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y ZOOTECNIA
DETERMINACION DE LA CONCENTRACION MINIMA
DETECTABLE POR MEDIO DE LA REACCION EN
CADENA DE LA POLlMERASA, PCR DE Salmonella
enteritidis EN ORGANOS y HECES DE AVES
INFECTADAS EXPERIMENTALMENTE
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
MEDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA
P R E S E N T A:
JORGE ALVA PEREZ
ASESORES:
MVZ. MC. NESTOR LEDESMA MARTINEZ
DRA. ODETTE URQUIZA BRAVO
MEXICO, D. F. 2005
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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Autorizo • la OIreccióll Geooi&1lie 8ibllotKls de ,.
UNAI.I • dltl:ndlr In formato tlecliÓn!r;o e imprtlO . ,
coAtanido do mi trabaje recepclonal.
NOMBRE : J~E &t.! fr: ítE ?.
FECHA:_._Q3.7~~~~ ~._
- I r;:).'~. ~ _ ~ - 5#~'G. -- --__.~~_
'la ciencia no sólo es compatible Con la espiritualidad
es una fuente profunda de espírílualtdad"
Carl &e,an.
"y as! fue enloncee que decid! ree,resar a la vida
cuando cada falsa luz me habla abandonado
fue enlences cuando encontré el reflejo de mi propia luz"
11
Haciendo un gran recuento desde queempecé estatesis hasta el día de hoy,
después de tantas cosas que han sucedido llegoa la conclusión queestatesis,
con todassusdesavenencias, con todos sus sufrimientos, sus éxitos y suscaídas,
noes mía.
Estatesis pertenece principalmente a laVida, esa fuerza y espíritu que nos rodea.
Estatesis pertenece a mispadres quienes han formado al serque hadescubierto
su propio camino.
Esta tesis pertenece a mi hermano delalma, ese gran serque Dios puso a mi lado
paradesvelarme durante seissemanas y conocer un poquito másde la maravilla
de la Verdad.
Estatesis pertenece a Nora, mi almagemela, quien a puesto todosu amoren que
yo seaquien soy hoy.
Estatesispertenece a los pollos, su vida representó para míel dondel
conocimiento.
Estatesis pertenece a Néstor, verdaderamente la guíaen estemi destino, cuya
asesoría atravesó másalládel vínculo estudiante maestro, llego hasta el camino
que incluyetoda mi vida.
Esta tesis pertenece a la Dra. Odette porser la intuitiva y verdadera de las luces
en estetrabajo.
Esta tesis pertenece a todos mis amigos: a Daniel porsu inquebrantable amistad a
prueba de todo, a Minelia porser mi amiga de corazón a prueba del tiempo, a
Ricardo, Rodrigo y Said, queestuvieron conmigo cuando nohabía nadie másen el
horizonte.
Estatesis pertenece a todos mis amigos del Departamento deAves, los queestán
y los queya siguen su propio camino: Aída, Gonzalo, Tere, Lupita, Julieta, Ma.
Elena, Nadia, Mónica, EIi, Rosl, Lidia, el Dr. Marco Juárez, el Dr. JoséAntonio
Quintana, el Dr. Tamas Fehervari, a la Dra. Gaby Verduzco y en especial porser
quienes (en caliente ni se siente) la Dra. Maria Teresa Casaubón.
Pertenece estatesis a losamigos que he reencontrado; en especial a Ulises, a
Ephraim, a Tania, a Karla, al Dr. Efraín Alva, al Ing. Reyes, a papá Ernesto y a
mamá Chela, ya Paulina (desde México hastaLondres con especial cariño) .
Finalmente y no menos importante estatesisno sólopertenece a las personas
que hantocado mi vida, sinotambién a todos aquellos a quienes yo he tocado su
vida, sobretodo a aquellos quede alguna manera llegue esteconocimiento a ellos.
III
Agradezco profundamente a la Facultad de Veterinaria de la UNAM, queme ha
dado las herramientas para concluireste trabajo, y que ha sido y serásiempre mi
alma matero
Agradezco profundamente al Dr. Rigoberto Hemández y al Dr. Rogelio Alonso
quienesme han apoyado con sus conocimientos para este trabajo.
Agradezco también al Ing. Reyespor ser el mejormaestro en la Licenciatura,
gracias, me ha enseñado a ser cada vez mejor.
IV
CONTENIDO
PÁGINA
RESUMEN............................................................ 1
ABSTRACT............................................................ 2
INTR.ODUCCIÓN.................................................... 3
mPÓTESIS.................................... 12
OBJETIVOS..... 12
MATERIAL Y MÉTODOS. .. .... . ..... . .. ... ... 13
RESULTADOS....................................................... 21
DISCUSIÓN...................... 29
CONCLUSIONES 42
BIBLIOGRAFÍA............ 44
ANEXO 1 52
ANEXO 2 , II 57
ANEXO 3 63
ANEX04 68
ANEXO 5 1 •• II •••••• ". ••••••••••••• •••• 72
v
RESUMEN
ALVA PÉREZ JORGE. Determinación de la concentración mínima detectable por
medio de la reacción en cadena de la polimerasa, PCR de Salmonella enterltidls
en órganos y heces de aves infectadas experimentalmente. (Bajo la asesorla del
MVZ. MC, NéstorLedesma Martínez y la Dra. OdetteUrqulza Bravo).
Debido a la importancia de la salmonelosis causada por Salmonella enteritidis
(SE) y al auge de la biología molecular como una herramienta en el diagnóstico,
los objetivos de este trabajo fueron: determinar la sensibilidad de la PCRen tejidos
y hecesprovenientes de aves infectadas con SE. y comparar la sensibilidad de la
PCR con los métodos bacteriológicos. Se utilizaron 93 pollos de un día de edad.
De estos se sacrificaron 5 pollos para determinar el estado de salud. realizándose
la necropsia y tomándose muestras pareadas de hlgado, bazo. tonsilas cecales
(TC), médula ósea (MO), sacovitelino (SV)y heces (HEC), para el aislamiento de
SE y para la realización de la PCR. Las aves restantes se dividieron en dosgrupos
(G1 y G2): el primero fue de 63 aves y el segundo fue de 25 aves. El G1 fue
inoculado por vía oral con SE fagotipo (PT) 13a a una concentración de 1 x 108
UFC/ave. el G2 fue inoculado con 0.25 mi se PBSestéril. Cadasemana se llevó a
cabo el sacrificio de 10 avesdel G1 durante 6 eemanas y 5 avesdel G2 a partirde
la 2° semana hasta la 6° semana. De estas aves se tomaron muestras pareadas
de TC, SV, HEC, MO, duodeno (DU), y la combinación de hígado-bazo (HB). Del
primer conjunto de muestras se realizó un estudio cuantitativo bacteriológico
(ECB, fase 1) para determinar la concentración real, en UFC/g de SE. Además, se
determinó la presencia de microorganismos diferentes a SE. Se realiz6 un estudio
estadístico de diferencia de proporciones que determinó la proporción real de
muestras positivas en cada semana postinoculaci6n (pi). En la fase 2 del estudio
se determinó la sensibilidad de la prueba de PCR, con base en los resultados del
ECB, en donde se emplearon el segundo conjunto de muestras. Se utilizaron 6
muestras de cada semana pi: 2 muestras de concentración alta, 2 muestras de
concentración baja y 2 muestras donde no se aisló SE. A estas muestras se les
realizó extracción de ADN y se les realizó la PCRy la PCR anidada. En la fase 3
del estudio se realizaron diluciones décuples seriadas a partir de 109 UFC hasta
10° UFC. De cada dilución se realizó unaextracción de ADN y se realizó la PCR y
PCRanidada, para determinar la concentración mínima detectable de esta prueba
de UFC y de ADN. En el G1 fue en HEC donde se encontró la mayor
concentración durante todo el experimento (media geométrica (MG) de 570.943
UFC/g) y la menor fue en DU (MG de 1.159 UFC/g). Existió evidencia
estadísticamente significativa (p<0.05) que la mayor proporción de muestras
positivas fue en SV y la menorproporción fue en HB y en DU. En el G2 no se aisló
SE. En la 2' fase del estudio los resultados de la PCRdel G1 las concentraciones
positivas fueron mayores a 105 UFC/g (a excepción de MO y DU). Aunque los
resultados en la mayoría de las muestras en la fase 2 del estudio no fueron
concluyentes, en la fase 3 los limites de detección obtenidos a partir de cultivopuro indicaron que la sensibilidad de estaprueba es suficiente paradetectar SEen
muestras biológicas. ya que la bacteria se multiplica de manera Intermitente en las
aves.
2
ABSTRAer
ALVA PÉREZ JORGE. Oetermination of the minimum detectable concentration by
the means of the polimerase chaln reaction, PCR of Salmonella anteritidis in
organs and feces of birds infected experimentally. (Under the consultantship of
MVZ. Me, Néstor Ledesma Martinez and Dra. Odette Brava Urquiza).
Due to the importance of the salmonelosis caused by Salmonella enteritidis (SE)
and to the bloom of the molecular biology as a tool in the diagnosis, the objectives
of this work were: to determine the sensibility of the PCR in tissues and feces
coming from birds infectad with SE, and to compare the sensibility of the PCR with
the bactertological methods. 93 chickens of a day of age were usad. From these
group, 5 chickens were sacrificed and necropsied to determine the state of health,
also taking from these paired samples of liver, spleen, cecal tonsils (TC), bone
marrow (MO), yolk sac (SV) and feces (HEC), for the isolation of SE and for the
realization of the PCR. The remaining birds were dlvided In two groups (G1 and
G2): the first one was of 63 birds and the second one was of 25 blrds. The G1 was
inoculated orally with SE phagetype (PT) 13a to 8 concentration of108 CFUlbird,
the G2 was inoculated with 0.25 mi of stenle PBS. Once in a week it was carried
out the sacrifice of 10 birds of the G1 during 6 weeks and 5 birds of the G2, starting
from the 2° week until the SO week. From these birds was gotten paired samples of
Te, SV, HEC, MO, duodenum (DU), and the Iiver-spleen combinatlon (HB). From
the first group of samples it was carried out a bacteriological quantitative study
(ECB, phase 1) to determine the real concentration, in CFU/g of SE. A1so, the
presence of microorganisms different to SE was determined. It was made a
statistical study of proportions differences that it determined the real proportion of
positive samples in every week postinoculation (pi). In the phase 2 of the study the
sensibility of the test of PCR was determined, with the results of the ECB, where it
used the second group of samples. 6 samples of every week pi were used: 2
samples of the highest concentration, 2 samples of the lowest concentration and 2
samples where SE was not ¡solated. From these samples the purification of DNA,
the PCR and the nested PCR was made. On phase 3 of the study it was made ten
fold dilutions , starting from 109 CFU to 10° CFU. Of each dilution it was made DNA
purification, the PCR and nested PCR, to determine the minimum detectable
concentration of this test on CFU and on DNA. In the G1 was found the highest
concentration of HEC during the whole experiment (the geometric mean (MG) was
570.943 CFU/g) and the minor was in DU (MG of 1.159 UFC/g). Statistlcally
significant evidence (p <0.05) shows that the biggest proportion of positive
samples was in SV and the smallest proportion was in HB and in DU. In the G2 SE
was not lsclated. In the 2nd phase of the study the G1 positive results of the PCR
shows concentrations were bigger than 105 CFU/g (MO and DU was excluded).
