Identificacion-de-Mycobacterium-avium-subsp -paratuberculosis-mediante-tecnicas-de-diagnostico-bacteriologicas-moleculares-y-anatomopatologicas-en-ungulados-silvestres-en-Mexico

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA 
 
 
“IDENTIFICACIÓN DE Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis 
MEDIANTE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICAS, 
MOLECULARES Y ANATOMOPATOLÓGICAS EN UNGULADOS 
SILVESTRES EN MÉXICO”. 
 
TESIS 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
MEDICA VETERINARIA ZOOTECNISTA 
 
PRESENTA 
 
ANA LAURA HERNÁNDEZ REYES 
 
 
Asesores 
 
Gilberto Chávez Gris 
Edith Maldonado Castro 
 
 
Ciudad Universitaria, CDMX. 2018 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
II 
 
 
Dedicatoria 
 
A Dios, porque todo viene de él, Gracias Señor. 
A mi papá Darwin Hernández Chablé por el esfuerzo que hizo y hace cada 
día por darnos lo mejor, por ser el mejor ejemplo a seguir y darme las 
herramientas para llegar hasta donde estoy, a mi mamá Ana María Reyes 
Esparza por siempre creer en mí y por compartir el amor a los animales. 
A mis hermanas, por ser mis mejores consejeras y amigas, a ti Rosi porque 
siempre has estado conmigo, a ti Cary gracias por todo el apoyo que me 
diste a lo largo de la carrera, gracias porque siempre han creído en mí, 
incluso más de lo que yo lo hago, las amo. 
A Alex, gracias por haber estado conmigo desde que inicie la carrera, 
porque has sido mi apoyo en todos los aspectos y siempre me alientas a 
ser mejor, te amo. 
A mi sobrinos Bruno y Victoria, porque algún día leerán esto y sabrán que 
también es para ustedes. 
Gracias a ti Puffy, por traer más alegría a mi vida, por acompañarme esas 
noches de desvelo y por hacer que ame a los gatos. A mis perritos que se 
han ido, gracias a ustedes me esfuerzo cada día para ser mejor, a Rorris, 
mi chica, candy, lolita, mi güera Dolly, siempre están conmigo y a ti ninja 
por darme ese amor acuático. 
A mis amigos de la carrera (no diré nombres para no herir 
susceptibilidades jaja) pero ustedes saben quiénes son, gracias por hacer 
más amenas las clases, la estancia en la Facultad y todas esas aventuras 
en las prácticas. 
 
III 
 
 
Agradecimientos 
 
A Dios nuevamente. 
A mi familia, mis papás porque saben que todo esto por y para ustedes, a 
mis hermanas y Alex porque son lo mejor que tengo, este logro también 
es suyo, los amo. 
Al Dr. Gilberto Chávez Gris, por confiar en mí para este proyecto, por hacer 
todo lo que posible para que se llevara a cabo, por la confianza que me ha 
dado para participar no solo en este, sino en varios proyectos y por todo 
lo que me ha enseñado, no solo en lo profesional, también en lo personal, 
siempre estaré agradecida. 
A Edith Maldonado Castro por ser mi maestra y enseñarme tantas cosas 
en el laboratorio, por contestar mis llamadas de auxilio, gracias también 
por ser amiga. 
Gracias a mis compañeros y amigos de USEDICO, Caro, Montse, Giselle, 
Abril, Jesús y a todos lo demás, por hacer más divertida mi estancia y 
poder estar horas trabajando en el laboratorio, con una mención especial 
a la Dra. Olivia Castillo por siempre estar dispuesta a apoyarme cuando 
tenía dudas. 
A la Dra. Carolina Segundo por apoyarme mientras estuve haciendo mi 
tesis, por siempre saber darme un buen consejo y a todo el personal del 
CEIEPAA y de la USEDICO, gracias don Dani, Eloy, Rocío, Manuel, 
Señora Irma, Noemi y Cecy, por apoyarme de una u otra manera, en la 
realización de mi tesis. 
A la patóloga, Luz Elena Alcaraz Sosa por siempre ser tan accesible y 
alegre, gracias por apoyarme; a todo el personal del zoológico, a los 
IV 
 
cuidadores gracias por ayudarme a obtener las muestras, por siempre 
estar dispuestos a ayudar en todo. 
A los animales de estudio, los orix cimitarra, con mención especial al 
“Guadalajara”, a las jirafas y ñus, gracias por formar parte de mi estudio. 
A la Dirección General de Zoológicos y Vida Silvestre por apoyarme y 
permitirme realizar este proyecto. 
A mi jurado, Dra. Myrna Vicencio, Dr. José Ramírez Lezama, Dra. Beatriz 
Arellano y Dr. Oscar Rico, por su asesoría y comentarios para poder 
mejorar mi trabajo. 
A la Universidad Nacional Autónoma de México, mi Universidad, gracias 
por todas las oportunidades, por todo lo aprendido, es un gran orgullo estar 
en la mejor Universidad de México, a la Facultad de Medicina Veterinaria, 
por todo lo que me ha dado, porque gracias a ella, pude cumplir el sueño 
de ser veterinaria. 
Al Proyecto PAPIIT IT201118 “Evaluación de la vacuna recombinante P35 
en modelo murino y en animales naturalmente infectados con 
Mycobacterium subsp. paratuberculosis” cuyo responsable es el Dr. 
Gilberto Chávez Gris, por el financiamiento brindado para llevar a cabo 
este estudio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
V 
 
Contenido 
RESUMEN ................................................................................................. 1 
Introducción ............................................................................................... 2 
Definición ................................................................................................ 2 
Antecedentes históricos. ......................................................................... 2 
Agente etiológico .................................................................................... 3 
Transmisión ............................................................................................ 5 
Patogenia y signos clínicos .................................................................... 6 
Fases clínicas ......................................................................................... 8 
Hospederos ............................................................................................ 9 
Cepas reportadas de M. paratuberculosis ............................................ 11 
Diagnóstico ........................................................................................... 12 
Control .................................................................................................. 17 
Paratuberculosis y fauna silvestre ........................................................ 20 
Justificación ............................................................................................. 22 
Hipótesis .................................................................................................. 23 
Objetivo general ....................................................................................... 23 
Objetivos específicos ............................................................................ 23 
Material y métodos .................................................................................. 24 
Área de estudio ..................................................................................... 24 
Identificación de animales .................................................................... 24 
Toma y envío de muestras. .................................................................. 25 
Concentración de micobacterias a partir de intestino ........................... 26 
Descontaminación de muestras. .......................................................... 27 
Identificación de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) mediante 
tinción Ziehl-Neelsen ............................................................................ 27 
VI 
 
Aislamiento bacteriológico.................................................................... 28 
Extracción de ADN ............................................................................... 28 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) IS900 ........................... 32 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Tipo específico ............ 32 
Purificación de productos de PCR ........................................................ 33 
Secuenciación ...................................................................................... 34 
Estudios anatomopatológicos ............................................................... 34 
Análisis de la información. Estadística descriptiva ............................... 35 
Resultados ............................................................................................... 36 
Identificación de animales .................................................................... 36 
Toma y envío de muestras ................................................................... 37 
Aislamiento bacteriológico (Löwenstein-Jensen y Herrold) .................. 38 
Identificación de BAAR mediante tinción Ziehl-Neelsen (Z-N) ............. 41 
Extracción de ADN: Cuantificación y evaluación .................................. 44 
PCR IS900 ............................................................................................ 45 
PCR Tipo específico ............................................................................. 46 
Análisis de secuencias ......................................................................... 47 
Estudios anatomopatológicos ............................................................... 48 
Análisis de la información en la especie orix cimitarra. ........................ 52 
Discusión ................................................................................................. 55 
Conclusiones ........................................................................................... 64 
Referencias .............................................................................................. 66 
Anexos ..................................................................................................... 77 
 
 
VII 
 
Figuras 
Figura 1. Pared de micobacterias ............................................................ 4 
Figura 2. Posibles rutas de transmisión e infección de MAC. ............... 10 
Figura 3 Foto grupo de orix cimitarra. .................................................... 36 
Figura 4. Fotografía de colonias bacterianas en cultivo Herrold con yema 
de huevo, piruvato y micobactina (HEYMP). ........................................... 40 
Figura 5. Fotografía de colonias bacterianas en cultivo Herrold con yema 
de huevo, piruvato y micobactina (HEYMP). ........................................... 41 
Figura 6. Fotomicrografía de frotis Z-N positivo a partir de muestras de 
heces de orix cimitarra. ............................................................................ 43 
Figura 7. Fotomicrografía de frotis Z-N positivo a partir de macerado de 
intestino de orix cimitarra. ........................................................................ 43 
Figura 8. Fotomicrografía de frotis Z-N positivo de colonias bacterianas en 
medio cultivo HEYMP, muestras de orix cimitarra................................... 43 
Figura 9. Fotografía de extracción de ADN a partir de muestras de heces 
en gel de agarosa al 1.5%. ...................................................................... 44 
Figura 10. Fotografía de extracción de ADN a partir de muestras de 
secciones de intestino en gel agarosa al 1.5% ....................................... 45 
Figura 11. Fotografía de productos amplificados de PCR IS900 en gel 
agarosa al 1.5% ....................................................................................... 46 
Figura 12. Fotografía de productos amplificados de PCR tipo específico 
en gel agarosa al 1.5% ............................................................................ 47 
Figura 13. Dendograma Neighbour-Joining (NJ) .................................... 48 
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VIII 
 
