensar, la 
conciencia trasmitida para así actuar en beneficio de este gran país que aunque 
herido profundamente por años, es nuestro hermoso México. 
‘La risa mejora al intelecto, la adversidad mejora al sentimiento, 
la insatisfacción mejora al deseo, la enfermedad mejora al alma.‘ 
‘Lo que doy, me lo doy. Lo que no doy, me lo quito. Nada 
para mí que no sea para los otros.’ 
Alejandro Jodorowsky 
 
Índice 
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 1
1.1 Epilepsia ........................................................................................................ 2 
1.2 Antiepilépticos ................................................................................................ 3 
1.3 Carbamazepina (CBZ) ................................................................................... 4 
 1.3.1 Propiedades físicas y químicas .............................................................. 4 
 1.3.2 Usos terapéuticos ................................................................................... 6 
 1.3.3 Farmacocinética ..................................................................................... 7 
 1.3.4 Farmacodinamia ..................................................................................... 9 
1.4 Inmunoanálisis quimioluminiscente de micropartículas (CMIA) ..................... 9 
1.5 Validación de métodos analíticos ................................................................. 13 
1.6 Métodos de cuantificación de carbamazepina ............................................. 14 
 1.6.1 Objetivos planteados ........................................................................... 15 
2. ESPECIFICACIONES PARA EL DESARROLLO EXPERIMENTAL ................. 16
2.1 Preparación de Soluciones .......................................................................... 18 
 2.1.1 Preparación de mezcla de extracción ................................................... 18 
2.2 Ensayo de curvas de calibración en metanol y plasma humano .................. 19 
 2.2.1 Diagrama de extracción ........................................................................20 
2.3 Descripción del método cromatográfico utilizado ......................................... 21 
2.4 Validación de métodos analíticos ................................................................. 21 
 2.4.1 Selectividad .......................................................................................... 21 
 2.4.2 Límite Inferior de Cuantificación (LIC) ................................................. 22 
 2.4.3 Curva de Calibración ........................................................................... 22 
 2.4.4 Precisión: Repetibilidad y reproducibilidad .......................................... 23 
 2.4.5 Exactitud .............................................................................................. 25 
 2.4.6 Estabilidad: pruebas a corto y largo plazo ........................................... 25 
2.5 Comparación entre métodos: CLAR y CMIA ................................................ 27 
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 29
Conclusiones ......................................................................................................... 45 
Bibliografía ............................................................................................................ 46 
1 
1. INTRODUCCIÓN
Uno de los requisitos primordiales para la implementación de un método analítico, es 
llevar a cabo su validación correspondiente con la cual se obtienen datos que justifican la 
precisión y exactitud de dicho método, para así ser implementado en estudios clínicos, 
farmacocinéticos, de bioequivalencia o para un control terapéutico en pacientes dentro del 
área clínica en hospitales y/o Institutos que lo requieran y lleven a cabo. 
La determinación de niveles séricos de carbamazepina en pacientes con epilepsia 
que acuden al Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía ‘Manuel Velasco Suárez’, se 
realiza en el laboratorio de Hormonas y Niveles séricos, por la técnica de Inmunoanálisis 
Quimioluminiscente de Micropartículas (CMIA) de manera automatizada, la cual no 
garantiza los resultados en muestras que no sean suero o plasma humano, por lo que éste 
método de análisis no es aplicable a estudios farmacocinéticos de CBZ en modelos 
animales, los cuales son muy frecuentes en investigación. 
Se llevó a cabo la validación de un método analítico para cuantificar carbamazepina 
en plasma humano por Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución. La carbamazepina 
es un fármaco tricíclico relacionado con los antidepresivos debido a su estructura química 
además, es el fármaco de primera elección en el tratamiento de convulsiones 
generalizadas en un cuadro de epilepsia. 
2 
1.1 Epilepsia 
La epilepsia es un trastorno neurológico que se manifiesta por la presencia de crisis 
epilépticas, siendo estas un evento temporal consecuencia de un aumento en la actividad 
eléctrica de forma simultánea, exagerada y anómala por un grupo de neuronas ubicadas 
sobre la corteza cerebral (1). 
Dichos episodios pueden estar o no asociados a convulsiones, presentándose por una 
manifestación clínica diferente de acuerdo con la extensión y zona cerebral afectada. 
Resultado de estos eventos de corta duración (de segundos a minutos), se manifiestan 
diversas consecuencias como la presencia de movimientos musculares involuntarios, en 
ocasiones sumamente violentos, cambios bruscos en el comportamiento y pérdida de 
conciencia (1, 2, 3). 
Las crisis epilépticas se pueden agrupar en: 
 Convulsiones parciales o focales: en las cuales la descarga neuronal anormal
simultánea, se presenta en una zona específica del cerebro. En este tipo, el paciente 
no presenta pérdida de conocimiento. 
 Convulsiones generalizadas: este tipo de disfunciones neuronales se presentan
alrededor de la corteza cerebral en ambos hemisferios. En este caso el paciente 
experimenta una pérdida de la cognición. 
3 
Dentro de las convulsiones generalizadas, se encuentran otros trastornos como son las 
crisis tónico-clónicas, crisis de ausencia, mioclónicas, así como convulsiones febriles por 
mencionar algunos (1, 2, 3). 
La epilepsia afecta aproximadamente a 50 millones de personas a nivel mundial y el 
padecimiento se encuentra entre los más comunes que afectan al Sistema Nervioso 
Central (SNC), ocupando el tercer lugar sólo por debajo de la enfermedad cerebro-vascular 
y el Alzheimer, según reporta la OMS (3,4). 
1.2 Antiepilépticos 
Son los fármacos prescritos y utilizados en el tratamiento de la epilepsia, los cuales 
ayudan a disminuir la intensidad e incluso el número de crisis epilépticas manifestadas por 
eventos convulsivos o no (5,6). 
Su mecanismo de acción, se encuentra basado en la alteración de las funciones de 
las bombas de Sodio o Calcio (Na+ o Ca2+) dependientes de voltaje ubicadas en la 
membrana de células cerebrales, el aumento de los impulsos inhibidores de GABA (Ácido 
gamma-aminobutírico) o interfiriendo los impulsos excitadores del glutamato, ayudando de 
esta manera a disminuir la intensidad de los brotes epilépticos (5). 
4 
1.3 Carbamazepina (CBZ) 
La carbamazepina es el principal anticonvulsivo para el control de los eventos 
presentados por la epilepsia considerado como el fármaco principal en el tratamiento de la 
misma, ya sea por sí sola o en conjunto con otros antiepilépticos. 
Es uno de los dos antiepilépticos más seguros para los diferentes tipos de eventos 
epilépticos, siendo Fenitoína el otro, debido a su alta eficacia y baja incidencia de efectos 
adversos. Su uso fue aprobado en 1968 por la FDA (Food and Drug Administration) en los 
Estados Unidos (2,3). 
1.3.1 Propiedades físicas y químicas 
Entre sus propiedades estructurales se encuentra un grupo denominado ‘carbamoilo’ 
en la posición 5 (-N-C=O-NH2), al cual se le atribuye la actividad anticonvulsiva del fármaco 
(2,5,7). 
Cabe mencionar que posee características estructurales semejantes con algunas 
drogas psicoactivas tales como imipramina, clorpromazina, felbamato por mencionar 
algunas. 
1.3.1.1 Nombre químico de carbamazepina: 
 5H- Dibenz[b,f]-azepina-5-carboxamida
 5-Carbamoil-5H-dibenz[b,f]azepina (8,9,10)
5 
1.3.1.2 Fórmula condensada de carbamazepina: 
 C15H12N2O (7,10)
1.3.1.3 Estructura química de carbamazepina: 
Figura 1. Estructura química de carbamazepina (7,10,11,12) 
1.3.1.4 Masa molecular de carbamazepina: 
 236.27g/mol (7,9,10,11)
1.3.1.5 Descripción: Es un polvo blanco cristalino ligeramente amarillento. Ésta sustancia 
presenta polimorfismo en dos formas cristalinas, alfa y beta carbamazepina (9). 
1.3.1.6 Solubilidad: Fácilmente soluble en Cloroformo, poco soluble en etanol y acetona, 
casi insoluble en agua y éter etílico (9). 
1.3.1.7 Punto de fusión: 190-193 °C (8) 
6 
1.3.2 Usos terapéuticos 
La CBZ se utiliza principalmente en el tratamiento de convulsiones tónico-clónicas 
generalizadas y parciales de la epilepsia por su capacidad de disminuir la difusión de 
impulsos eléctricos anormales en el cerebro y disminuyendo la intensidad de los eventos 
convulsivos. 
Entre otros usos en la terapéutica se encuentran: el tratamiento de la depresión 
bipolar, las crisis maniaco-depresivas así como la neuralgia del trigémino (2,3,7). 
1.3.2.1 Dosis y vía de administración 
Entre las formas farmacéuticas de dosificación de carbamazepina por vía oral, se 
encuentra principalmente en forma de tabletas y suspensión. 
En Adultos: se maneja una dosis de 400-1200 mg/día a dosis ascendentes de 200 
mg/semana hasta alcanzar la dosis necesaria. Las dosis diarias de 1 g o hasta 2 g son 
tolerables por el paciente. 
En Niños: la dosis oscila entre 10 a 30 mg/Kg iniciándose la terapia con dosis de 5 
mg/Kg hasta alcanzar los 20 mg/Kg para obtener una respuesta sin efectos secundarios 
(13). 
1.3.2.2 Efectos adversos 
Entre los efectos secundarios que pudieran presentarse por el uso de CBZ se han 
documentado: visión doble (diplopía)con una duración menor a una hora, mareos, pérdida 
de coordinación o ataxia, malestar gastrointestinal, inestabilidad motora, somnolencia (en 
dosis mayores), visión borrosa así como un desequilibrio hidro-electrolítico conocido como 
7 
hiponatremia, en la cual se presenta por una disminución de los niveles de sodio en sangre 
(3,7,13). 
1.3.3 Farmacocinética 
1.3.3.1 Absorción 
La absorción gastrointestinal de carbamazepina es casi completa; los niveles 
plasmáticos máximos se alcanzan entre 4 a 8 horas. Su absorción se favorece con la 
ingesta de alimentos (3,6,8,9). El rango terapéutico de concentración en adultos se 
encuentra de 4 a 12 µg/mL, requiriendo como mínimo un mes de tratamiento para alcanzar 
una concentración estable así como para obtener el efecto esperado (5). 
1.3.3.2 Distribución 
Se distribuye ampliamente en el organismo y la fracción libre de CBZ atraviesa las 
barreras biológicas fácilmente, encontrándose en fluidos tales como saliva y líquido 
cefalorraquídeo, entre otros. 
Posee un volumen de distribución (Vd) de 0.8 a 1.4 L/Kg y se une aproximadamente 
a un 70% de las proteínas plasmáticas (2,13). 
1.3.3.3 Metabolismo 
Carbamazepina es metabolizada en más de un 95% por el hígado siendo el sustrato 
principal para la enzima CYP3A4 y que a diferencia de ésta, es metabolizada escasamente 
por otras como las CYP1A2 y CYP2C8. 
 