Although results in most of the samples in the phase 2 of the study were not
conclusive, in the phase 3 the detection Iimits obtained from pure culture of SE
indicated that the sensibility of this test is enough to detect SE in biological
samples.
3
INTRODUCCiÓN
La salmonelosis es una enfermedad de tipo gastroentérica que afecta a la
mayorla de los animales domésticos (1, 2, 3, 4). El género Ss/mone//s fue descrito
por primera vez en 1885 por Daniel Salman (5). Este género se divide en dos
especies, la especie enterica y la especie bongori (3, 5, 6, 10). Los principales
serotipos patógenos se encuentran en la subespecie enterics, como lo son
Ss/monells dub/in, Ss/monella gallinarum, y Ss/mone//a enteritidis. La forma
correcta de expresar a estas bacterias es Sa/mone//a enterica subespecieanterica
serotipo enterlt/dls, sin embargo es aceptado por la OMS (Organización Mundial
de la Salud), la terminologfa simple de Sa/mone//a enteritidis (S, 7). De esta
subespecie enterica existen bactarias que son especIficas para un determinado
huésped y otras que son inespecfficas, esto significa, que la bacteria puede
Infectar a un indeterminado número de organismos (2, S). Tal es el caso de
Salmonella anteritidis, que es inespecifica en cuanto al huésped se refiere (1).
Salmonella enterltidis en la contaminación de los alimentos y la
infección en losseres humanos
Esta bacteria conjuntamente con Salmone//a typhimurium han cobrado
importancia en los últimos 20 añoe, ya que se han relacionado con gastroenteritis
y septicemia por el consumo de alimentos contaminados en seres humanos en
todo el mundo (8, 9, 12, 13, 14, 1S). La contaminaci6n de los alimentos con
especies de Sa/mone//a es multifactorial, pero principalmente es debido a la falta
de medidas de higiene y de inocuidad alimentaria (12, 14). Las infecciones con
Ss/monella enteritidis (SE) en los seres humanos se han identificado
principalmente por el consumo de productos avfcolas, y el principal núcleo de
población afectada es aquella que esta inmunocomprometida (16, 17). El consumo
de huevos contaminados con SE, asf como la came de pollo han sido los
principales responsables de los brotes de salmonelosis en paIses del continente
4
europeo, americano , asiático y africano principalmente (19, 20, 21). Los
mecanismos por los cuales se presenta la contaminación de huevos para
consumo se presenta principalmente por parvadas que son infectadas, aunque
60n varias las vías de contaminación de los huevos (4). Se ha mencionado que la
contaminación se da desde el exterior del cascarón, hasta el interior del huevo
(22), algunos otros investigadores han selialado que SE se transmite desde la
yema del huevo, debido a una infección ovárica (23). Por otro lado Kinde et al.,
1996 (24), así como el manual de inspección de los alimentos de la USDA
(Departamento de agricultura de los Estados Unidos) en su impresión de 1998
(25) han informado que la incidencia de huevos contaminados en gallinas
infectadas naturalmente es de 0.03%, sugiriendo que la infección con SE por el
consumo de huevos directamente contaminados debe ser escasa. En esta
situación diversos investigadores han dado importancia a la contaminación del
cascarón del huevo, que al romperse para la preparación de los alimentos, da por
consecuencia la contaminación del interior del huevo (18, 26).
La came de pollo contaminada no ha tenido el mismo impacto en la sociedad
que los huevos contaminados con SE. Aunque se ha descrito que la carne
contaminada de pollo puede presentarse por la infección con SE en aves, se han
identificado que las principales rutas de contaminación es en el manejo del ave al
momento del sacrificio y procesamiento para venta, debido a la contaminación del
interior del tracto gastrointestinal, así como las heces con la came (14, 27). Los
principales slntomas observados en los seres humanos producidos por la infección
con SE son fiebre, dolores agudos abdominales, dolor de cabeza y dolor en
articulaciones (18). Estos síntomas se refieren a gastroenteritis principalmente,
aunque este cuadro puede progresar a un estado septicémico. Las pérdidas
económicas por estas infecciones se han estimado hasta en 4 billones de d61ares
anuales en los Estados Unidos de Norteamérica. (9). En la actualidad la epidemia
ha sido controlada, principalmente en la Unión Europea (12). Las pérdidas
económicas incluyen a la industria avícola, al procesamiento de los alimentos, asl
como el costo de la enfermedad (5, 28, 29).
s
Salmonelosis en aves
El origen de la infección con SE en las aves se remonta a la erradicación de las
especies gallinarum y pullorum de la avicultura en paises desarrollados. Esto
produjo un nicho de infección vacío que fue ocupado por SE. El origen de
Sa/mone//a spp parece ser murino,esto quiere decir que este patógeno era
aislado de los ratones con relativa frecuencia (12, 30). En aves la infección
paratifoidea produce reacciones diversas según la edad de infección. En aves
menores de una semana de edad produce alta mortalidad, debido principalmente
a las complicaciones derivadas por gastroenteritis y bacteremia. La enfermedad
ocurre en tres fases: la primera fase es de colonización gastrointestinal, la
segunda de multiplicación en el sistema fagocltico mononuclear y la última fase es
de bacteremia e infección en varios tejidos. Los principales signos son: depresión
y diarrea. Se pueden llegar a observar lesiones como pericarditis, esplenomegalia,
hepatomegalia, lesiones en el tracto gastrointestinal como distensión por gas, asl
como dilatación de tonsilas cecales (4, 22). Conforme va creciendo el ave, los
signos observados y la mortalidad disminuyen, aunque las lesiones pueden
permanecer (sobretodo en el tracto gastrontestinal), por lo cual las lesiones
pueden ser un buen indicador de la infección. En aves adultas puede observarse
ocasionalmente diarrea ligera y deshidratación, en general no se observan signos.
En gallinas en producción puede disminuir la postura, aunque los huevos pueden
estar infectados (4, 29, 31). La falta de signos en aves adultas cobra importancia,
ya que se ha demostrado que las aves quedan en estado de portador y no se
elimina por completo la bacteria (22, 23, 36). Tanto la infección horizontal como
vertical se han descrito como la fuente de infección de aves portadoras a aves
sanas. Las principales vías de infección horizontal son por la mucosa oral y
cloacal, (aunque cualquier mucosa es susceptible de infección) que sigue en una
infección predominante gastrointestinal, aunque se ha demostrado que también
puede presentarse la infección en el oviducto y ser esta infección ascendente
hasta el ovario; una de las vlas por las cuales se produce la contaminación de
6
huevos(4, 22). La vla vertical de infección se presenta de la gallina a su progenie,
debido a la puesta de huevos Infectados. Los pollitos resultantes tienen una alta
probabilidad de moriral poco tiempo (22, 23). Otravla de infecci6n de los huevos
es debido a las heces que se depositan en el cascarón (32). Aunque existe
susceptibilidad de las avesa la infecci6n con SE, se ha demostrado que las aves
que se recuperan a la infecci6n paratifoidea conSE pueden heredar a su progenie
esta resistencia natural a la infección (4, 34). Debido a la infección tanto vertical
como horizontal en las aves esta se convierte en recurrente a causa de las
rein~ cciones en una población determinada (29, 36). Por lo anterior, las medidas
de bioseguridad y de desinfección han sido importantes para el control de las
infecciones paratifoideas en aves. Se ha adoptado en México una norma para la
erradlcaci6n de la salmonelosis aviar, lo cual describe los métodos necesarios
para la desinfecci6n, y en su caso, la esterilizaci6n de materiales y superficies
(3S). Aunque esta norma se circunscribe solamente a Salmonella gallinarum y
Salmone/la pu//orum, se puede aplicar la misma metodologla de desinfecci6n y
bioseguridad para SE. Se ha descrito que SE tiende a formar capas superficiales
en diversos materiales, y que la desinfección con materiales qulmicos no ha
resultado ser del todo efectiva (11 , 33).
Taxonomia y características particulares de Salmonella
enterltidis
Salmonella enterit/dis pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Es una
bacteria gramm negativa, no esporula, presenta motilidad y produce toxinas.
Puede crecer en medios de aerobiosis o anaerobiosis, se ha descrito que su
virulencia es mayormente expresada si crece en medios de anaerobiosis (4). La
temperatura 6ptima de crecimiento es de 37° e, pero puede crecer desde los So
hasta los 42°. El pH 6ptimo para el crecimiento es de 7.0, sin embargo puede
crecer en un rango de 4.0 a 9.0. Se ha reportado que en medios ácidos el
crecimiento de SE es minimizado de manera significativa, lo cualse ha utilizado en
la preparaci6n de alimentos para las aves, agregando ácido propi6nico ya que
7
disminuye la contaminaci6n del alimento con esta bacteria (4, 5). SE es sensible al
calor y la radiación, por lo que la cocción de la came de pollo es suficiente para
eliminarla (4, 37). Se ha sugerido, que la cocción inadecuada del huevo no
asegura la eliminación total de SE, sobretodo en la yema que permanece liquida
(16, 3). SE es sensible a la mayorla de los desinfectantes qulmicos, aunque no la
eliminan por completo (4).
Se han utilizado diversas metodologlas para la clasificación de Sa/monella spp,
estas metodologlas son de utilidad para conocer los aspectos de virulencia y
patogenicidad. Una de ellas utiliza la tagotipificación que ha servido en la
actualidad para fines epidemiológicos. Los principales fagotipos involucrados en la
salmonelosis humana han sido el fagotipo (PT) 4 Y el PT 8 en México y en la
mayorta del continente americano, aunque han cobrado importancia otros como el
PT 13·, principalmente en estados Unidos de Norteamérica (8, 38). Otra
metodologla refiere a la estructura de la bacteria, como son los antlganos
somáticos, capsulares y flagelares (representados con la letra O, Vi Y H
respectivamente). esta clasificación es de utilidad serológica ya que determina el
tipo de antigenos que contiene (10, 4). La fórmula de se es O: 1,9,12; H: g,m,
según esta clasificación antigénica (38).
