Identificacion-de-protenas-diferenciales-en-cerebros-de-mosquitos-Anopheles-albimanus-infectados-con-Plasmodium-berghei

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS 
 
FACULTAD DE MEDICINA (UNAM) 
 
CENTRO DE INVESTIGACIÓN SOBRE ENFERMEDADES INFECCIOSAS (INSP) 
 
“IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DIFERENCIALES EN 
CEREBROS DE MOSQUITOS Anopheles albimanus INFECTADOS 
CON Plasmodium berghei” 
 
TESIS QUE PARA OBTAR POR EL GRADO DE DOCTOR EN 
CIENCIAS BIOMÉDICAS 
 
 PRESENTA: 
M en C. ALEJANDRO ALVARADO DELGADO. 
 
 
DIRECTOR: 
DR. HUMBERTO LANZ MENDOZA 
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PÚBLICA 
 
TUTORES: 
DRA. BERTHA ESPINOZA GUTIÉRREZ 
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS 
 
DRA. LEONOR PÉREZ MARTÍNEZ 
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA 
 
 CDMX, Julio de 2018 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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ÍNDICE 
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS 
RESUMEN………………………………………………………………………...9 
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………. 10 
1.1. Generalidades de los insectos……………………………………………10 
1.2. Importancia de los dípteros……………………………………………….10 
1.3. Mosquitos del género Anopheles……… ……………………………….11 
1.4. Ciclo de vida de Anopheles……………………………………………….12 
1.5. Parásitos del género Plasmodium………………………………………..14 
1.6. Ciclo de vida de Plasmodium……………………………………………..15 
1.7. Respuesta anti-Plasmodium en Anofelinos……………………………..17 
1.8. Sistema nervioso en insectos…………………………………………….18 
1.9. Sistema nervioso central (SNC)………………………………………….19 
1.10. Sistema nervioso periférico (SNP)……………………………………..20 
1.11. El cerebro, órgano principal del SNC…………………………………..21 
1.12. Generalidades de los neuropéptidos.................................................22 
2. ANTECEDENTES……………………………………………………………27 
2.1. Modificación de la expresión de proteínas y neuropéptidos en 
 cerebro de mosquito…………………………………………………………...29 
2.2. Participación de los neuropéptidos en la respuesta inmune 
de insectos……………………………………………………………………….30 
3. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………..33 
3 
 
4. OBJETIVOS………………………………………………………………….34 
5. METODOLOGIA……………………………………………………………..35 
5.1. Obtención de mosquitos Anopheles albimanus………........................35 
5.2. Cultivo de oocinetos de Plasmodium berghei……………………….....35 
5.3. Infección de mosquitos Anopheles albimanus 
con oocinetos de Plasmodium berghei……………………………………….36 
5.4. Obtención de cerebros de mosquitos……………………………………36 
6. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS……………………………………….37 
6.1. Electroforesis de doble dimensión (2D SDS-PAGE) 
y análisis de imágenes…………………………………………………………37 
6.2. Proteólisis, identificación y anotación funcional………………………..38 
6.3. Análisis tipo STRING……………………………………………………...39 
7. IDENTIFICACIÓN DE NEUROPÉPTIDOS Y ANÁLISIS 
TRANSCRIPTOMICO………………………………………………………….40 
7.1. Obtención de RNA total…………………………………………………..40 
7.2. Síntesis de cDNA, generación de librerías y 
secuenciación masiva en la plataforma 454………………………………...41 
7.3. Análisis transcriptomico e identificación in silico 
de transcritos de neuropéptidos en cerebros de mosquitos 
 An. albimanus…………………………………………………………………..44 
7.4. Validación y análisis de expresión diferencial de transcritos de 
neuropéptidos………………………………………………………………......45 
8. RESULTADOS……………………………………………………………....46 
8.1. Análisis del perfil proteico en geles de doble dimensión (2D), 
expresión diferencial e identificación de proteínas…………………………46 
4 
 
8.2. Proteínas que participan en la síntesis de ATP acoplada 
a transporte de protones………………………………………………………..47 
8.3. Proteínas que participación en re-arreglos del 
citoesqueleto y plasticidad sináptica…………………………………………..48 
8.4. Proteínas que participan en procesos de óxido-reducción…………....48 
8.5. Proteínas que participan en la transducción de señales………………49 
8.6. Proteínas con participación diversa……………………………………...49 
8.7. Análisis tipo String………………………………………………………....57 
8.8. Análisis del transcriptoma de los cerebros de An. albimanus………...58 
8.9. Identificación de transcritos de neuropéptidos………………………….62 
8.10. Caracterización estructural del gen de la miosupresina……….........68 
8.11. Expresión diferencial de neuropéptidos en el cerebro de 
An. albimanus infectados con oocinetos de P. berghei………………........73 
8.12. Descripción de transcritos de neuropéptidos con 
expresión diferencial……………………………………………………………74 
9. DISCUSIÓN…………………………………………………………….........80 
10. CONCLUSIONES………………………………………………………….91 
11. PERSPECTIVAS…………………………………………………….........92 
12. REFERENCIAS…………………………………………………………...93 
13. MANUSCRITOS ENEXOS……………………………………………...109 
 
 
 
 
5 
 
 
 
 
INDICE DE FIGURAS Y TABLAS 
Figura 1. Distribución mundial de mosquitos anofelinos……………………12 
Figura 2. Ciclo de vida de Anopheles…………………………………………14 
Figura 3. Fases invasivas del parásito Plasmodium………………………...15 
Figura 4. Fase sexual del ciclo de vida de Plasmodium en el mosquito vector 
Anopheles…………………………………………………………………………16 
 
Figura 5. Sistema nervioso central de insectos………………………………20 
Figura 6. Sistema neuroendocrino y cerebro de insectos…………………..22 
Figura 7. Síntesis, procesamiento, transporte y secreción de neuropéptidos.23 
Figura 8. Participación de neuropéptidos en diferentes procesos 
fisiológicos de insectos………………………………………………………….24 
 
Figura 9. Grupos de neuropéptidos identificados en insectos……………..26 
Figura 10. Proteínas identificadas en cabezas de mosquitos An. gambiae 
Infectadas con esporozoítos de P. berghei…………………………………...30 
 
Figura 11. Neuropéptidos como allatotropina y allatostatina inducen 
la expresión de la respuesta inmune en intestinos de An. albimanus……..32 
 
Figura 12. Geles de electroforesis bidimensional de extractos cerebrales de 
mosquitos An. albimanus……………………………………………………….47 
 
Figura 13. Secuencia del péptido AALB008255-PA………………………...53 
Figura 14. Secuencia del péptido AALB000444-PA………………………...54 
6 
 
Figura 15. Secuencia del péptido AALB010381-PA………………………...55 
Figura 16. Análisis tipo String………………………………………………….57 
Figura 17. Principales transcritos a los que mapearon los “reads” de An. 
albimanus………………………………………………………………………...59 
 
Figura 18. Análisis tipo GO de transcritos identificados en cerebros de An. 
albimanus a partir de secuencias “contigs”…………………………………..60 
 
Figura 19. Análisis tipo Interpro de transcritos identificados en cerebros 
de An. albimanus a partir de secuencias “contigs”…………………………..61 
 
Figura 20. Transcritos de neuropéptidos identificados en el transcriptoma 
de cerebros de An. albimanus………………………………………………….63 
 
Figura 21. Amplificación y expresión de transcritos que corresponden a 
diversos neuropéptidos………………………………………………………….64 
 
Figura 22. Identificación y descripción de miosupresina………………..69-73 
Figura 23. Expresión relativa de neuropéptidos en cerebros de 
mosquitos An. albimanus infectados con oocinetos de P. berghei…………74 
 
Figura 24. Hormona adipocinetica II (AKH II)………………………………..76 
Figura 25. Piroquinina………………………………………………………….77 
Figura 26. Corazonina………………………………………………………….79 
Figura 27. Distribución teórica de las proteínas que tuvieron expresión 
diferencial en cerebros de An. albimanus…………………………………….81 
 
Figura 28. Transcritos de proteínas con expresión diferencial encerebros 
de mosquitos An. albimanus…………………………………………………...87 
 
Tabla 1. Proteínas expresadas diferencialmente en cerebros de 
An. albimanus infectados con oocinetos de P. berghei……………………..50 
 
Tabla 2. Proteínas detectadas solo en el cerebro de mosquitos 
infectados…………………………………………………………………………51 
 
7 
 
Tabla 3. Datos generales de secuenciación……………………………….....59 
Tabla 4. Neuropéptidos identificados en el genoma de An. albimanus…....67 
Tabla 5. Biopéptidos generados a partir de secuencias polipéptidicas…....66 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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SUMMARY: 
For a long time, it has been documented that protozoan parasites manipulate 
behavior of vectors to favor their transmission and their life cycle. Anopheles 
mosquitoes infected with the Plasmodium parasite, modify physiological and 
behavioral aspects such as oviposition, contact with the host, number of bites and 
attraction of the vector to the host. These and other aspects associated with 
development are coordinated and regulated by the Central Nervous System (CNS). 
Few studies have focused on identifying molecules that modify their expression in 
the CNS of infected mosquitoes. In Anopheles albimanus, one of the main vectors 
of malaria in Mexico and Central America, there are no studies that identify CNS 
molecules in infected mosquitoes. In this work, using next generation sequencing, 
quantitative PCR, double-dimension electrophoresis and mass spectrometry 
techniques, we identified 19 proteins and 3 transcripts of neuropeptides that 
modified their expression in brains of An. albimanus mosquitoes infected with P. 
berghei ookinetes. In addition, we described the putative transcriptome of An. 
albimanus brain, 2170 transcripts were identified and associated with several 
molecular functions, ion binding, neurological processes, translation and signal 
transduction. In addition, twenty four transcripts of neuropeptides were identified 
that include peptides related to tachykinin, orcokinins, pirokinins/PBAN´s, 
pyrokinins/CAPA, myosuppressins, adipokinetic hormones, allatostatins, 
allatotropin, insulin-like peptides, crustacean cardioactive peptide, corazonin, 
bursicon, SIFamide, eclosion hormone, diuretic hormone, ecdysis triggering 
hormone and pigment dispersing hormone. This information it´s essential to 
continue elucidating the participation of the SNC in behavioral, immune and 
development processes in the vector-parasite interaction. 
 