Figura 14. Sección de intestino de orix cimitarra de una hembra adulta 49 
Figura 15. Sección de intestino de orix cimitarra fijado en formalina 
amortiguada al 10%, de una hembra adulta ............................................ 49 
Figura 16. Fotomicrografía de intestino con infiltrado granulomatoso. ... 50 
Figura 17. Fotomicrografía de vista panorámica de intestino de orix 
cimitarra. .................................................................................................. 51 
Figura 18. Fotomicrografía con infiltrado granulomatoso (Acercamiento).
 ................................................................................................................. 51 
Figura 19. Resultados positivos en cultivo, PCR IS900 y Z-N a partir de 
muestras de heces e intestino de orix cimitarra. ..................................... 53 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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IX 
 
Tablas 
Tabla 1. Identificación de los animales del área de estudio .................... 36 
Tabla 2. Número de muestras de heces obtenidas por especie y por 
periodo ..................................................................................................... 37 
Tabla 3 Descripción de las muestras de intestino obtenidas de la especie 
orix cimitarra ............................................................................................ 38 
Tabla 4 Aislamientos bacteriológicos en medio cultivo HEYMP a partir de 
heces de orix cimitarra. ............................................................................ 38 
Tabla 5. Aislamientos bacteriológicos en medio de cultivo HEYMP a partir 
de muestras de intestino de orix cimitarra .............................................. 39 
Tabla 6. Tiempo de crecimiento de colonias bacterianas en medio HEYMP
 ................................................................................................................. 39 
Tabla 7. Resultado de Z-N a partir de muestras de heces, por especie 
durante las 4 tomas de muestra .............................................................. 42 
Tabla 8. Resultados de Z-N a partir de macerado de intestino en orix 
cimitarra ................................................................................................... 42 
Tabla 9. Resultados de análisis macroscópico e histopatológico de las 
muestras de intestino de la especie orix cimitarra ................................... 52 
Tabla 10. Resultados en cultivo bacteriológico, PCR IS900 y Z-N mediante 
muestras de heces e intestino de orix cimitarra. ..................................... 53 
Tabla 11. Resultados de las pruebas diagnósticas realizadas en todos los 
ejemplares de la especie orix cimitarra ................................................... 54 
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1 
 
RESUMEN 
 
La Paratuberculosis es una enfermedad crónica, causada por Mycobacterium 
avium subsp. paratuberculosis (M. paratuberculosis), se caracteriza por 
presentar una enteritis granulomatosa teniendo como consecuencia, diarrea 
intermitente y pérdida de peso; esta enfermedad afecta a animales domésticos 
y silvestres. Actualmente en México se desconoce la situación sanitaria de la 
paratuberculosis en fauna silvestre, tanto en cautiverio como en vida libre, sin 
embargo es importante conocer el papel que tienen estas especies en la 
transmisión y diseminación de la enfermedad. El objetivo de este estudio fue 
demostrar, mediante diferentes técnicas de diagnóstico y empleando un método 
de muestreo no invasivo, la presencia de M. paratuberculosis, en una UMA de la 
Ciudad de México, en la cual se reporta sospecha de paratuberculosis, en un 
área donde conviven 3 especies de ungulados silvestres, orix cimitarra 
(Oryx dammah), jirafa (Giraffa camelopardalis) y ñu azul (Connochaetes 
taurinus). Durante 8 meses, se realizaron 4 tomas de muestra de heces, 
recolectadas directamente del suelo, obteniendo un total de 56 muestras así 
como, 5 muestras de intestino de orix cimitarra obtenidas en las necropsias 
realizadas durante este periodo. Únicamente en la especie orix cimitarra, se 
demostró la presencia de M. paratuberculosis a partir de muestras de heces e 
intestino. En la PCR IS900, se obtuvieron 2 resultados positivos a partir de 
muestras de heces y 3 a partir de secciones de intestino, en la PCR tipo 
específico, tanto en muestras de heces como de intestino, se obtuvo la 
amplificación de un fragmento correspondiente a la cepa tipo C (cattle). Se 
obtuvieron 6 aislamientos bacteriológicos en medio de cultivo HEYMP, a partir 
de 4 muestras de heces y 2 de intestino, confirmando el aislamiento con la PCR 
IS900. En la revisión anatomopatológica, dos muestras de intestino presentaron 
un engrosamiento de la mucosa intestinal, histopatológicamente se observó un 
infiltrado granulomatoso difuso, con abundantes bacilos ácido alcohol resistentes 
(BAAR), evidenciados en la tinción Ziehl-Neelsen. Este es el primer estudio en 
México, donde se realiza la identificación de M. paratuberculosis mediante 
diferentes técnicas de diagnóstico en la especie orix cimitarra mantenida en 
cautiverio. 
2 
 
Introducción 
 Definición 
Paratuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica debilitante, 
caracterizada por una enteritis granulomatosa, ocasionada por Mycobacterium 
avium subsp. paratuberculosis (M. paratuberculosis) (Chiodini et al. 1984; Cocito 
et al. 1994). Esta enfermedad afecta principalmente a rumiantes domésticos y 
silvestres (Manning & Collins 2001). Su importancia radica en las pérdidas 
económicas que representa en el sector agropecuario. En México, Miranda 
Bandera (2005) calculó pérdidas de $9,116 pesos por vaca, en una hato ubicado 
en Tizayuca, Hidalgo, donde se reportó una seroprevalencia de 24.1%, en este 
estudio se menciona que las mayores pérdidas calculadas, fueron por fallas 
reproductivas y baja producción láctea, siendo la paratuberculosis una de las 
causas. 
Es importante mencionar que la paratuberculosis se ha relacionado con la 
enfermedad de Crohn en humanos, Chiodini y colaboradores (1984) aislaron M. 
paratuberculosis a partir de secciones de intestino de pacientes humanos que 
cursaban con la enfermedad de Crohn, siendo la primera evidencia de la posible 
asociación entre este agente y dicha enfermedad. Sin embargo, actualmente se 
encuentra en discusión la participación de esta micobacteria en el desarrollo de 
Crohn. 
Antecedentes históricos. 
Los primeros reportes relacionados con paratuberculosis, son del año 1820 en 
Estados Unidos, sin embargo no se tenía conocimiento sobre su etiología y fue 
hasta finales del siglo XIX (1894), en Dresden, Alemania, donde, Johne y 
3 
 
Frothingham observaron lesiones granulomatosas con presencia de bacilos 
acido-alcohol resistentes (BAAR), en intestino y linfonodos mesentéricos de un 
bovino, que presentó pérdida de peso y diarrea, proponiendo, para esta 
enfermedad el nombre de “enteritis pseudotuberculosa”. En 1923, el Manual 
Bergey, Determinative Bacteriology, reconoció a la paratuberculosis como una 
enfermedad, denominando al agente causal como Mycobacterium 
paratuberculosis. (Chiodini 2005; Manning & Collins 2010). 
Agente etiológico 
El género Mycobacterium está conformado por bacterias saprófitas, oportunistas 
y patógenas. Dentro de las micobacterias patógenas se encuentran dos 
importantes complejos en veterinaria, el complejo Tuberculosis y el complejo 
Avium; a este último pertenece Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, y 
otras subespecies como, M. avium subsp. avium, M. avium subsp. hominissuis, 
y M. avium subsp. silvaticum (Turenne & Alexander 2010; Thorel et al. 1990). 
La pared celular de las micobacterias está compuesta por peptidoglicanos que 
rodean la membrana celular brindando rigidez, seguido de una capa de 
arabinogalactanos unidos de forma covalente a los ácidos micólicos, los cuales, 
son determinantes en la permeabilidad celular (Figura 1). La estructura de la 
pared celular le permite a la bacteria ser resistente a un bajo pH,altas 
temperaturas y agentes químicos (Whittington et al., 2004). 
4 
 
 
M. paratuberculosis es una bacteria intracelular facultativa, Gram-positiva, con 
un tamaño de 0.5 a 1.5 μm; aerobia, de lento crecimiento (Lambrecht, Carriere 
& Collins, 1988), debido a las características tintoriales que le confiere la 
presencia de ácidos micólicos en su pared, es considerada como una bacteria 
ácido-alcohol resistente (BAAR) (Zimmer et al., 1999). 
Para el desarrollo de micobacterias patógenas como M. paratuberculosis, es 
necesario el hierro, sin embargo para poder ser captado por estas bacterias, es 
indispensable la presencia de sideróforos como la micobactina. A diferencia de 
la mayoría de las micobacterias, M. paratuberculosis no es capaz de producir la 
micobactina, es por ello, que en los medios de cultivo, debe adicionarse (Thorel, 
Krichevsky & Levy-Frebault, 1990). 
Las características estructurales de M. paratuberculosis, hacen que sea 
altamente resistente en el medio ambiente (Whittington et al., 2004), lo que 
permite mantenerse viable. Se sabe que puede permanecer hasta por un año en 
suelo haciendo más fácil la transmisión y diseminación a las especies que se 
encuentren en ambientes contaminados (Manning & Collins 2001). 
Figura 1. Pared de micobacterias 
 
A) Ácidos grasos B) Ácidos micólicos C) Arabinogalactanos D) Peptidoglicanos E) 
Membrana celular 
 