Virulencia y patogenicldad
Los factores de virulencia de se están relacionados con la capacidad de
producir toxinas (4). se produce una endotoxina asociada con la porción A de la
parte Iipldica de la pared celular (lipopolisacárido), esta endotoxina ha demostrado
producir fiebre cuando es liberada a la circulación sangulnea (4, 18). Se ha
reportado también la presencia de una enterotoxina responsable de la
acumulación de Ifquido en el intestino delgado (4). se tiene la capacidad de
colonizar el epitelio gastrointestinal (TGI). Esta bacteria presenta además
plásmidos que están relacionados con la infección en nódulos linfáticos, hlgado,
tonsilas cecales y bazo (4, 39). Gracias a que se presenta antlgenos fimbrlales,
asl como flagelares, le permite adherirse al epitelio intestinal y por tanto infectar a
8
los enterocitos (4, 40). Esta condición de invasión celular, ha permitido a SE evadir
la respuesta Inmune (22, 42), aunque por otro lado en aves que son resistentesa
la infección se han descrito los mecanismos por los cuales la respuesta inmune
logra controlar eficazmente la infección (4, 41). Debido a la particularidad de los
antlgenos, asl como de los genes de SE, se han podido desarrollar vacunas cuya
efectividad esta siendo probada, con resultados parciales (43, 44). En México
debido a la NOM-005-Z00-1993, esta prohibido vacunar a las aves de engorda
con la cepa RS, utilizada para el control de la tifoidea aviar en parvadas de aves
reproductoras, por lo que al detectar una parvada infectada, se opta por la
despoblación de dicha granja. Esto se realiza ya que se está en la etapa de
erradicación (35). Es por ello importante contar con un buen sistema de
diagnóstico confiable y eficaz, para determinar que aves se encuentran infectadas
y no presentan signos.
El diagnóstico
Los métodos de aislamiento e identificación de Salmonella han sido los más
utilizados en todo el mundo para el diagnóstico de salmonelosis (2, 4, 19). Debido
al comportamiento intermitente de la infección, es importante entonces contar con
métodos confiables de diagnóstico. Aunque en México, los métodos
bacteriológicos son los más utilizados, con frecuencia no se identifica el fagotipo al
que pertenecen los distintos serotípos encontrados, posiblemente a causa de la
falta de personal capacitado para ello, además del costo (38). En general, las
muestras para el aislamiento de SE provienen principalmente de tejidos, heces,
agua, alimento y en algunas ocasiones muestras de polvo de las granjas
(principalmenteen Estados Unidos de Norteamérica). En México. tomando como
referencia la NOM-oOS-ZOO-1993 la muestra es sembrada en un medio de
preenriquecimlento primario que favorece el crecimiento principalmente de
Salmonella spp (se ha utilizado caldo tetrationato o caldo selenita). Después de
una incubación, la muestra sospechosa se siembra en medios sólidos
diferenciales (agar verde brillante o agar McConkey), después de una segunda
9
incubación las colonias sospechosas lactosa (-) son sembradas en medios para
bioqulmica con el objetivo de identificar el género de la bacteria, posteriormentese
lleva a cabo la serotipificación. En el caso de no observar colonias sospechosas a
Sa/mone//a spp; se repite la siembra a partir de medio de preenriquecimiento, con
el objetivo de descartar falsos negativos (7, 8, 35, 37). 8 aislamiento ha sido
eficaz para el diagnóstico de salmonelosis, sin embargo el tiempo en el que se
obtiene el diagnóstico ha limitado la toma de decisiones en los productores, de tal
forma que se han buscado nuevas opciones en el diagnóstico, que sean
confiables y rápidas. El tiempo que tarda el diagn6stico de salmonelosis por
medios bacteriol6gicos se ha determinado en un rango de 4 hasta 15 dlas (45, 46,
47). Los métodos serológicos como la aglutinación en placa, asl como la prueba
de ELlSA (prueba de inmunoensayo ligado a enzimas) han sido las opciones con
mayor auge para determinar si una parvada esta infectada con Salmonella, ya que
son pruebas que detectan la presencia de anticuerpos de manera rápida, aunque
su confiabilidad no ha sido del todo completa (48, 49).
Los métodos de biologia molecular de diagnóstico
Como se ha mencionado, el diagnóstico definitivo de salmonelosis se logra a
través del aislamiento e identificación del agente (35). Estos métodos
bacteriológicos consumen mucho tiempo para dar una respuesta, y los métodos
serol6gicos e inmunol6gicos son rápidos, sin embargo han demostrado que tienen
algunas deficiencias, ya que aunque rutinarios, en algunas ocasiones los
resultados no son del todo confiables a causa de las reacciones cruzadas entre
antlgenos y anticuerpos, que hacen que existan falsos positivos o falsos
negativos. Es por ello que la creaci6n de metodologlas diagn6sticas más eficientes
y rápidas se ha hecho necesaria. Tal es el caso de la PCR (reacci6n en cadena de
la polimerasa, por sus siglas en inglés) método que utiliza la identificación de una
parte del genoma (AON) de cualquier organismo para su identificación, partiendo
de la premisa de que cada genoma cuenta con particularidades especificas que
hacen único al organismo en cuestión (esto se refiere a los genes). La eficacia de
10
esta metodologla en el diagnóstico ya se ha comprobado, al identificar desde
virus, parásitos hasta bacterias. (51, 52, 53, 54). En el caso especifico de
bacterias, la prueba de PCR ha identificado exitosamente especies del género
Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma, Srucella, entre muchas otras (54). Los
métodos de biologla molecular para el diagnóstico han avanzado hasta el grado
de contar con pruebas para diferenciar entre cepas de un mismo agente patógeno,
utilizando enzimas de restricción que identifican las variaciones de tamal'lo de un
mismo gen analizado, (RFLP'S, polimorfismo de la longitud de los fragmentos de
restricción, por sus siglas en inglés) lo cual es de utilidad epidemiológica (55).
Existen entonces diversas modalidades para la realización de la PCR, todas con
el mismo objetivo de identificar el agente patógeno, a través de una parte de su
material genético, haciendo esta prueba más sensible y especifica. Aunque
existen diversas metodologlas para la realización de la PCR en especies del
género Salmonella, todas se basan en la identificación de genes especlficos (45,
56). Al respecto existe un grupo de genes que son especlficos para la invasión a
las células epiteliales, denominados como invA, S, e y D. Estos son los que se
han utilizado para la identificación de estos agentes por la PCR (52, 53, 57).
Debido entonces a las caracterlsticas de la prueba, la PCR resulta ser confiable
para la detección del agente patógeno, aunque la sensibilidad de la prueba
siempre ha sido tema de discusión (52). Se han creado diversas formas para
aumentar la sensibilidad de la prueba, una de ellas es la creación de la PCR
anidada. Para la realización de esta PCR, se utiliza como material genético una
PCR hecha con anterioridad. Por lo cual el objetivo es la amplificación del material
genético de la PCR (un fragmento del mismo gen amplificado por PCR, pero más
pequeño). Esto aumenta la sensibl/ldad al amplificar material genético que se
encuentra de manera escasa (52, 54). Otro método que aumenta la sensibilidad
de la prueba de PCR es el enriquecimiento previo de las muestras, con el objetivo
de favorecer el crecimiento de Salmonella spp (45). Aunque esto es de utilidad, no
se conoce con certeza la concentración inicial bacteriana en la muestra. Se ha
mencionado teóricamente que los métodos bacteriológicos pueden detectar desde
1 UFC (unidad formadora de colonia), sin embargo se ha demostrado que
- --- - - -
11
concentraciones bajas de Sa/monella spp no son aisladas de muestras biológicas,
dando lugar a falsos negativos (50). Esto cobra importancia en los agentes
bacterianos, ya que el comportamiento de la infección es elelico e intermitente por
lo que la concentración de la bacteria es impredecible (4, 54, 58). Actualmente,
aunque se ha avanzado en el estudio de Salmonella spp por métodos
moleculares, todas las metodologlas que se utilizan para el diagnostico de
salmonelosis por la PCR dan diversos limites de detección (ya sea por
nanagramos de ADN o UFC), lo cual produce que tengan diferente sensibilidad, y
por tanto que la confiabilidad de los resultados sea cuestionable. De hecho, para
el análisis de tejidos y heces, existen diferencias significativas para el limite de
detección en una sola prueba de PCR, lo mismo sucede si se analiza alimento o
agua. (45, 54, 58, 59). Varios Investigadores han mencionado la importancia que
tiene la extracción de ADN a partir de estas muestras biológicas, ya que además
de que la capacitación del personal es importante, es necesario tomar en cuenta
que con la presencia de factores inhibitorlos es importante tener una metodologla
especIfica de extracción del material genético en diferentes tipos de muestra (52,
54). Debido a estas condiciones, y por el hecho de que la prueba de PCR cada
vez más se ha convertido en una herramienta eficaz en el diagnóstico de
Sslmone/ls, se hace necesario determinar el limite de detección para las
diferentes muestras, ya que es importante determinar la sensibilidad (y con esto la
confiabilidad de los resultados) para detectar SE en las muestras de aves.
12
HIPÓTESIS
La prueba de PCR es más sensible y rápida para la detección de Salmonella
enteritldls PT 13· en muestras de tejidosy heces de pollos infectados desdelos 2
dfas de edad, queel método del aislamiento e identificación bacteriológica.
OBJETIVOS
1. Determinar el limite de detección de la prueba de PCR (en UFCpor gramo
de muestra) en tejidos y en heces de aves infectadas experimentalmente
con SE PT 131 •
2. Determinar el limite de detección de la prueba de PCR(en UFCy de ADN)
en diluciones décuples seriadas de cultivo purode SE PT13a.
3. Precisarlas diferencias entre la sensibilidad del aislamiento bacteriológico y
la sensibilidad de la prueba de peR.
4. Conocer el comportamiento de la infección de SE PT13a por vla oral en
pollos de engorda. asl como la concentración de esta bacteria en tejidos y
hecesduranteel ciclode engorda.