 
 
 
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RESUMEN 
Durante mucho tiempo se ha documentado que los protozoarios parásitos 
manipulan la conducta de sus vectores para favorecer su transmisión y su ciclo 
vital. Mosquitos del género Anopheles, transmisores de la malaria, modifican 
diversos aspectos fisiológicos y conductuales como la oviposición, el contacto con 
el hospedero, el número de picaduras y la atracción del vector hacia el huésped 
cuando son infectados con el parásito Plasmodium. Estos y otros aspectos 
asociados al desarrollo, son coordinados y regulados por el Sistema Nervioso 
Central (SNC). Sin embargo, en estos mosquitos, pocos estudios se han enfocado 
a identificar moléculas que modifican su expresión en el SNC cuando existe la 
presencia del parásito de la malaria. Actualmente, se ha identificado un número 
reducido de moléculas en el SNC de los mosquitos que modifican sus perfiles de 
expresión. En Anopheles albimanus, uno de los principales vectores de malaria en 
México y Centroamérica, no existen trabajos que identifiquen moléculas del SNC 
cuando existe una infección por parásitos del género Plasmodium. En este trabajo 
utilizando técnicas de secuenciación masiva, tiempo real, electroforesis de doble 
dimensión y espectrometría de masas se identificaron 19 proteínas y 3 transcritos 
de neuropéptidos que modifican su expresión en cerebros de mosquitos An. 
albimanus en presencia de oocinetos de P. berghei. Además se identificaron 2170 
transcritos que forman parte del transcriptoma putativo de este órgano y que están 
asociados a funciones moleculares, de unión a iones, a procesos neurológicos, de 
traducción y transducción de señales. Además se identificaron veinticuatro 
transcritos de neuropéptidos que incluyen a los péptidos relacionados a 
taquikinina, orcokininas, piroquininas/PBAN, piroquininas/CAPA, miosupresinas, 
hormonas adipocinéticas, allatostatinas, allatotropina, péptidos similares a insulina, 
péptido cardioactivo de crustáceo, corazonina, bursicon, SIFamida, hormona de 
eclosión, hormona diurética, hormona activadora de ecdisis y hormona dispersante 
de pigmento. La información generada, aporta nuevas moléculas de estudio para 
continuar dilucidando la participación del SNC en procesos conductuales, 
inmunes, de desarrollo y en la interacción vector-parásito. 
10 
 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1 Generalidades de los insectos 
Los insectos, son invertebrados del filo de los artrópodos, caracterizados por 
presentar un par de antenas, tres pares de patas y dos pares de alas 
(http://dicciomed.eusal.es/palabra/insecto). Los insectos son el grupo de animales 
más diverso de la tierra y pueden encontrarse en casi todos los ambientes, 
comprenden aproximadamente un millón de especies descritas y con estimaciones 
de entre 6 y 10 millones de especies no descritas (Zhang 2011). Algunas de las 
características que les han permitido colonizar hábitats tan diversos son su 
tamaño, sus tiempos cortos de desarrollo entre generaciones, su descendencia 
abundante, su capacidad para volar, su co-evolución con plantas, su respuesta 
inmunitaria y el desarrollo de diferentes estadios de su ciclo de vida (Grimaldi and 
Engel 2005). El cuerpo de los insectos está formado por tres regiones principales 
(cabeza, tórax y abdomen), las dos últimas, cubiertas por el exoesqueleto. La 
cabeza está especializada para la alimentación y la captación de señales, en ella 
destacan los ojos, órganos sensoriales y piezas bucales. El tórax es la región 
media del cuerpo y está asociado al movimiento ya que a él se anexan las patas y 
las alas, y presenta dos aberturas que forman el sistema traqueal. Y el abdomen 
que contiene los órganos especializados para la digestión, secreción y 
reproducción (Grimaldi and Engel 2005). 
 
1.2 Importancia de los dípteros 
 
Los dípteros son un orden de insectos cuya característica principal es la presencia 
de un par de alas y de los cuales se han descrito alrededor de 150,000 especies 
(Hoell et al., 1998). Muchas especies de dípteros son hematófagos, lo que 
conlleva a que sean vectores y transmisores de parásitos que producen 
enfermedades infecciosas, que son incapacitantes e incluso mortales en el ser 
humano causando una gran repercusión en la economía y salud de las familias y 
11 
 
los países que las padecen (WHO 2013). Algunas de estas enfermedades 
transmitidas son malaria, leishmaniasis, filariasis, chagas, fiebre amarilla, dengue, 
chinkunguya y zika. Por lo cual, el estudio de estos insectos a distintos niveles 
(molecular, genético, fisiológico, ecológico y epidemiológico) es importante a nivel 
mundial. 
Los mosquitos, son miembros de varias familias de insectos del orden de los 
dípteros y particularmente del suborden de los nematóceros, cuyos miembros 
tienen cuatro etapas de desarrollo en su vida (huevo, larva, crisálida/pupa y 
adulto) y necesitan ambientes acuáticos y terrestres para completar su ciclo de 
vida (Hoell et al., 1998). Viven en zonas cálidas y húmedas, rurales y urbanas 
generalmente en altitudes menores a 2,000 metros sobre el nivel del mar. Su 
distribución ecológica está relacionada directamente con la diversidad de sus 
criaderos larvales que son diversos como canales de drenaje, charcos con o sin 
vegetación acuática, lagos y depósitos de agua que son los más comunes 
(Grimaldi and Engel 2005). 
 
1.3 Mosquitos del género Anopheles 
Son mosquitos de la familia Culicidae que habitan principalmenteen zonas 
tropicales y subtropicales. Existen aproximadamente 400 especies de anofelinos 
que pueden transmitir diversas especies de Plasmodium entre los vertebrados, de 
las cuales, se estima que entre 30 a 40 especies transmiten las cinco especies 
causantes de la malaria humana (P. falciparum, P. malarie, P. vivax, P. ovale y P. 
knowlensi) (Kiszewksi et al., 2004). Las especies más importantes de anofelinos 
transmisoras de la malaria humana son Anopheles gambiae, An. arabiensis y An. 
funestus en África, An. stephensi, An. dirus y An. minumus en Asia, An. darlingi en 
Sudamérica y An. albimanus y An. pseudopunctipennis en Centro y Norte América 
(Figura 1). Los anofelinos se pueden distinguir de otros géneros de mosquitos por 
algunas características particulares como el tamaño de los palpos, por la 
presencia de escamas sobre las alas y por su postura en reposo (Komp 1948). 
12 
 
Los mosquitos anofelinos son los vectores para la transmisión de la malaria a los 
seres humanos. En 2013, 215 millones de casos de malaria se registraron en el 
mundo, causando 438.000 muertes (WHO 2013). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.4 Ciclo de vida de Anopheles 
Al igual que todas las especies de mosquitos, los anofelinos tiene cuatro fases de 
desarrollo: huevo, larva, pupa y adulto (Figura 2). Las primeras 3 etapas 
transcurren en un medio acuático y se prolongan entre 5 y 14 días según la 
especie y los factores ambientales como la temperatura y la humedad. El ciclo 
inicia cuando los mosquitos hembra ovipositan sus huevos uno a uno en la 
superficie del agua y eclosionan liberando larvas. Las larvas poseen una cabeza 
desarrollada y prominente; el tórax y el abdomen carecen de patas y de sifón 
respiratorio por lo que necesitan tener el cuerpo paralelo a la superficie del agua 
respirando a través de espiráculos situados en el octavo segmento abdominal. 
Son cuatro estadios larvales que se desarrollan: El primer estadio dura desde que 
Figura 1. Distribución mundial de mosquitos anofelinos. Algunos de los principales anofelinos de importancia médica en América son: An. 
darlingi en Sudamérica, An.albimanus y An. pseudopunctipennis en Centro y Norte América (Kiszewksi et al., 2004). 
 
 
13 
 
el huevo eclosiona y la larva se desarrolla hasta un tamaño aproximado de 1mm, 
este estadio dura en promedio 48 horas. El segundo estadio larval se desarrolla 
entre las 48 y 96 horas (de uno a cuatro días post-eclosión) alcanzando un 
tamaño aproximado de entre 2 y 3 mm, mientras que el cuarto estadio se 
desarrolla entre los 4 a 8 días post-eclosión llegando a medir entre 5 y 8 mm 
(Snodgrass 1959). Las larvas de cuarto estadio se desarrollaran a pupas en las 
que la cabeza y el tórax se funden formando un cefalotórax mientras que el 
abdomen se curva bajo éste. La pupa entra en una etapa de metamorfosis, se 
desarrolla a mosquito, que emergerá por la parte dorsal del cefalotórax 
(Snodgrass 1959). 
Los mosquitos se alimentan de néctares de flores, y a las 48 horas de que han 
emergido, machos y hembras están listos sexualmente para aparearse y generar 
descendencia (Nuttall and Shipley 1901). Las hembras, además de azúcares, 
necesitan sangre como fuente de proteínas para desarrollar los huevos. Después 
del apareamiento y la ingesta de sangre, las hembras reposan mientras los 
huevos se desarrollan hasta que, son depositados en ambientes acuosos en 
donde encuentran condiciones ambientales óptimas para su eclosión y reiniciar el 
ciclo de vida del insecto (Nuttall and Shipley 1901). 
 
 
 
 
 
 
 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shipley%20AE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20474132
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Figura 2. Ciclo de vida de Anopheles. El ciclo comienza cuando la hembra deposita los huevecillos en el agua y estos se desarrollan a 
larvas (L1, L2, L3 Y L4). El tercer estadio de desarrollo es la pupa que, después de uno o dos días, liberara al mosquito. (Tomado y 
modificado de Medhekar Ajit: (http://www.biologydiscussion.com/articles/structure-and-life-cycle-of-mosquito-with-diagram/2675)). 
 
 
 
1.5 Parásitos del género Plasmodium. 
Éste parásito pertenece al filo Apicomplexa, clase Aconoidasida, orden 
Haemosporina, familia Plasmodiidae y género Plasmodium. Existen más de 100 
especies de Plasmodium que infectan reptiles, aves y mamíferos (Knell 1991). 
Estos parásitos causantes de la malaria invaden y se multiplican en eritrocitos de 
vertebrados y son transmitidos por la picadura de mosquitos Anopheles; las 
etapas invasivas móviles del parásito (merozoítos, oocinetos y esporozoítos) son 
alargadas, poseen un solo núcleo y tienen la capacidad de ingresar en las células 
o pasar a través de tejidos usando organelos de secreción y locomoción 
especializados (Figura 3) (Knell 1991). 
 
