Efecto-protector-de-antioxidantes-en-la-toxicidad-por-dicromato-de-potasio-en-celulas-LLCPK1

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
EFECTO PROTECTOR DE ANTIOXIDANTES 
EN LA TOXICIDAD POR DICROMATO DE POTASIO 
EN CÉLULAS LLC-PK1 
 
 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
PRESENTA 
 
LILIAN ARACELI CRUZ 
 
 
 
 
 
 MÉXICO, D. F. 2008 
 
 
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Sitio donde se desarrollo el tema: 
 
 
Laboratorio 5, Departamento de Farmacología. Sexto piso, Torre de Investigación, 
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Financiamiento: 
 
 
Este trabajo fue apoyado por los proyectos PAPIIT IN22905 y CONACYT 47993-M 
 
 
 
 
 
 
Asesora: ____________________________________ 
 Dra. Diana Barrera Oviedo 
 
 
 
 
Sustentante: __________________________________ 
 Lilian Araceli Cruz 
 
 
 
 
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RESUMEN 
 
El estrés oxidativo es un estado de desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes 
celulares. Los oxidantes son radicales libres formados normalmente o en condiciones 
patológicas. Los antioxidantes son moléculas o enzimas que neutralizan a los radicales 
libres. Los radicales formados durante el estrés oxidativo, pueden oxidar a las 
biomoléculas que conforman la estructura de la célula. Las moléculas oxidadas pierden la 
capacidad de realizar su función y si el daño en la célula es grande puede conducir a su 
muerte. Esto ocurre cuando hay exposición a algunos fármacos, solventes orgánicos o a 
metales pesados como el cromo. 
 
El cromo forma radicales libres que dañan las células. En ratas y en humanos se 
acumula en hígado y en riñón. En el riñón se acumula específicamente en células de 
túbulo proximal ocasionando insuficiencia renal aguda. 
 
En este trabajo se investigó el efecto de los antioxidantes piruvato, S-acetil-
cisteína, N-alil-cisteína, glutatión, ácido ascórbico y curcumina, en la toxicidad por 
dicromato de potasio en células LLC-PK1. 
 
Las células LLC-PK1 son derivadas de túbulo proximal de riñón de cerdo. Estas 
células fueron expuestas a dicromato de potasio en presencia de los antioxidantes 
(preincubando, preincubando y coincubando o solo coincubando). Se midió la viabilidad 
celular y la cantidad de peroxinitrito (marcado de estrés oxidativo) en cada uno de los 
grupos. 
 
El ácido ascórbico no protege. La S-alil cisteína, el piruvato y la curcumina 
presentan un efecto protector parcial. La N-acetil cisteína y el glutatión generan un efecto 
protector total. Los antioxidantes que protegen parcial o totalmente de la muerte 
ocasionada por el dicromato de potasio, lo hacen solo cuando se incuban al mismo tiempo 
el dicromato de potasio y el antioxidante. Todos los antioxidantes estudiados son capaces 
de disminuir parcialmente los niveles del peroxinitrito. 
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INDICE 
 
I. INTRODUCCIÓN 1 
1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL ESTRÉS OXIDATIVO 1 
2. ANTIOXIDANTES BIOLÓGICOS Y SUS CARACTERÍSTICAS. 1 
2.1. Ácido ascórbico 2 
2.2. Piruvato 3 
2.3. Glutatión 4 
2.4. S-alil-cisteína 5 
2.5. N-acetil-cisteína 6 
2.6. Curcumina 6 
3. CROMO Y K2Cr2O7 7 
4. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN RENAL 9 
5. CONDICIONES PATOLÓGICAS DE LA FUNCIÓN RENAL 10 
II.- ANTECEDENTES EXPERIMENTALES 11 
HIPÓTESIS 13 
OBJETIVO GENERAL 13 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 13 
III. MATERIALES Y MÉTODOS 14 
1. Reactivos 14 
2. Línea celular 14 
3. Medición de la viabilidad celular por reducción de MTT 15 
4. Medición de la viabilidad celular por tinción con cristal violeta 15 
5. Medición del peroxinitrito por oxidación de dihidro-rodamina 16 
6. Análisis estadístico 16 
7. Diseño experimental 16 
7.1. Modelo de toxicidad por K2Cr2O7 16 
7.2. Ensayos con antioxidantes 17 
IV. RESULTADOS 18 
V. DISCUSIÓN 31 
VI. CONCLUSIONES 34 
INDICE DE ABREVIATURAS 35 
VII. BIBLIOGRAFIA 36 
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 1 
I. INTRODUCCIÓN 
 
1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL ESTRÉS OXIDATIVO 
 
Un radical libre es una especie química que contiene uno o más 
electrones desapareados ya sea por pérdida o ganancia de ellos. La presencia 
de electrones desapareados modifica la reactividad química de un átomo o de 
una molécula y la hace generalmente más reactiva. 
 