13
MATERIAL Y MÉTODOS
El experimento se realiz6 en tres fases. En la primera fase se llevo a cabo un
estudio de cinética bacteriana (estudio cuantitativo bacteriológico, ECB) para
determinar la concentraci6n recuperada en UFC por gramo de tejidos y heces de
pollos de engorda, durante el ciclo promedio de engorda. Paraello se inocularon
por vla oral a pallas de engorda a los 2 dlas de edad con un in6culo de 1 x108
UFC de SE PT 138 (dosis infectante (DI) 50%) por pollo (22). Con base a estos
resultados en la segunda fase del experimento se realiz6 la prueba de PCR y PCR
anidada a los tejidos y heces representativos del ECB, para asl determinar la
sen$ibilidad de la prueba de PCR en estas muestras. En la tercera fase del
experimento se realiz6 una prueba de sensibilidad a la prueba de PCR a partir de
diluciones de cultivo puro de SE PT 138 .
Inóculo
Se utilizo como in6culo SE PT 13a proveniente del National Veterinary Services
en Ames lowa (E.U.), mantenida en TSBs (caldo triptona soya, por sus siglas en
inglés). Esta cepa tiene resistencia gen6mica al ácido nalidíxico (AN) y a la
novobioclna (NVB). El In6culo para el desafio de las aves se ajusto con la ayuda
de un espectrofot6metro a 1 unidad de absorbancia (450 nan6metros) que
equivale a 1 x 109 UFC (SO). Para comprobar el in6culo fuera exacto se realizaron
diluciones décuples seriadas del in6culo hasta 10.9, sembrándose las últimas 4
diluciones en AVBb (anexo 1). El in6culo fue suspendido en PBSe (soluci6n
amortiguada de fosfatos, por sus siglas en inglés) estéril.
• BactoTRYPTIC SOYBROTH SOO g No. de catálogo 03070-17-3. DlFCO laboratorles DetroitMICP.
48232
b Acumediamanufacturers BaltímoreMaryland CP. 2121 1
e PBS: Phosphate-buffered saline(lx) 500miNo. de catálogo 14040-141 •LífeTechnologies USACP6482
- ~ - ~~------
14
FASE 1
ESTUDIO CUANTITATIVO BACTERIOLÓGICO (ECB)
Animales de Experimentación
Se emplearon 93 pollos de la estirpe Rossd de un dia de edad. Al arribo de las
avesfueron pesadas paradeterminar el estado de salud, además se sacrificaron a
5 aves según la NOM 033 ZOO 1995 (61) Yse les realizó la necropsia (muestreo
preinoculación). Se efectuó entonces el aislamiento de Sa/mone//a spp. según la
NOM-OOS- ZOO-1993 (35), a partir de hlgado, bazo, saco vitelina, médula ósea,
tonsilas cecales y heces, para determinar la ausencia de Sa/monel/a spp en las
aves. La mitad de estas muestras se almacenó en congelación a -200 C para la
posterior realización de la PCR. Las 88 aves restantes se mantuvieron durante 6
semanas (ciclo promedio de engorda) en las unidades de aislamiento del
Departamento de Producción Animal: Aves, de la Facultad de Medicina Veterinaria
y Zootecnia de la UNAM. Durante todoel experimento las aves fueron alimentadas
diariamente con alimento comercial yagua a libreacceso.
Diseño experimental
Las ee aves se dividieron en dos grupos. El primergrupo (G1) cont6 con 63
aves y el segundo grupo (G2) fue de 25 aves. Al primer grupo se le administro un
in6culo por vla oral de 250 ",,1 conteniendo 1 x 108 UFC de SE PT 131 por ave, a
los 2 dlas de edad. El segundo grupo conformo el grupo testigo y fue inoculado
con 0.25 mi de PBS estéril. A partir de la primera semana postinoculación (pi) y
hasta la sexta semana pi, cada 7 dlas se sacrificaron según la NOM-033-Z00-
1995(61)Yse les realiz61a necropsia a 10 avesdel G1 ya 5 avesdel G2 (a partir
de la segunda semana pi), tomándose asépticamente: hlgado, bazo, tonsilas
cecales, saco vitelina (en la primera semana pi.), duodeno (a partirde la segunda
semana pi) y heces en bolsas de plástico estériles. Estas mue~tras se tomaron de
d Aviagen Incorporated 5015 Bradford Drive, Huntsville, Alabaroa 35805, USA. Proporcionadas por Grupo
Agropecuario YesakiSA de ev.
15
manera pareada, una para la determinaci6n de la concentraci6n bacteriana y la
segunda se congeló a -200 C para la realización de la PCR. Las muestras de
hígado y bazo conformaron una sola muestra (muestra combinada) de cada ave
sacrificada.
Durante las primeras tres semanas pi, cada 7 días se pesaron a las aves para
determinarsu crecimiento y desarrollo, además se registró diariamente durantelas
seis semanas del experimento la presencia de cualquier signo de enfermedad en
los dos gruposde aves.
Prueba deAglutinación en Placa contra Sslmonells spp
Para la 50 semanapi se tomaron muestras de sueroa partir de la vena radialde
las aves del G1 y G2. A estasmuestras se les realiz6 la prueba de aglutinaci6n en
placa. Esta prueba conslsti6 en diluir una gota de suero sangulneo de cada ave
con una gota del antígeno comercial". Se interpretaron como resultados positivos
(muestras de suero sanguíneo que contenlan anticuerpos específicos contra
Sa/monella spp.) aquellas muestras que aglutinaron con el antlgeno comercial en
un rango máximo de 90 a 100 segundos. Se interpretaron como resultados
negativos (muestras de suero sangulneo que no contenlan anticuerpos
especlficos contra Sa/monella spp.) aquellas muestras que aglutinaron con el
antlgeno comercial después de los 100segundos o que no aglutinaron.
• AntfgenoK polivalentecoloreado. 50 mi 1000pruebas.LoteNo. 96069Vineland Lab. New JerseyCP.
08360.
16
Procesamiento de las muestras para el estudio cuantitativo
bacteriológico (ECB)
A partir de 1 gramo de muestra en 9 mi de PSS estéril se realizaron diluciones
décuples seriadas hasta la dilución 1O-s. De cadadilución se sembraron 3 gotas de
20 ~I cada una en medio diferencial agar verde brillante (AVB) conteniendo 20
~g/ml de AN' y 25 ~/ml de NVBg para descartar el crecimiento de otras bacterias
diferentes a SE PT 131 • Estas placas con AVS fueron incubadas a 370 C durante
18 horas. Posteriormente se contaron las colonias lactosa (-) para determinar la
concentración bacteriana en cada muestra (52). Paradeterminar la concentración
bacteriana de SEen UFC por gramo'de muestra se utilizóla siguiente fórmula:
CB= [«(NC /3) x 1000) /20] x DILx 10
Donde: CS:concentración bacteriana
NC: número de colonias encontradas
DIL:número de la dilución en donde se contaron las colonias
Además se sembraron 20 ,.11 de la dilución 10-8 en agar triptona soya (TSA por
sus siglas en lnglésh) para identificar otras bacterias presentes. Estas placas se
incubaron a 370 C durante 18 horas y se realizó posteriormente la identificación
bacteriana por medio de pruebas bioqulmlcas.
Estudio estadistico
Para valorar la proporción real de muestras positivas y negativas de cada tejido
y hecesse realizó un estudio estadistico de diferencia de proporciones.
fNalidixicacld,SigmaChemical StoLouis M014S08
I Novobiocin. SigmaChemical Sto Louis MO14508.
~ Difco™ Beeton, Dickinson and Company38800 LePointde Claíx,Francia
17
FASE 2
Procesamiento de las muestras parabiologia molecular
Se realiz6 un estudio de sensibilidad a la prueba de PCR representativo de las
muestras provenientes de la fase 1 del experimento. De esta manera se tomaron
de cada semana pi del G1 6 muestras de diferentes tejidos y heces de la siguiente
manera: 2 muestras de la mayor concentración recuperada de se de cada
semana pi, 2 muestras de la menor concentración recuperada de se de cada
semana pi y (si se encontraron) 2 muestras de las que no se aisló SE de cada
semana pi (muestras negativas al aislamiento). Se tomaron además del G2 una
muestra de cada semana pi. Se tomaron muestras de tejido y heces de las aves
del muestreo preinoculación. De estas muestras se llevo a cabo la extracción de
ADN (63) a partir de 1 gramo de cada muestra para confirmar la concentraci6n
real obtenida en la primera fase del experimento. Las muestras que no tenlan el
pesosuficiente de 1 gramo se mezclaron con otras muestras del mismo tejidoo de
heces con concentración similar de la misma semana pi (muestreo), conformando
ast una sola muestra para la realización de la PCR. A las muestras positivas por
bacteriologla, pero que resultaron ser negativas a la PCR se les efectuó la prueba
de PCRanidada quedando asl el resultado definitivo. Para finesde esteestudio se
determinó que las muestras negativas al aislamiento tuvieran unvalorde OUFC.
Purificación de ADN para las muestras biológicas y realización
de la PCRy PCRanidada
Un gramode cada muestra fue macerado en 1 mide PBS estéril, posteriormente
estos macerados se suspendieron con 4~1 delisozimal (20 mg/ml) para un
volumen final de 1004 ~I, incubándose a 4° e durante 45 minutos. Después de
esta incubación se adicionaron 12.5~1 de proteinasa t<i (20 mg/ml) y 250 ~I de
~ Lysozyme 20,000U/mg, 5g Researeh Organics, Cleveland Ohio. 44125
J Proteinase K lOOmg. LifeTechnologies USA6482
18
soluci6n STEP (10% de SDSk, TRIS\ 1M, pH 8, EDTAm 0.5M, pH 8) incubándose
durante 2 horas a 37° C. Al volumen resultante de 1266.5 ,.11 se le realiz6 una
extracci6n con fenol~oroformo isoamllico 25:24:1° y cloroformo isoamflicoo,
agregando un volumen de fenol-cloroformo isoamllico 25:24:1 (1266.5 J.L1) Yun
volumen (según el volumen recuperado de la última extraccl6n Con fenol
cloroformo isoamllico 25:24:1) de cloroformo isoamllico. Después se agrego dos
volúmenes totales de etanol absolutoP (según el volumen recuperado de la última
extracci6n con cloroformo isoamllico) para precipitar el ADN, conservándose a
-20° C durante 30 minutos. Posteriormente se lavó el ADN con etanol al 75%.