5 
 
Transmisión 
 Fecal - Oral 
Se han reportado diferentes vías de transmisión de M. paratuberculosis, siendo 
la principal la transmisión fecal-oral, en donde las micobacterias son 
diseminadas a través de las heces de animales infectados, posteriormente son 
ingeridas por otros animales a través de agua, leche, pastura o alimento 
contaminados (Ayele et al. 2001; Sweeney 1996; Chiodini et al. 1984). Se ha 
descrito que se necesitan al menos 1x103 unidades formadoras de colonias 
(UFC) de M. paratuberculosis, en 1 gramo de heces, para establecer una 
infección (Whittington & Sergeant 2001). 
 Leche 
En estudios previos se ha demostrado la excreción de M. paratuberculosis en 
leche, obteniendo aislamientos en cultivo bacteriológico a partir de la misma 
(Sweeney, Whitlock & Rosenberger, 1992a; Dimareli-Malli, 2010). Los neonatos 
son los más susceptibles, ya que al tener el sistema inmune inmaduro, pueden 
infectarse, al tomar calostro o leche con M. paratuberculosis, o bien mediante la 
glándula mamaria contaminada con heces (Cocito et al., 1994; Sweeney, 1996). 
 Intrauterina 
La transmisión intrauterina por M. paratuberculosis fue descrita por primera vez 
en 1935 (Sweeney, 1996), desde entonces se han realizado estudios en 
animales domésticos y silvestres, comprobando esta vía de transmisión. En el 
año 2009, al realizarse un meta-análisis con el fin de conocer la prevalencia de 
las infecciones intrauterinas en becerros, se observó una prevalencia del 13%, 
siendo mayor en los fetos de vacas que tenían presentación clínica de la 
enfermedad. (Whittington & Windsor 2009). En fauna silvestre también se ha 
6 
 
demostrado la transmisión uterina, obteniendo aislamiento bacteriológico a partir 
de fetos de ciervo rojo, sin embargo aún se desconoce el mecanismo de cómo 
llega M. paratuberculosis al feto (Mackintosh & Koets 2006). 
 Semen 
Otra vía de transmisión reportada es el semen (Larsen et al., 1981), en ganado 
bovino, se ha aislado M. paratuberculosis a partir vesículas seminales, epidídimo 
y testículos de toros (Ayele et al., 2004), sugiriendo que los machos puedan 
infectar a las vacas a través de la monta directa o por inseminación artificial. 
Patogenia y signos clínicos 
 
Una vez que M. paratuberculosis entra al organismo a través de su ingesta oral, 
se dirige al intestino, principalmente a yeyuno y la región terminal del íleon, este 
último es el principal portal de entrada, ya que hay gran cantidad de células M, 
las cuales están presentes en la cúpula subepitelial que cubre las placas de 
Peyer; la micobacteria es captada por estas células y mediante un proceso 
conocido como transcitosis, es liberada en la submucosa intestinal donde será 
fagocitada por los macrófagos (Momotani et al., 1988; Sweeney, 2011). Dentro 
de los macrófagos, M. paratuberculosis cuenta con diferentes mecanismos de 
sobrevivencia, uno de ellos es la inhibición de la maduración del fagosoma, al 
impedir la acidificación del mismo, evitando su fusión con el lisosoma, 
interfiriendo en el reconocimiento y la respuesta del hospedador (Momotani et 
al., 1988; Clarke, 1997; Hostetter et al., 2003). Los macrófagos que han sido 
infectados por M. paratuberculosis, liberan algunas citocinas como TNFα, IL-1, 
IL-12 e IL-8, que estimulan el reclutamiento progresivo de linfocitos y macrófagos 
7 
 
para finalmente formar las lesiones granulomatosas (Clarke, 1997; Waters et al., 
2003). 
El infiltrado granulomatoso se observa macroscópicamente como un 
engrosamiento de la mucosa intestinal, que en fases iniciales se encuentra de 
forma focal o multifocal en íleon y yeyuno; en fases avanzadas, el proceso 
inflamatorio es difuso, extendiéndose hasta intestino grueso. Estas lesiones 
también se observan en linfonodos mesentéricos e ileocecales, así como vasos 
linfáticos adyacentes. Histológicamente el infiltrado granulomatoso está 
compuesto por macrófagos, células epitelioides, células gigantes y linfocitos; las 
vellosidades se encuentran acortadas y engrosadas lo cual reduce la capacidad 
de absorción intestinal (Sweeney, 2011) 
Hay dos tipos de lesiones granulomatosas que pueden presentarse en 
paratuberculosis (Perez, Marin & Badiola, 1996; Clarke, 1997) 
 Lesiones tuberculoides o paucibacilares: Asociadas a lesiones iniciales, 
formadas por infiltrado de linfocitos con escasa presencia de bacilos, 
escasos macrófagos y células gigantes multinucleadas. 
 Lesiones lepromatoides o multibacilares: Están menos organizadas y 
compuestas por numerosos macrófagos y células epitelioides con 
abundantes bacilos. 
La presentación clínica de la enfermedad es comúnmente asociada a una 
transición de una respuesta inmune celular, basada en la producción de 
Interferon Gamma, a una respuesta inmune humoral caracterizada por la 
producción de anticuerpos y de citocinas como IL-4 e IL-10 (Ellingson et al., 
2005; Sweeney, 2011). Ante una falta de control de la infección, la tasa de 
8 
 
excreción de M. paratuberculosis por heces incrementa, así como la 
diseminación a otros órganos como testículos (Ayele et al., 2004), útero y 
glándula mamaria (Sweeney, Whitlock & Rosenberger, 1992a; Van Kooten, 
Mackintosh & Koets, 2006). 
Al cuadro clínico se le conoce como Enfermedad de Johne; en la mayoría de las 
especies los signos clínicos se presentan entre los 3 - 5 años, sin embargo hay 
reportes en ciervo rojo donde se presentaron antes del año de edad (Mackintosh 
et al., 2010). Los principales signos son, pérdida de peso, diarrea de manera 
inicial intermitente, que posteriormente se convierte en persistente, en algunos 
casos también se observa pelaje áspero y edema submandibular. Se estima que 
por cada animal que presenta signos clínicos, existen de 5 a 10 en etapa 
subclínica (Chiodini et al. 1984; Cocito et al. 1994) 
Fases clínicas 
 
De acuerdo a Whitlock y Buergelt (1996), se reconocen 4 fases de la 
enfermedad. 
1. Fase silenciosa: Animales menores a 2 años que no presentan signos 
clínicos de la enfermedad pero pueden eliminar a la bacteria en heces a 
niveles bajos. Principalmente se observa una respuesta inmune celular. 
2. Fase subclínica. Animales que se identifican como clínicamente sanos y 
están infectados con la micobacteria, estos animales pueden excretar a 
M. paratuberculosis en heces en cantidades variables y de manera 
intermitente. Se asocia a una respuesta inmune celular, con un 
incremento de la respuesta inmune humoral. 
9 
 
3. Fase clínica. donde se encuentran animales con signosclínicos como 
diarrea y pérdida de peso, eliminan micobacterias por heces y leche. 
Existe una alta respuesta inmune de tipo humoral. La mayoría de estos 
animales dan positivos a pruebas para detectar M. paratuberculosis en 
heces o anticuerpos. Se observan cambios patológicos como 
engrosamiento de la mucosa intestinal. 
4. Fase avanzada de la enfermedad. Animales que presentan pérdida de 
peso y diarrea profusa, emaciación, edema submandibular y reducción en 
la producción láctea. Eliminan gran cantidad de micobacterias por heces 
y leche, además de presentar una alta respuesta inmune humoral. 
Histológicamente se observa una enteritis granulomatosa con marcada 
infiltración celular (Whitlock & Buergelt 1996; McSpadden et al. 2013). 
Hospederos 
 
Paratuberculosis tiene como hospederos a los rumiantes domésticos y 
silvestres, sin embargo se han realizado más estudios en rumiantes domésticos, 
debido a las repercusiones económicas que representa (Chiodini et al. 1984). Se 
han reportado casos positivos de rumiantes silvestres, tanto en vida libre como 
en cautiverio, siendo los del orden Artiodactyla los de mayor incidencia (Manning, 
2011). 
En animales no rumiantes, también se han realizado aislamientos 
bacteriológicos de M. paratuberculosis a partir de tejido y heces; existen reportes 
en conejo (Oryctolagus cuniculus), mapache (Procyon lotor), armadillo (Dasypus 
novemcinctus), zarigüeya (Didelphis virginiana), gatos ferales (Felis catus) y 
zorros (Vulpes vulpes), entre otras especies, comprobado su participación como 
10 
 
reservorios en la transmisión de M. paratuberculosis, diseminando a la bacteria 
por heces (Beard et al., 2001; Corn et al., 2005; Nugent et al., 2011). 
En general en las especies del Complejo Mycobacterium avium, se han descrito 
en un amplio rango de hospedadores de especies domésticas, por lo cual el 
consumo de productos derivados o el contacto con estos animales también 
podría constituir una vía de potencial infección para el hombre (Figura 2). 
 
 
En la figura se observa las posibles rutas de transmisión de MAC entre el medio 
ambiente, fauna silvestre, ganado doméstico y el humano. 1. Infección oral; 2. Infección 
por aerosoles; 3. Infección pasiva 4. Infección a través de productos derivados; 5. 
Infección por depredación. Tomado de Tesis doctorado: Caracterización molecular de 
aislados de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Mapa epidemiológico en 
España. Elena Castellanos Rizaldos. 2010 (adaptación de Biet y col. 2005). 
 