15 
 
 
 
Figura 3. Fases invasivas del parásito Plasmodium. El merozoíto es la fase que invade eritrocitos y la más pequeña de las tres (1.5 µm). 
Los esporozoítos invaden las glándulas salivales del mosquito y su tamaño promedio es de 15 µm y los oocinetos invaden el epitelio 
intestinal, tienen un tamaño promedio de 12 µm. Las tres fases presentan órganos secretores que utilizan para el reconocimiento y 
adhesión a la célula hospedera. (Tomado y modificado de Castro and Rodríguez 2009). 
 
 
1.6 Ciclo de vida de Plasmodium 
El ciclo de vida de Plasmodium se lleva a cabo en dos hospederos, la fase asexual 
en vertebrados y la fase sexual en los mosquitos. La fase sexual inicia cuando el 
mosquito ingiere sangre infectada con gametocitos, que en el intestino del 
mosquito se diferencian a gametos femeninos y masculinos, los gametos 
masculinos exflagelan y fecundan a los gametos femeninos formando un cigoto, 
que dará origen a una forma móvil y alargada conocida como oocineto; el cual, 
migra del bolo alimenticio para invadir el epitelio del intestino del mosquito. El 
oocineto puede atravesar múltiples células epiteliales y establecerse en el espacio 
entre el epitelio intestinal y la lámina basal, en donde se diferencia a un ooquiste 
que después de 14 días madura y produce miles de esporozoítos que son 
liberados en el hemocele e invaden las glándulas salivales del mosquito (Figura 4). 
16 
 
 
 
 
 
 
 
Cuando un mosquito con esporozoítos se posa en una persona y se alimenta de 
su sangre, inocula la saliva con esporozoítos e invaden el torrente sanguíneo 
(Knell 1991). En el humano el ciclo del parásito continua en su fase asexual 
cuando los esporozoítos circulan hasta invadir células hepáticas en donde 
proliferan hasta formar cientos de merozoítos que posteriormente son liberados 
nuevamente al torrente sanguíneo y se transforman en trofozoítos que crecen 
hasta alcanzar alrededor de 7.2 micras de diámetro originando esquizontes 
eritrocíticos en donde, durante la división nuclear se originan entre 8 y 24 
merozoítos eritrociticos que son liberados e invaden otros eritrocitos iniciando este 
ciclo nuevamente. Este proceso se repite causando fiebre cada vez que los 
parásitos se liberan, la ruptura de los esquizontes es periódica y varía según la 
especie de Plasmodium. Algunos merozoítos exo y eritrocíticos después de invadir 
Figura 4. Fase sexual del ciclo de vida de Plasmodium en el mosquito vector Anopheles. El gametocito macho y hembra entran 
al intestino del mosquito con la comida sanguínea, en donde encuentran las condiciones óptimas para madurar a gametos que se 
fusionan y forman un cigoto, el cual desarrollara a las fases invasivas denominadas oocinetos que atraviesan el epitelio intestinal 
y se posan sobre la lámina basal, en donde se desarrollaran los ooquistes que generaran los esporozoítos que invaden las glándulas 
salivales. (Tomado y modificado de Riehle et al., 2003). 
17 
 
nuevos eritrocitos siguen un proceso de diferenciciación sexual aumentando de 
tamaño, pero no se multiplican sino que se transforman enmacrogametocitos 
(hembras) y microgametocitos (machos) que solo pueden continuar el ciclo 
cuando son ingeridos por un mosquito susceptible (Figura 3) (Knell 1991). 
 
Respuesta anti-Plasmodium en anofelinos. 
El sistema inmune de los insectos hace frente a infecciones por diversos 
microorganismos (Dimopoulos et al., 1997; Dimopoulos et al., 1998; Hoffmann and 
Reichhart 2002). Los mosquitos, al igual que otros invertebrados pueden generar 
respuestas eficientes, mediadas por factores humorales y celulares. En la 
infección por Plasmodium, diversos órganos y tejidos del mosquito como el epitelio 
intestinal, el cuerpo graso, la glándula salival y hemocitos que circulan en la 
hemolinfa secretan moléculas que resultan tóxicas para el parásito (Luckhart et al., 
1998; Dimopuolos et al., 2001; Cirimotich et al., 2010) como caspasas, nitritos y 
peróxidos por células apoptóticas del intestino medio infectado, las cuales inducen 
la muerte del oocineto (Kumar et al., 2004); péptidos antimicrobianos que 
destruyen la integridad de la membrana de esporozoítos y oocinetos (Kumar and 
Barillas-Mury 2005). Análisis transcripcionales de la carcasa del mosquito que 
contiene cuerpo graso, muestran cambios de expresión de diversos transcritos en 
respuesta a la alimentación con sangre y a la infección con el parásito (Dong et al., 
2006). Los hemocitos funcionan como células efectoras que, por nodulación, 
encapsulación y fagocitosis eliminan esporozoítos que se encuentran y circulan en 
el hemocele (Lavine and Strand 2002). 
En el intestino medio del mosquito, los oocinetos son detectados y marcados por 
factores de reconocimiento que activan las vías de inmunidad (TOLL, IMD y JAK-
STAT) asociadas a la eliminación del parásito generando activación de péptidos 
antimicrobianos, moléculas como TEP1 (thioester-containing protein 1), FBN9 
(fibronectin-related protein 9), (fibronectin-related protein 8) FBN8, (leucine rich-
repeat protein 7) LRRD7 y (down síndrome cell adhesión molecule) DSCAM son 
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proteínas que funcionan como marcadores y reconocimiento del parásito 
(Cirimotich et al., 2010). La citotoxicidad, es otro mecanismo efector de la 
respuesta inmune que destruye a las células por alteraciones en su estructura y 
metabolismo; lo que conduce a modificaciones en la permeabilidad de su 
membrana, así como de su actividad enzimática y de proliferación (Medical 
Subject Headings 1978). Por otro lado, se ha observado que las especies 
reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS y RNS) se incrementan durante la infección 
por Plasmodium, en respuesta al daño ocasionado por la invasión al epitelio 
intestinal; esto conduce a que muchos de los parásitos que atraviesan este órgano 
sean eliminados por este mecanismo de defensa (Molina-Cruz et al., 2008; 
Herrera-Ortiz et al., 2011). En general, estos órganos, moléculas y mecanismos 
son los responsables de la eliminación del parásito y sus diversos estadios 
invasivos durante su desarrollo en el interior del mosquito. 
En la actualidad se conoce que en vertebrados existe una estrecha relación entre 
los tres sistemas esenciales en un organismo que son el sistema inmune, sistema 
nervioso y sistema endocrino dando origen al sistema neuroinmunoendocrino; en 
invertebrados esta asociación aún no está bien definida, sin embargo, existen 
hipótesis que relacionan al sistema nervioso con el sistema endocrino y el inmune, 
se plantea que el sistema nervioso, al igual que en vertebrados, podría modular la 
función inmune mediante la liberación de moléculas como neuropéptidos, que 
podrían estimular o inhibir la función inmune contra diversos parásitos. 
 
1.8 Sistema nervioso en insectos. 
Contrario a lo que se podría pensar, los invertebrados no son “animales simples o 
sencillos”, son expertos en ahorro de recursos en donde, el sistema nervioso, a 
pesar de tener menos neuronas que en un vertebrado, está asociado a una gran 
diversidad y complejidad de conductas que han contribuido al éxito de estos 
animales en la evolución (Matheson 2002). El sistema nervioso de un insecto se 
compone de neuronas (motoras, sensoriales, interneuronas y gliales) las cuales 
transmiten información a todo el cuerpo del insecto, a través de impulsos 
19 
 
eléctricos (potenciales de acción) que viajan como ondas de despolarización a lo 
largo de las membranas neuronales. El sistema nervioso se divide en sistema 
nervioso central y sistema nervioso periférico, visceral o simpático (Chapman 
1998). Se asocia y controla prácticamente toda actividad del insecto, sea 
muscular, alimenticia, motora y funciones relevantes para la competencia vectorial 
entre otras (Chapman 1998). 
 
1.9 Sistema nervioso central (SNC): 
El SNC del insecto está formado por el cerebro, localizado en la parte dorsal de la 
cabeza, un cordón nervioso ventral compuesto de pares de ganglios segmentados 
que se encuentran a lo largo de toda la línea media ventral, torácica y abdominal, 
y de nervios sensoriales y motores (Figura 5). El cerebro de los insectos es el 
principal centro de asociación del cuerpo del insecto al recibir información 
sensorial externa a través de receptores de la cabeza y es el resultado de la fusión 
de seis ganglios, que forman tres pares y que a su vez definen tres regiones en el 
cerebro: el protocerebro, que inerva los ojos compuestos y los ocelos, es la región 
posterior del cerebro, y es el primer par de ganglios fusionados, en él se controlan 
aspectos asociados la visión del insecto; el deuterocerebro, es el segundo par de 
ganglios, inerva a las antenas y procesa la información sensorial colectada por 
ellas; y el tritocerebro que inerva el labro y el estomodeo, une al cerebro con el 
cordón nervioso e integra los estímulos sensoriales del protocerebro y 
deuterocerebro (Ruppert et al., 2004). Los ganglios del cordón nervioso están 
unidos por un nervio corto situado en la parte media, llamado comisura 
transversal. Cuando el insecto está en fase larval, algunos de estos ganglios están 
fusionados y el número total de ganglios es menor al número total de segmentos 
abdominales (Chapman 1998, Ruppert et al., 2004). 
 
 
20 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.10 Sistema nervioso periférico (SNP): 
Los órganos internos (digestivos, reproductores, excretores, etc.) de los insectos 
están inervados por el SNP, que está constituido por nervios segméntales 
formados por los axones de neuronas sensoriales y motoras que conectan a los 
órganos sensoriales con el sistema nervioso central (Träger and Homberg 2011). 
El sistema nervioso estomatogástrico, constituido de neuronas sensoriales y 
motoras, que controlan y monitorean los órganos viscerales y funciones internas 
median interacciones del ambiente exterior. Mientras que el ganglio subesofágico, 
situado en la parte ventral de la cabeza inerva mandíbulas, maxilares y labio 
(Figura 6) (Meyer 2006; Ruppert et al., 2004). 
 