Finalmente el ADNfue incubado en aguadobledestilada en 55°C a 6CO C durante
10 mino Cada muestra se conservo a -2CO C hasta la posterior realizaci6n de la
PCR.
Para la realización de la PCR se tomaron 3 ,.11 de ADN de cada una de las
muestras sometidas a extracci6n de ADN y se agregaron a una mezcla de 20 !JI
conteniendo: 2 !JI de soluci6n amortiguadora para la PCRq, 0.2 mM de dNTP'Sr
(nucle6tidos), 1!JM de iniciadores, 1.5 mM de MgCI, O.~ J.LI de Taq pollmerasa (2.5
unidades)'y 9.3 J.LI de aguadobledestilada. En la PCRse utilizaron los iniciadores
INV1F: 5'-CGT CAT TCC ATT ACC TAC CT-3' e INV1R: 5'-eAA TAG CGT CAC
CTT TGA TA-3' (52). El protocolo de la PCRfue: un ciclo de 95Q C durante 5 min;
30 ciclos de 93° C durante45 segundos, 59° C 45 segundos, 72° C 45 segundos
(s), seguida de unaextensi6n final durante 4 minutos (min)a 72°C.
Para la realizaci6n de la PCRanidada, se tomaron 3 !JI de la PCRanterior, como
base para la PCR anidada y se suspendieron con ~ !JI de soluci6n amortiguadora
para la PCR, 0.2 mM de dNTP'S (nucleótidos), O.~ !JM de iniciadores, 1.5 mM de
k 10%SOSSodium Ouodecyl Sulfate Soludon lOOmI.LifeTechnologies NY35
I Tris,UltraPure. Research Organice, Cleveland Ohio44125
m EOTA(Ethylenediaminetetracetie acid), disodium sallo 500g.. SigmaChemieal St.Louis MO 14508
n PhenollChloroformlIsoamyl Alcohol 25:24:1 4OOml. Research Organics, Cleveland Ohio44125
o Cloroformo isoamUico:mezclade 96 mide cloroformo (Chloroform, minimum 99%500ml. Chemical Sto
LouisMO. 14508.) y 4 mi de alcohol isoamflico (Alcohol iso-arnflico 11. No. IT. BakcrXalostoe México.)
p Alcohol etílicoabsoluto anhidro 18L. IT BakcrMallinckrodt Baker,Edo.Mex. México55320
q 10XPCRMasterMix for 10reaetíons. 1.5ml,MBIFermentas GMBH Opelstrasse 0-68789.Germany
r 2mMdNTPMixO.lmlMBIFermentas GMBH Opelstrasse 0-68789. Germany.
• TaqONAPolymerase (recombinant). MBIFermentas GMBH Opelstrasse 0-68789. Germany
19
MgCl, 0.10% de tritónl , 0.15 mglml de BSA (albómina sérica bovina por sus siglas
en inglésU) , O.p~1 de Taq polimerasa (2.5 unidades) y 7.3 ~ de agua doble
destilada. En este PCR se utilizaron los iniciadores INV2F: 5'-TGG TGT TTA TGG
GGT CGT TCT A 3' e INV2R: 5'-CCT TCA M T CGG CAT CM TAC TC -3' (52).
El protocolo para la PCR anidada fue: un ciclo de 950 C durante 5 min; 30 ciclos
de 920 C durante 45s, 650 C 45s, 720 C 45s, seguida de una extensión final de 4
mln a 720 C. Después de la realización de la PCR los resultados fueron
visualizados en luz ultravioleta, posterior a la realización de electroforesis, en
geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidío.
FASE 3
Sensibilidad de la prueba de PCR encultivo puro
Esta fase del experimento tuvo corno objetivo determinar la sensibilidad de la
prueba de PCR en un cultivo puro de SE PT 131 , realizándose diluciones décuples
seriadas en PBS estéril del cultivo puro de SE PT13, a partir de 109 UFC hasta 10°
UFC/ml. Para ello se ajusto la concentración bacteriana con la ayuda de un
espectrofotómetro a 1 unidad de absorbancia (450 nanómetros) que equivale a 1 x
109 UFC/ml (60, anexo 1). De cada dilución se efectu6 la prueba de PCR y la
prueba de PCR anidada para determinar la sensibilidad de la prueba de PCR,
previo a la realizaci6n de extracci6n de ADN. El protocolo de extraccl6n de ADN
(63) para estas diluciones fue el siguiente: cada dilución se centrifugo a 3,500 rpm
(revoluciones por minuto), posteriormente se resuspendi6 la pastilla de células en
500 ~I de TRIS EDTA 50mMv, adicionándose además 2 ~I de Iisozima. El volumen
resultante de 502 ~I fue incubado a 40 C en 45 minoTerminada esta incubaci6n se
adicionaron 12.5 ~I de proteinasa K (20 mg /ml) y 250 ~I de soluci6n STEP (10%
de SOS, 1 M de TRIS pH 8, 0.5 M de EOTA pH 8) incubándose durante 2 horas a
370 C. Al volumen resultante de 764.5 J..l1 se le realizó una extracci6n con fenol-
t Triton X-lOO IL Research Organics, Cleveland Ohio44125
• BSA, BovincSerumAlbumin IOg. Research Organice, Cleveland Ohlo. 44125.
• Mezclade TRIS base (Tris, UltraPureo Research Organics, Cleveland Ohio44125) y EDTA 50mM(EDTA
(Ethylenediamlnetetracelic acld), disodium salto 500g..SigmaChemical Sto LouisMO 14508)
- - - - - - - -
20
cloroformo isoamllico 25:24:1 y cloroformo isoamllico, agregando un volumen de
fenol~loroformo lsoamlllco 25:24:1 (764.5 ~I) Y un volumen (según el volumen
recuperado de la última extracci6n con fenol cloroformo isoamllico 25:24:1) de
cloroformo isoamllico. Después se agrego dos volúmenes totales de etanol
absoluto (según el volumen recuperado de la última extracci6n con cloroformo
isoamllico) para precipitar el ADN, conservándose a -200 C durante 30
minutos. Posteriormente se lav6 el ADN con etanol al 75%. Finalmente el ADN fue
incubado en agua doble destilada en 55° C a 60° C durante 10 mln. Cada muestra
se conservo a -200 C hasta la posterior realizaci6n de la PCR.
Para determinar la concentraci6n mlnima detectable de ADN por la PCR y la
PCR anidada se determin6 por espectrofotometrla la concentraci6n en
nanogramos, picogramos o femtogramos por microlitro de cada diluci6n (63).
21 
RESULTADOS 
Muestreo Prelnoculaclón 
En la necropsia no se observaron lesiones macroscópicas aparentes. En el 
aislamiento bacterlol6gico de Salmonella spp no se aisló la bacteria en ninguna de 
las muestras analizadas. 
FASE 1 
ESTUDIO CUANTITATIVO BACTERIOLÓGICO 
A) Grupo 1 (G1) 
Registro de los signos observados en las aves 
En el grupo de aves inoculadas se observaron los siguientes signos: 1 ° dia: 
inoculación de las aves, no se observaron signos patol6gicos aparentes (SPA), 2° 
dla: SPA, 3° dla: SPA, 4° dla: SPA, 5° dla: depresi6n (aves postradas, sin reacción 
a estlmulos extemos) (5/63), SO dia: depresi6n (10/63), 7° día: depresión (15/63), 
8° dla: SPA, 9° dla: mortalidad (1/63), 10° dla: presencia de heces diarreicas en 
cama (diarrea acuosa, DA), 11° dla: mortalidad (2163), presenCia de DA, 12° dla: 
presencia de DA, 13° dla: presencia de DA y 14° dla: presencia de DA. A partir del 
dla 14 pi hasta el final del experimento (6° semana pi) no se observaron signos de 
enfermedad. De las tres aves que murieron (dla 9 y dla 11 pi) uno de ellos murió 
por aplastamiento y los dos restantes (dia 11° pi) se sacrificaron por presentar 
poco crecimiento y desarrollo. De la necropsia de estas tres aves, una de las que 
se sacrificaron el dla 11° pi se encontró retención de saco vitelina. De estas aves 
no se aisló SE de ninguna muestra de tejidos y heces analizada, ni se observaron 
lesiones macroscópicas aparentes. 
22
Peso de las aves
El peso de las aves en los tres primeros muestreos se muestra en el cuadro 1.
En este cuadro también se muestra el peso oficial reportado por la estirpe Ross
(64). En la gráfica 1 se observa el comportamiento del peso conforme a las tres
primeras semanas pi en cada grupo, comparado con el peso ideal reportado por la
estirpeRoss.
Prueba de aglutinación en placa
Las avesdel G1 a la 50 semana pi quese muestrearon resultaronser positivas a
la aglutinaci6n rápida en placa (10/10).
Estudio cuantitativo bacteriológico (ECS)
Los resultados del ECS se encuentran en la cuadro 2. Lasprincipales lesiones a
la necropsia se encuentran en la cuadro 3. En el cuadro 4 y en la gráfica 2 se
muestran los resultados de la media geométrica de cada muestra y de cada
muestreo. El comportamiento de recuperación de la bacteria durante el ECS
puedeobservarse en la gráfica 3. Para una valoraci6n de los datos obtenidos en
esta fase del experimento en el anexo 5 se puede observar la concentraci6n
recuperada de cadamuestra analizada (enUFC/g) de cada pollo.
1° Semana pi
En este primer grupo de aves inoculadas sacrificadas s610 uno de ellos no
presento aislamiento de SE en los diferentes tejidos analizados ni en heces (1/10).
En la cuadro 2 se observan las concentraciones recuperadas expresadas en
UFC/g de tejido o heces de este muestreo. Del total de muestras analizadas de
heces 9/10 fueron positivas, en higado-bazo 3/10, en saco vitelina 317, en tonsilas
cecales 7/10 yen médula 6sea5/10. En el aislamiento e identificación de bacterias
23
diferentes a SE (cuadro 5) se encontró que muestras de saco vitelina, tonsilas
cecales y médula ósea presentaron crecimiento de Escherichia coli (E. coli). La
mediageométrica paraeste muestreo fue de 4,682.6 UFC/g {cuadro 4}.
20 Semana pi
En este muestreo de las aves inoculadas se aisló SE de 9/10. Del total de
muestras de heces9/10 fueron positivas, yen tonsilas cecales 1/10 (cuadro 2). No
se recuperó SE de otros tejidos {la combinación hlgado-bazo, médula ósea ni
duodeno}. En el aislamiento de bacterias diferentes a SE se aisló E. coli y
Citrobacter freundii en muestras de duodeno, tonsilas cecales y heces {cuadro 5}.
la mediageométrica paraeste muestreo fue de 15.8UFC/g {cuadro 4}.