 
 
Figura 2. Posibles rutas de transmisión e infección de MAC. 
11 
 
Cepas reportadas de M. paratuberculosis 
 
Se han reportado 2 principales tipos de cepas de M. paratuberculosis las cepas 
tipo I o S (sheep) y la tipo II o C (cattle) (Collins, De Zoete & Cavaignac, 2002). 
Estas cepas fueron nombradas así, por el hospedero en el fueron aisladas por 
primera vez, actualmente se conoce que las cepas no son exclusivas de un 
hospedero (Stevenson, 2010). 
La cepa C se ha reportado en un amplio rango de hospederos, como bovinos y 
animales silvestres, por lo que, se considera más patógena en comparación con 
la cepa S la cual solo ha sido aislada en borregos y cabras domésticos (Motiwala 
et al., 2004). Las colonias bacterianas de la cepa C tienen mejor desarrollo en 
medio de cultivo Herrold y su crecimiento es más rápido (4-16 semanas) en 
comparación con la cepa S, que puede desarrollarse entre 4 meses y un año (De 
Juan et al., 2006; Florou et al., 2009). Dentro de estas cepas, existen subtipos, 
que se han determinado por medio de pruebas moleculares más específicas, 
como la técnica de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), 
la cual ha permitido identificar subtipos como el III o I (intermedia) y la “Bison 
type” (Pavlik et al., 1999; Whittington, Marsh & Whitlock, 2001). Otra técnica es 
la de Unidades Repetitivas Intergénicas dispersas de las micobacterias-
Repeticiones en Tandem de Número Variable (MIRU-VNTR por sus siglas en 
inglés) (Möbius et al., 2008), la cual permite una subtipificación molecular, con el 
fin de conocer y entender la epidemiología de M. paratuberculosis. 
 
 
12 
 
Diagnóstico 
 
El diagnóstico de la paratuberculosis no es un procedimiento sencillo, ya que los 
signos clínicos no se observan en las fases finales de la infección y para 
determinar en el resto de los animales, cuáles se encuentran en la etapa 
subclínica, es necesario utilizar una o varias pruebas de diagnóstico. Las 
pruebas diagnósticas se dividen en la identificación del agente causal de la 
enfermedad (M. paratuberculosis) y en la determinación de la respuesta inmune 
evocada en el animal a la infección, ya sea humoral o celular. La Organización 
Mundial de Sanidad animal, mejor conocida como OIE recomienda técnicas de 
diagnóstico para la paratuberculosis como, estudios anatomopatológicos, la 
tinción Ziehl-Nielseen, el cultivo bacteriológico, la prueba de Fijación del 
Complemento, Inmunoensayo Enzimático (ELISA), Inmunodifusión en Gel Agar 
(IDGA), Interferón Gamma, la prueba de hipersensibilidad de tipo retardado o 
Johnina y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Organización Mundial 
de Sanidad Animal, 2014). 
Pruebas de identificación de M. paratuberculosis 
 Diagnóstico anatomopatológico 
El diagnóstico anatomopatológico se hace a través de la necropsia, en donde se 
buscan lesiones macroscópicas y microscópicas que sugieren una infección por 
paratuberculosis. En las lesiones macroscópicas se observa engrosamiento de 
la mucosa, principalmente de íleon, yeyuno y válvula íleocecal. Otro hallazgo son 
los linfonodos mesentéricos aumentados de tamaño, fusionados y edematosos; 
así como ascitis en algunos casos. Para confirmar el diagnóstico se deben tomar 
muestras de intestino y linfonodos mesentéricos con sospecha de 
paratuberculosis, con el fin de comprobar mediante histopatología el infiltrado 
13 
 
granulomatoso compuesto por macrófagos, células epitelioides, linfocitos y en 
ocasiones células gigantes donde generalmente se encuentran agregados de 
micobacterias (Clarke & Little 1996; Chiodini et al. 1984). 
 
 Tinción Ziehl-Neelsen 
La tinción se hace a partir de frotis de heces, tejido o colonias en cultivo 
bacteriológico, tiene la finalidad de detectar bacilos ácido alcohol resistente 
(BAAR), entre los que se encuentra M. paratuberculosis. En esta tinción se 
aprovechan las características estructurales de la pared de las micobacterias, 
las cuales retienen colorante fucsina después del empleo de alcohol ácido, 
donde los bacilos se observan de color rosa intenso, M. paratuberculosis, se 
observa como agregados de bacilos cortos. Esta prueba, es simple, rápida y 
económica pero tiene la desventaja de poseer una sensibilidad baja (15%) (Ris, 
Hamel & Ayling, 1988; Zimmer et al., 1999; Maroudam et al., 2015). 
 Cultivo bacteriológico 
El cultivo bacteriológico ha sido considerado como la “prueba de oro” ya que 
presenta un 100% de especificidad, no obstante presenta una sensibilidad entre 
39% y 82% (Collins et al., 2006; Timms et al., 2011). Mediante el cultivo, se 
puede detectar a la mayoría de los animales en estados avanzados de la 
enfermedad, pero solo unos cuantos en fases iniciales (Whitlock et al., 2000). M. 
paratuberculosis es una bacteria de lento crecimiento in vitro, se requiere entre 
8 y 40 semanas para desarrollar colonias visibles, lo cual hace que este método 
de diagnóstico no sea el más eficiente (Lambrecht, Carriere & Collins, 1988). Es 
indispensable adicionar micobactina a los medios para lograr el aislamiento, ya 
14 
 
que, como se ha mencionado anteriormente M. paratuberculosis es dependiente 
de micobactina (Thorel, Krichevsky & Levy-Frebault, 1990). 
El cultivo puede realizarse a partir de diferentes muestras como heces, sangre, 
leche, tejidos infectados. Las muestras de heces y tejidos deben someterse adescontaminación previa, para inhibir el crecimiento de otras bacterias y hongos, 
empleando sustancias químicas como ácido oxálico con hidróxido de sodio o 
cloruro de cetilpiridinium (HCP) (Payeur, 2005). 
Existen medios de cultivo sólidos y líquidos, siendo los sólidos, los más 
utilizados, debido a que son más baratos y se requiere menos material. 
Löwenstein-Jensen y Herrold son los más utilizados, aunque también existe el 
medio Middelbrok 7H9 y 7H11 (Whittington, 2010). Se han desarrollado otros 
procedimientos para mejorar los tiempos requeridos para su aislamiento, como 
el medio líquido BACTEC™ 12B, en donde mediante una técnica de cultivo 
radiométrico se reduce el tiempo de incubación, además de ser considerado el 
medio de cultivo más sensible, aunque tiene un costo elevado (Whittington et al., 
1999). 
Se considera que en el medio de Löwenstein-Jensen, es más útil para el 
desarrollo de M. paratuberculosis de origen ovino y caprino, mientras que a partir 
de las muestras provenientes de bovinos e incluso de rumiantes silvestres el 
medio Herrold con yema de huevo y adicionado con piruvato de sodio ofrece 
mejores resultados (Whittington et al., 1999; Nielsen, Kolmos & Christoffersen, 
2004). 
 
15 
 
 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en 
inglés). 
Es una prueba molecular, que puede realizarse a partir de muestras como sangre 
completa, heces, leche, tejido, así como cultivos bacterianos. Presenta una 
especificidad de 100% de sensibilidad cuando se emplea para confirmar el 
diagnóstico a partir de colonias bacteriológicas, no obstante cuando se utilizan 
muestras biológicas, la sensibilidad baja hasta 30%, siendo una de las causas, 
los inhibidores de PCR, presentes en las muestras (Stevenson & Sharp 1997; 
Manning & Collins 2001; De Juan Ferré 2005). Una de las ventajas de esta 
técnica, es que el resultado puede obtenerse el mismo día que se recibe la 
muestra y no requiere que la bacteria esté viva al momento de procesarla. 
El diagnóstico de M. paratuberculosis mediante esta técnica, se basa en la 
detección de fragmentos de secuencias específicas del genoma de la bacteria, 
estas secuencias se eligen por su alto número de copias dentro del genoma, la 
secuencia de inserción IS900, es una de las más empleadas en el diagnóstico 
debido a que encuentran de 15 a 20 copias de ésta, en el genoma (Vary et al., 
1990). Existen otras secuencias para el diagnóstico como ISMap02 con un total 
de 6 copias (Paustian et al. 2004; Stabel y Bannantine 2005), IS1311 con 7 
copias, F57 (Vansnick et al., 2004) y HspX (Stabel et al., 2004) con una copia, 
sin embargo, el poseer menos cantidad de copias reduce la sensibilidad de la 
prueba. 
También es posible la identificación de cepas reportadas en M. paratuberculosis, 
tipo C (Cattle), S (Sheep) o I (Intermedia) mediante una PCR (Collins et al. 2002), 
o estudios de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción para la 
tipificación molecular de las cepas (Pavlik et al., 1999). 
16 
 
Pruebas de detección de la respuesta inmune contra M. 
paratuberculosis 
 Prueba de intradermoreacción 
Es una prueba de detección de inmunidad celular, también conocida como 
johnina; se ha empleado de forma similar a la tuberculina, en la cual se hace la 
aplicación intradérmica de un antígeno de M. paratuberculosis, un derivado 
proteico purificado (PPD). Esta prueba es capaz de detectar primordialmente a 
animales que están en fases iniciales de infección (Organización Mundial de 
Sanidad Animal, 2014). Actualmente, ya no se emplea, debido a la reacción 
cruzada con otras micobacterias (Kalis et al., 2003). 
 Prueba de interferon gamma 
Se basa en la detección de IFNγ producido por los linfocitos T durante un periodo 
de incubación de 18-36 horas con un antígeno específico, que es un PPD. 
Después la evaluación cuantitativa se hace mediante un ELISA, sin embargo, la 
especificidad varía de 67% al 94%, con una sensibilidad del 70%. (Kalis et al., 
2003; Organización Mundial de Sanidad Animal, 2014). 
 Ensayo de Inmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA) 
El ELISA es la prueba de detección de respuesta inmune humoral más utilizada 
para el diagnóstico de paratuberculosis, detecta anticuerpos del isotipo G (IgG) 
mediante su unión a un antígeno determinado, esto significa que la sensibilidad 
y especificidad de la prueba, depende en gran medida del tipo de antígeno 
empleado y si éste es compartido con otras bacterias del género Mycobacterium. 
Algunos de los antígenos empleados son, la proteína 85, PPA-3, 35 kDa y 
Superoxido Dismutasa (SOD) (Collins, 1996; Organización Mundial de Sanidad 
Animal, 2014). Actualmente existen pruebas de ELISA, que han mejorado su 
17 
 
sensibilidad y especificidad, Castrellón-Ahumada (2012) desarrolló una 
metodología diagnóstica basada en la detección de anticuerpos contra la 
proteína P35, cuya sensibilidad es del 100% y la especificidad es del 92% al 
compararla con el aislamiento bacteriológico a partir de heces de ovinos. 
 Inmunodifusión en gel de agar. 
IDGA es una prueba de detección de la respuesta inmune humoral, es útil en 
animales clínicamente sospechosos, principalmente a animales domésticos. 
Esta prueba detecta reacciones antígeno-anticuerpo en un medio semisólido, 
como lo es el gel agarosa, las cuales se observan como una banda de 
precipitación después de un periodo de incubación de 48 horas (Manning & 
Collins 2001; Organización Mundial de Sanidad Animal 2014). La sensibilidad 
varía siendo de 90-95% en etapas clínica y avanzada, y hasta 30% en etapas 
subclínicas (Yayo Ayele, Macháčková & Pavlík, 2001). 
 Fijación del complemento. 
 