 
Figura 5. Sistema nervioso central de insectos. A) Se muestran los tres pares de ganglios fusionados que constituyen 
el cerebro (protocerebro, deuterocerebro y tritocerebro). B) Cordón nervioso ventral. C) Comisuras conectoras de ganglios. 
D) Conexiones intersegmentales. F) Ganglio subesofágico y zonas que inerva. G) Ganglios torácicos y H) Ganglios 
abdominales iniciales. (Tomado y modificado de Meyer 2006). 
21 
 
1.11 El cerebro, órgano principal del SNC. 
La evolución de la simetría bilateral y de la locomoción en los invertebrados ha 
significado que un extremo del organismo (la cabeza) busque y encuentre 
estímulos relacionados a su sobrevivencia en su entorno antes que el resto del 
cuerpo. Para detectar mejor estas señales del medio ambiente ha habido una 
acumulación de estructuras sensoriales en la cabeza y diversos órganos 
captadores de estímulos se encuentran en ella (Matheson 2002). Estas 
adaptaciones han impulsado muchas especializaciones en el ganglio anterior para 
formarun cerebro. 
El cerebro constituye el componente central del sistema nervioso de los insectos 
(Robinson et al., 2008) y la regulación de la expresión de moléculas en él tienen 
un papel importante en la plasticidad conductual y la toma de decisiones del 
organismo en respuesta a estímulos internos y externos (Robinson et al., 2008). 
Diversos factores externos e internos pueden modificar la conducta del insecto; la 
disponibilidad de alimento y las infecciones por patógenos son alguno de estos 
factores (Hurd 2003; Klein 2003). Existen regiones vinculadas bilateralmente que 
contienen un gran número de neuronas muy pequeñas que se piensa que están 
asociadas a la integración y el aprendizaje asociativo; más de 1 millón de 
neuronas en esta región en el cerebro de las abejas generan una red 
interconectada que subyace a una notable comunicación social y conductas 
aprendidas por los insectos (Matheson 2002). Aunque el cerebro tiene un papel 
preponderante en coordinar eventos conductuales, otra función es activar otros 
mecanismos más complejos como la búsqueda de alimento, el control de la 
excitabilidad, el aprendizaje y la memoria. 
 
 
22 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Generalidades de los neuropéptidos 
Algunas de las moléculas que son componentes esenciales del sistema nervioso 
de los insectos son los neuropéptidos, que están conformados por diferentes 
cantidades de aminoácidos (Nässel 2002). Los neuropéptidos se generan a partir 
de secuencias de DNA precursoras que son sintetizados en los núcleos de las 
neuronas, que producen transcritos y se traducen a secuencias polipeptidicas 
conocidas como pre-pro-neuropéptidos que son procesadas postraduccionalmente 
(Figura 7), funcionan como moléculas señalizadores de procesos sinápticos que 
influyen en la actividad del cerebro o tienen función parecida a las hormonas, 
secretándose al sistema circulatorio de los organismos llegando a otros órganos 
para regular diversos procesos fisiológicos (Fricker 2012). Están implicados en la 
regulación neuroendocrina y el control de muchos procesos fisiológicos como la 
reproducción, la metamorfosis, el crecimiento, el metabolismo, la diuresis, la 
Figura 6. Sistema neuroendocrino y cerebro de insectos. Conformado por el cerebro, el ganglio subesofágico, el cordón 
nervioso ventral, la corpora cardiaca y la corpora allata. En la imagen se observan las células neurosecretoras (líneas punteadas 
y puntos negros) que salen del cerebro e inervan las glándulas secretoras CC y CA. (Tomado y modificado de Hartenstein 2006). 
23 
 
ecdisis, la diapausa, la actividad motora o muscular, la oviposición, el 
apareamiento y procesos conductuales (Figura 8) (Gäde and Goldsworthy 2003; 
Nässel and Homberg 2006; Schoofs et al., 2017). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Síntesis, procesamiento, transporte y secreción de neuropéptidos. En el núcleo de la célula se codifica la formación del 
ARNm (ácido ribonucleico mensajero) a partir de genes. En el retículo endoplásmico rugoso (RER) y el aparato de Golgi, este ARNm 
se traduce a un péptido precursor el cual, se procesa y transporta en las vesículas hacia las terminales sinápticas. Este transporte 
axonal puede ser anterógrado o retrógrado. Finalmente, la neurona libera péptidos en la terminal presináptica, que una vez 
liberados, interactúan con receptores propios o ajenos, o se degradan enzimáticamente. (Tomado y modificado de 
https://neurocerebro.es.tl/P%C9PTIDOS.htm y Fricker 2012). 
24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Los pre-pro-neuropéptidos presentan un péptido señal N-terminal, uno o varios 
neuropéptidos potencialmente activos flanqueados por sitios de escisión que 
consisten de residuos básicos como lisina-arginina (KR, KK, RR, RK, K o R) 
(Figura 7) y un motivo amidado C-terminal conservado generalmente como 
residuo de glicina (Vanden Broeck 2001). La alfa-amidación promueve la 
estabilidad y la bioactividad del neuropéptido (Cuttitta 1993; Merkler 1994). 
Algunos neuropéptidos son secretados a la hemolinfa y regulan diversas funciones 
en otros órganos (Gäde and Hoffmann 2005; Mykles et al., 2010; Scherkenbeck 
and Zdobinsky 2009). 
En los insectos, los neuropéptidos se pueden clasificar en diversos grupos de 
acuerdo a sus características estructurales y funcionales (Figura 9). Entre los 
Figura 8. Participación de neuropéptidos en diferentes procesos fisiológicos de insectos. Funciones en el 
desarrollo, la ecdisis del exoesqueleto, la homeostasis en la regulación de procesos metabólicos, comportamiento, 
migración, apareamiento y ovoposición entre otros. (Tomado y modificado de Scherkenbeck et al., 2009). 
25 
 
grupos que se han descrito se encuentran las hormonas adipocinéticas (AKH´s), 
allatostatinas (de los tipos A, B o C), allatotropinas, orcokininas, miosupresinas, 
piroquininas/PBAN, péptidos relacionados a taquiquininas y los péptidos similares 
a insulina (ILP´s), otros pueden ser únicos como la corazonina y la SIFamida 
(Nässel 2002; Nässel and Homberg 2006; Nässel and Winther 2010; Noyes et al., 
1995; Van der Horst 2003, Vanden Broeck 2001). Las hormonas adipocinéticas 
movilizan los lípidos del cuerpo graso a la hemolinfa, aumentan los niveles de 
trehalosa en la hemolinfa, estimulan la frecuencia de los latidos cardíacos y 
potencian la activación en cascada de profenoloxidasas (Nässel et al., 1995). Las 
miosupresinas inhiben las contracciones viscerales y del músculo cardíaco, y las 
estimulan en el músculo esquelético (Evans 2001), estimulan la secreción de 
enzimas en el intestino (Nachman et al., 1997) e inhiben la ingesta de alimentos 
(Aguilar et al., 2004). Los péptidos relacionados a taquiquininas estimulan las 
contracciones del músculo visceral (Schoofs et al., 1993), regulan la liberación de 
AKH´s (Nässel et al., 1995), modulan procesos olfatorios (Winther et al., 2006) y 
de agresividad (Asahina et al., 2014). Las piroquininas/PBAN regulan las 
contracciones del músculo visceral (Marciniak et al., 2012), activan la biosíntesis 
de feromonas (Altstein 2004), regula la melanización (Hiruma and Riddiford 2009), 
la diapausa embrionaria (Nagasawa 1992) y aceleran la pupación (Nachman et al., 
1997), mientras que la corazonina regula la fisiología del corazón (Hillyer et al., 
2012), como las contracciónes del corazón (Veenstra 1989), la ecdisis (Kim et al., 
2004) y la respuesta al estrés (Zhao et al., 2010) y la SIFamida está implicada en 
la regulación del comportamiento sexual y la promoción del sueño (Park et al., 
2014; Terhzaz et al., 2007). 
26 
 
 
 
 
 
En los genomas de diversos insectos, se han identificado y descrito genes que 
codifican para diversos grupos de neuropéptidos, por ejemplo, en Apis mellífera se 
han identificado 57 genes (Han et al., 2015) y en Aedes aegypti 50 genes (Predel 
et al., 2010), los cuales producen alrededor de 90 a 100 neuropéptidos 
funcionales. Ya que los anofelinos son un importante grupo de mosquitos que 
transmiten la malaria y el genoma de más de 20 especies de ellos están 
disponibles, (Neafsey et al., 2015), sólo el neuropeptidoma de An. gambiae se ha 
reportado y caracterizado y comprende al menos treinta y cinco genes que 
codifican péptidos relacionados con taquiquininas, piroquininas/PBAN, 
miosupresinas, hormonas adipocinéticas, péptidos similares a insulina, 
sulfaquininas, entre otros (Riehle et al., 2002). 
Figura 9. Grupos de neuropéptidos identificados en insectos. 
27 
 
2. Antecedentes 
Al igual que en los vertebrados, en los insectos los patrones de conducta son 
coordinados y regulados por el SNC (Klein 2003) por lo que, modificaciones en la 
expresión de proteínas del SNC podrían estar involucrados directamente en 
regular mecanismos que modifiquen los cambios de conducta. En invertebrados, 
cuando se envía una señal al SNC como resultado de un estímulo externo o 
interno y esta a su vez a una función específica,los receptores de moléculas de 
señalización mantienen o modifican sus perfiles de expresión (Klowden and 
Zwiebel 2005). Durante mucho tiempo se ha documentado que los 
microorganismos parásitos manipulan la conducta de sus vectores para favorecer 
su transmisión y su ciclo vital (Hurd 2003; Klein 2003; Biron et al., 2005). Existe 
evidencia de que el parásito de la malaria altera la función del sistema endocrino y 
el sistema inmune al infectar mosquitos (Hurd 2003; Klein 2003). Sin embargo, 
aunque existe una compleja interacción molecular entre el parásito Plasmodium y 
el mosquito Anopheles a nivel epitelial (oocineto-epitelio intestinal, esporozoíto-
glándula salival), se sabe poco sobre la alteración neuronal que provoca la 
invasión y presencia del parásito (Lefevre et al., 2007). Por lo tanto, moléculas 
sintetizadas en el SNC de los mosquitos infectados podrían tener una participación 
fundamental en la conducta y regulación de procesos inmunes. Un primer 
acercamiento para tratar de entender esta influencia es identificar moléculas del 
SNC que modifiquen su expresión cuando exista la presencia de parásitos. 
Se ha demostrado que P. falciparum y P. yoelii nigeriensis alteran la conducta de 
sus mosquitos vectores, An. gambiae y An. stephensi (Anderson et al., 1999; 
Wekesa et al., 1992) modificando el contacto de los insectos infectados con el 
huésped vertebrado (Koella et al., 1998; Smallegange 2013), el aumento en el 
número de alimentaciones sanguíneas (Smallegange 2013) así como la 
disminución de actividad enzimática en las glándulas salivales del mosquito 
(Rossignol et al., 1984) y la oviposición (Ferguson et al., 2005). 
28 
 