 
8 
 
Cabe mencionar que éste fármaco posee la propiedad de inducir su propio 
metabolismo así como de tener un metabolito activo, el 10-11-epóxido de carbamazepina, 
que posee efectos similares aunque tóxicos a niveles importantes en el ser humano,pero 
aún no son conocidos sus efectos del todo (2,7,11,14). 
 
 
Figura 2. Principales vías metabólicas de CBZ 
 
1.3.3.4 Eliminación 
 La CBZ se elimina por vía renal en un 79% en forma de metabolitos inactivos y 
excretándose de forma inalterada sólo un 3% del fármaco en la orina y en las heces. Su 
tiempo de vida media (t1/2) es de entre 10 a 30 h y de 8 a 19 h en adultos y niños 
respectivamente (12). 
 
 
 
 
9 
 
1.3.4 Farmacodinamia 
Como se mencionó, la carbamazepina forma parte del grupo de los antiepilépticos 
bloqueadores de los de canales de sodio dependientes de voltaje. 
Ésta acción se logra por la reducción en la difusión de impulsos nerviosos de las 
neuronas anómalas bloqueando los canales de sodio de éstas células y evitando que se 
presenten potenciales repetidos evitando su propagación en el foco epiléptico 
disminuyendo así la intensidad de las convulsiones (5,8,11). 
Además, CBZ actúa en los receptores monoamina, acetilcolina así como N-Metil-D-
Aspártico (NMDA) de glutamato con mecanismo similar (13). 
 
 
1.4 Inmunoanálisis quimioluminiscente de micropartículas (CMIA) 
Es un inmunoensayo in vitro de tipo no competitivo de un solo paso; se lleva a cabo 
con el instrumento Architect i System (Laboratorios Abbott) en el Instituto Nacional de 
Neurología y Neurocirugía, para la determinación cuantitativa de sustancias específicas 
(antiepilépticos, antidepresivos, entre otros) presentes en alguna matriz biológica ya sea 
suero o plasma humano, con la finalidad de determinar los niveles del fármaco y ayudar a 
su correcta dosificación. 
 
El método que se utiliza, llamado i-Carbamazepine, está basado en sus dos 
componentes principales, micropartículas paramagnéticas recubiertas por anti-
carbamazepina y el conjugado de carbamazepina, marcado por el compuesto 
quimioluminiscente acridinio, y juntos forman la mezcla de reacción. 
 
 
10 
 
A detalle, el principio consiste en que las micropartículas marcadas se unan a la 
carbamazepina presente en la muestra por analizar y al conjugado, en el que después de 
un lavado, con solución amortiguadora de fosfatos/solución salina, se le añaden dos 
soluciones una pre-activadora y otra activadora, compuestas por peróxido de hidrógeno e 
hidróxido de sodio respectivamente, para después presentarse la reacción 
quimioluminiscente la cual es detectada y medida en unidades relativas de luz. 
 