Esta prueba se basa en la capacidad del complemento para unirse a los 
complejos antígeno anticuerpo. Es una prueba útil para la confirmación del 
diagnóstico de animales con signos clínicos sugerente de enfermedad de Johne, 
sin embargo no es lo suficientemente sensible (40%), no obstante presenta una 
especificidad del 90%. (Sockett et al., 1992; Organización Mundial de Sanidad 
Animal, 2014). 
Control 
Para un adecuado programa de control es necesario tomar en cuenta las 
características del agente etiológico, las vías de infección, su resistencia al medio 
ambiente, así como el tipo de producción animal y las pruebas de diagnóstico 
18 
 
elegibles que mejor se adecuen a la especie en la que se va a llevar a cabo las 
estrategias de control. 
 Probar-eliminar 
Esta propuesta, se basa en realizar pruebas de diagnóstico para detectar, tanto 
animales que estén eliminando M. paratuberculosis, como para la confirmación 
de la enfermedad en aquellos con sospecha clínica, las pruebas más utilizadas 
son PCR, ELISA y cultivo bacteriológico de muestras de heces (Roussel, 2011), 
los animales que resulten positivos son eliminados, con el fin, de evitar la 
diseminación de la enfermedad a los demás animales sanos, sin embargo, es 
importante mencionar que esta medida de control no aplica en todos los casos, 
ya que se debe considerar el número de animales infectados, las pérdidas 
económicas y genéticas que se generan al sacrificar a los animales positivos a 
paratuberculosis. Para que esta medida de control sea efectiva, es necesario 
conjuntarlo con medidas de bioseguridad (Lu et al., 2008). 
 Medidas de bioseguridad 
Considerando que las principales vías de excreción son las heces y la leche, que 
los animales más susceptibles son los recién nacidos y que M. paratuberculosis 
se caracteriza por ser altamente resistente al medio ambiente (Manning & Collins 
2001), las principales medidas de bioseguridad van dirigidas a estos puntos 
críticos. Ejemplos de estas medidas son, evitar la introducción de animales con 
sospecha clínica o que no se les hayan realizado pruebas de diagnóstico, 
separar a los neonatos de madres que sean positivas, alimentarlos con calostro 
y leche libre de paratuberculosis, limpieza y desinfecciónde áreas de 
confinamiento y material utilizado en las mismas, así como evitar fertilizar las 
19 
 
praderas con estiércol proveniente de animales infectados (Committee on 
Diagnosis and Control of Johne’s Disease, 2003). 
 Vacunación 
Esta estrategia ha mostrado su eficacia principalmente en rumiantes domésticos, 
en hatos o zonas con alta incidencia de paratuberculosis. Países como 
Inglaterra, Francia, Holanda, Estados Unidos e Islandia han logrado reducir la 
presentación clínica de paratuberculosis por medio de la aplicación de vacunas 
contra este agente. Se ha demostrado que la vacuna reduce la presentación de 
los signos clínicos, así como como la tasa de excreción de micobacterias. 
Actualmente existen en el mercado mundial vacunas vivas atenuadas, no 
atenuadas y bacterinas, las cuales han demostrado incrementar la respuesta 
inmune celular (Faisal et al., 2013). 
Una de las desventajas de la vacunación es que puede llegar a ocasionar 
granulomas en el sitio de la aplicación, además de la interferencia diagnóstica 
en pruebas serológicas y pruebas oficiales de diagnóstico frente a la tuberculosis 
(Patton, 2011). En los programas de erradicación de la tuberculosis bovina se 
utilizan dos tuberculinas hechas a partir de derivados proteicos puros purificados 
(PPDs) de Mycobacterium bovis y Mycobacterium avium subsp. avium (Maa), 
estas dos micobacterias son genéticamente similares a M. paratuberculosis por 
lo cual existe una gran posibilidad, de que una infección con M. paratuberculosis 
pueda dar respuesta a animales reactivos. Debido a esto, la vacunación en 
ganado bovino está prohibida en países que tienen un programa de erradicación 
de la tuberculosis bovina, como México (SAGARPA 1996). Actualmente se están 
desarrollado vacunas que contienen antígenos que no son compartidos con las 
micobacterias del Complejo Tuberculosis (González-Rodríguez, 2016). 
20 
 
Paratuberculosis y fauna silvestre 
La pérdida del hábitat, el incremento de la población humana, el aumento en las 
producciones ganaderas y el cambio de uso suelo, son algunas de las causas 
que facilitan la transmisión de enfermedades entre ganado doméstico, animales 
silvestres y humanos (Miller, Farnsworth & Malmberg, 2013). M. paratuberculosis 
es un agente infeccioso que tiene la capacidad de infectar a rumiantes y no 
rumiantes silvestres, aunque la mayoría de las investigaciones están enfocadas 
a los rumiantes domésticos, en la última década se han incrementado los 
estudios en animales silvestres, comprobando la presencia de M. 
paratuberculosis en estas especies, y su participación como posibles fuentes de 
transmisión, haciendo que sea necesario conocer su estado sanitario, para 
generar programas de control de la enfermedad, tanto en animales silvestres 
como domésticos (Manning, 2011; Carta et al., 2013; Gortazar et al., 2015). 
Se ha aislado a M. paratuberculosis en ungulados silvestres alrededor del mundo 
(Mackintosh & Griffin 2010). Algunos ejemplos son, bisontes (Bison bison) 
(Buergelt & Ginn 2000) y wapití (Cervus elaphus) en Estados Unidos, (Manning 
et al., 1998) búfalo de agua (Bubalus bubalis) en la India (Sivakumar, Tripathi 
and Singh, 2005), dromedarios (Camelus dromedarius), camello bactriano 
(Camelus bactrianus) en Irán (Haghkhah et al., 2015), gamo europeo (Dama 
dama) en España (Marco et al., 2002), entre otros, donde se ha demostrado que 
presentan signos clínicos y lesiones similares que en animales domésticos 
(Buergelt & Ginn 2000; Manning 2011). Se conoce que el ciervo rojo es más 
susceptible a M. paratuberculosis en comparación con otras especies, teniendo 
presentaciones clínicas al año de edad (Mackintosh et al., 2010), además de un 
alto porcentaje en transmisiones intrauterinas. En un estudio realizado en Nueva 
21 
 
Zelanda, en 2006, se encontró a fetos infectados con M. paratuberculosis en el 
90% de las hembras con presentación clínica (Van Kooten, Mackintosh & Koets, 
2006). 
La transmisión de M. paratuberculosis entre ganado y fauna silvestre de vida 
libre se ha documentado, de ganado bovino a ciervo rojo en Alemania (Fritsch et 
al., 2012), nilgo azul (Boselaphus tragocamelus) a borregos y cabras en la India 
(Kumar et al., 2010), en ganado bovino y pudu (Pudu puda) en Chile (Salgado et 
al., 2015), con esto se comprueba la importancia de tomar en cuenta a los 
animales silvestres, al crear programas de control de M. paratuberculosis, sobre 
todo en las zonas de contacto o interfaces de animales domésticos y silvestres. 
El control de M. paratuberculosis en animales en cautiverio, principalmente en 
colecciones de zoológico es muy importante, ya que se encuentran especies de 
alto valor genético, así como especies en programas de conservación (Manning, 
2011). Se estima que una tercera parte de los zoológicos pertenecientes a la 
Asociación Americana de Acuarios y Zoológicos ha presentado al menos un caso 
de M. paratuberculosis, es importante recordar que los animales en cautiverio 
están frecuentemente expuestos a factores de estrés lo cual facilita la 
presentación clínica de paratuberculosis (Manning & Collins 2001). 
 