Los principales radicales libres son los formados a partir del oxígeno, 
también conocidas como especies reactivas de oxígeno (ERO): 
 
 e- e- + 2H+ e- + H+ e- + H+ 
 O2 → O2
•- → H2O2 → OH
• → H2O 
(oxígeno) (anión superóxido) (peróxido) (radical hidroxilo) (agua) 
 
Cuando por alguna razón se produce un exceso de radicales libres en 
el organismo y la capacidad de las defensas antioxidantes resulta ser 
ineficiente, se establece la situación conocida como estrés oxidativo. Se sabe 
que algunos fármacos, solventes orgánicos, metales pesados y diversas 
enfermedades, inducen la producción de radicales libres y por tanto estrés 
oxidativo. Durante un estado de estrés oxidativo, las estructuras celulares 
pueden sufrir daño por alteraciones en las macromoléculas tales como 
proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, lo cual al ser muy severo, puede conducir 
a la muerte celular. 
 
2. ANTIOXIDANTES BIOLÓGICOS Y SUS CARACTERÍSTICAS. 
 
Las células poseen sistemas defensivos que les permiten controlar la 
concentración de radicales libres. Estos sistemas son de dos tipos: sistemas 
antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos. 
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 2 
Las principales enzimas antioxidantes son la superóxido dismutasa, la 
glutatión peroxidasa, la catalasa y la glutatión reductasa. Los antioxidantes no 
enzimáticos o simplemente antioxidantes, son compuestos que poseen la 
capacidad de interaccionar directamente con los radicales libres. 
 
2.1. Ácido ascórbico 
 
 
El ácido ascórbico (vitamina C) se encuentra en cítricos, tomate y 
verduras (Ríos de Molina et al., 2002). Las plantas y muchos animales pueden 
sintetizar el ascorbato a partir de la glucosa, pero algunas especies como los 
humanos, los cobayos y algunos árboles frutales no cuentan con la enzima 
requerida (gulonolactona oxidasa) para sintetizarlo (Halliwell y Gutteridge, 
1999). 
 
En sistemas in vivo el ascorbato se requiere como un cofactor para 
enzimas (prolina hidroxilasa, lisina hidroxilasa, dopamina-β-hidroxilasa). Una 
deficiencia de ascorbato en la dieta humana causa escorbuto (Halliwell y 
Gutteridge, 1999). El ascorbato es un compuesto que se localiza tanto en el 
citosol de las células como en los fluidos extracelulares y se caracteriza por su 
capacidad de aceptar electrones. Puede reaccionar directamente con el O2
•-, 
OH• y el radical urato (Frei et al., 1990; Sauer et al., 2001),generando 
semidehidroascorbato o el radical ascorbilo, el cual puede ser oxidado para dar 
dehidroascorbato, o bien para reciclarlo a ascorbato por el sistema reductor 
tiorredoxina/tiorredoxina reductasa (Buettner, 1993; May et al., 1998). 
 
 Asc + OH• → Asc•- + H2O 
 Asc•- + Trx(red) → Asc + Trx(ox) 
+ OH• → + H2O 
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 3 
El ascorbato atrapa a los radicales peroxilo, que son solubles en agua. 
En la industria de alimentos se han desarrollado ésteres lipofílicos de ascorbato 
para atrapar radicales lipo-solubles como tioles y radicales oxisulfurosos. 
 
El ascorbato es un poderoso atrapador del ácido hipocloroso, de ácido 
peroxinitroso y de agentes nitrosativos. Además es agente quelante del 
singulete de oxígeno y poderoso atrapador de ozono y dióxido de nitrógeno en 
fluidos del cuerpo humano. También coopera con la vitamina E, regenerando 
los radicales α-tocoferil a α-tocoferol en membranas y lipoproteínas (Halliwell y 
Gutteridge, 1999). 
H+ + ascorbato- + α-Tocoferil• → α-Tocoferol + Asc•- 
 
2.2. Piruvato 
 
 
El piruvato es un alfa-ceto-ácido, producto final de la glicólisis y un 
potente antioxidante (Halliwell y Gutteridge, 1999). 
 
Se ha sugerido que el piruvato reacciona directamente con el H2O2, 
debido a que disminuye el daño que provoca el H2O2 en modelos in vitro e in 
vivo (Salahudeen et al., 1991; Varma et al., 2006; Crestanello et al., 2001). 
 
El piruvato reduce el daño al DNA durante la hipoxia y la reoxigenación 
en células de carcinoma (Roudier et al., 2007), disminuye el estrés oxidativo 
por etanol en membranas de eritrocito (Gabbianelli et al., 2007); en hígado de 
pollo (Peng y Lin 2004) y en mitocondrias humanas de neuroblastoma (Wang et 
al., 2007). El piruvato es cardioprotector ante la isquemia reperfusión en rata 
(Arya et al., 2006). 
 