Para llevar a cabo la cuantificación, se realiza una curva de calibración dentro del 
intervalo terapéutico de carbamazepina así como la evaluación de ésta calibración por 
medio del análisis de un suero control valorado para inmunoensayos y diversos fármacos 
para finalmente obtener una gráfica de Levy Jennings (gráfico de control de calidad) y por 
las reglas de Westgard, que son herramientas de evaluación de control de calidad, para 
descartar algún error dentro de los análisis ya determinar la concentración correcta del 
analito a cuantificar. 
 
Las reglas de Westgard son las siguientes: 
- Regla 12s: Indica si un control evaluado excede el límite de 2 Desviaciones Estándar 
(DE). 
 
Figura 3. Grafico de Levy-Jennings: Incumplimiento de la Regla 12s. 
 
 
11 
 
 
- Regla 13s: Indica si un control evaluado excede el límite de 3 DE. Detecta un error 
aleatorio inaceptable y el inicio de un posible error sistemático. 
 
Figura 4. Grafico de Levy-Jennings: Incumplimiento de la Regla 13s. 
 
 
 
- Regla 22s: Cuando dos puntos consecutivos exceden del mismo lado 2 
DE. Si se produce esto, se detecta un error sistemático. 
 
 Figura 5. Grafico de Levy-Jennings: Incumplimiento de la Regla 22s. 
 
 
 
 
- Regla R4s: Cuando dos valores consecutivos de diferentes controles se encuentra 
alguno por debajo de menos 2 veces la DE y otro por arriba de 2 veces la DE. Si 
ocurre, se está en presencia de un error aleatorio. 
 
 
 
12 
 
 
Figura 6. Grafico de Levy-Jennings: Incumplimiento de la Regla R4s. 
 
 
- Regla 41s: Cuando 4 resultados de control superan 1 DE del mismo lado. Posible 
error sistemático y se resuelve calibrando o dando mantenimiento al sistema. 
Figura 7. Grafico de Levy-Jennings: Incumplimiento de la Regla 41s. 
 
 
- Regla 10x: Diez puntos consecutivos se encuentran del mismo lado, sobre o por 
debajo de la media. 
 
Figura 8. Grafico de Levy-Jennings: Incumplimiento de la Regla 10x. 
 
 
13 
 
1.5 Validación de métodos analíticos 
 La validación se define como la evidencia experimental documentada de que un 
procedimiento cumple con el propósito para el cual fue diseñado. Cabe mencionar la 
existencia de diversos tipos de validación siendo estos, la total, donde se realizan todos los 
criterios establecidos en la norma; parcial, aquella en la que se hacen pequeños cambios a 
un método analítico validado y la cruzada, en la cual se analiza de manera independiente 
por entidades diferentes y al finalizar, se comparan los resultados obtenidos por cada uno 
de los analistas. 
 
La validación se puede llevar a cabo no sólo para un método, también es útil para 
equipos, personal, entre otros. En este caso se realizó la validación de un método para la 
cuantificación de los niveles de carbamazepina en plasma como matriz biológica (15). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
1.6 Métodos de cuantificación de carbamazepina 
En la tabla 1, se muestran diversos parámetros de relevancia dentro de métodos 
analíticos realizados en los últimos años utilizados para determinar carbamazepina. 
 
Tabla 1. Métodos analíticos en los últimos años 
 
Fuente Año Método Analítico Columna 
Preparación 
Muestra 
Fase Móvil 
(v/v) 
Tiempo de 
análisis 
(min) 
Λ 
(nm) 
Flujo 
(mL/min) 
(16) 2008 CLAR-UV Nova Pak C-18 
Extracción 
líquido-líquido 
con Cloruro de 
Metileno 
Agua-ACN 
(70:30) 10 210 0.5 
(17) 2012 CLAR 
C18 
μ-
Bondapak 
Separación 
con Metanol 
Metanol: Agua 
(50:50) 15 285 1.0 
(18) 2013 CLAR-UV 
LiChroCAR
T 
Purospher 
Star C18 
column 
Extracción en 
fase sólida por 
desproteini-
zación con 
metanol 
H2O-CH3OH-
ACN-
Trietanolamina 
(68.7:25:6:0.3; 
pH 6.5) 
15 237 1.0 
(19) 2014 CLAR-DAD 
Columna 
Bonus-RP 
Desproteniza-
ción simple de 
suero 
ACN /buffer 
K2HPO4 
(pH:7.5) 
(45:55) 
5 210-400 1.0 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
1.6.1 Objetivos planteadosObjetivo particular 
 Llevar a cabo la validación de un método analítico que permita cuantificar 
carbamazepina en plasma, empleando Cromatografía de Líquidos de Alta 
Resolución (CLAR) cumpliendo con las especificaciones establecidas en la NOM-
177-SSA1-2013. 
 
 
 
Objetivos particulares 
 Analizar de manera ciega, utilizando el método por CLAR validado y los datos del 
método de Inmunoensayo Quimioluminiscente de Micropartículas (CMIA), muestras 
control y muestras de pacientes para la determinación de concentraciones de 
carbamazepina en plasma humano. 
 
 
 Evaluar la concordancia de los resultados obtenidos por el método de CLAR 
validado con respecto al método por Inmunoensayo Quimioluminiscente de 
Micropartículas (CMIA) de manera automatizada. 
 
 
 
 
16 
 
2. ESPECIFICACIONES PARA EL DESARROLLO EXPERIMENTAL 
 
Instrumentos 
 Computadora KAYAK XM600 
 Balanza OHAUS Galaxy 4000D 
 Balanza analítica Sartorius CP225D 
 Cromatógrafo de líquidos de Alta Resolución Agilent 1100 Series que constó de: 
- Inyector modelo G1313A 
- Bomba cuaternaria modelo G1311A 
- Detector UV modelo G1315B 
- Degasificador modelo G1322A 
 Potenciómetro Beckman Φ41 pH Meter 
 
Equipos 
 Multiagitador de pulsos Glas-Col 
 Agitador Vortex Thermolyne Tipo 37600 
 Centrífuga Beckman Modelo TJ-6 
 
Materiales 
 Evaporador conectado a tanque de Nitrógeno para tubos de muestra 
 Repipeteador Eppendorf 0.5-10 mL 
 Micropipeta Eppendorf 10-100 µL 
 Micropipeta Eppendorf 100-1000 µL 
 
 
 
17 
 
Consumibles 
 Columna cromatográfica Zorbax Eclipse XDB-C8 de 5 µm (4.6x150 mm) 
 Papel filtro Whatman #42 (Ø110 mm) y #4(Ø125 mm) 
 Filtros de membrana DURAPORE, Millipore 
 
Reactivos 
 Metanol, J.T. Baker, grado: CLAR 
 Acetonitrilo, J.T. Baker, grado: CLAR 
 Alcohol Isoamílico, Golden Bell reactivos, grado: reactivo analítico 
 Hexanos, Técnica química, grado: reactivo analítico 
 Hidróxido de Sodio (Perlas), PM: 40.00, grado reactivo; J.T. Baker 
 Agua grado CLAR. 
 