 
 
22 
 
Justificación 
Paratuberculosis es una enfermedad crónica que causa enteritis granulomatosa 
teniendo como consecuencia, diarrea intermitente y pérdida de peso llegando a 
ocasionar la muerte (Manning & Collins 2010). M. paratuberculosis es un agente 
infeccioso que tiene la capacidad de infectar a rumiantes silvestres, aunque la 
mayoría de las investigaciones están enfocadas a los rumiantes domésticos, en 
la última década se han incrementado los estudios en animales silvestres, 
comprobando la presencia de M. paratuberculosis en estas especies, 
participando como posibles fuentes de transmisión a otras especies. (Manning, 
2011; Carta et al., 2013; Gortazar et al., 2015). 
Actualmente en México se desconoce la situación sanitaria de paratuberculosis 
en fauna silvestre tanto en cautiverio como en vida libre, son pocos los reportes 
que existen sobre la enfermedad (Rendón-Castro, 2009). Por lo anterior, es 
relevante la realización estudios con el fin de conocer el estado sanitario de la 
enfermedad, utilizando diferentes pruebas diagnósticas, así como el tipo de 
muestras aplicables en estas especies, para poder realizar el aislamiento e 
identificación de M. paratuberculosis, ya que, una vez conociendo el estado 
sanitario se podrán proponer estrategias de control y brindar una mejor calidad 
de vida a los animales. La pérdida de ejemplares ya sea en vida libre o cautiverio, 
genera una disminución en la diversidad de especies sobre todo en aquellas que 
se encuentran en peligro de extinción. 
 
23 
 
Hipótesis 
Demostrar la presencia de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, en 
ungulados silvestres, dentro de la Unidad de Manejo para la Conservación de 
Vida Silvestre (UMA), realizando una toma de muestras no invasiva, mediante 
técnicas de diagnóstico como PCR, cultivo bacteriológico y estudios 
anatomopatológicos. 
Objetivo general 
Realizar el aislamiento e identificación de M. paratuberculosis en una UMA 
donde conviven diversas especies de ungulados silvestres, a partir de muestras 
de heces e intestino mediante técnicas de diagnóstico como cultivo 
bacteriológico, estudios anatomopatológicos, PCR y secuenciación de 
aislamientos bacteriológicos. 
Objetivos específicos 
 Aislar M. paratuberculosis mediante cultivo bacteriológico a partir muestras 
de heces e intestino de los animales del área de estudio. 
 Identificar un fragmento de la secuencia de inserción IS900 mediante PCR a 
partir de muestras de heces e intestino de los animales dentro del área de 
estudio. 
 Determinar el tipo de cepa de M. paratuberculosis mediante de PCR tipo 
específico, en los casos positivos a PCR IS900. 
 Realizar la secuenciación del fragmento amplificado de los productos de PCR 
IS900 a partirde colonias bacterianas de M. paratuberculosis para determinar 
el origen de los aislamientos obtenidos. 
24 
 
 Identificar lesiones mediante estudios anatomopatológicos de intestino 
delgado, a partir de la mortalidad de las especies de ungulados del área de 
estudio en un periodo de ocho meses. 
Material y métodos 
Área de estudio 
El presente estudio se realizó dentro de una Unidad de Manejo para la 
Conservación de Vida Silvestre (UMA) en la Ciudad de México (CDMX). Las 
características meteorológicas en el área donde se encuentra la UMA, presentan 
una temperatura promedio de 17.9 °C y precipitación pluvial anual de 655.9 mm. 
(Albanil, A. Pascual, R. Lopez, 2016). 
En el área de estudio conviven tres especies de ungulados silvestres: 8 
ejemplares de orix cimitarra (Oryx dammah), 5 de jirafa (Giraffa camelopardalis) 
y 3 de ñu azul (Connochaetes taurinus). En esta área se reportó sospecha clínica 
de paratuberculosis en la especie orix cimitarra, al mostrarse signos clínicos de 
diarrea y pérdida progresiva de peso. 
Identificación de animales 
Los animales no cuentan con aretado o algún otra forma de identificación, por lo 
cual, se identificó a cada individuo, con base en sus características anatómicas 
y señas particulares, se asignó una letra y un número a cada ejemplar; la letra 
“O” a los ejemplares de orix cimitarra, la letra “J” a las jirafas y la letra “Ñ” a los 
ñus. 
25 
 
Toma y envío de muestras. 
Se tomaron muestras de heces e intestino en un periodo de 8 meses entre 2016 
y 2017, estas muestras fueron procesadas en el Laboratorio de Microbiología 
Molecular en la Unidad de Servicios de Diagnóstico y Constatación (USEDICO), 
perteneciente al Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción 
Animal en Altiplano (CEIEPAA), de la Facultad de Medicina Veterinaria (FMVZ), 
de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), ubicado en la 
Carretera Federal Tequisquiapan a Ezequiel Montes, km. 8.5. Municipio de 
Tequisquiapan, Querétaro. 
 Heces 
Las muestras de heces se tomaron de manera no invasiva en cuatro periodos 
con intervalos de 2 meses, durante noviembre-diciembre 2016, enero-febrero 
2017, marzo-abril 2017, y durante mayo-junio 2017; recolectando al menos 10 
gramos directamente del suelo. La colecta se hizo mediante la observación 
directa del animal que eliminó las heces, así como por la morfología de las 
mismas (Liebenberg, 1990; Chame, 2003), con el fin de que las muestras fueran 
identificadas por individuo y correspondieran al mismo día en que se realizó el 
muestreo. Todas las muestras obtenidas fueron identificadas indicando la fecha 
de colecta y número de identificación del individuo, se mantuvieron en una 
hielera con refrigerantes, posteriormente fueron llevadas al Laboratorio de 
Microbiología Molecular de la USEDICO, donde se procesaron antes de las 72 
horas de su colecta, manteniéndolas en refrigeración a 4°C. En aquellos casos 
donde el procesamiento fue posterior a las 72 horas se mantuvieron en 
congelación a -20 °C. (Vansnick et al., 2005; Münster et al., 2013). 
26 
 
 Intestino 
Se obtuvieron 5 muestras de intestino a partir de la mortalidad de los ungulados 
dentro del área de estudio. Las muestras se tomaron durante las necropsias 
realizadas por el personal de la UMA, en el periodo de ocho meses. Fueron 
divididas en dos secciones, una se fijó en formalina amortiguada al 10% para 
estudios anatomopatológicos y la otra mitad se mantuvo en congelación a -20°C 
hasta la realización del aislamiento bacteriológico en el laboratorio de 
Microbiología Molecular de la USEDICO. 
Concentración de micobacterias a partir de intestino 
La concentración de micobacterias a partir de la mucosa intestinal se hizo 
empleando la versión de Ratnamohan y Spencer (1986), modificada por Estévez 
y Chávez-Gris (2007), se lavó una sección de intestino de aproximadamente 30 
a 40 cm de largo con una solución de ampicilina (Pisa®) a una concentración 
de 200 mg/ml en agua destilada; después se hizo un raspado de la mucosa, 
posteriormente se maceró mediante disrupción física empleando un tenbroeck, 
al macerado se agregaron 150 ml de solución de tripsina al 0.5% (Gibco™) 
disuelta en PBS ajustando el pH entre 7.5 y 8, se mantuvo en agitación por una 
hora y se dejó toda la noche en refrigeración a 4°C. Al día siguiente se centrifugó 
a 4,000 rpm/20 min, a la pastilla obtenida se agregó 100 ml de PBS con 20 mg 
de lisozima y se colocó en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente, se 
centrifugó nuevamente a 4000 rpm/20 minutos; la pastilla obtenida se disolvió 
con 10 ml de agua destilada, se repitió el procedimiento de centrifugación y se 
agregaron 5 ml de agua destilada estéril. Este macerado de intestino se mantuvo 
a -20° C hasta procesamiento. 
27 
 
Descontaminación de muestras. 
Antes de la siembra en cultivo bacteriológico las muestras se descontaminaron 
adicionando cloruro de cetilpiridinium (HCP) al 0.75% (Ver Anexo I). (Whipple, 
Callihan & Jarnagin, 1991). 
 Descontaminación a partir de intestino 
Se agregó 10 ml de cloruro de cetilpiridinium (HCP) al 0.75% (Ver Anexo I), a 5 
ml del concentrado de micobacterias con agua destilada, se mezcló con un 
homogeneizador eléctrico y se dejó sedimentar por 3 días, para después ser 
sembrado en los medios de cultivo. 
 Descontaminación a partir de heces 
Se desintegró 1 g de heces empleando palos de madera, después se agregó 40 
ml cloruro de cetilpiridinium (HCP) al 0.75% (Ver Anexo I) y se mezcló con un 
homogeneizador eléctrico. Se dejó sedimentar por 3 días, hasta que se observó 
la interfase, la cual fue utilizada para sembrar en medios de cultivo. 
Identificación de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) 
mediante tinción Ziehl-Neelsen 
Se realizaron frotis para detección de BAAR a partir de las heces en 
descontaminación, del macerado de intestino y de colonias obtenidas en cultivo 
bacteriológico, posteriormente se hizo la tinción Ziehl-Neelsen, la cual se 
encuentra descrita en el Anexo II. Los resultados se consideraron positivos 
cuando en el frotis se observaron agrupaciones de BAAR. 
28 
 
Aislamiento bacteriológico 
El aislamiento bacteriológico se realizó utilizando los medios de cultivo, 
Löwenstein Jensen (LJM) y Herrold con yema de huevo y piruvato de sodio 
(HEYMP), ambos adicionados con micobactina para favorecer el crecimiento de 
M. paratuberculosis (Ver Anexos III y IV). 
Después de la elaboración de los medios de cultivo, se realizó la siembra a partir 
de las muestras de heces y de intestino, previamente procesadas y 
descontaminadas. Con una pipeta estéril se tomaron de 5-7 gotas de las 
muestras en descontaminación, posteriormente fueron sembradas en los 
medios de cultivo. De cada medio de cultivo (Löwenstein-Jensen y Herrold), se 
utilizaron 3 tubos por muestra; dos con micobactina y uno sin micobactina; 
(Payeur, 2005). Se dejaron hasta 52 semanas incubando, en una estufa de calor 
seco a 37°C, haciendo revisiones periódicas cada semana a partir de la cuarta 
semana después de haber realizado la siembra (Whipple, Callihan & Jarnagin, 
1991). En la interpretación de resultados los cultivos se consideraron positivos 
solo al observarse en medios adicionados con micobactina, la presencia de 
colonias de morfología compatible con M. paratuberculosis. Estas colonias 
mostraron una coloración de blanco a amarillo, de morfología convexa y aspecto 
cremoso. (Thorel, Krichevsky & Levy-Frebault, 1990; Payeur, 2005). 
Extracción de ADN 
 Extracción de ADN a partir de heces 
La lisis celular y extracción de ADN a partir de heces, se realizó de acuerdo a la 
técnica de enfriamiento-calentamiento de Garrido y colaboradores (2000). La 
elaboración de los reactivos utilizados se encuentra descrito en el Anexo V. 
29 
 