Ya que el cerebro y el sistema nervioso del mosquito dictan la conducta 
alimenticia, la actividad muscular, la secreción hormonal neuropéptidica y otras 
funciones (Dwivedi et al., 2014), se podría suponer que moléculas de este sistema 
juegan un papel crucial en la diseminación de la malaria. Aunado a que existe un 
“feedback” entre moléculas del sistema nervioso y el sistema inmune como 
neurotransmisores, citosinas, hormonas y neuropéptidos (Bendena 2010) que 
participan en diversos procesos vitales para el insecto. 
La interacción molecular entre Anopheles y Plasmodium se ha estudiado 
principalmente en la respuesta inmune que produce el mosquito (Le et al., 2012; 
Hauck et al., 2013; Garver 2012a, Garver 2012b ) y los mecanismos moleculares 
de evasión desarrollados por el parásito (Ramphul et al., 2015). La respuesta del 
cerebro a la presencia de oocinetos en el intestino del mosquito podría ser 
genérica y depender del estrés y/o de la especie y estadio del parásito. Así, las 
probables vías de señalización asociadas con la infección generadas en las 
células del intestino hacia el cerebro o viceversa siguen siendo desconocidas. Por 
lo que los efectos de la interacción e invasión entre los oocinetos y las células del 
intestino podrían generar señales de estrés que perciben las células del SNC y 
enviarse al cerebro del mosquito el cual activaría y modificaría diversas vías como 
las señales relacionadas con la privación de energía, el estrés oxidativo y las 
asociadas a inmunidad. Se ha demostrado que cuando el intestino de An. 
albimanus es invadido por oocinetos de P. berghei, el mosquito produce y libera 
óxido nítrico (NO) y peróxido de hidrógeno (H2O2), compuestos que son capaces 
de activar una respuesta inmune sistémica (Herrera-Ortiz et al., 2011). Además, la 
presencia de oocinetos induce cambios en la expresión de proteínas asociadas a 
inmunidad y defensa, óxido-reducción mitocondrial, metabolismo, transcripción y 
generación de energía en las células del intestino del mosquito (Serrano-Pinto et 
al., 2010). Sin embargo, modificaciones en el cerebro que se podrían generar 
durante esta fase de la infección por Plasmodium aún no sean reportado. 
 
29 
 
2.1 Modificación de la expresión de proteínas en cerebro de mosquito 
En algunos modelos de insectos se han identificado y descrito moléculas del 
sistema nervioso que cambian sus niveles de expresión cuando existe la 
presencia de un microorganismo parásito (Lefevre et al., 2007; Biron et al., 2006; 
Helluy and Thomas 2003; Hurd 2003). En anofelinos, solo en An. gambiae se han 
reportado proteínas de la cabeza del mosquito que modifican su expresión cuando 
hay esporozoítos en las glándulas salivales, estos esporozoítos, se desarrollan 20 
días después de que los parásitos entran en forma de gametocitos junto con la 
sangre al estómago del mosquito. Proteínas como PGAM (Phosphoglycerate 
mutase), ATP-grasp, COX5A (Complex IV of mitochondrial respiratory chain, 
subunit Va), ADK (Adenylate kinase), HAD-SF_hidro_IIA (phosphoglycolate 
phosphatase), BSD (Synapse-associated protein), HSP20 (Heat schock protein 
20KDa), Efhand-calmodulina, Tropomiosina, Anexina y la proteína 14-3-3, que 
participan en procesos metabólicos, de transmisión sináptica, en vías de 
señalización y de citoesqueleto, fueron identificadas (Figura 10) (Lefevre et al., 
2007). Los homólogos de estas proteínas en otros sistemas parásito-vectores 
tienen un papel importante en vías de señalización, metabolismo e interacción 
proteína-proteína (Klein 2003). 
En lo que respecta a la expresión diferencial de neuropeptidos, solo se ha 
reportado en An. stephensi que, los péptidos similares a la insulina (ILP´s), que 
coordinan el crecimiento y la reproducción (Riehle et al., 2002), mostraron un 
diferencial de expresion en la cabeza de mosquitos por cambios en la dieta y la 
infección por Plasmodium (Márquez et al., 2011). 
 
30 
 
 
 
 
 
 
2.2 Participación de los neuropéptidos en la respuesta inmune de insectos. 
En los últimos años, se ha generado evidencia que apoya la idea que los 
neuropéptidos podrían estar participando directa o indirectamente en la activación 
de la respuesta inmune de insectos. Se ha demostrado que AKHI activa y 
prolonga la actividad de la fenolóxidasa en Locusta migratoria cuando es co-
inoculada con lipolisacáridos o laminarina (Goldsworthy et al., 2002) y que otros 
neuropéptidos como CCAP y taquikinina promueven la liberación de AKHI 
(Goldsworthy et al., 2003). Otros estudios han demostrado que homodímeros de 
bursicon (burs α-α y burs β-β) pueden regular la expresión de genes asociados a 
inmunidad como diptericina, cecropina B, attacina A y B, y turandot B (An et al., 
2012). Recientemente, se ha demostrado que en D. melanogaster el neuropéptido 
NPLP1-VQQ activaba la vía IMD traslocando Relish, lo que da como resultado un 
aumento en la expresión del gen de diptericina (Overend et al., 2012). El péptido 
paralítico (PP), que participa en la contracción muscular en larvas de D. 
melanogaster (Sekimizu et al., 2005; Ishii et al., 2008), está asociado con la 
Figura 10. Proteínas identificadas en cabezas de mosquitos An. gambiae infectadas con 
esporozoítos de P. berghei. Gel SDS-PAGE en doble dimensión. Ma (PGAM), Na (ATP grasp), Md 
(COX5A), Mb (ADK), Mc (HAD-SF_hydro_IIA), Mf y Mg (BSD), Mi (HSP20), Mj (Efhand), Me, Mk 
(Tropomiosina), Mi (anexina), Mh (proteína de función diversa). Lefevre et al., 2007. 
31 
 
activación de fagocitosis y péptidos antimicrobianos como cecropina A, moricina y 
tetraspanina E (Ishii et al., 2010; Fujiyuki et al., 2012). En cucarachas, se ha 
demostrado que la allatostatina es producida no solo en el SNC, sino que también 
por una población de hemocitos granulados que pueden contribuir a la respuesta 
inmune (Skinner et al., 1997). Estudios recientes en An. albimanus, muestran la 
participación directa de neuropéptidos allatotrópicos en la respuesta inmune del 
mosquito (Figura 11) (Hernández-Martínez et al., 2017). Los estudios demuestran 
que estos neuropéptidos, al ser adicionados a cultivos in vitro de intestinos de An. 
albimanus, activan la expresión de péptidos antimicrobianos como cecropinay 
gambicina; además, en la línea celular (LSB-AA695BB de embriones de An. 
albimanus) y hemocitos activan fagocitosis contra E. coli. Adicionalmente, datos 
preelimiares muestran un aumento en los niveles de allatotropina en la hemolinfa 
de los mosquitos en presencia de oocinetos de P. berghei (Hernández-Martínez et 
al., 2017). Estos antecedentes sugieren que diversos neuropéptidos, además de 
realizar las funciones ya descritas para cada uno de ellos; están involucrados en 
procesos inmunes. La identificación de los neuropéptidos y su implicación en los 
procesos fisiológicos relevantes para la transmisión de la enfermedad es esencial 
para conocer y proponer mecanismos asociados a la eliminación de la infección 
(Riehle et al., 2002). 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
Control LPS AT AS
2^-DDct Attacina
2^DDct Cecropina
2^DDct Gambicina
Figura 11. Neuropéptidos como allatotropina inducen la expresión de mensajeros asociados a respuesta inmune en 
intestinos de An. albimanus. Los RNA mensajeros para péptidos antimicrobianos como atacina, cecropina y gambicina 
aumentan su expresión en intestinos del mosquito incubados con allatotropina. Lo que indica que además de su función ya 
conocida, podría participar en la activación de la respuesta inmune del mosquito (Hernández–Martínez et al., 2017). 
33 
 
3. Justificación: 
A pesar de que An. albimanus, es uno de los principales vectores del paludismo 
en México y Centro América, no existen estudios que identifiquen moléculas del 
cerebro que modifiquen su expresión cuando los mosquitos están infectados por 
Plasmodium. Ya que el cerebro del mosquito se asocia a diversos patrones 
fisiológicos, inmunes y de conducta; la identificación de moléculas ayudara a 
comprender y proponer como el sistema nervioso podría estar reaccionando a la 
presencia del parásito. En este trabajo utilizamos un enfoque proteómico y 
transcriptómico para identificar y analizar la expresión de moléculas en el cerebro 
de An. albimanus después de una alimentación con sangre infectada de oocinetos 
de P. berghei. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. OBJETIVOS 
Analizar y describir el proteoma y neuropéptidoma de cerebros de mosquitos 
An. albimanus. 
GENERAL 
 
Identificar moléculas con expresión diferencial producidas en el cerebro de 
mosquitos Anopheles albimanus infectados con el parásito Plasmodium berghei. 
ESPECIFICO 
35 
 