Sustancias de referencia 
 Carbamazepina, CAS: 298-46-4, C15H12N2O, PM: 236.27, Sigma Aldrich. 
 Prazicuantel, CAS: 55268-74-1, C19H24N2O2, PM: 312.41, Sigma Aldrich. 
 Ácido Valpróico, CAS: 99-66-1, C8H16O2, PM: 312.41, Sigma Aldrich. 
 Difenilhidantoína, CAS: 57-41-0, C15H12N2O2, PM: 252.27, Sigma Aldrich. 
 Lamotrigina, CAS: 84057-84-1, C9H7Cl2N5, PM: 256.09, Sigma Aldrich. 
 Primidona, CAS: 125-33-7, C12H14N2O2, PM: 218.25, Sigma Aldrich. 
 
 
 
 
 
18 
 
2.1 Preparación de Soluciones 
 
Solución 1.5 N de Hidróxido de sodio 
 
Se pesaron 30 g de perlas de Hidróxido de Sodio y se depositaron en vaso de 
precipitados de 1 L en el que se disolvieron con agua grado CLAR, aproximadamente 100 
mL y una vez disueltas, se trasfirió a matraz volumétrico de 500 mL, llevándose finalmente 
a volumen con agua grado CLAR. 
 
Preparación de soluciones stock y Estándar Interno (EI) 
 
Se prepararon soluciones stock, de CBZ y Prazicuantel (empleado como EI) con una 
concentración de 100 μg/mL para lo cual se pesó, inicialmente el equivalente a 1 mg 
(0.0010 g) dada la legibilidad de la balanza analítica. 
Las cantidades pesadas fueron depositadas en matraz aforado de 10 mL y llevadas 
a volumen con metanol. De esta forma se obtuvieron soluciones con 100 µg/mL tanto de 
CBZ como de PZQ. 
 
2.1.1 Preparación de mezcla de extracción 
 La mezcla de extracción se realizó utilizando una probeta de 250 mL en la cual se 
transfirió, utilizando un vaso de precipitados, a la probeta la cantidad necesaria de Hexano 
para después agregar la parte proporcional de Alcohol Isoamílico con pipeta graduada; se 
llevó a cabo de acuerdo a una proporción de 98.5:1.5 %v/v. 
 
 
19 
 
2.2 Ensayo de curvas de calibración en metanol y plasma humano 
 
Fueron realizadas dos curvas de calibración a partir de un stock de 100 µg/mL de 
carbamazepina en metanol, siendo la primer curva, en metanol y la segunda utilizando 
plasma humano, el cual fue provisto por el banco de sangre del INNN y recientemente 
filtrado en el laboratorio. 
 
Se prepararon 7 soluciones con diferentes concentraciones de CBZ cada una, 
siendo: 20, 15, 10, 5, 2.5, 1.25 y 0.5 µg/mL llevadas a volumen de 10 mL, ya sea con 
metanol o con plasma de acuerdo con la tabla 2. Se realizaron diluciones seriadas a partir 
de la solución con 20 μg/mL de CBZ, tomando alícuotas de 5 mL para cada solución y 
llevando a volumen de 10 mL obteniéndo las concentraciones antes mencionadas. 
Excepto la concentración de 15 μg/mL se preparó tomando 1.5 mL de la solución 
stock de CBZ a una concentración de 100 μg/mL, evitando la formación de burbujas 
producto de la desnaturalización de proteínas del plasma al contacto con el metanol de la 
solución stock. 
 
La curva de calibración se estableció de acuerdo a las concentraciones máximas en 
estado estacionario en plasma y el intervalo terapéutico reportados en la literatura (4 a 12 
μg/mL), se consideró aproximadamente el 5% del límite superior del intervalo terapéutico 
para la concentración menor de la curva de calibración. 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
Tabla 2. Preparación de curvas de calibración en metanol y en plasma humano. 
 
Soln. 
Concentración 
de solución 
(μg/mL) 
Alícuota 
de soln. 
(mL) 
 
Vol. del aforo 
(mL) 
Concentración 
Final 
(μg/mL) 
1 100 2 10 20 
2 100 1.5 10 15 
3* 20 5 10 10 
4* 10 5 10 5 
5* 5 5 10 2.5 
6* 2.5 5 10 1.25 
7 5 1 10 0.5 
*Por dilución seriada 
 
2.2.1 Diagrama de extracción 
A continuación se muestra el diagrama de flujo seguido para llevar a cabo la 
extracción de CBZ de las muestras plasmáticas preparadas. 
 
Figura 9. Extracción líquido-líquido de CBZ en muestras de plasma humano. 
 
 
21 
 
2.3 Descripción del método cromatográfico utilizado 
El método validado se desarrolló en un equipo cromatográfico Agilent modelo 1100 en 
el cual se implementó con las siguientes especificaciones: 
 Tiempo de análisis por muestra: 6.5 min. 
 Fase móvil: Agua : Acetonitrilo (55:45 % v/v) 
 Fase estacionaria: Columna cromatográfica marca Zorbax Eclipse XDB-C8 de 5 µm 
(4.6x150 mm) 
 Flujo: 1 mL/min 
 Longitud de onda: 210 nm 
 Volumen de Inyección 20 μL de muestra 
 
2.4 Validación de métodos analíticos 
 
 De acuerdo a lo dispuesto por la NOM-177-SSA1-2013 en su apartado de criterios y 
requisitos para el análisis de muestras biológicas de un estudio de biodisponibilidad o 
bioequivalencia, se evaluaron los siguientes criterios: 
 
2.4.1 Selectividad 
 Este parámetro fue evaluado analizando seis unidades de plasma de manera 
independiente para demostrar la ausencia de sustancias endógenas que interfieran con el 
método y se realizó mediante un ‘pool’ de plasma a partir de dichas unidades para 
homogenizar la matriz biológica. 
 
 
22 
 
Se prepararon muestra blanco, muestra cero, plasma adicionado con diversos 
antiepilépticos (Difenilhidantoína, Primidona, Lamotrigina, Ácido Valpróico), así como el 
análisis de muestras de CBZ en plasma de rata. 
 Se realizó una solución a una concentración de 100 µg/mL en metanol de cada uno 
de los fármacos antes mencionados. Se analizaron muestras plasmáticas adicionadas con 
CBZ a una concentración de 10 µg/mL y 50 µL de cada una de soluciones de 
Antiepilépticos de manera independiente y en conjunto. Se realizó la técnica de extracción 
y se reconstituyó en metanol para la cuantificación de los fármacos. 
 
2.4.2 Límite Inferior de Cuantificación (LIC) 
 
 Este criterio fue determinado por medio del análisis por quintuplicado de la 
concentración más baja de la curva de calibración, 0.5 µg/mL, se tomó para dicho punto 
como base el 5 % del límite superior del intervalo terapéutico. 
Se considera que el parámetro tiene validez si su valor promedio se encuentra 
dentro del 20% del valor nominal con un coeficiente de variación no mayor que 20% (20). 
 
2.4.3 Curva de Calibración 
 
Para este criteriose realizaron tres curvas patrón de CBZ en plasma humano, 
partiendo de una solución de 1000 μg/mL en metanol y por dilución 1:10 se prepararon por 
triplicado soluciones stock con 100 μg/mL aforadas con plasma humano de manera 
independiente. A partir de las soluciones stock de CBZ se prepararon soluciones de 20, 15, 
10, 5, 2.5, 1.25 y 0.5 µg/mL tal como se muestra en la tabla 2. 
 