 
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 4 
 
2.3. Glutatión 
 
 
En sistemas in vivo, los tioles, especialmente el glutatión reducido 
(Glu-Cys-Gly) son agentes antioxidantes, aunque ellos mismos pueden generar 
radicales libres. El glutatión tiene múltiples funciones en el metabolismo 
humano, incluyendo la detoxificación de xenobióticos, radioprotección y 
defensa antioxidante (Halliwell y Gutteridge, 1999). El glutatión es sustrato para 
dos familias importantes de complejas enzimas antioxidantes como las 
glutatión peroxidasas y las glutatión S-transferasas. 
 
Los radicales ti-il son formados cuando los grupos tiol reaccionan con 
algún grupo carbonilo, con radicales de oxígeno (OH• , RO• , RO2
•) y en menor 
proporción con el O2
•- 
RSH + C•- → -CH + RS• 
RSH + OH• → RS• + H2O 
RSH + RO2
• → RS• + ROOH 
 
Los radicales ti-il también se forman cuando ciertos tioles reaccionan 
con dióxido de nitrógeno (NO2
•) o son expuestos a peroxinitrito (ONOO-), y 
durante la oxidación de tioles por peroxidasas y por proteínas hemo. 
 
Los radicales ti-il son generados también por reacción del grupo tiol 
con iones metálicos. 
RSH + Fe3+ → RS• + Fe2+ + H+ 
RSH + Cu2+ → RS• + Cu+ + H+ 
 
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 5 
Además son formados por la fisión homolíltica de disulfuros, 
incluyendo los puentes disulfuro de las proteínas. 
Cisteína – S – S- Cisteína ---------� CisteínaS• + •SCisteína 
 
In Vitro, GSH reacciona con el OH•- , RO• y RO•2. Esta reacción puede 
generar radicales ti-il (GS•) (Halliwell y Gutteridge, 1999). 
 
2.4. S-alil-cisteína 
 
 
La S-alil-cisteína es un compuesto con un grupo tiol. La S-alil-cisteína 
es uno de los compuestos azufrados del ajo, otros compuestos son la S-alil-
mercaptocisteína, la S-metil-cisteína y la γ-glutamil-cisteína. Se ha observado 
que estos compuestos protegen a las membranas celulares hepáticas frente a 
la agresión de peróxidos lipídicos y protegen al endotelio vascular frente a 
peróxido de hidrógeno (Amagase, 2006). 
 
La S-alil-cisteína es capaz de reaccionar con el O2
•-, H2O2, OH
• y 
ONOO- (Chung, 2006; Ide y Lau, 2001; Kim et al., 2006; Maldonado et al., 
2003). 
 
La S-alil-cisteína tiene una gran actividad antioxidante (Numagami et 
al., 1996), tiene efecto hepato-protector (Nakagawa et al., 1988; Kalayarasan et 
al., 2008;), reno-protector (Segoviano-Murillo et al. 2008), cardio-protector 
(Chuah et al., 2007), reduce el riesgo de necrosis en el hígado por 
acetaminofen (Sumioka et al., 1998) e induce la hepatogénesis (Sundaresan y 
Subramanian 2008). La S-alil-cisteína reduce la adhesión y la invasión de 
células de tumor mamario (Gapter et al., 2008). 
 
 
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 6 
2.5. N-acetil-cisteína 
 
 
La N-acetil-cisteína es una cisteína acetilada. Este antioxidante evita la 
apoptosis producida por diferentes tóxicos, sin embargo también es capaz de 
generar apoptosis. La N-acetil cisteína aporta una protección anti-oxidante 
intracelular, se le considera como “limpiador de radicales libres”, mantiene la 
función inmunitaria y posee propiedades anti-virales. 
 
La N-acetil-cisteína es efectiva eliminando OH•, H2O2 y ácido 
hipocloroso y en menos proporción inhibe al O2
•-. Un mecanismo importante de 
la N-acetil-cisteína es mantener el nivel de glutatión total en la célula (Aruoma 
et al., 1989). 
 
La N-acetil-cisteína es nefroprotectora ante la ciclosporina A (Duru et 
al., 2008) y el medio de contraste (Romano et al., 2008) en rata. La N-acetil-
cisteína protege al miocardio de rata y al pulmón de cerdo de la isquemia 
reperfusión (Abe et al., 2008). La N-acetil-cisteína protege de cirrosis al hígado 
rata con síndrome hepatopulmonar (Vercelino et al., 2008), de sobre dosis de 
acetaminofen (Terneus et al., 2008), de lipopolisacárido en ratón (Alipour et al., 
2007) y de rayos X en ratón (Liu et al., 2007). 
 