5. Metodología 
5.1 Obtención de mosquitos Anopheles albimanus: 
Mosquitos An. albimanus de la cepa franja blanca (Chan et al., 1994) se criaron y 
se obtuvieron del insectario del Centro de Investigación sobre Enfermedades 
Infecciosas del Instituto Nacional de Salud Pública en Cuernavaca Morelos, 
México. Los mosquitos se mantuvieron bajo condiciones controladas a una 
temperatura de 28oC y humedad relativa de 70-80%, con ciclos de fotoperiodo de 
12 horas luz-12 horas oscuridad y en recipientes cerrados con malla. Para 
determinar que los cambios en la expresión de proteínas del cerebro se asocian 
principalmente a la presencia de Plasmodium en el intestino, a los mosquitos se 
les eliminó la microbiota intestinal tratándolos con antibióticos (Contreras-Garduño 
et al., 2015) que se suministraron al alimentarse ad libitum con 15 ml de sacarosa 
estéril al 8% suplementada con PSN 1X (penicilina, 5,000 U, estreptomicina 5 
mg/ml, neomicina 100 µg/ml) (Life technologies) y gentamicina (50 µg/ml) 
embebidos en torundas de algodones estériles. Los algodones se colocaron sobre 
la malla de cada recipiente que contenía a cada grupo de mosquitos 12 horas 
después de que los mosquitos emergieron de las pupas y se cambiaron cada 24 
horas en los tres días subsiguientes. 
5.2 Cultivo de oocinetos de Plasmodium berghei: 
Parásitos de la cepa ANKA-GFP de P. berghei que expresan la proteína verde 
fluorescente (Franke-Fayard et al., 2004) donada por el Dr. Robert E. Sinden 
(Imperial Collage, Reino Unido) se descongelaron de nitrógeno líquido y se 
utilizaron para infectar a ratones Balb C previamente tratados con difenilhidrazina 
(200 mg/ml) para inducir la producción de reticulocitos, se utilizaron 1x106 de 
parásitos por cada infección. A partir del tercer día de infección se monitoreo la 
parasitemia y gametocitemia en cada ratón. Cuando la parasitema estuvo entre el 
10 y 20% y la gametocitemia entre el 3 al 5%, se tomaron muestras de sangre de 
5 µl que se colocaron en portaobjetos para verificar en un microscopio compuesto 
a objetivos de 10 y 40X la producción de gametos machos por un proceso 
36 
 
denominado “exflagelación de gametocitos”. Al obtener una exflagelación y 
formación de 5 a 10 “rosetas” (fecundación) en cada campo microscópico 
analizado, se procedió a realizar la producción de cultivos de oocinetos in vitro. 
La sangre de cada ratón infectado seleccionado se obtuvo con jeringas de insulina 
que contenían 100 µl de heparina (1U/µl) que se agregó a matraces estériles de 
250 ml que contenían 3 ml de medio de cultivo RPMI y 2 ml de suero fetal bovino 
descomplementado, cada cultivo se mezcló sutilmente y se incubó a 19oC por 24 
horas para permitir el desarrollo de los oocinetos. Para validar el desarrollo de 
ellos, 5µl de cada cultivo se colocaron en un portaobjetos que se cubrió con un 
cubreobjetos y se analizaron en un microscopio de fluorescencia. 
5.3 Infección de mosquitos Anopheles albimanus con oocinetos de 
Plasmodium berghei: 
Para la alimentación e infección de los mosquitos, se utilizaron alimentadores 
artificiales y una incubadora circulante que mantuvo la sangre y el cultivo de 
oocinetos a 37oC. Mosquitos hembra de cuatro días de edad se separaron en 2 
grupos de 300-400 individuos y se alimentaron con 500 µl de sangre de ratón de la 
cepa Balb C (grupo control) o con 500 µl de un cultivo de oocinetos de P. berghei 
(grupo infectado, con 800 oocinetos por microlitro). Los mosquitos que no se 
alimentaron plenamente se separaron y se sacrificaron. Ambos grupos de 
mosquitos se incubaron a 21oC por 24 horas para permitir la interacción y la 
invasión de los oocinetos al epitelio intestinal del mosquito. Cada intestino se 
analizó en un microscopio de fluorescencia para confirmar la presencia (grupo 
infectado) o ausencia (grupo control) de oocinetos. Cada experimento de infección 
se realizó tres veces de manera independiente. 
Obtención de cerebros de mosquitos: 
El cerebro de cada mosquito se diseco en condiciones estériles a las 24 horas 
post-alimentación utilizando un microscopio estereoscópico, agujas y pinzas de 
disección. Para la disección, los mosquitos fueron anestesiados incubándolos por 
37 
 
10 minutos a 4oC y manteniéndolos en cajas Petri sobre hielo, cada mosquito se 
colocó en un portaobjetos estéril con la parte ventral hacia arriba, posteriormente 
se decapitó y se separó la cabeza a la que se tomó sutilmente con las pinzas de 
disección por sus partes latero-anteriores, mientras la aguja de disección se 
colocó en una parte cercana a las antenas, la probóscide y los palpos y de un solo 
movimiento se oprimió la cabeza para que el tejido cerebral saliera del lado 
posterior (parte que se unía al tórax). Trescientos cerebros fueron obtenidos de 
cada grupo y se colectaron en 200 µl de PBS 1X con inhibidores de proteasas (2 
mM PMSF, 2 mM TLCK, 0.1 mg/ml leupeptina y 1 mM EDTA) (Sigma, Mo). Para el 
grupo infectado, solo se colectaron y se utilizaron los cerebros de mosquitos que 
tuvieron presencia de oocinetos en el intestino y se almacenaron a -70oC hasta su 
uso. 
6. IDENTIFICACION DE PROTEINAS 
6. 1 Electroforesis de doble dimensión (2D SDS-PAGE) y análisis de 
imágenes: 
Las muestras de cerebros de cada grupo (control e infectado) se descongelaron,se centrifugaron por 10 minutos a 10,000 g a 4oC, se eliminó el sobrenadante y la 
pastilla del tejido se solubilizó en una solución de lisis (ampholine lysis buffer 
#A6049 © SIGMA) que contenía Urea (7M), DTT (100mM), CHAPS (2%) y 
anfolinas (0.2%). El contenido de proteína se determinó utilizando el método BCA 
(#23225©Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Triplicados de 125 ug de proteína 
de cada grupo se separaron en tiras de acrilamida comerciales de 13 cm, pH 3–10 
NL (no linear) (separación de proteínas por isoelectroenfoque) (Amersham). El 
isoelectroenfoque (IEF) se realizó en el equipo Ettan IPGphor (#11-0033-64© 
Amersham Biosciences, Uppsal, Sweden) de acuerdo a lo recomendado por el 
proveedor. Las tiras con cada muestra se hidrataron a 2000 volts por 17 horas a 
20oC, inmediatamente después se sometieron a una electroforesis escalada no 
linear a 300 volts, 600 volts y 800 volts. Finalizada la electroforesis, las tiras se 
incubaron en un buffer de rehidratación y las proteínas se redujeron y alquilaron 
38 
 
incubándolas secuencialmente por 15 minutos en un buffer de equilibrio (Tris-HCL 
0.04M pH 6.8, SDS 1%, glicerol 30%, DTT 4mg/ml en EB) y 15 minutos en el 
buffer de equilibrio pero sustituyendo el DTT por iodoacetamida (40 mg/ml). Las 
tiras con las muestras se colocaron en la parte superior de geles de acrilamida 
(SDS-PAGE) al 13% para separar las proteínas por peso molecular sometiéndolos 
a electroforesis a 150 volts (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Finalizada la 
electroforesis, los geles se lavaron con dos litros de agua destilada durante 1 hora 
a temperatura ambiente y se tiñeron con PhastGel Blue (Amersham Biosciences, 
Uppsala, Sweden) por 15 horas de acuerdo a las recomendaciones del proveedor. 
Los geles teñidos fueron escaneados y digitalizados usando un densitómetro (Bio-
Rad Hercules, CA, EUA), las imágenes de los geles de doble dimensión de cada 
muestra biológica independiente de cada condición fueron procesadas utilizado el 
software PD-Quest 8.0.1 (Bio-Rad, Hercules CA). Los spots de cada gel se 
detectaron automáticamente con el software. La normalización de las imágenes se 
realizó utilizando el método de normalización que utiliza un modelo de regresión 
para normalización suplementado por el software. Para una comparación 
apropiada de las muestras; las imágenes se ajustaron adaptando un modelo 
común de distorsión, lo cual se hizo ajustando los spots de las tres imágenes de 
cada condición. Las imágenes de cada condición se compararon entre sí para 
generar una base de datos de los spots totales con un 98% de confianza 
estadística (P<0.01) utilizando una prueba de t de Student. Finalmente, los spots 
que presentaron un cambio de intensidad de ±2 veces fueron seleccionados y 
fueron sometidos a un análisis de espectrometría de masas para su identificación. 
6.2 Proteólisis, identificación y anotación funcional: 
Los spots seleccionados de los geles 2D, fueron extraídos manualmente en 
condiciones estériles en campana de flujo laminar para evitar contaminación de 
queratina, colocados en tubos eppendorf de 1.5 ml y almacenados a -70oC hasta 
su procesamiento. Para su identificación por espectrometría de masas, las 
muestras se prepararon de acuerdo a lo reportado por Shevchenko et al., 1996 y 
Encarnación et al., 2005. 
39 
 
Los spots se destiñeron, se redujeron, se alquilaron y se digirieron con tripsina 
(Promega, Madison, WI, USA). Los péptidos se desalaron utilizando columnas de 
Zip Tip C18 (Millipore, Bedford, MA), de acuerdo a las recomendaciones del 
proveedor. La espectrometría se realizó utilizando un equipo Bruker Daltonics 
Autoflex (Bruker Daltonics, Billerica, MA) operado en un modo reflecton y con 
extracción retardada. Los espectros se calibraron externamente usando un 
calibrador estándar (Bruker Daltonics 206095). Las mezclas peptídicas se 
analizaron utilizando una solución saturada de ácido alfa-ciano-4-hydroxicinamico 
en ácido trifluoroacético (0.1%)-acetonitrilo (50%). 
La lista de picos de las masas peptídicas se analizaron utilizando las bases de 
datos de acceso abierto en NCBI nr (National Center for Biotechnology Information 
non-redundant data set)( 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/nonredundantproteins/#reference) y 
Anopheline protein data bank (https://www.vectorbase.org/organisms)(Giraldo- 
Calderon, et al., 2015) utilizando el programa Mascot (Matrix Science, London, UK; 
http://www.matrixscience.com)(Mascot software), con los siguientes parámetros: 
Un sitio de corte aminoacídico permitido, carbaminometilcisteína como la 
modificación fija y oxidación de la metionina como la variable de modificación. Las 
proteínas con scores >50 y P>0.05 se tomaron como proteínas identificadas. 
6.3 Análisis tipo STRING: 
Para realizar el análisis de redes con las proteínas identificadas en el cerebro de 
An. albimanus, se identificaron las proteínas ortólogas en Drosophila melanogaster 
y An. darlingi, se analizó la similitud y homología entre las tres especies y se 
construyó una base de datos. El análisis de redes de las proteínas identificadas se 
construyó utilizando la base de datos Search Tool for the Retrieval of Interacting 
Genes (STRING)(Szklarczyk et al., 2015), y se visualizó con el programa Medusa 
(Hooper and Bork 2005). Las interacciones incluyeron asociaciones directas 
(físicas) e indirectas (funcionales) derivadas de contextos genómicos y 
experimentales, así como de datos de co-expresión y reportados en la literatura. 
40 
 