3° Semana pi
Para este tercer muestreo de las 10 aves sacrificadas, únicamente se aisló SE
en tejidos y hecesen 5 de 10 aves del G1 (5110). Del las 10 muestras analizadas
de heces 3110 fueron positivas, en hlgado-bazo 1/10, en tonsilas cecales 3/10, en
médula ósea 1/10, y en duodeno ninguna muestra fue positiva de las 10
analizadas (cuadro 2). Se aisl6 en muestras de heces y de tonsilas cecales
hongos del género Mucor spp. (cuadro 5). La media geométrica para este
muestreo fue de 7.5 UFClg(cuadro 4).
4° Semana pi
En este muestreo de las 10 aves sacrificadas solamente de una se aisló SE
(1110). El aislamiento correspondió a la muestra de heces en esta ave (1/10). No
se aisl6 SE de alguna otra muestra de tejidos (cuadro 2). En muestras de tonsilas
cecales y heces se aisló hongos del género Mucorspp. También se aisló E. coli,
Proteus spp y Citrobacter freundli en muestras de heces, duodeno, hlgado-bazo y
24
tonsilas cecales (cuadro 5). La media geométrica para este muestreo fue de 1.2
UFC/g (cuadro 4).
5° Semana pi
A la 5° semana pi de las 10 aves sacrificadas se recupero SE en 4/10 aves. Del
total de muestras analizadas SE fue aislada en 411Omuestras de tonsilas cecales,
en médula ósea 1/10 y en heces 1/10 (cuadro 2). No se aisló SE de muestras de
la combinación hlgado-bazo ni duodeno. Para este muestreo también se aisló
hongos del género Mucorspp en heces y tonsilas cecales (cuadro 5). La media
geométrica para este muestreo fue de 3.8 UFC/g (cuadro 4).
6° Semana pi
En este último muestreo de las 10 aves sacrificadas solamente en 1/10 se aisló
SE de una muestra de duodeno (cuadro 2). En el aislamiento de bacterias
diferentes a SE se encontró E. coli y Proteus spp en las muestras de heces y de
tonsilas cecales (cuadro 5). La media geométrica para este muestreo fue de 1.1
UFC/g (cuadro 4).
Estudio estadistico dediferencia de proporciones
En muestras de saco vitelina se obtuvo la mayor proporción de muestras
positivas (existió evidencia estadlsticamente significativa, p<O.OS), le siguieron las
muestras de heces, en tercer lugar las muestras de tonsilas cecales, después las
muestras de médula ósea y por último tanto las muestras de duodeno como las
muestras de la combinación hlgado-bazo tuvieron la menor proporci6n de
muestras positivas en relación a otras muestras. En la gráfica 4 y S se observa el
porcentaje de muestras positivas de manera general y en particular en cada
muestreo respectivamente.
2S
B) Grupo 2 (G2)
Durante todo el experimento no se observaron signos de enfermedad en el G2.
El peso de estas aves en los muestreos de la 2° semana pi y 3° semana pi se
encuentra en la cuadro 1. Durante esta primera fase del estudiono se aisl6 SE de
ninguna de las aves a partir de las muestras de tejidos y heces analizadas. Los
microorganimos aislados diferentes a SE se encuentran enlistadospor muestreo
en la cuadro5. Las 5 avestestigode la 5° semana pi resultaron ser negativas a la
pruebade aglutinaci6n en placa(5/5).
FASE 2
PRUEBA DE PCR
GRUPO 1
Muestreo Preinoculación
Los resultados de la PCR de estas muestras (tanto en tejidos y heces) fueron
negativos.
Muestras provenientes del ECB
En el cuadro6 se encuentran expresados los resultados positivos y negativos de
la prueba de PCR, además de las muestras que requirieron la realizaci6n de la
PCR anidada. Las muestras que fueron negativas al aislamiento de SE en el ECB
se les otorg6 un valor de O UFC/g. En los cuadros 7 al 11 se observa la
comparaci6n entre los resultados obtenidos en el ECB (fase 1) con los resultados
obtenidos por PCR (fase2) en cada tipo de tejido analizado y heces. En el cuadro
12 se observa una comparaci6n entre los resultados del ECB y los resultados de
la prueba de PCR en todas las muestras que se analizaron (un total de 36). En los
resultados de la PCR y la PCRanidada se obtuvo una banda de 525 pb Yde 329
26
pb respectivamente. En la figura 1 se observa la sensibilidad obtenida para la
prueba de PCR para cada tejido y heces. En la figura 2 se pueden observar los
fragmentos amplificados de 333 pb en un gel de agarosa al 2% de algunas de las
muestras analizadas por la PCR anidada. No se realizó la prueba de PCR para
muestras de saco vitelina (1° semana pi), debidoal tama/'lo de la muestra, ya que
solamente fue viablepara la realización del ECB.
1° Semana PI
Para este primer muestreo de las 6 muestras analizadas 4 fueronpositivas (416).
Se trabajaron mezcladas 3 muestras: 2 muestras de heces (rango de
concentración de 109.1010 UFC/g y 109.1011 UFC/g) y 1 muestra de médula ósea
(rango de concentración de 103-107 UFC/g, cuadro 6). La mlnima concentración
detectada por PCR fue de 1.6 x 103 UFC/g, encontrada en médula ósea y la
máxima concentración detectada fue el rango de 109 - 1010 UFC/g encontrada en
heces. Se analizó una muestra de médula ósea negativa al aislamiento de SE
cuyo resultado fue positivo. Para la PCR anidada se analizaron 4 muestras de las
cuales2 fueron positivas (214).
2°Semana PI
En este segundomuestreo de las 6 muestras analizadas 2 fueron positivas (216).
En forma de mezcla se trabajo una sola muestra de heces (con un rango de
concentración de 106-107 UFC/g, cuadro6). La únicaconcentración detectada por
PCR fue de 1.6 x 107 UFC/g encontrada en heces. Una muestra de médula ósea
negativa al aislamiento de SE fue positiva a la prueba de PCR. Se analiZaron un
total de 4 muestraspor la PCRanidada, de las cuales2 fueron positivas (2/4).
------ - - - - - -
27
3° Semana PI
En las muestras analizadas de la 3° semana pi, 2 fueron positivas (216). De
manera mezclada se trabajó una muestra de heces (con un rango de
concentración de 104.107 UFC/g) y otra de tonsilas cecales (con un rango de
concentración de 108-107 UFC/g, cuadro 6). Para este conjunto de muestras, solo
una muestra cuya concentración fue de 1.6 x 103 UFC/g de médula ósea fue
positiva a PCR. Una muestra de duodeno negativa al aislamiento de SE fue
positiva a PCR. Se analizaron un total de 3 muestras por la PCR anidada de las
cuales todas fueron negativas (0/3).
4° Semana PI
En este muestreo todas las muestras representativas resultaron ser negativas a
la PCR(0/6). Solamente se analiz6 una sola muestra de heces positiva al
aislamiento de SE cuya concentraci6n fue de 1.6 x 104 UFC/g, que resultó
negativo a la PCR. Todas las demás muestras analizadas resultaron negativas al
aislamiento de SE (cuadro 6). Ninguna muestra se trabajo de manera mezclada.
Se analizaron 3 muestras por medio del análisis de la PCR anidada (3/6), los
cuales fueron negativos (0/3).
5° Semana PI
En este muestreo 4 muestras fueron positivas (416). Se trabajo una sola muestra
mezclada. proveniente de tonsilas cecatas (con un rango de concentraci6n de
103-104 UFC/g). La mlnima concentración detectada fue de 1.6 x 103 UFC/g,
proveniente de una muestra de médula ósea, y la máxima concentración
detectada fue de 1.32 x 106 UFC/g proveniente de un muestra de tonsilas cecales
(cuadro 6). Una muestra de la combinación hlgado-bazo que resultó negativa al
aislamiento de SE fue positiva a peR. Se analizaron 3 muestras por la PCR
anidada (3/6) y los resultados fueron positivos para las tres concentraciones (313).
28
6° Semana PI
En este muestreo, de las muestras representativas, la mitad fue positiva (3/6).
Se trabajo mezclada 1 muestra de médula ósea (conjunto de 3 muestras de
médula ósea que resultaron ser negativas al aislamiento de SE) y una muestra de
la combinación hlgado bazo (conjunto de 2 muestras de la combinación hlgado-
bazo que resultaron ser negativas al aislamiento de SE, cuadro 6). Una muestra
de duodeno con una concentración de 1.6 x 103 UFC/g fue la (mica muestra
positiva. Las otras 2 muestras positivas corresponden a 2 muestras (una muestra
de heces y otra de tonsilas cecales) que fueron negativas al aislamiento de SE.
Para la PCRanidada se trabajo unamuestra (1/6) quefue positiva (1/1).
Grupo2
De las muestras provenientes del grupotestigo no se detecto la presencia de SE
por mediode la PCR.
FASE 3
SENSIBILIDAD DELA PRUEBA DE PCR EN CULTIVO PURO
Se determinó que 109 UFC de SE PT 138 equivale a 137.4 ng/J.l1 (nanagramos
por microlitro), esto se comprobó después de 10 lecturas por espectrofotometrla
(63) de ADN puro proveniente de 10 purificaciones de ADN que contenlan 109
UFCde SE PT 138 • A travésde la prueba de PCRel limitede detección paraADN
puro de SE PT 1311 se encuentra en la dilución 10· UFC, que equivale 1.37 pg/J.l1
(picogramos por microlitro) de concentración de ADN. Por medio de la prueba de
PCR anidada el limite de detección se encuentra en la dilución 101 UFC. que
equivale a una concentración de 1.37 fg/f.l' (femtogramos por microlitro). Las
concentraciones de ADN se encuentran expresadas en la cuadro 13. En la figura2
29
pueden observarse los limites de detección en un gel de agarosa al 2% para la
PCR y en la figura 3 para la PCR anidada.