 
23 
 
Las muestras plasmáticas fueron procesadas de acuerdo al procedimiento de 
extracción líquido-líquido descrito anteriormente en la fig. 3 las muestras se analizaron bajo 
las condiciones establecidas para el sistema cromatográfico. 
 De los cromatogramas obtenidos del análisis de las muestras se consideró la altura 
de los picos cromatográficos tanto de CBZ como de su EI llevándose a cabo su relación de 
alturas. 
𝑅𝐸𝐿𝐴𝐶𝐼Ó𝑁 𝐷𝐸 𝐴𝐿𝑇𝑈𝑅𝐴𝑆 = 
𝐴𝐿𝑇𝑈𝑅𝐴 𝐷𝐸 𝐶𝐵𝑍
𝐴𝐿𝑇𝑈𝑅𝐴 𝐷𝐸 𝑃𝑍𝑄 (𝐸𝐼)
 
 
En el método matemático empleado, se realizaron la gráficas correspondientes de 
relación de alturas vs concentración para el promedio de las tres curvas y se realizó el 
análisis de regresión lineal utilizando el método de mínimos cuadrados y = mx +b dentro 
del cual el eje de las ordenadas correspondió a la relación de alturas y el eje de las 
abscisas a la concentración nominal de CBZ. Se calculó la concentración recuperada y su 
% de Desviación. 
 
2.4.4 Precisión: Repetibilidad y reproducibilidad 
 La precisión del método fue determinada en base a la repetibilidad así como por su 
reproducibilidad. 
 
 
 
 
 
24 
 
Repetibilidad 
 Fue determinado por medio de la preparación y análisis de tres muestras control: 12 
µg/mL (nivel alto) a partir de un stock de 100 µg/mL, 4 µg/mL (nivel medio) y 0.8 µg/mL 
(nivel bajo) partiendo de una solución de 10 µg/mL preparada por dilución 1:10 del stock 
así como el LIC. 
Se analizaron por quintuplicado en un mismo día de trabajo, con el mismo equipo y 
analista. 
 El criterio de aceptación fue que el C.V% del valor promedio no fuera mayor al 15%, 
excepto para el límite inferior de cuantificación el cual debe ser menor o igual que 20% 
(15). 
 
Reproducibilidad 
Este parámetro fue evaluado en dos días continuos de trabajo, en las mismas 
condiciones de equipo y laboratorio, analizando por quintuplicado los niveles control de 0.8, 
4 y 12 µg/mL. Se obtuvieron los valores promedio, desviación estándar y C.V% del valor 
promedio, el cual no debe ser mayor que el 15% excepto para el límite inferior de 
cuantificación el cual debe ser menor o igual que 20% (15). 
 
 
 
 
 
25 
 
2.4.5 Exactitud 
 Este parámetro se alcanzó calculando el porcentaje de la desviación absoluta de la 
concentración obtenida (datos de reproducibilidad y repetibilidad) con respecto al valor 
nominal (concentración adicionada) empleando la siguiente ecuación: 
 
% 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 100 𝑥 
|𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑎 − 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎|
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑎
 
 
 El valor promedio del % de desviación no debe ser mayor que el 15%, excepto para 
el límite inferior de cuantificación, el cual debe ser menor o igual al 25 %. 
 
 
2.4.6 Estabilidad: pruebas a corto y largo plazo 
 Esta medida se llevó a cabo para determinar la conservación de las propiedades del 
fármaco evaluado sometiéndolo a diversas condiciones tanto de tiempo como de 
temperatura dentro de la matriz biológica. 
Para dicha evaluación se preparó una solución de 1000 µg/mL pesando el 
equivalente a 10 mg (0.0100 g) de CBZ llevado a volumen en matraz volumétrico de 10 mL 
y preparando a partir de esta solución, 25 mL de cada uno de las muestras control de 0.8 
µg/mL (MCB) y 12 µg/mL (MCA). 
Se llevaron a cabo las extracciones de CBZ por triplicado en los tiempos 
programados para cada evaluación, conforme a las siguientes condiciones: 
 
 
 
 
26 
 
Estabilidad a corto plazo 
- Muestras a temperatura ambiente (a 25°C realizando su inyección al cromatógrafo 
después de finalizado su proceso de extracción. 
- Muestras procesadas, reconstituidas y almacenadas a temperatura ambiente en el 
cromatógrafo, para ser analizadas 4 horas posteriores al haber sido reconstituidas. 
- Muestras procesadas reconstituidas y almacenadas en refrigeración (-4°C) durante 24 h. 
- Muestras procesadas, reconstituidas y almacenadas en congelación (-72°C) durante 24 h. 
 
Estabilidad a largo plazo (60 días) 
 Se prepararon muestras de cada muestra control (bajo y alto) para después 
almacenarse en congelación (-71°C) por un periodo de 60 días y concluido el tiempo, se 
analizaron por quintuplicado cada una de las muestras para evaluar su estabilidad durante 
este lapso de tiempo. 
 
Las muestras control fueron interpoladas en una curva de calibración recién 
preparada y las concentraciones obtenidas son comparadas contra la concentración 
nominal. La concentración promedio de cada nivel debe estar dentro del 15% de la 
concentración nominal (15). 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
Ciclos de congelación-descongelación 
 El procedimiento consistió en almacenar en congelación las muestras control a cada 
nivel de concentración por un periodo de 24 h a 25 °C, al momento de su análisis, las 
muestras se descongelaron a temperatura ambiente, se tomó una alícuota de cada muestra 
y se realizó el proceso de extracción descrito (Figura 3). 
 
Finalizando la toma de las muestras necesarias, las muestras control fueron 
almacenadas nuevamente en congelación por el siguiente período de 24 h y de esa forma 
llevar a cabo el segundo y tercer ciclo. 
 Se realizaron 3 ciclos de congelación y descongelación y se obtuvo el promedio, la 
desviación estándar así como el C.V.% para cada uno de las muestras control en cada uno 
de los ciclos. Los límites deben estar dentro en un valor menor al 15% del valor nominal. 
 Las soluciones de referencia de CBZ y del EI fueron preparadas y utilizadas, en el 
día de análisis en cada una de las pruebas analíticas realizadas. 
 