 
7. IDENTIFICACION DE NEUROPEPTIDOS Y ANALISIS TRANSCRIPTOMICO 
7.1 Obtención de RNA total 
El RNA total de 300 cerebros de cada grupo se obtuvo a las 24 horas 
postinfeccion, utilizando el reactivo y la metodología propuesta por la técnica de 
trizol (Invitrogen, USA). Los cerebros de cada muestra se disecaron como 
previamente se describió y se solubilizaron en 500 µl de trizol, posteriormente, 
utilizando un biovortex estéril y libre de RNAsas, las muestras se maceraron a 4oC 
aplicando 5 pulsos de 30 segundos cada uno para disgregarlas y homogenizarlas 
y enseguida se incubaron por 3 minutos a temperatura ambiente para lisar el tejido 
y disociar los complejos proteicos presentes, posteriormente se agregaron 100 µl 
de cloroformo y las muestras se agitaron vigorosamente de manera manual 
durante 15 segundos y se incubaron a temperatura ambiente por 3 minutos. 
Usando una centrifuga refrigerada (Prism R de Labnet) las muestras se 
centrifugaron a 4°C durante 15 minutos a 13000 rpm (16000 x g); en seguida, la 
fase acuosa superior (transparente que contiene el RNA) se extrajo y se recuperó 
en tubos eppendorf estériles y libres de RNAsas. Se añadieron 250 µl de 
isopropanol absoluto frio a cada una de las muestras para precipitar el RNA y se 
homogenizó la mezcla agitando gentilmente por inversión 5 veces, las muestras se 
incubaron a -20°C por 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, se 
centrifugaron a 13,000 rpm (16000 x g) a 4°C durante 15 minutos, 
cuidadosamente se descartó el sobrenadante y se agregaron 500 µl de etanol frio 
al 75% centrifugando a 10,000 rpm por 8 minutos, se descartó el sobrenadante y 
se eliminó el exceso de etanol dejando secar el pellet de cada muestra/tubo a 
temperatura ambiente por 5 minutos; que posteriormente se resuspendió 
perfectamente agregando 20 µl de agua-dietilpirocarbonato (0.1% DEPC). Ya que 
algunas muestras de RNA contenían pigmento de los ojos compuestos del insecto, 
los volúmenes de resuspensión se ajustaron a 200 µl con agua-DEPC y se 
pasaron por columnas del kit “RNA clean up kit” (Zymoclean) de acuerdo a la 
41 
 
metodología sugerida por el fabricante, al final, estas muestras se resuspendieron 
en 15 µl de agua-DEPC. La concentración, integridad y cantidad del RNA total de 
cada muestra se determinó utilizando el equipo “Agilent’s 2100 Bioanalyzer” y el kit 
“RNA 6000 Pico kit” de acuerdo a lasinstrucciones del fabricante (Agilent 
Technologies, Santa Clara, CA, USA). 
7.2 Síntesis de cDNA, generación de librerías y secuenciación masiva en la 
plataforma 454: 
El cDNA se sintetizó a partir de un microgramo de RNA total de los cerebros de 
cada grupo de mosquitos utilizando el kit “Mint-2 cDNA synthesis kit (Evrogen, 
Moscú, Rusia) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. El RNA total fue 
previamente tratado con DNase I (Invitrogen, USA). Para la síntesis de la primera 
cadena de cDNA se utilizó un oligonucleotido dT (CDS-GsuI), cada microgramo de 
RNA total se mezcló con 12 pmol de oligonucleótido CDS-GsuI, y se incubaron a 
70oC por 3 minutos e inmediatamente después a 42oC por 2 minutos. 
Posteriormente, se agregaron 5 pmol del oligonucleótido adaptador plug y se 
mezcló cuidadosamente la reacción a la que posteriormente se le agregó una 
mezcla de reacción que consistió de buffer 5X (2.7 µl), DTT 1M (1µl), dNTP´s 
2.5mM (1µl), reverso transcriptasa 200u/µl (1µl) e inhibidor de RNAsa 40u/µl 
(0.3µl). Cada reacción se incubó por 1 hora a 42oC, a las que posteriormente se 
les agregó un microlitro de MnCl2 (20mM), se mezcló y se incubó nuevamente por 
1 hora a 42oC y posteriormente 10 minutos a 72oC. Al final las reacciones de 
síntesis se centrifugaron 10 segundos a 10,000 g y se almacenaron a -70oC. 
Para generar la segunda cadena del cDNA, se realizaron reacciones de síntesis 
por PCR (PCR evaluador) utilizando volúmenes de reacción de 50 µl cada una y 
utilizando 1.2 µl de cDNA del grupo control o 1.5 µl de cDNA del grupo infectado, 
5µl de Buffer Taq platinum (10X), 2.5 µl de MnSO4 (50 mM), 1µl de dNTP´s (10 
mM), 1µl de oligonucleotido M1 (10pmol), 1µl de Taq platinum (10U), ajustando el 
volumen final con H20-DEPC 0.1%. Las condiciones de síntesis fueron las 
siguientes: 
42 
 
Un ciclo a 95oC por 3 minutos, 33 ciclos a: 95oC 30 segundos, 66oC 30 segundos, 
68oC 3 minutos y un ciclo a 68oC 5 minutos para la reacción de la muestra control; 
para la muestra infectados las condiciones de síntesis fueron similares, solo se 
modificó el número de ciclos de desnaturalización, alineamiento y síntesis de 33 
ciclos a 28 ciclos, este modificación en la cantidad ciclos de amplificación se hizó 
con el fin de ajustar la cantidad de transcritos de cada muestra. 
Finalmente, tres microgramos de cDNA de doble cadena se digirieron con la 
enzima GsuI (15 U) por 6 horas a 30oC para quitar secuencias adaptadoras de los 
oligonucleótidos. 
La generación de librerías de cDNA consistió básicamente de cuatro pasos y se 
prepararon con el kit “GS FLX Titanium Rapid Library Preparation” de acuerdo a 
las recomendaciones del fabricante. 
Brevemente, los cDNAs de cada muestra se fragmentaron en productos de entre 
200 a 800 pares de bases aproximadamente mediante un proceso físico conocido 
como “nebulización”. Posteriormente, por un proceso de ligación se añadieron 
secuencias adaptadoras (RL Adaptor – RL MID Adaptor) a cada fragmento de 
cDNA obtenido de cada muestra (adaptador A y adaptador B). Estas secuencias 
adaptadoras funcionan como etiquetas en los pasos de selección, amplificación y 
secuenciación. El siguiente paso fue seleccionar los fragmentos de cDNA a los 
que se unieron correctamente los adaptadores. Para ello, los fragmentos de cDNA 
se unieron a microesferas por la parte 3´ del adaptador B. Los fragmentos que 
tenían el adaptador A no se unieron a las microesferas y fueron eliminados. Los 
fragmentos de doble cadena unidos a estas microesferas fueron tratados con 
hidróxido de sodio (NaOH 10mM) para romper los puentes de hidrogeno y generar 
fragmentos de cDNA de cadena sencilla. Para el proceso de amplificación, las 
microesferas se introducen en una emulsión de agua y aceite para que cada 
esfera quede dentro de una gota de esta mezcla, con los reactivos y enzimas 
necesarios para realizar una reacción tipo PCR (PCR en emulsión). Después de 
43 
 
esta reacción, se habrán generado en cada microesfera un gran número de 
secuencias de doble cadena idénticas. 
Las librerías generadas de cada muestra (control e infectados) se amplificaron por 
qPCR siguiendo las recomendaciones y la metodología del kit “KAPA Library 
Quantification Kit for Roche 454 GS Titanium platform” (KAPA Biosystems). 
Para realizar la secuenciación se adaptó un oligonucleótido de secuencia a cada 
librería (RL MID 4 para la muestra control y RL MID 5 para la muestra problema), y 
se ajustó el número total de microesferas a 2.1 x106 por grupo que se colocaron 
cuidadosamente en el dispositivo “PicoTiterPlate” que es el que se introduce en el 
secuenciador 454. Este dispositivo consta de más de un millón de pozos de 44 µc 
de diámetro de forma que solo una microesfera con fragmentos de cDNA cabe en 
cada pozo. Además de las microesferas, se introdujeron otros tipos de 
microesferas que contenían las enzimas sulfurilasa y luciferasa que fueron 
necesarias para detectar la incorporación de los nucleótidos durante la síntesis de 
la cadena complementaria. La primera genera ATP a partir de pirofosfato y la 
segunda se transforma en oxiluciferina en presencia de ATP con emisión de luz. 
De esta forma se construye una cascada enzimática que comienza cuando la DNA 
polimerasa incorpora un nucleótido a la cadena creciente complementaria del 
cDNA a secuenciar liberando un pirofosfato y terminando cuando la luciferasa 
emite luz. El secuenciador automatiza el proceso de secuenciación, la captura de 
imágenes y su interpretación. El secuenciador vierte automáticamente sobre los 
pozos los reactivos necesarios y un tipo de nucleótido cada vez. Así de forma 
cíclica se irán vertiendo adeninas, citocinas, guaninas y timidinas en cada pozo y 
la DNA polimerasa añadirá uno o más nucleótidos dependiendo de la secuencia 
que actúa como molde y se emitirá luz con una intensidad proporcional al número 
de nucleótidos incorporados a la nueva cadena que se va sintetizando durante el 
proceso de secuenciación (Roche). 
 