DISCUSION
Los métodos de diagnóstico bacteriológicos actuales tienen como principal
objetivo ser más rápidos, eficaces y económicos. En el caso de SE que es una
bacteria de gran importancia debido a su Implicación en salud pública, los métodos
de diagnóstico se vuelven aún más importantes. Las herramientas con las que se
cuenta hoy en dla en este rubro, son principalmente las técnicas de aislamiento
bacteriológico, aunado a las técnicas de serologla. Se conoce al aislamiento
bacteriológico como el método definitivo de diagnóstico, sin embargo el tiempo en
la entrega de resultados es largo. Por otro lado la biologla molecular ha tenido
gran aceptación en el ámbito bacteriológico ya que no solo ha demostrado ser
eficaz en el diagnóstico de las principales enfermedades bacterianas en los
animales, sino también ha demostrado ser rápida. En el caso de la salmonelosis
se cuentan con varios métodos diagnósticos en base a la PCR. Se escogió para
este trabajo la técnica de PCR que detecta un fragmento del gen InvA, por ser esta
metodologla que se usa rutinariamente en el diagnóstico de salmonelosis. El
método de la PCR cumple con las premisas de eficacia, sensibilidad y rapidez
para la detección de SE, deseables en una buena herramienta de diagnóstico. Sin
embargo debido a la variación de recuperación de SE según el tiempo transcurrido
de la Infección, es importante establecer el limite de detección de esta prueba. Es
por esto que los métodos de aislamiento bacteriológico son importantes, pues de
esta forma se puede llegar a conocer la cantidad de bacteria que se multiplica en
los diferentes tejidos. Como se puede deducir tanto la técnica de PCR es útil e
importante, como los métodos bacteriológicos de aislamiento de SE.
Varios autores han reportado que la infección oral con SE en aves produce de
manera primaria una infección gastrointestinal, y a su vez una eliminación
constante de SE por heces (4, 14). Gast y Holt., 1998 (36) Y Shivaprasad et al.,
1990 (23) han reportado que la persistencia en la infección se debe principalmente
30
a que la infección queda latente en el tracto gastrointestinal (TGI) y en tonsilas
cecales, y que la eliminación de SE en heces varia considerablemente, aunque en
los demás tejidos la concentración recuperada de SE en estos pueda disminuir
confonne se recupera el ave. En la 10 semana pi la media geométrica de
recuperación de SE (MG) fue de 4,682.6 UFC/g (cuadro 4, gráfica 2). Como se
puede analizar la concentración disminuye drásticamente hasta 15.8 UFC/g en la
20 semana pi (cuadro 4). Progresivamente esta concentración va disminuyendo
confonne pasa el tiempo pi. Sin embargo, a los 35 dlas pi existe un "pico· en la
recuperación, que no llega a ser mayor a 10 UFC/g. Esto indicana, posiblemente,
que la infección en las aves no se elimina por completo y que por tanto SE
permanece latente en ellas. Esta latencia en la infecciÓn aún más se confinna ya
que SE no dejó de aislarse de las diferentes muestras durante todo el
experimento, pero especialmente en las muestras del TGI. Se observa que la
mayor concentración de SE se encontró en heces, saco vitelino y tonsilas cecales
(MG de 570.9 UFC/G, 50.3 UFC/g y 36.26 UFC/g; respectivamente, cuadro 4).
Aunque proporcionalmente existió una mayor cantidad de muestras positivas de
saco vitelina en general, (gráfica 4), fue en las muestras de heces donde hubo la
mayor recuperación de SE en todo el experimento (gráfica 2). En contraste con
otras muestras, inclusive de muestras del TGI, fue en heces donde de todos los
muestreos a excepción del último, se recuperó SE, sugiriendo por tanto que las
heces son un buen monitor de la infección, como lo ha mencionado Gast., 2003
(4). Esto sugiere entonces una Infección predominante en el TGI. Esta
recuperación predominante de SE en el TGI también es concordante con las
principales lesiones macroscópicas encontradas en el TGI (cuadro 2). Después de
la recuperación de SE en heces en la primera semana pi la concentración
recuperada disminuyó progresivamente hasta cero en la última semana del
experimento (42 dlas pi; cuadro 2,4).
Por otro lado la concentración recuperada en tonsilas cecales tuvo una media
geométrica de 36.261 UFC/g, lo cual fue una de las concentraciones más altas en
todo el experimento. Únicamente e los 28 dlas pi y e los 42 dlas pi no se recuperó
SE de tonsilas cecales. A diferencia de heces y de tonsilas cecales, en duodeno
31
hubo la menor recuperación en muestras del TGI, solamente se recuperó de una
sola muestra a los 42 dlas pi con una concentración de 1.6 x 103 UFC/g. Al
respecto, el crecimiento óptimo de SE se obtiene en pH de 7.0 aunque se ha
reportado que SE puedecrecerdesdepH de 4.0 hasta9.0 (4, 5). El pH reportado
en duodeno en pollosde engorda es de 5.7 a 6.4 con una media de 6.0 y depende
de factores como el tipo de alimentación, si se encuentra vaclo o lleno, asl como
también por el estado fisiológico del ave (76), sugiriendo por tanto que el pH
encontrado en el duodeno no es el óptimo parael crecimiento de SE, sin embargo
SE se recupero al final del experimento confirmando la capacidad de SE para
infectarel TGI.
En la infección con SE en aves menores a 1 semana de edad se ha reportadoque el saco vitelino es uno de los principales sitios de infección, debido a la
cercanla con el TGI (4). En muestras de saco vitelino se obtuvo la mayor
proporción de muestras positivas al aislamiento de SE de todo el experimento
además de que en estas muestras la mediageométrica fue de 50.393 UFC/g que
es la segunda concentración media más alta, después de heces (la media
geométrica de heces fue de 570.943 UFC/g). Con base en estos resultados es
importante entonces el muestreo del saco vitelino para la identificación de SE. Es
entonces que la infección en el TGI en este experimento jugó un papel muy
importante en la persistencia de la infecci6n, sobretodo cuando esta se desarrolla
en la etapatemprana de la vidadel pollo.
Tanto el hlgado como el bazo son importantes en el proceso de infección. En
estosórganos SE puede permanecer "oculta" de la respuesta inmune (debido a la
invasión intracelular de SE), o el proceso inmunol6gico en el bazopuede controlar
la Infecci6n al disminuir la multiplicación de SE (4, 22, 41). También se ha
mencionado que el higadoes importante en la gravedad de la infección, ya que se
ha descrito que en éste la infecci6n produce focos necroticos y hepatomegalia,
indicando un proceso de inflamaci6n activa. Esto es debido a que SE es
transportada por la circulaci6n sanguinea (bacteremia) después de la infección en
TGI, y el primer sitio de infecci6n después del TGI es el hlgado (67). En este
experimento las muestras de la combinación de higado-bazo la media geométrica
32
encontrada fue de 1.78 UFC/g, que es una de las más bajas encontradas en este
experimento. Proporcionalmente también fue donde hubo un menor número de
muestras positivas, s610 4 de 60. Aunque la concentraci6n encontrada en estas
muestras fue menor, se conoce que existió una infección sistémica que empezó
desde la primera semana pi (cuadro 2). Sin embargo no se recupero SE después
de la primera semana pi, a excepción de los 21 dias pi; lo cual sugiere una baja
colonización y multiplicación en estos tejidos. Las lesiones hepáticas que están
reportadas en el cuadro 3 únicamente se observaron a los 7 dlas pi. Esto podrla
significar que las aves pudieron controlar la infecci6n sistémica de manera
oportuna.
Los resultados en médula 6sea, junto con los resultados la combinaci6n higado-
bazo, confirman la infección sistémica, ya que también se ha descrito como uno de
los sitios de infección la médula ósea (4, 67); además se ha reportado que en este
tejido existe cierta actividad fagocitica (41). En las muestras de médula ósea se
recuperó SE a los 7, 21 Y a los 35 dlas pi. La concentración recuperada varió
considerablemente entre las muestras, a los 21 dias pi la recuperación fue mucho
mayor que en los 7 y 35 días pi. Los resultados de la media geométrica indican
que en médula ósea la concentración fue de 3.12 UFC/g, que es visiblemente
mayor a la concentración en muestras de la combinaci6n hlgado-bazo. La médula
ósea fue más representativa de la infección sistémica que la combinación hlgado-
bazo, ya que pudo permanecer SE de manera latente multiplicándose en este
tejido.
Uno de los principales signos en la salmonelosls es la disminución en la
eficiencia alimenticia (4). SE infecta las células epiteliales del TGI de manera
intracelular, por lo que, cuando la célula epitelial muere SE es liberada a la
membrana basal (4). Esto se traduce en una deficiente absorción de nutrientes
con la consecuente desnutrición del ave, lo cual afecta negativamente el
crecimiento normal y el desarrollo del ave (4, 22, 65, 66). Este efecto de la
infección se observa en el peso de las aves. Con respecto al peso del G1 (cuadro
1) en las primeras tres semanas resulto ser menor en comparación con las aves
del G2, asl como también por el peso indicado por la estirpe Ross (64). En el
33
cuadro 1 Y la gráfica 1 se observa que el G2 resulta ser más homogéneo que el
G1 . Para la 3° semana pi las aves del G1 resultan más heterogéneas en
comparación con las dos primeras semanas pi lo quedenota entonces unaposible
mala uniformidad debido a la infección con SE. Además en este estudio se
observó que los primeros signos de enfermedad fueron aparentes desde los
primeros 5 dias pi. Diversos investigadores han mencionado que la morbilidad en
la salmonelosis paratifoidea en las aves es muy variable y que además depende
en gran medida en la capacidad de Invasión y la producción de toxinas (4, 22). Es
por esto que pudo deberse la heterogeneidad en el peso de las aves y
presentación variable de los signos en el G1 . Las lesiones encontradas están
relacionadas con la concentración recuperada de SE en cada muestreo (cuadro
3), y pueden mostrar por tanto la gravedad de la Infección. Se ha mencionado
además que si SE se encuentra en una fase logarltmica de crecimiento, la
invasividad de las células epiteliales intestinales es mayor que si la bacteria se
encontrara en un estado estacionario de crecimiento (4). Tanto signos y lesiones
disminuyen conforme la edad de las aves es mayor y por ende conforme avanz6
esteestudio. Estosugerirla una respuesta inmune activa en contra de la infección,
que es corroborado por los resultados positivos a la prueba de aglutinaci6n en
placa en las aves del G1 a los 35 dias pi (SO semana pi). Sin embargo, un factor
importante de resistencia a la infección no inmunológico es la flora nativa
microbiana intestinal que por competencia inhibe los sitios de multiplicación de SE
en el epitelio intestinal (68), lo cualpodria explicar el inaparente aislamiento de SE
en algunas aves en el experimento. Se ha mencionado que la respuesta inmune
en contra de SE es tantocelular (en la primera fasede la respuesta inmune) como
humoral, los principales anticuerpos a nivel del suero sangulneo son IgGe IgM, y
a nivel intestinal es IgA (68, 69). La presencia de anticuerpos en sangre en las
aves inoculadas se detecta a partir de la primera semana pi y hasta las 35
semanas pi (70). Por la vla celular los responsables de desencadenar la
inmunidad son los heter6filos, junto con la producci6n de cltocinas (71). Las
protefnas fimbriales, conjuntamente con las protelnas estructurales de SE son
altamente inmunogénicas, por lo que son las responsables de desencadenar la
34
respuesta inmune (44). En aves resistentes genéticamente se ha descrito que la
presencia de esta bacteria en los macr6tagos desencadena el mecanismo de
estallido respiratorio, controlando asl la infección. (41) Sin embargo en aves
susceptibles, como podrla sugerir el comportamiento de SE en las aves de este
experimento, se ha demostrado que la supervivencia de SE dentro de los
macrófagos en las aves depende de la evasión de la unión del fagosoma-lisosoma
dentro de los macr6fagos en órganos Iinfoides, esto contribuye a la destrucci6n de
los macr6fagos, por lo que, si la infecci6n es aguda puede provocar
inmunodepresi6n, (4, 22) Y debido a esta condici6n inmunodepresiva las aves
quedan en estado de portador de SE, y son susceptibles a infecciones
secundarias (4). Por otro lado, se ha reportado también la presencia de plásmidos
bacterianos en las células afectadas, lo que contribuye a la evasi6n de la
respuesta inmune (42). Por todo lo anteriormente mencionado se podrla sugerir
que debido a tanto los factores de patogenicldad y virulencia de la bacteria, asl
como los factores de inmunogenicidad, y de resistencia del ave influyeron en la
recuperaciónde esta bacteria en las diferentes muestras.