 
2.5 Comparación entre métodos: CLAR y CMIA 
Para la comparación entre métodos se prepararon muestras repetidas en plasma 
adicionadas con CBZ a tres niveles de concentración 0.8, 4.0 y 12 g/mL (n=15). Cada 
muestra se dividió en dos en tubos de ensayo, una serie se analizó por HPLC con el 
método validado y la segunda serie se envió al Laboratorio de Hormonas y Níveles Séricos 
para su análisis por CMIA, de igual manera, el laboratorio de Hormonas y Níveles Séricos 
proporcionó muestras plasmáticas de pacientes bajo tratamiento con Carbamazepina 
 
 
28 
 
(n=15), las muestras se analizaron por CMIA y el método de HPLC validado. El análisis de 
todas las muestras por HPLC y CMIA se llevó a cabo de manera simultánea el mismo día. 
Se realizó la gráfica comparativa de las concentraciones de CBZ determinadas por 
ambos métodos y se determinó el coeficiente de correlación. 
Adicionalmente se empleó el Método de Bland-Altman, que es utilizado en estudios 
comparativos en química analítica y bioestadística para mostrar la concordancia de 
resultados entre dos métodos. El gráfico consiste en representar en un diagrama de 
dispersión, la media de las dos mediciones a comparar, frente a la diferencia entre ambos 
valores. 
Éste gráfico fue realizado de la siguiente manera, en el eje de las ordenadas (y) la 
diferencia calculada entre las respuestas de ambos métodos, en este caso entre CLAR y 
CMIA; mientras que en el eje de las abscisas (x) representa el promedio de las 
concentraciones de cada uno de los métodos ya mencionados. 
En el gráfico incluye una línea horizontal en la diferencia media esperada con valor = 0 y 
dos líneas de concordancia que son igual a ±1 y ±2 desviaciones estándar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Selectividad 
Figura 10. Cromatogramas correspondientes a la evaluación de la selectividad del método. 
b) Muestra cero
30 
En lafigura 10, se muestran los cromatogramas obtenidos en este parámetro 
observándose en el primero, “a”, el análisis de una muestra blanco de plasma, es decir, 
sólo la matriz biológica empleada. En el cromatograma “b” se presenta el análisis de una 
muestra blanco más el estándar interno escogido (muestra cero), sin que se observen 
interferencias de la matriz biológica. En “c”, se presenta el análisis de una muestra 
adicionada con diversos antiepilépticos (Ácido Valpróico, Lamotrigina, Primidona, Fenitoína 
y Carbamazepina), la concentración adicionada de cada antiepiléptico fue de 100 μg/mL, 
no se observó señal alguna de los antiepilépticos adicionados, siendo el método selectivo 
para CBZ. 
 En los últimos dos gráficos (d y e) se muestra el análisis de muestras empleando 
plasma humano y de rata respectivamente, resultando ser comparables ya que no hay 
interferencias tanto para CBZ como para el EI usando ambas matrices biológicas. 
3.2 Límite Inferior de Cuantificación 
En la tabla 3 observamos la concentración recuperada en cada uno de los puntos 
repetidos, así como su promedio, desviación estándar y su C.V.%. 
Tabla 3. Límite Inferior de Cuantificación para el método de CBZ 
No. de 
muestra 
Conc. nominal 
(µg/mL) 
Conc. recuperada 
(µg/mL) 
1 0.50 0.43 
2 0.50 0.42 
3 0.50 0.42 
4 0.50 0.48 
5 0.50 0.42 
Promedio 0.43 
D.E. 0.03 
C.V.% 6.18 
31 
En los resultados obtenidos podemos observar que el valor promedio es cercano al 
nominal y que el valor de C.V.% cumple con lo establecido al no ser mayor del 20 %.
3.3 Curva de Calibración 
En la tabla 4 se presentan los datos correspondientes a la concentración 
recuperada, de las curvas de calibración realizadas dentro de un mismo día de trabajo y los 
datos de regresión lineal, coeficiente de correlación lineal (r), pendiente (m) y ordenada al 
origen (b) correspondientes a cada una de las curvas realizadas. En la Tabla 5, se 
despliegan los datos de la curva de calibración promedio, así como, el porciento de 
recuperación y porciento de desviación. Asimismo en la figura 5, se muestra la curva de 
calibración promedio de CBZ en plasma dentro de un intervalo de concentraciones de 0.5 a 
20 µg/mL y sus datos de regresión lineal. 
Tabla 4. Concentración recuperada de las curvas de calibración del método para cuantificar 
carbamazepina en plasma humano. 
Conc. 
(µg/mL) Curva 1 
% 
Desviación Curva 2 
% 
Desviación Curva 3 
% 
Desviación 
0.5 0.45 10.0 0.52 -4.0 0.58 -16.0 
1.25 1.31 -4.8 1.14 -4.8 1.07 14.4 
2.5 2.55 -2.0 2.41 -2.0 2.41 3.6 
5 4.94 1.2 5.05 1.2 5.29 -5.8 
10 9.89 1.1 10.31 1.1 10.36 -3.6 
15 15.09 -0.6 15.84 -0.7 15.87 -5.8 
20 19.99 0.1 19.23 0.1 19.13 4.4 
r 0.9999 0.9979 0.9974 
m 1.0004 0.9944 0.9903 
b -0.0079 0.0756 0.1409 
32 
Tabla 5. Curva de calibración promedio
Conc. 
(µg/mL) 
Promedio 
Relación 
de alturas 
Promedio de 
concentración 
% 
Recuperado 
% 
Desviación 
0.5 0.11 0.52 104.0 -4.0 
1.25 0.20 1.17 93.6 6.4 
2.5 0.37 2.45 98.0 2.0 
5 0.72 5.09 101.8 -1.8 
10 1.39 10.19 101.7 -1.9 
15 2.11 15.60 100.0 -4.0 
20 2.61 19.45 97.2 2.8 
r 0.9988 0.9989 Promedio 99.47 
m 0.1321 0.9953 
b 0.0429 0.0675 
y = 0.1321x + 0.0429
r = 0.9988
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 5 10 15 20 25
R
e
la
ci
ó
n
 d
e
 a
lt
u
ra
s 
(C
B
Z
/
E
I)
Concentración (μg/mL)
Curva de calibración 
Figura 11. Relación de alturas vs concentraciones promedio y sus datos de regresión lineal. 
33 
El coeficiente de correlación lineal obtenido en las tres curvas de calibración es 
mayor de 0.99, presentando una alta correlación en cada curva así como en el promedio de 
éstas. 
El criterio de aceptación del parámetro fueron los datos de concentración recuperada 
de la curva de calibración deben estar dentro del 15% de la concentración nominal, en cada 
nivel de concentración, excepto para el LIC, ya que puede ser menor o igual que el 20%. Al 
menos el 75% de las concentraciones de la curva de calibración con un mínimo de 6 
puntos deben cumplir con este criterio. 
Del total de las curvas evaluadas, al menos el 50% de cada nivel de concentración 
debe cumplir con el criterio del 15% de la concentración nominal y el 20% para el LIC. 