2.6. Curcumina 
 
 
El principio activo de la cúrcuma es el polifenol curcumina, responsable 
del color amarillo. La curcumina se extrae del rizoma de la Curcuma linn longa, 
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 7 
una hierba perenne muy cultivada en las regiones tropicales de Asia (Joshi et 
al., 2003). Existen al menos dos formas de la curcumina, ambas tautómeras: la 
ceto y la enol. La forma ceto se encuentra en estado sólido y la forma enol en 
estado líquido. 
 
Se emplea para teñir algodón, lana, seda, cuero, papel, lacas, barniz y 
ceras y como colorante en algunos alimentos como mantequilla, quesos, 
licores, productos de pastelería, etc. Los curcuminoides tienen un uso potencial 
como aditivo natural de comidas previniendo la oxidación y rancidez de aceites 
y grasas durante su almacenamiento y calentamiento (Míquel et al., 2002). 
 
En cosmética se ha aislado un compuesto de la cúrcuma llamado 
tetrahidrocurcuminoide (THC), que es una sustancia incolora con propiedades 
antioxidantes y puede tratar algunas inflamaciones de la piel (Nakamura et al., 
1998). 
 
La curcumina evita la peroxidación lipídica, atrapando al O2
•- y al OH•. 
Además se demostró que aumenta la actividad de las enzimas detoxificantes 
(las glutatión-S-transferasas) in vivo (Piper et al., 1998). En células epiteliales 
renales, la curcumina inhibe la peroxidación lipídica producida por el H2O2 
(Míquel et al., 2002). 
 
 
3. CROMO Y K2Cr2O7 
 
El cromo es un elemento que tiene múltiples estados de oxidación: Cr 
(VI), Cr (V), Cr (IV), Cr (III) y Cr (II); siendo el Cr (III) el estado más estable. El 
Cromo (III) es esencial para el metabolismo normal de la glucosa. El cromo (II, 
III, IV, V) puede reaccionar con peróxido para formar radical hidroxilo (OH•) 
(Halliwell y Gutteridge, 1999). 
Cr (V) + H2O2 → Cr (VI) + OH
- + OH• 
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 8 
El cromo es un metal pesado muy utilizado especialmente en las 
industrias metalúrgicas (cromado, galvanizado), en el curtido de pieles y en la 
preparación y uso de pinturas,esmaltes y tintas. 
 
Los trabajadores expuestos al cromo lo absorben principalmente por 
vía aérea, sin embargo es posible que lo absorban por piel o por ingestión. La 
cantidad de cromo que se absorbe y la velocidad de absorción por respiración 
varía enormemente dependiendo del estado fisicoquímico de las partículas 
inhaladas y de las condiciones de la mucosa bronquial y las membranas 
alveolares (Franchini et al., 1978). 
 
Una vez absorbido, el cromo se distribuye por los eritrocitos y las 
proteínas del plasma. En particular, el cromo hexavalente es transportado a 
diferentes órganos. Los órganos con mayor irrigación (pulmones, riñón, hígado, 
bazo) son los que más lo acumulan y en consecuencia son los mayormente 
afectados. El cromo es eliminado predominantemente a través de la orina; es 
casi completamente reabsorbido a nivel tubular y el porcentaje excretado es 
cerca del 1%. 
 
Los cromatos penetran a las células por el sistema de transporte de 
sulfatos y son bien conocidos por ser tóxicos, carcinogénicos y mutagénicos. El 
Cr (VI) puede ser reducido a Cr (V) por algún antioxidante como ascorbato, 
glutatión reducido, anión superóxido (O2
•-) y otros sistemas reductores 
celulares. 
 
El cromo del dicromato de potasio, una vez que entró a la célula es 
capaz de producir radical libres. Las células de hígado y de riñón lo acumulan y 
por tanto son afectadas por el estrés oxidativo. En el riñón ocasiona 
insuficiencia renal aguda, debido a que produce la disfuncionalidad y muerte de 
las células de túbulo proximal. 
 
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 9 
4- ESTRUCTURA Y FUNCIÓN RENAL 
 
Los riñones filtran el plasma a una tasa variable conforme a las 
necesidades del cuerpo. Las sustancias indeseables del filtrado (ingeridas o 
producidas en el metabolismo) son excretadas en la orina, en tanto que las 
sustancias que son necesarias retornan a la sangre. De igual forma, los riñones 
controlan el volumen y la composición electrolítica del líquido corporal (Guyton, 
2005). Como consecuencia de estas funciones, los riñones regulan el equilibrio 
ácido-base y la presión arterial. 
 