 
44 
 
 
7.3 Análisis transcriptómico e identificación in silico de transcritos de 
neuropéptidos en cerebros de mosquitos An. albimanus: 
A las “reads” o secuencias obtenidas se les eliminó la secuencia correspondiente 
a los adaptadores utilizando el software SeqClean (Roche) y posteriormente 
fueron mapeadas contra el genoma y transcriptoma de An. albimanus 
(https://www.vectorbase.org/Anopheles_albimanus/.) 
(http://funcgen.vectorbase.org/annotatedtranscriptome/MartinezBarnetche_et_al_A
nopheles_albimanus) (Martínez-Bartnetche et al., 2012) utilizando el software GS 
Reference Mapper, versión 2.5.3. y el programa Exonerate versión 2.2 (Slater and 
Birney 2005). Los archivos generados tipo Bam se usaron para verificar los 
mapeos y para identificar genes y transcritos putativos anotados y/o no anotados 
en las bases de datos del genoma, estos archivos estan disponibles en las URLs: 
http://201.131.57.23:8080/files/anopheles_albimanus/mapeo_control/mapeo_contr
ol.bam y http://201.131.57.23:8080/files/anopheles_albimanus/pberghei/pberghei 
sorted.bam. 
Las anotaciones tipo Gene ontology (GO) de los transcritos se obtuvieron con el 
software Biomart (Kinsella et al., 2011) y la búsqueda y comparación de los 
dominios GO entre los transcritos obtenidos de los cerebros y de la base de datos 
de An. albimanus se realizó utilizando el software BLAST2GO versión 4.0.2 
aplicando una prueba de Fisher´s Exact Test (Conesa et al., 2005). 
Adicionalmente, los transcritos se anotaron de acuerdo a los dominios utilizando el 
software InterProScan (Zdobnov and Apweiler 2001). Los transcritos identificados 
con dominios de neuropéptidos y hormonas neuropeptídicas se seleccionaron y se 
validaron por tblastx y blastp. 
 
 
45 
 
7.4 Validación y análisis de expresión diferencial de transcritos para 
neuropéptidos: 
La secuencia de RNA correspondiente a cada uno de los neuropéptidos se utilizó 
paradiseñar oligonucleótidos específicos para amplificar los transcritos de cada 
uno de los neuropéptidos identificados. Los oligonucleótidos se analizaron usando 
el programa OligoAnalyzer 3.1 (Integrated DNA Technologies) tomando en cuenta 
el tamaño del amplicón (100 a 200 pb), el tamaño del oligonucleótido (de 17 a 25 
bases), el porcentaje de GC (guanina y citosina) mayor o igual a 50%, temperatura 
de fusión (promedio de 60°C), la formación de estructuras secundarias como 
dímeros o heterodímeros menores a -5 kcal/mol y formación de estructuras de asa 
y tallo menores a -5 kcal/mol. La validación de cada transcrito se realizó aplicando 
la técnica de PCR tiempo real en el equipo Step One Real Time PCR System 
(AppliedBiosystems). Se utilizaron tres muestras biológicas diferentes de cada 
condición y por triplicado para cada neuropéptido, el transcrito codificante para la 
actina se utilizó como gen endógeno. 
Cada reacción de qPCR se realizó a un volumen final de 10µl utilizando 5µl de 
Master Mix (2x) SYBR Green/ROX qPCR (ThermoScientific), 1µl de oligo Forward 
(1.5 pmol), 1µl de oligo Reverse (2.5 pmol), 1µl de cDNA molde y 2µl de H2O libre 
de nucleasas (ThermoScientific). Las condiciones de amplificación fueron las 
siguientes: 1 ciclo a 95°C (10 minutos) y 40 ciclos a 95°C (15 segundos), 64°C (1 
minuto), 1 ciclo a 95°C (15 segundos) 64°C (15 segundos) y 95°C (15 segundos). 
La expresión de AKH II, miosupresina, pyrokinina/PBAN, SIFamida, taquikinina, 
corazonina, ILP2 e ILP3 se analizó de manera diferencial entre los grupos de 
mosquitos infectados con P. berghei y no infectados. Los resultados de cada 
neuropéptido que se obtuvieron se compararon aplicando la formula delta–delta 
cT(ΔΔcT) (Livak and Schmittgen 2001) y un análisis de varianza de una vía 
(ANOVA) seguida de un análisis Kruskal-Wallis (α = 0.05). 
 
 
46 
 
8. RESULTADOS 
8.1 Análisis del perfil proteico en geles de doble dimensión (2D), expresión 
diferencial e identificación de proteínas. 
Los perfiles proteicos de las muestras cerebrales de An. albimanus de cada 
condición mostraron 547 spots en el grupo control y 405 spots en el grupo 
infectado, el 96% del total de spots presentó tinción bien definida (Figura 12). El 
peso molecular de las proteínas tuvo un rango de entre 15 y 130 kDa, y el punto 
isoeléctrico (pI) de 2.0 a 8.9. La intensidad de cada spot (aumento o disminución) 
se consideró significativa cuando presentaron cambios de intensidad relativa 
mayor a dos veces entre ambos grupos a un nivel de confianza del 99% (P <0,01). 
Se identificaron ciento ochenta y ocho spots con expresión diferencial, 165 en el 
grupo control (88%) y 23 (12%) en el grupo infectado, lo que sugiere que la 
invasión de oocinetos de P. berghei al tejido intestinal desencadena una respuesta 
cerebral en An. albimanus. De los 188 spots diferenciales, se identificaron 
diecinueve proteínas con E-values, score, identidad y cobertura que fueron 
compatibles con la identificación y asignación correcta a proteínas ya reportadas 
del proteoma de An. gambiae y An. darlingi. Además, los transcritos de estas 
proteínas también se identificaron en el análisis transcriptómico y se identificaron 
en la base de datos del genoma An. albimanus 
(https://www.vectorbase.org/taxonomy/anopheles) (Giraldo-Calderon et al., 2015). 
Las proteínas identificadas se clasificaron en cinco categorías: 1) síntesis de ATP 
acoplada a transporte de protones, 2) proteínas que participan en re-arreglos del 
citoesqueleto y plasticidad sináptica 3) procesos de óxido-reducción, 4) 
transducción de señales y 5) participación diversa (tabla 1 y tabla 2). 
 
 
 
47 
 
 
 
 
 
 
 
8.2 Proteínas que participan en la síntesis de ATP acoplada a transporte 
de protones. 
Las proteínas identificadas y que se clasificaron en este grupo fueron las 
proteínas alfa y beta del complejo ATP-sintasa (spots 10 y 19, claves 
AALB010020-PA y AALB005889-PA respectivamente), la subunidad f de la 
ATP-sintasa vacuolar (spot 13, clave AALB009730-PA), y una proteína del 
canal dependiente de voltaje anión selectiva (spot 7, clave AALB000444-PA). 
Estas cuatro proteínas fueron sobre expresadas en cerebros de mosquitos 
infectados (tabla 1). 
 
Figura 12. Geles de electroforesis bidimensional de extractos cerebrales de mosquitos An. albimanus. A: grupo control (no 
infectado); B: grupo infectado con P. berghei. Se identificaron diecinueve proteínas con expresión diferencial entre grupos. (Véase 
también la Tabla 1.) 
48 
 
8.3 Proteínas que participación en re-arreglos del citoesqueleto y 
plasticidad sináptica. 
En este grupo se identificaron 4 proteínas: La proteína asociada a la sinapsis 
(spot 4, clave AALB008424-PA), que contiene un dominio similar al factor de 
transcripción BTF-2 y un dominio tipo Dos2-like (BSD). Esta proteína se 
encuentra de manera específica en las neuronas y es un importante elemento 
molecular del sistema nervioso (Lauks et al., 2012; Saumweber et al., 2011). 
Su expresión se reprimió en los cerebros de mosquitos infectados (tabla1). 
La cadena β de la tubulina (spot 16, clave AALB000046-PA) que es un 
elemento importante en el ensamble de microtúbulos en el citoesqueleto 
(Janke 2014). La cofilina (spot 14, clave AALB010134-PA), que está implicada 
en la regulación de la polaridad neuronal (Sarmiere and Bamburg 2004). La 
calreticulina (spot 8, clave AALB003666-PA), una proteína multifuncional que 
participa principalmente en la conformación adecuada de proteínas, que 
controla niveles de calcio y que además está asociada a regular mecanismos 
de resistencia contra infecciones (Michalak et al., 2009). Estas tres proteínas 
fueron sobre-expresadas en cerebros de mosquitos infectados (tabla 1 y tabla 
2). 
8.4 Proteínas que participan en procesos de óxido-reducción. 
En este grupo se identificaron 5 proteínas: La enoyl-CoA hidratasa (spot 1, 
clave AALB010381-PA). Esta enzima cataliza el segundo paso en la vía de la 
beta-oxidación del metabolismo de los ácidos grasos (Zhang et al., 2015), y 
mostró represión de expresión durante la infección. Otras cuatro enzimas 
involucradas en este proceso pero que se sobre-expresaron fueron: La malato 
deshidrogenasa (spot 3, clave AALB008565-PA), que participa en el ciclo del 
ácido cítrico, catalizando la reacción de oxidación del malato a oxaloacetato; la 
enolasa (spot 6, clave AALB000829-PA), implicada en el metabolismo de los 
carbohidratos; la alanina aminotransferasa (spot 12, clave AALB006338-PA), 
que cataliza la transferencia de un grupo amino de L-alanina a α-cetoglutarato 
49 
 
y que está considerada como marcador de daño tisular en diversos 
organismos (Iganaki et al., 2012), y la mitofilina (spot 12, clave AALB002066-
PA), enzima que se ha asociado a disminuir el estrés oxidativo súbito (von der 
Malsburg et al., 2011) (tabla 1 y tabla 2). 
 
8.5 Proteínas que participan en la transducción de señales. 
En este grupo se identificaron dos proteínas de la familia de proteínas de 
choque térmico 70 con expresión reprimida (spots 2 y 15, clave AALB008255-
PA), mientras que una proteína beta 3 de unión a nucleótidos guanina (spot 
17, clave AALB004447-PA) se identificó de forma sobre-expresada en 
mosquitos infectados. Esta proteína se ha asociado a complejos proteicos que 
permiten el reconocimiento de señales entre un receptor y proteínas efectoras 
y pertenece a la familia de proteínas G (tabla 1). 
8.6 Proteínas con participación diversa. 
La proteína ribosomal 60S P0 ácida que se une a la subunidad ribosomal 25S 
(spot 18, clave AALB008188-PA) se identificó con expresión reprimida en 
mosquitos infectados. Mientras que dos proteínas se identificaron de manera 
sobre-expresada durante la infección: la arginina cinasa (spot 9, clave 
AALB004623-PA), que cataliza la transferencia de fosfato del ATP a arginina 
(Shi et al., 2012); y la peptidil-Prolyl cis-trans-isomerasa (spot 5, clave