En la figura 11 se muestra la curva trazada con el promedio de la relación de alturas 
(CBZ/EI), obtenida de cada uno de los puntos de la curva de calibración, la ecuación 
obtenida así como su coeficiente de correlación y sus datos de regresión lineal. 
3.4 Precisión y Exactitud 
3.4.1 Repetibilidad 
En la tabla 6 se presentan los datos de concentración recuperada de cada muestra 
analizada, así como su % de Desviación con respecto a la concentración nominal 
correspondiente a la muestra. 
34 
Tabla 6. Concentraciones recuperadas de repetibilidad del método para cuantificar CBZ. 
Muestra MCB (0.8µg/mL) 
MCM 
(4.0µg/mL) 
MCA 
(12µg/mL) 
1 0.75 4.00 13.08 
2 0.75 3.96 12.24 
3 0.65 4.02 12.00 
4 0.67 3.97 11.65 
5 0.66 4.01 12.11 
Promedio 0.70 3.99 12.22 
Desv. Est. 0.05 0.03 0.53 
C.V. % 7.15 0.65 4..33 
% 
Desviación 13.00 -0.20 -1.80 
MCB: Muestra Control Baja, MCM: Muestra Control Media MCA: Muestra Control Alta. 
Con los datos obtenidos se puede advertir que el C.V.% del promedio obtenido en 
cada uno de las muestras control es menor al 15%. 
3.4.2 Reproducibilidad 
En la tabla 7 se despliegan los datos de las concentraciones recuperadas de CBZ 
por día de análisis de cada punto control así como también promedio, desviación estándar, 
porcentaje de desviación absoluta y C.V.%, siendo el parámetro de aceptación. 
35 
Tabla 7.Reproducibilidad y exactitud en días diferentes de análisis para el método de CBZ 
LIC: límite de cuantificación, MCB: Muestra Control Baja, MCM: Muestra Control Media, 
 MCA: Muestra Control Alta. 
DIA 1 
Muestra 
Concentración recuperada en µg/mL 
LIC MCB MCM MCA 
Conc. nominal 
(µg/mL) 
0.50 0.80 4.00 12.00 
1 0.58 0.79 3.86 12.11 
2 0.47 0.75 3.91 11.87 
3 0.49 0.61 3.86 11.94 
4 0.49 0.72 3.9 11.98 
5 0.57 0.71 3.89 12.94 
Promedio 0.52 0.71 3.88 12.17 
D.E. 0.05 0.07 0.03 0.44 
C.V.% 9.39 9.28 0.66 3.63 
% Desviación -4.32 10.89 2.90 -1.40 
DIA 2 
Conc. nominal 
(µg/mL) 
0.50 0.80 4.00 12.00 
1 0.55 0.84 4.16 12.07 
2 0.42 0.65 4.61 11.95 
3 0.45 0.70 4.40 12.33 
4 0.45 0.70 4.02 11.90 
5 0.47 0.72 4.09 12.08 
Promedio 0.47 0.72 4.26 12.07 
D.E. 0.05 0.07 0.24 0.17 
C.V.% 10.81 9.83 5.71 1.37 
% Desviación 6.67 -5.00 -6.25 -0.50 
36 
De acuerdo con los datos obtenidos de reproducibilidad, por el análisis de los 
muestras control en días por separado mostrados en la tabla 6, se observa que, en el 
primer día de análisis, el C.V.% se encuentra entre 0.65 % y 9.38% y en el segundo día de 
1.37% y 10.81%, estando por debajo del límite permitido que es de 15% cumpliendo con lo 
especificado para el parámetro 
3.5 Estabilidad 
3.5.1 Estabilidad a corto plazo 
En la tabla 8 se presentan las concentraciones recuperadas de cada uno de las 
muestras control en las condiciones establecidas así como sus datos promedio de 
desviación estándar (D.E.), C.V.% y el % Desviación.
Tabla 8. Datos de estabilidad de Muestras Procesadas a diferentes condiciones 
Relación de 
alturas 
Tiempo 
inicial 4 h después 
24 h 
reconstituidas 
en 
refrigeración 
24 h 
en 
congelación 
MCB 
(0.8µg/mL) 
0.83 0.83 0.88 0.89 
0.87 0.87 0.88 0.94 
0.83 0.88 0.91 0.84 
Promedio 0.85 0.86 0.89 0.91 
D.E. 0.02 0.02 0.02 0.03 
C.V.% 2.42 2.91 2.31 3.27 
% Desviación -6.25 -7.50 -11.25 -13.75 
MCA 
(12µg/mL) 
11.38 11.74 13.30 11.81 
11.95 12.53 12.34 10.93 
12.51 11.65 11.69 13.00 
Promedio 11.95 11.97 12.44 11.92 
D.E. 0.56 0.48 0.81 1.04 
C.V.% 4.70 4.05 6.50 8.77 
% Desviación 0.42 0.25 -3.66 0.66 
MCB: Muestra Control Baja, MCA: Muestra Control Alta 
37 
En los datos de la tabla anterior podemos observar que el C.V.% en cada uno de los 
puntos no excedieron del 15% del valor nominal de cada una de las concentraciones así 
como el porcentaje de desviación.3.5.2 Ciclos de congelación-descongelación 
En las tablas 9, 10 y 11 se exponen los datos de concentración correspondientes a 
los ciclos de congelación-descongelación realizados así como sus datos de promedio, 
desviación estándar y porcentaje de coeficiente de variación, para cada uno de los tres 
ciclos. 
Tabla 9. Primer ciclo de congelación-descongelación 
Muestra MCB (0.8µg/mL)
MCA 
(12µg/mL)
1 0.86 12.28 
2 0.81 11.53 
3 0.89 14.16 
Promedio 0.85 12.66 
D.E. 0.04 1.36 
C.V.% 4.74 10.71 
% Desviación -6.67 -5.47 
MCB: Muestra Control Baja, MCA: Muestra Control Alta 
Tabla 10. Segundo ciclo de congelación-descongelación 
Muestra MCB (0.8µg/mL)
MCA 
(12µg/mL)
1 0.77 12.03 
2 0.84 11.97 
3 0.80 12.18 
Promedio 0.80 12.06 
D.E. 0.04 0.11 
C.V.% 4.37 0.89 
% Desviación -0.42 -0.50 
MCB: Muestra Control Baja, MCA: Muestra Control Alta 
38 
Tabla 11. Tercer ciclo de congelación-descongelación 
Muestra MCB (0.8µg/mL)
MCA 
(12µg/mL)
1 0.85 13.91 
2 0.77 13.45 
3 0.81 12.72 
Promedio 0.81 13.36 
D.E. 0.04 0.60 
C.V.% 4.94 4.49 
% Desviación -1.25 -11.33 
MCB: Muestra Control Baja, MCA: Muestra Control Alta 
3.5.3 Estabilidad a largo plazo (60 DÍAS) 
Tabla 12. Estabilidad a largo plazo 
Inicial MCB (0.8µg/mL)
MCA 
(12µg/mL)
1 0.84 11.38 
2 0.87 11.95 
3 0.83 12.51 
Promedio 0.85 11.95 
D.E. 0.02 0.57 
C.V.% 2.46 4.73 
% Desviación -5.83 0.44 
60 días 
1 0.85 12.12 
2 0.89 11.79 
3 0.88 11.97 
Promedio 0.87 11.96 
D.E. 0.02 0.17 
C.V.% 2.38 1.38 
% Desviación -9.17 0.33 
MCB: Muestra Control Baja, MCA: Muestra Control Alta 
39 
En los datos mostrados de estabilidad por ciclos de congelación-descongelación así 
como en los de estabilidad a los 60 días transcurridos en congelación, se concluye que los 
valores de concentración recuperada son cercanos a su concentración nominal respectiva, 
dato ejemplificado de acuerdo a su C.V.% expresando la desviación entre los datos 
obtenidos en cada una de las pruebas antes mencionadas y su % de Desviación. 
3.6 Inmunoanálisis quimioluminiscente de micropartículas
Tabla 13. Determinaciones de CBZ por ambos métodos en muestras con conc. conocida. 
Conc. 
(µg/mL) 
CLAR 
(µg/mL) 
%Desviación 
CMIA 
(µg/mL) 
%Desviación 
Promedio 
Conc. 
0.8 0.79 0.01 0.86 -0.07 0.83 
0.8 0.80 0.01 0.88 -0.10 0.84 
0.8 0.72 0.10 0.84 -0.05 0.78 