La nefrona constituye la unidad funcional del riñón. En el ser humano 
cada riñón contiene casi un millón de nefronas, cada una capaz de formar 
orina. El riñón no puede generar nuevas nefronas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Diagrama 1. La nefrona. G- glomérulo; TP- túbulo proximal; TD- túbulo 
distal; AH- Asa de Henle; TC- túbulo colector. 
 
 
 
 
G 
AH 
TP 
TD 
TC 
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 10 
Cada nefrona tiene dos componentes principales (Diagrama 1): 1) un 
glomérulo (capilares glomerulares) a través del cual se filtran grandes 
cantidades de líquido y moléculas procedentes de la sangre y 2) un túbulo en el 
cual el filtrado se convierte en orina en su camino hacia la pelvis del riñón 
(Guyton, 2005). 
 
En el túbulo se aprecian diferentes secciones: el túbulo proximal, asa 
de Henle, túbulo distal y túbulo colector. Estas secciones tienen morfología y 
funciones diferentes. 
 
El túbulo proximal lleva a cabo la reabsorción de la mayoría de los 
nutrientes y moléculas pequeñas del plasma. Debido a esta alta actividad es la 
sección del túbulo más sensible al daño funcional y estructural. 
 
 
5.- CONDICIONES PATOLÓGICAS DE LA FUNCIÓN RENAL 
 
La insuficiencia renal aguda (IRA) es un síndrome caracterizado por 
una rápida disminución de la filtración glomerular, lo que ocasiona la 
acumulación de productos finales del metabolismo, como por ejemplo los 
compuestos nitrogenados tales como urea y creatinina. La IRA es 
generalmente asintomática y se detecta al realizar un perfil bioquímico. 
 
La IRA está asociada con el aumento de la morbilidad y mortalidad 
intrahospitalaria debido a la severidad de su naturaleza de enfermedad oculta y 
la alta incidencia de complicaciones. La IRA se clasifica en tres categorías 
dependiendo de su origen: IRA pre-renal, IRA intrínseca e IRA post-renal. La 
IRA intrínseca es una enfermedad donde se ve comprometido el tejido renal y 
representa el 35 y el 40% de los casos de IRA. El 90% de los casos de IRA 
intrínseca son debidos a necrosis tubular aguda (NTA). 
 
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 11 
La NTA se caracteriza por la generación de una serie de alteraciones 
estructurales y moleculares de las células tubulares, tales como aparición de 
especies reactivas de oxígeno (Baud y Ardaillou, 1993; Rovin et al., 1990), 
pérdida del borde en cepillo, disminución o desaparición de los procesos de 
absorción y excreción, aparición de hipoxia, incremento de calcio citosólico, 
disfunción mitocondrial, descenso en los niveles de ATP y ADP, aumento de 
AMP, acidosis intracelular y abultamiento de las células epiteliales, que junto 
con restos necróticos de estas células, contribuye a la obstrucción tubular 
(Brenner, 2000; Sánchez, 1993). 
 
La NTA es causada por isquemia o tóxicos como antibióticos, 
anestésicos, medios de contraste, venenos, inmunosupresores, solventes 
orgánicos o metales pesados (Dishart y Kellum, 2000; Sánchez, 1993; Wedeen 
y Qian, 1991). 
ron Sci 14: 199-206. 
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 11 
II.- ANTECEDENTES EXPERIMENTALES 
 
En estudios histológicos de riñón de ratas tratadas con dicromato de 
potasio (K2Cr2O7), se observó un incremento en la vacuolización 
(extendiéndose progresivamente) y en necrosis celular (Barrera et al., 2003a). 
En un periodo más avanzado de lesión, hubo una desaparición de células 
epiteliales del túbulo proximal. Las células del túbulo distal no presentaron daño 
(Barrera et al. 2003b). En humanos, la exposición aguda a Cr (VI) produjo, 
necrosis aguda de los túbulos renales y lipoperoxidación (Franchini et al., 
1978). 
 
Debido a que el K2Cr2O7 produce daño renal, ha sido utilizado para 
establecer modelos en los que se ha estudiado la fisiopatología de la 
insuficiencia renal aguda. Aunque el mecanismo por el que el K2Cr2O7 produce 
toxicidad renal no se ha aclarado, se piensa que las ERO pueden estar 
involucradas. 
Xie y Zhuang (2001) observaron en cultivos celulares, que la 
generación de OH• en células tratadas con Cr (VI) estuvo involucrada en el 
daño de la membrana plasmática y de los organelos, lo que trae como 
consecuencia su disfunción. 
 