Se tomaron 10 ml de la interfase de las muestras de heces en descontaminación, 
se centrifugó a 2,500rpm/10 min hasta que se formó una pastilla, después se 
hicieron 3 lavados a la pastilla con 10 ml de PBS 1X, centrifugando a 2,500 rpm/ 
10 min; se hizo un último lavado con 2 ml PBS 1X y se centrifugó a 14,000 rpm/ 
5 min. A la pastilla lavada se agregó 500 µl de TE-tritón 100X, se mezcló y pasó 
a un criotubo de tapa de rosca (NALGENE®), las muestras se colocaron en 
nitrógeno líquido durante 5 minutos, posteriormente se incubaron a 100°C en 
estufa de calor seco (Terlab®) durante otros 5 minutos, este procedimiento se 
realizó 3 veces. Después del procedimiento de enfriamiento y calentamiento se 
agregaron 450 µl de isoticianato de guanidina y 250 µl de acetato de amonio con 
pH de 6.3, se mezclaron por inversión varias veces y los criotubos se colocaron 
en un criocontendor a 1°C (NALGENE®) durante 15 minutos. 
Las muestras se transfirieron a microtubos de 2 ml, se agregaron 500 µl de 
cloroformo-alcohol isoamílico, se mezclaron con un homogeneizador eléctrico 
por 10 segundos y se centrifugaron a 14,000 rpm/ 5 min; la fase acuosa (500-
600 µl) se transfirió a un microtubo de 2 ml, se agregó nuevamente 500 µl de 
cloroformo-alcohol isoamílico repitiendo el procedimiento, a la fase acuosa 
obtenida se agregó 450 µl de isopropanol y se mantuvo a -20°C durante 18 
horas. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 14,000 rpm/ 5 min y se 
eliminó el sobrenadante, se obtuvo una pastilla, la cual fue lavada dos veces con 
1 ml de etanol al 70%, se mezclaron por inversión suave y se centrifugó a 14,000 
rpm/ 1 min; se dejó secar la pastilla a temperatura ambiente y una vez que no 
tuvo residuos de etanol se agregó entre 20-30 µl de agua destilada. Del ADN 
obtenido se tomaron 3 µl con 1 µl de solución amortiguadora de carga, con lo 
cual se llevó a cabo la electroforesis en gel agarosa al 1.5%, después el gel fue 
30 
 
teñido con bromuro de etidio y visualizado en un transiluminador de luz UV; (UV 
Transilluminator, M-20 UVP Analityk Jena). El ADN fue conservado a -20°C hasta 
su uso para la PCR IS900 y PCR tipo específico. 
 Extracción de ADN a partir de intestino 
 
Para la extracción de ADN del intestino se utilizó el estuche comercial QIAamp 
DNA mini Kit spin column (QIAGEN®, Duesseldorf, Alemania). Se tomaron 200 
µl del macerado de intestino, se colocaron en un microtubo de 2 ml, en seguida 
se agregaron 250 µl de PBS 1X, 10 µl de proteinasa K, 300 µl de Tris HCL 1M 
pH 8, 250 µl de Tritón 100X y 400 µl de solución AL provista por el fabricante, el 
microtubo se colocó en un bloque térmico a 50°C dejando incubar la muestra por 
2 horas. Terminado el procedimiento térmico se agregó 200 µl de etanol 
absoluto, se mezcló invirtiendo el tubo 15 veces, después se mezcló con un 
homogeneizador eléctrico durante 1 min. Posteriormente se transfirió la mezcla 
(500-600 µl) a una columna con un tubo colector provistos por el fabricante, se 
centrifugó a 8,000 rpm/ 1 min, se desechó el filtrado con el tubo colector y la 
columna se pasó a otro tubo colector; se agregaron 500 µl de la solución AW1 
provista por el fabricante y se centrifugó a 8,000 rpm/ 1 min, se eliminó lo filtrado 
por el tubo colector y se agregó la solución AW2, se centrifugó a 8,000 rpm/3 
min, se desechó el tubo colector y se pasó a un microtubo de 1.5 ml nuevo y 
estéril, posteriormente se agregó 50 µl de solución AE, se dejó incubar a 
temperatura ambiente durante 5 min y después se centrifugó a 8,000 rpm/1 min. 
Del ADN obtenido se tomaron 3 µl con 1 µl solución amortiguadora de carga, se 
llevó a cabo la electroforesis en gel agarosa al 1.5%, después el gel fue teñido 
con bromuro de etidio y vizualizado en un transiluminador de luz UV; (UV 
31 
 
Transilluminator, M-20 UVP Analityk Jena). Posteriormente, el ADN fue 
conservado a -20°C hasta su uso para la PCR IS900 y PCR tipo específico. 
 Extracción de ADN a partir de colonias bacterianas 
La extracción de ADN a partir de colonias desarrolladas en medios de cultivo 
adicionados con micobactina, se hizo mediante choque térmico. Para lo anterior, 
se empleó un asa bacteriológica en ambiente estéril, tomándose de dos a tres 
colonias del medio de cultivo y se mezclaron con 50 µl de agua estéril en 
microtubos de 1.5 ml. Posteriormente se colocó en bloque térmico a 100° C 
durante 20 min, se centrifugaron las muestras a 10,000 rpm/10 min, el 
sobrenadante se pasó un microtubo de 0.6 ml. El ADN se almacenó a -20°C 
hasta su uso para PCR IS900 y PCR tipo específico. 
 Cuantificación y evaluación de ADN 
El ADN obtenido de las muestras de heces e intestino fue evaluado mediante su 
observación en gel de agarosa y se cuantificó midiendo la absorbancia a las 
longitudes de onda 280 y 260 nanómetros (nm), mediante un espectrofotómetro 
(Jenway 6305 Spectrophotometer) colocando el ADN diluido en agua destilatada 
estéril en una cubeta de cuarzo (Puerta y Ureña, 2005) 
Para la cuantificación de ADN se utilizó la absorbancia obtenido a 260 nm, 
empleando la siguiente fórmula. 
DO 260 nm x Factor de dilución x 50 µg/ml /1000= [ADN] µg/ µl 
La pureza del ADN se obtuvo mediante la relación 260/280 nm, si la relación es 
mayor a 1.6 puede considerarse que la muestra es pura, ya que la absorción 
obtenida se debe mayoritariamente a los ácidos nucleicos, de los contrario 
sugiere contaminación con alcoholes, cloroformo, fenoles o proteínas. 
32 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) IS900 
A partir del ADN obtenido de muestras de heces, macerado de intestino y 
colonias bacterianas, se hizo la PCR IS900, en la cual se buscó amplificar un 
fragmento de 314 pb de la secuencia de inserción IS900 presente en M. 
paratuberculosis. Se utilizó 3 µl de ADN, 20 µl de la mezcla Super Mix PCR 
Roche® y 1 µl de cada uno de los iniciadores P3N 
(5´GGGTGTGGCGTTTTCCTTCG 3´) y P5N (5´ATTTCGCCGCCACCGCCACG 
3´) (Yurame López, 2014). Las condiciones utilizadas en la prueba fueron 1 ciclo 
a 94°C 5 min (desnaturalización inicial), 35 ciclos a 94°C 40 segundos 
(desnaturalización), 56°C 40 segundos (alineamiento), 72 °C 40 segundos 
(extensión) y 72°C 5 min durante 1 ciclo (extensión final). Se llevó acabo la 
electroforesis en gel agarosa al 1.5%, después el gel fue teñido con bromuro de 
etidio y visualizado en un transiluminador de luz UV (UV Transilluminator, M-20, 
UVP Analityk Jena). Las muestras se consideraron positivas cuando se visualizó 
la amplificación de un fragmento de 314 pares de bases (pb). Se incluyó como 
control positivo, ADN obtenido a partir de aislamiento de M. paratuberculosis, 
mientras que como control negativo se empleó agua bidestilada estéril. 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Tipo específico 
A partir del ADN obtenido de muestras heces, macerado de intestino y colonias 
en medio de cultivo, se buscó identificar el tipo de cepa de M. paratuberculosis 
en los casos positivos a la PCR IS900. Para esta prueba se utilizó 5 µl de ADN, 
22 µl de la mezcla para PCR Super Mix Roche® y 1 µl de cada uno los iniciadores 
DMC 529 (5’GCTGTTGGCTGCGTCATGAAGTC3’), DMC 531 
(5’TTCTTATCGGACTTCTTCTGG3’) y DMC 533 (5’TGAAACGCAGGTCAATCCGCA 
33 
 