0.8 0.75 0.06 0.84 -0.05 0.80 
0.8 0.89 -0.11 0.87 -0.09 0.88 
Promedio 0.79 0.01 0.86 -0.07 0.82 
4 3.51 0.10 3.98 0.01 3.74 
4 4.04 -0.01 4.11 -0.03 4.07 
4 4.37 -0.09 4.18 -0.04 4.28 
4 4.35 -0.09 4.10 -0.02 4.22 
4 5.04 -0.26 4.19 -0.05 4.62 
4 3.84 0.04 4.07 -0.02 3.96 
Promedio 4.19 -0.05 4.11 -0.03 4.11 
12 12.91 -0.08 12.52 -0.04 12.72 
12 13.82 -0.15 12.88 -0.07 13.35 
12 14.13 -0.18 12.89 -0.07 13.51 
12 11.81 0.02 12.51 -0.04 12.16 
Promedio 13.17 -0.10 12.70 -0.06 12.70 
40 
Figura 12. Concordancia entre los métodos CLAR y CMIA para muestras con concentración 
conocida. 
La figura 12 muestra un alto coeficiente de correlación lineal para la medición por 
ambos métodos r> 0.99. 
A continuación se muestran los datos independientes obtenidos de CMIA y CLAR de 
pacientes aleatorios atendidos en el Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía. 
R² = 0.9911
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10 12 14
C
M
IA
CLAR
Muestras cargadas con CBZ
41 
Tabla 14. Concentraciones de pacientes ambulatorios obtenidas por CLAR y CMIA 
Código CLAR (µg/mL) CMIA (µg/mL) Diferencia 
1702140517 11.74 11.87 -0.13 
1302140424 8.78 8.66 0.12 
1302140429 7.60 7.43 0.17 
1102140364 6.05 6.37 -0.32 
1002140307 4.45 4.31 0.14 
602140198 8.70 8.67 0.03 
602140204 6.56 5.86 0.70 
602140206 8.02 10.69 -2.67 
502140139 6.04 5.72 0.32 
502140146 4.75 5.58 -0.83 
402140071 10.13 10.67 -0.54 
402140073 10.97 11.87 -0.90 
402140074 12.06 11.85 0.21 
3101141355 6.45 5.47 0.98 
3101141359 5.96 5.10 0.86 
En la tabla 14, se muestran los datos obtenidos por cada uno de los métodos 
realizados de manera independiente así como las diferencias en concentraciones 
obtenidas. 
42 
Figura 13. Determinación de la concentración de CBZ en muestras de pacientes por CLAR 
y CMIA. 
Los resultados del análisis de las 15 muestras control y 15 muestras de pacientes 
obtenidos por métodos de HPLC y CMIA, se representan gráficamente en las figuras 12 y 
13 respectivamente. Se obtuvo una buena correlación de los resultados obtenidos por 
ambos métodos (r2≈0.9) 
Se realizó el gráfico de Bland-Altman, para corroborar la concordancia que existe 
entre ambos métodos de análisis para las muestras control y de pacientes se observa en 
las Figuras 15 y 16 respectivamente. 
R² = 0.899
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10 12 14
C
M
IA
CLAR
Muestras de pacientes
43 
3.6.1 Relación entre métodos: CLAR y CMIA
En el gráfico de Bland-Altman se espera una diferencia entre pares de valores que 
presenten una distribución normal y más del 90% de los datos estén dentro de los límites 
de concordancia. 
Figura 14. Gráfico Bland-Altman de concordancia para muestras control analizadas por 
ambos métodos. 
En la figura 14 se presenta el gráfico de Bland-Altman utilizando las diferencias entre 
las concentraciones obtenidas por cada uno de los métodos, CLAR y por CMIA para 
muestras de pacientes. Se observó que los datos se encuentran dentro del límite de ±2 
desviaciones estándar (DE) y están distribuidos alrededor del valor medio que es muy 
cercano a 0, excepto por un punto. 
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
D
ife
re
nc
ia
 c
on
ce
nt
ra
ci
ón
 (C
M
IA
-C
LA
R
)
Valor medio de concentraciones
44 
Figura 15. Gráfico de Bland-Altman para el análisis de muestras de pacientes con ambos métodos 
(CLAR Y CMIA).
En la figura 15 se observan la distribución de las muestras control analizadas todas 
se encuentran dentro de los límites establecidos mostrando así una alto grado de 
concordancia entre los métodos analíticos. 
En ambas gráficas el 93.3% de los datos se encuentran dentro de los límites de 
concordancia, por lo que el análisis con ambos métodos es similar. 
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
D
ife
re
nc
ia
 d
e 
co
nc
en
tr
ac
ió
n 
(C
M
IA
-C
LA
R
)
Valor medio de concentraciones
45 
Conclusiones 
 El método analítico por Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución para
cuantificar carbamazepina en plasma humano desarrollado en este trabajo, de
acuerdo a la NOM-177-SSA1-2013, es selectivo, preciso, exacto y estable dentro de
un intervalo de 0.5 a 20 µg/mL.
 La determinación de concentraciones de carbamazepina comparando los métodos
de CLAR y CMIA mostraron una alta concordancia entre ambos. Por lo que se
concluye que el método por CLAR es una alternativa en la medición de los niveles
de carbamazepina para el monitoreo terapéutico del fármaco en el INNN.
 Por lo anterior, el método validado es confiable para la cuantificación de
carbamazepina en estudios de monitoreo, farmacocinética y biodisponibilidad.
 El método es selectivo en plasma de rata, no obstante, para poder utilizarlo en
estudios de farmacocinética en animales, es necesario determinar la precisión y
exactitud del método en esta matriz biológica.
46 
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48 
15. Secretaría de Salud. (2013). Norma Oficial Mexicana, NOM-177-SSA1-2013, Que
establece las pruebas y procedimiento para demostrar que un medicamento es 
intercambiable. Requisitos a que deben sujetarse los Terceros Autorizados que realicen las 
pruebas de intercambiabilidad. Requisitos para realizar los estudios de biocompatibilidad. 
Requisitos a que deben sujetarse los Terceros Autorizados, Centros de Investigación o 
Instituciones hospitalarias que realicen las pruebas de biocomparabilidad. 
16. Sanches C., López K., Omosako C., Bertoline M., Pereira M., Santos S. (2008).
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19. Vosough M, Ghafghazi S, Sabetkasaei M. (2014). Chemometrics enhanced HPLC–DAD
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20. Secretaría de Salud. (1998). Norma Oficial Mexicana, NOM-177-SSA1-1998, Que
establece las pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es 
intercambiable. Requisitos que deben sujetarse los Terceros Autorizados que realicen las 
pruebas. 
	Portada
	Índice
	1. Introducción
	2. Especificaciones para el Desarrollo Experimental
	3. Resultados y Discusión
	Conclusiones
	Bibliografía