Algunos antioxidantes como ácido ascórbico, vitamina E, N-acetil 
cisteína, glutatión y S-alil cisteína previenen el daño renal inducido por K2Cr2O7 
(Appenroth y Winnefeld, 1998; Hojo y Satomi, 1991; Na et al., 1992; Standeven 
y Wetterhahn, 1989; Sugiyama, 1992; Kalayarasan et al., 2008), mientras que 
la inhibición de la biosíntesis de glutatión aumenta el daño renal (Standeven y 
Wetterhahn, 1989; Sugiyama, 1992). Por otro lado, se sabe que al reaccionar el 
anión cromato con el glutatión se puede formar Cr (III), el cual es un compuesto 
inocuo (Hojo y Satomi, 1991). 
Además de evidenciar la presencia de las ERO en el daño que induce 
el Cr (VI) (Sengupta et al., 1992; Liu y Shi, 2001; Stohs y Bachi, 1995), se 
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 12 
demostró indirectamente su presencia mediante la evaluación de la 
lipoperoxidación en el riñón (Huang et al., 1999). 
 
Recientemente en el laboratorio se encontró que en células de túbulo 
proximal de cerdo (LLC-PK1) expuestas a K2Cr2O7 producen O2
• −, H2O2, 
•OH, 
y 1O2 (Carranza, 2007). 
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 13 
HIPÓTESIS 
 
Si los antioxidantes reaccionan con los radicales libres que genera el 
dicromato de potasio entonces los antioxidantes serán capaces de prevenir o 
disminuir la toxicidad por dicromato de potasio en las células LLC-PK1. 
 
 
 
 
OBJETIVO GENERAL 
 
Determinar el efecto de los antioxidantes piruvato, N-acetil-cisteína, S-
alil-cisteína, glutatión, ácido ascórbico y curcumina, en la toxicidad por 
dicromato de potasio en células LLC-PK1. 
 
 
 
 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
1. Determinar la CL50 del dicromato de potasio en las células LLC- PK1. 
2.Evaluar la viabilidad de células LLC-PK1 expuestas al dicromato de potasio 
en combinación con los antioxidantes piruvato, N-acetil-cisteína, S-alil-
cisteína, glutatión, ácido ascórbico y curcumina. 
3. Medir el peroxinitrito presente en las células LLC-PK1 expuestas al 
dicromato de potasio en combinación con los antioxidantes piruvato, N-
acetil-cisteína, S-alil-cisteína, glutatión, ácido ascórbico y curcumina. 
 
 
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 14 
III. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
1. Reactivos. El dicromato de potasio y ácido acético al 96% (v/v) (JT Baker, 
México). Medio Dubelco’s Eagle Modificado (DMEM), suero fetal bovino (SFB) 
certificado y tripsina-EDTA 0.25% (Gibco, EUA). Piruvato, S-alil cisteína, N-
acetil cisteína, glutatión, ácido ascórbico, curcumina, glutaraldehído 25% v/v, 
cristal violeta, bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tetrazolio (MTT), 
ácido clorhídrico y dihidrorodamina 123 (Sigma Chemical Co, EUA). 
 
2. Línea celular. Se utilizó una línea comercial de células de túbulo proximal de 
cerdo, LLC-PK1 (ATCC, EUA). Las células se mantuvieron congeladas en 
nitrógeno líquido, para su preservación. El manejo de las células se llevó a 
cabo en un gabinete de seguridad biológica (Clase II Tipo A/B3, Nuaire) en 
donde se mantienen condiciones de esterilidad. 
 
Las células se descongelaron rápidamente, sumergiendo el vial en un 
baño maría (Serie 180, Precision) a 37°C. Se lavaron con 10 mL de medio 
DMEM suplementado con SFB al 10% (DMEM/SFB 10%) y se centrifugaron 
por 3 min a 1000 rpm en una centrífuga EBA20 (Hettich). Se desechó el 
sobrenadante, se resuspendieron en 5 mL de DMEM/SFB 10% y se sembraron 
aproximadamente 1 millón de células en una botella de cultivo. Las botellas se 
mantuvieron en una incubadora de CO2, RM130005-9-ABA (Revco Termo 
Electrón Corporation) a 37°C con atmósfera de CO2 al 5%. Luego de 48 h, las 
células se tripsinizaron. 
 
La tripsinización celular se realizó para despegar las células de la caja. 
Para lo cual se eliminó el medio y se lavaron las células dos veces con 2 mL de 
amortiguador de fosfatos (PBS pH 7.4). Después se adicionó 1 mL de tripsina 
al 0.25% y se dejó actuar por 3 min. Las células se observaron en un 
microscopio invertido (TMS, Nikon) para verificar que se despegaran. Las 
células se colectaron en un tubo de centrífuga y la acción de la tripsina se 
Neevia docConverter 5.1
 15 
detuvo adicionando 1 mL de DMEM/SFB 10%. Las células se centrifugaron por 
3 min a 1000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron en 5 mL de 
DMEM/SFB 10%. Las células se contaron en un hematocitómetro. Se 
sembraron 15 000 células en cada pozo de cajas de 96 pozos. Luego de 24 h, 
las células llegaron a la confluencia y se realizó el ensayo correspondiente. 
 