En el cuadro 5 puede observarse cuales fueron los microorganismos que con
mayor frecuencia se aislaron en las diferentes muestras además de SE. tanto en
aves provenientes del G2 como del G1. De estos resalta en importancia cuatro: E.
col;, C;trobacter freundií, Proteus spp. y Mucorspp. Se ha mencionado que E. coli,
aunque forma parte de la flora nativa bacteriana en la parte baja del intestino, es
un agente patógeno oportunista (72). Puede ser entonces que debido al dañe
causado por SE en las avesinoculadas é. coli dal'\o aún más el TGI, ya que como
se ha reportado é . coli produce enteritis, distensi6n por gas en intestino, tiflitis y
diarrea (72), lesiones observadas tanto en la 2° semana pi como en la So semana
pi. El aislamiento de é. coli en muestras de la combinaci6n de hígado-bazo y en
médula 6sea posiblemente se deba a bacteremia.
Tanto Proteus spp. como Citrobacter spp. se hallan como agentes
contaminantes en el medio ambiente, también se ha reportado que estas forman
parte de la flora nativa bacteriana en la parte baja del intestino (73). La mayorfa de
3S
las veces que se aislaron fue proveniente de muestras del TGI, lo que podrla
sugerirqueestasbacterias provienen de la mucosa intestinal de lasaves.
La presencia de hongos del género Mueor spp., principalmente en muestras de
tonsilas cecales y de heces, podrla sugerirque el dat'io en el epitelio intestinal fue
grave. Las infecciones con este tipo de hongos en las aves no es común y
denotan un estado de inmunodepresi6n (74), y debido a quesolamente se aislaron
de muestras del TGI, se podrla deducir que estos hongos se circunscribieron
únicamente al TGI, posiblemente al dano producido por SE y a la susceptibilidad
de las aves(74).
PRUEBA DE PCR
Se ha reportado que la sensibilidad de la prueba de PCR depende no solamente
de la realizaci6n de la misma, sino también de otros factores tal como el
enriquecimiento bacteriol6gico previo de la muestra quefavorece el crecimiento de
SE. Otrofactor importante son los factores inhibitorios a la prueba de PCR(52, 53,
75). Según lo descrito por Rychlik et al., 1999por medio de estaprueba de PCRel
limite de detecci6n para Salmonella spp es de 105 en muestras de heces sin
enriquecimiento previo, además llegaron a la conclusión de que si la muestra es
preenriqueclda bacteriol6gicamente, la sensibilidad aumenta (52). Esto podrla
explicar el porque en algunas muestras con concentraciones superiores a 105
UFC/g los resultados son negativos (ya que en este estudio no hubo
enriquecimiento previo). Lo que se acerca a la teorla de que 1 UFC puede ser
detectada por la PCR, con la ventaja de que esta metodologla es más rápida. Se
ha establecido que el limite de detecci6n de SE por métodos bacteriol6gicos
comunes puede ser desde 4 células, dependiendo de la sobrevivencia de la
bacteria (56). En el cuadro 6 se observan los resultados obtenidos en la fase2 de
este estudio. Lo que se observa de manera primordial es que en todos los
muestreos existeamplificaci6n de ADN (ya sea por la PCRo por la PCR anidada),
a excepci6n de las muestras provenientes de la 4° semana pi, lo que confirma el
hechode que existi6 una baja multiplicaci6n de SE en los tejidos a los 28 dias pi.
36
Se menciona también que la sensibilidad puede ser aumentada hasta 1000 veces
más cuando se realiza la prueba de PCR anidada (52). La realización de la PCR
anidada se realizó bajo la premisa de aumentar la sensibilidad en muestras que
eran positivas al ECB, pero que hablan sido negativas a la PCR. En el cuadro 12
se puede observar que de las 36 muestras analizadas (19 positivas a ECB), la
PCRsolamente detectó 9 y fall6 en detectar 10 (a las que se les realiz61a prueba
de PCRanidada), aunque por otro ladodetectó como positivas a 6 muestras de 17
que por ECB eran negativas. Esta aparente menorsensibilidad de la PCR para
detectar SE en muestras biológicas que el aislamiento de se, se debe
probablemente a la metodologla aplicada de la PCR. Parala realizaci6n de la PCR
en este estudio se tomaron únicamente 3 ~ de ADN de cada muestra biológica.
Varios investigadores han utilizado de 1 a 5 J.l1 de ADN purificado a partir de
muestras biológicas para la realizaci6n de PCR, sin embargo en estos trabajos la
técnica de purificaci6n de ADN fue posterior a la realización de preenriquecimiento
bacteriológico de las muestras (45, 56, 75). Por otro lado la presencia de factores
inhibitorios en muestras biol6gicas (tales como el factor heme y sus metabolitos
presentes en muestras de hlgado) fue minimizado con la realización de la técnica
de purificaci6n de ADN realizada en este estudio (52). Por tanto en muestras
biológicas (y debido a la taita de preenriquecimiento previo) de este experimento
existió ADN que no correspondió al de SE, debido a la presencia de bacterias
diferentes a SE (en muestras del TGI), o de las propias células de los tejidos
(muestras de la combinaci6n hlgado-bazo y médula 6sea). Es por elloque el ADN
de se estaba diluido en estas muestras, de manera que se encontrarla en mayor
proporción en muestras del TGI, ya que en estas muestras se encontró mayor
concentración de SE. y en menorproporción en muestras de otrostejidos. Debido
a esto la técnica de PCRdebi6 ajustarse a la concentración de cada muestra, sin
embargo no se realizó de esta manera ya que se optó por un protocolo universal
de la PCR y PCRanidada. Porotro lado, los resultados también indican (cuadro 6)
la existencia de una mayor sensibilidad de la prueba de PCR para la detecci6n de
SE en comparación con el ECB, ya que en muestras donde no se aisl6 SE por
eCB, por la PCR se detecto ADN de se en estas muestras (un total de 6). Este
37
resultado Indica entonces que las pruebas de PCR y PCR anidada utilizadas en
este experimento son confiables y que se deben mejorar las técnicas utilizadas
parala realización de la misma.
.En este presente trabajo se encontró la amplificación de un producto de la PCR
de 525 pb Yun producto de la PCR interna de 329 pb, en ambos fragmentos se
incluyen los iniciadores. Rychlik et al., 1999 (52) reportan un fragmento de
esperado de 485 pb en la PCR y unode 284pb en la PCR anidada, sin embargo
ellos no incluyen el tamano de los iniciadores, es por ello que los fragmentos
encontrados en esteexperimento soncorrectos y corresponden a losdescritos por
Rychlik et al., 1999.
Soumet et al., 1999 reportaron que el crecimiento de otras bacterias talescomo
Citrobacter freundii y Enterobacter cloacae, pueden inhibir el crecimiento de SE y
afectar la prueba de PCR (75). Fue en heces donde se encontró la mayor
proporción de bacterias diferentes a SE (cuadro 5). Es probable entonces que
debido al crecimiento de bacterias diferentes a SE y la falta de enriquecimiento
previo la inhibición de la PCR pudo presentarse. Tanto en el cuadro 7 como en la
figura 1 puede observarse que fue en heces donde hubo la mayor cantidad de
muestras positivas al aislamiento de SE, pero negativas a la PCR. Se ha
mencionado que una gran proporción de ADN puede inhibir la reacción de PCR
(45). Además de la falta de enriquecimiento previo, la alta concentración de ADN
en muestras de heces pudo afectar negativamente a la prueba de PCR, dando por
consiguiente falsos negativos (como lo observado en esteexperimento). Debido a
que el objetivo de este estudio era determinar la sensibilidad en heces a la PCR
(determinar la concentración minima bacteriana), se observa entonces que los
resultados no son concluyentes debido a la falta de enriquecimiento previo, y que
por tanto es importante este, ya que esto redundaria en una mejor utilización de
estasmuestras para la realización de la PCR.
En muestras de tonsilas cecales los resultados de la PCR son similares a los
encontrados en las muestras de heces. El limite de detección por la PCR para
tonsilas cecales seriadesde103 UFC/g, sin embargo, como se indica en el cuadro
6 y en la figura 1 se observa que existen muestras negativas a PCRde tonsilas
38
cecales desde concentraciones como 105 UFC/g. Es en tonsilas cecales "donde se
pudo observar que exlsti6 una alta carga bacteriana, asl como mic6tica
recuperada en las muestras provenientes del G1 (cuadro 5). La raz6n de que se
encuentren concentraciones bacterianas desde 105 UFC/g como negativas podrla
ser debido a que la alta carga microbiana (alta concentraci6n de ADN) inhiba la
reacci6n de PCR, como se mencionó anteriormente enel apartado de heces.
En las muestras de duodeno se observan resultados