3’) (Collins et al. 2002). Las condiciones de la prueba fueron: 1 ciclo a 95 °C 3 
min (desnaturalización inicial), 35 ciclos a 94 °C 30 segundos 
(desnaturalización), 60 °C 30 segundos (alineamiento), 72 °C 30 segundos 
(extensión) y 72 °C 5 min durante 1 ciclo (extensión final). Se llevó a cabo la 
electroforesis en gel agarosa al 1.5%, después el gel fue teñido con bromuro de 
etidio y vizualizado en un transiluminador de luz UV; (UV Transilluminator, M-20 
(UVP Analityk Jena). En la interpretación de resultados la amplificación de un 
fragmento de 310 pb corresponde al tipo C (cattle), una banda de amplificación 
de 162 pb corresponde al tipo S (sheep) y de 160 pb corresponde al tipo I 
(intermedio). (D. M. Collins, De Zoete & Cavaignac, 2002). 
Purificación de productos de PCR 
Las muestras positivas por PCRIS900 fueron purificadas para su secuenciación 
con filtros comerciales utilizando el estuche comercial de purificación Montage® 
PCR Filters (Millipore, Schwalbach, Germany), siguiendo las indicaciones del 
fabricante, se agregó a los filtros entre 40-45 µl de producto de PCR y agua 
destilada estéril cuanto baste para (cbp) 400 µl como volumen final, se centrifugó 
a 1000 gravedades/ 15 minutos, se eliminó el sobrenadante y después se agregó 
20 µl de agua destilada estéril al filtro, después se invirtió y se colocó otro 
microtubo también provisto por el fabricante, se centrifugó a 1,000 g/2 min. Se 
observó el producto de PCR ya purificado mediante la electroforesis en gel 
agarosa al 1.5%, después el gel fue teñido con bromuro de etidio y vizualizado 
en un transiluminador de luz UV; (UV Transilluminator, M-20 UVP Analityk Jena) 
donde se observaron productos de amplificación de 314 pb. Los fragmentos de 
PCR purificados fueron almacenados a -20°C, hasta ser procesados para su 
secuenciación. 
34 
 
Secuenciación 
Los productos purificados fueron analizados en el Instituto de Fisiología Celular, 
en el Departamento de Biología Molecular, de la Universidad Nacional Autónoma 
de México, donde se realizó la secuenciación por el método de Sanger, una vez 
obtenidas las secuencias, fueron comparadas y analizadas mediante el método 
Neighbour-Joining (NJ) generado en Basic Local Alignment Search Tool 
(BLAST), utilizando la base de datos de secuencias genéticas Genebank del 
National Center for Biotechnology Information (NCBI). 
Estudios anatomopatológicos 
En la revisión macroscópica de las muestras de intestino se evaluaron cambios 
como coloración, aspecto y forma; con el fin de asociar estos cambios con 
lesiones compatibles a paratuberculosis (Clarke, 1997). Una vez realizada la 
revisión macroscópica, las mitad de las muestras de intestino se fijaron en 
formalina amortiguada al 10%, fueron incluidas en parafina y teñidas con 
Hematoxilina y Eosina, así como con la tinción Ziehl-Neelsen descrita en el 
Anexo II. 
Para la revisión microscópica, se hizo la clasificación basadas en si las lesiones 
histopatológicas son paucibacilares o multibacilares, así como la clasificación 
tomada por Pérez y colaboradores (1996); donde se les asigna un número según 
la distribución, así como tipo de infiltrado celular y cantidad de BAAR presentes. 
 Tipo I. Lesiones multifocales con infiltrado de macrófagos en las placas 
de Peyer, sin presencia de BAAR 
 Tipo II. Lesiones en tejido adyacente y en placas de Peyer, escasos 
BAAR, sin lesiones microscópicas. 
35 
 
 Tipo III. Lesiones a lo largo de la mucosa intestinal, se dividen en 3 
subtipos 
 Tipo IIIa Lesiones multifocales en placas de Peyer y en la lámina propia 
de la mucosa intestinal, BAAR en cantidad moderada, en la subserosa y 
serosa pueden encontrarse focos de linfocitos y macrófagos, alrededor 
de vasos linfáticos y sanguíneos. 
 Tipo IIIb. Lesiones difusas, con gran cantidad de macrófagos, células 
epitelioides y algunas células gigantes, además de BAAR en cantidad 
abundante. Lesiones macroscópicas visibles como engrosamiento de la 
mucosa, linfagiectasia y linfadenomegalia. 
 Tipo IIIc Lesiones difusas, tanto en placas de Peyer y lámina propia de la 
mucosa, sin embargo el infiltrado de linfocitos es mayor, además de poca 
cantidad de BAAR. 
Análisis de la información. Estadística descriptiva 
Los resultados fueron analizados mediante una estadística descriptiva, indicando 
los porcentajes de resultados positivos en cada una de las pruebas empleadas 
en este estudio. 
 
 
 
36 
 
Resultados 
Identificación de animales 
La identificación se hizo con base en las características anatómicas y señas 
particulares de cada individuo, para más detalle ver Tabla 1 y Fig. 3. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Foto grupo de orix cimitarra. 
Tabla 1. Identificación de los animales del área de estudio 
Foto de 3 ejemplares de orix cimitarra donde se observan el tamaño 
de los cuernos de cada individuo empleados para la identificación. 
 
37 
 
Toma y envío de muestras 
 Número de muestras de heces 
 Se obtuvieron 56 muestras durante los 4 períodos; el número de muestras fue 
variable en la especie orix cimitarra, debido a que antes del segundo periodo de 
toma de muestras (enero-febrero) murieron dos hembras identificadas como O6 
y O8, antes del tercer periodo de toma de muestras (marzo-abril) murió otra 
hembra identificada como O2. El número de muestras se encuentran descritas 
en la Tabla 2. 
 
 Número de muestras de Intestino 
Se remitieron 5 muestras de intestino de la especie orix cimitarra, de las cuales 
tres muestras correspondieron a hembras adultas identificadas como O2, O6 y 
O8, las cuales tenían más de 10 años de edad, así como el intestino de dos a 
crías identificadas como O9 y O10, entre 1-2 semanas de edad. La descripción 
de las muestras de intestino obtenidas se encuentra descritas en la Tabla 3. 
 
 
 
 
Tabla 2. Número de muestras de heces obtenidas por especie y por periodo 
Muestras de heces 
Especie Toma de muestra Total de 
muestras nov-dic ene-feb mar-abr mayo-jun 
Orix cimitarra 8 6 5 5 24 
Jirafa 5 5 5 5 20 
Ñu azul 3 3 3 3 12 
Total 16 14 13 13 56 
38 
 
 
Aislamiento bacteriológico (Löwenstein-Jensen y Herrold) 
No se obtuvo ningún crecimiento en el medio Löwenstein-Jensen con 
micobactina (LJM), mientras que en el medio de cultivo Herrold, con yema de 
huevo, micobactina y piruvato de sodio (HEYMP) se obtuvieron 6 aislamientos 
de la especie orix cimitarra, cuatro a partir de heces (Tabla 4) y dos a partir de 
intestino (Tabla 5). 
Tabla 4. Aislamientos bacteriológicos en medio cultivo HEYMP a partir de heces de 
orix cimitarra. 
Aislamientos bacteriológicos en medio de cultivo HEYMP a partir de heces 
de orix cimitarra (Oryx dammah) 
Período de toma muestra 
(n= total de muestras) 
Positivos Negativos Prevalencia 
nov-dic- (n=8) 1 7 12.5% 
enero-febrero (n=6) 0 6 0% 
marzo-abril(n=5) 0 5 0% 
mayo-junio (n=5) 3 2 60% 
 
 
 
Muestras de intestino 
Orix cimitarra (Oryx dammah) 
Periodo de recepción de 
muestra 
Identificación Características 
diciembre O8 Hembra adulta 
diciembre O9 Cría de O6 
enero O6 Hembra adulta 
enero O10 Cría 
marzo O2 Hembra adulta 
Tabla 3. Descripción de las muestras de intestino obtenidas de la especie orix cimitarra 
HEYMP: Medio de cultivo Herrold con yema de huevo, micobactina y piruvato de sodio 
 
39 
 
Tabla 5. Aislamientos bacteriológicos en medio de cultivo HEYMP a partir de muestras 
de intestino de orix cimitarra (Oryx dammah) 
 
 
Se observó el desarrollo de las colonias bacterianas en el medio HEYMP, a las 
8 semanas en 3 muestras de heces, dos muestras eran de hembras identificadas 
como O6 y O7, y una de un macho adulto identificado como O3; a partir de las 
10 semanas se observó crecimiento en muestras de intestino de dos hembras 
adultas identificadas como O6 y O8 y una muestra de heces de una macho adulto 
identificado como O4, lo anteriormente descrito se encuentra en la Tabla 6. 
Tabla 6. Tiempo de crecimiento de colonias bacterianas en medio HEYMP 
Tiempo de crecimiento de colonias bacterianas en medio HEYMP 
Especie orix cimitarra (Oryx dammah) 
Identificación Tipo de muestra Semana de crecimiento 
O3 (Macho) Heces 8° semana 
O4 (Macho) Heces 10° semana 
O6 (Hembra) Heces 8° semana 
O6 (Hembra) Intestino 10° semana 
O7 (Hembra) Heces 8° semana 
O8 (Hembra) Intestino 10° semana 
 
Aislamientos bacteriológicos en medio de cultivo HEYMP a partir de 
muestras de intestino de orix cimitarra (Oryx dammah) 
Recepción de muestra Identificación Aislamiento en cultivo HEYMP 
diciembre O8 (Hembra) Positivo 
diciembre O9 (Cría de O6) Negativo 
enero O6 (Hembra) Positivo 
enero O10 (Cría) Negativo 
marzo O2 (Hembra) Contaminación 
HEYMP: Medio de cultivo Herrold con yema de huevo, sodio