3. Medición de la viabilidad celular por reducción de MTT. El MTT es 
reducido por el sistema deshidrogenasas a formazán de MTT (1-[4,5-
dimetiltiazol-2-il]-3,5-difenilformazán) en las mitocondrias de células vivas. El 
MTT es de color amarillo y soluble en agua mientras que su forma reducida, 
formazán de MTT, es de color púrpura e insoluble en agua. 
 
Cuatro horas antes de que concluyera el tratamiento correspondiente, 
se adicionó MTT a las células, a una concentración final de 0.2 mg/mL. Una 
vez terminado el tiempo de incubación, se lavaron las células con 100 µL de 
PBS para eliminar el MTT no reducido. El formazán de MTT contenido en las 
células se disolvió en una solución de isopropanol ácido (HCl 0.1 N en 
isopropanol). La concentración de formazán de MTT es proporcional al número 
de células vivas. Se midió espectrofotométricamente la absorbancia a 570 nm 
(MTT y formazán) y 630 nm (MTT) en un lector de microplacas (EL-311, Bio-
Tek Instruments). Se obtuvo la diferencia de las absorbancias y se calculó el 
porcentaje de viabilidad tomando la del grupo control como el 100%. 
 
4. Medición de la viabilidad celular por tinción con cristal violeta. El cristal 
violeta es un colorante que se une inespecíficamente a las proteínas y existe 
una relación directa entre la cantidad de proteína y el número de células 
presentes. 
 
Una vez terminado el tratamiento a las células, se eliminó el medio de 
cultivo de los pozos y se lavaron con 100 µL de amortiguador de fosfatos para 
eliminar las células muertas. Las células se fijaron con 50 µL de glutaraldehído 
Neevia docConverter 5.1
 16 
al 1.1%, durante 15 min y se eliminó el glutaraldehído. Se tiñeron con 50 µL de 
cristal violeta al 0.4% durante 15 min y se eliminó la solución del colorante. Se 
lavaron las células con agua corriente hasta que el agua quedó clara. Se 
dejaron secar al aire libre y se adicionó ácido acético 50 µL al 10% para 
disolver el colorante. Se determinó la absorbancia a 595 nm en un lector de 
microplacas. 
 
5. Medición del peroxinitrito por oxidación de dihidro-rodamina. El 
peroxinitrito oxida a la dihidro-rodamina 123 a rodamina. La dihidro-rodamina 
no absorbe a 500 nm pero la rodamina sí absorbe (Haddad et al., 1994). 
 
Al término del ensayo, las células se lavaron 2 veces con PBS. Se le 
adicionó una solución de dihidro-rodamina 123 50 µM en PBS y se incubó por 3 
h a 37°C. Se determinó la absorbancia a 500 nm en un lector de microplacas y 
se calculó la cantidad de peroxinitrito, utilizando su coeficiente de extinción 
molar (εm=78000 M
-1 cm-1). 
 
6. Análisis estadístico. Se graficaron los promedios +/- el error estándar de la 
media (EEM). Se analizaron los datos con análisis de varianza (ANOVA) y un 
post-análisis múltiple de Bonferroni, usando el programa Graph Pad Prism 
version 3.00 para Windows. 
 
7. Diseño experimental. 
 
7.1. Modelo de toxicidad por K2Cr2O7. Las células se sembraron en cajas de 
96 pozos y después de llegar a la confluencia (usualmente 24 h después), se 
incubaron con soluciones de diferentes concentraciones de K2Cr2O7 (0, 0.25, 
0.5, 0.75, 1, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 5000 µM) por 24 h. Las 
soluciones de K2Cr2O7 se prepararon en DMEM/SFB 1%. Se midió la viabilidad 
celular por dos métodos: tinción por cristal violeta y reducción de MTT. Se 
calculó el porcentaje (%) de viabilidad celular, donde el promedio de las 
Neevia docConverter 5.1
 17 
absorbancias del grupo control representa el 100%. Se graficó el logaritmo de 
la concentración contra el promedio de los porcentajes de viabilidad. Se calculó 
la concentración letal 50 (CL50), la cual se utilizó en ensayos subsecuentes. 
 
7.2. Ensayos con antioxidantes. Las células se sembraron en cajas de 96 
pozos. 24 h después alcanzaron la confluencia y se realizaron los ensayos. Los 
grupos correspondientes se preincubaron con antioxidante por 6 h, después se 
eliminaron dichas soluciones y se adicionaron soluciones de antioxidante o 
K2Cr2O7 por separado o en combinación, dependiendo del grupo. Todas las 
soluciones se prepararon en DMEM/SFB 1%. Después de 24 h de incubación 
con el K2Cr2O7, el ensayo se detuvo y se tomaron fotos representativas de 
cada grupo, se midió la viabilidad con la técnica de cristal violeta a 595 nm o se 
midió la cantidad de peroxinitrito presente con el método de oxidación de 
dihidro-rodamina. Los ensayos se realizaron con una n de 3 y se repitieron al 
menos en 3 ocasiones. Las gráficas se realizaron con los promedios de todos 
los ensayos. Los antioxidantes utilizados fueron: piruvato (PIR) [1, 0.1 mM], S-
alil-cisteína (SAC) [20, 2 mM], N-acetil-cisteína (NAC) [10, 1 mM], glutatión 
(GSH) [20, 2 mM], ácido ascórbico (ASC) [2, 0.2 mM], curcumina (CUR) [0.01, 
0.001 mM]. Los grupos fueron los siguientes, para cada concentración de 
antioxidante. 
 
 
1.- Control: medio DMEM/SFB 1% por 24 h. 
2.- K2Cr2O7 incubado por 24 h. 
3.- Antioxidante preincubado 6 h; medio DMEM/SFB 1% 24 h. 
4.- Antioxidante preincubado 6 h; antioxidante incubado 24 h. 
5.- Antioxidante preincubado 6 h; K2Cr2O7 incubado 24 h. 
6.- Antioxidante preincubado6 h; antioxidante + K2Cr2O7 incubado 24 h. 
7.- Antioxidante + K2Cr2O7 incubado 24 h. 
 
 
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 18 
IV. RESULTADOS 
 
 
La curva dosis-respuesta describe la toxicidad del K2Cr2O7 en las 
células LLC-PK1 (Fig. 1). Se utilizaron dos métodos para determinar la 
viabilidad, por reducción MTT y tinción con cristal violeta. Se observó un 
comportamiento semejante con ambos métodos, sin embargo con el método de 
MTT se observaron valores con mayor variabilidad alrededor de la viabilidad al 
50%. Se decidió utilizar el método de cristal violeta para los subsecuentes 
experimentos. 
 
La CL50 para el K2Cr2O7 en células LLC-PK1 fue de 40 µM; esta 
concentración se utilizó en ensayos subsecuentes. 
 
 
 
-1 0 1 2 3 4
-10
10
30
50
70
90
110
MTT
CV
MTT
CV
Log [µµµµM]
V
ia
bi
lid
ad
%
 
Figura 1. Toxicidad por K2Cr2O7 en células LLC-PK1. Viabilidad medida por reducción 
de MTT y tinción con cristal violeta (CV). Prom±E.E.M. n=9. 
 
 
 
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 19 
Las fotografías tomadas mostraron que las células en el grupo control 
(grupo: 1 [medio DMEM/SFB 1% por 24 h]) no presentaron ninguna alteración 
(Fig. 2). Lo mismo pasó con todos los grupos preincubados o no y luego 
incubados con antioxidante por 24 h (grupos: 3 [Antioxidante preincubado 6 h; 
medio DMEM/SFB 1% 24 h] y 4 [Antioxidante preincubado 6 h; antioxidante 
incubado 24 h]). En el grupo con K2Cr2O7 (grupo: 2 [K2Cr2O7 incubado por 24 
h]) se observó una disminución en la cantidad de células pegadas, muchas 
células se estaban despegando y tenían formas y tamaños variados. En 
muchas células pegadas o en proceso de despegarse se observaron vacuolas 
(Fig. 2). 
 
La cantidad de células pegadas fue menor en los grupos en donde se 
preincubó o no con NAC o GSH y luego se coincubó con antioxidante y 
K2Cr2O7 (grupos: 6 [NAC o GSH preincubado 6 h; NAC o GSH + K2Cr2O7 
incubado 24 h] y 7 [NAC o GSH + K2Cr2O7 incubado 24 h]). En los grupos 
tratados con la concentración mayor de antioxidante (NAC 10 mM o GSH 20 
mM) se observó una cantidad de células pegadas más parecida al grupo 
control. El número de células muertas en el grupo donde se preincubó con NAC 
o GSH y luego se incubó con K2Cr2O7 (grupo: 5 [NAC o GSH preincubado 6 h; 
K2Cr2O7 incubado 24 h]) fue semejante al grupo de K2Cr2O7. Esto sucedió con 
las dos concentraciones de antioxidantes que fueron evaluadas. En la figura 2 
se muestran las fotografías representativas de los grupos de GSH 20 mM. 
 
La cantidad de células pegadas fue menor en los grupos en donde se 
preincubó o no con SAC o PIR y luego se coincubó con antioxidante y K2Cr2O7 
(grupos: 6 [SAC o PIR preincubado 6 h; SAC o PIR + K2Cr2O7 incubado 24 h] y 
7 [SAC o PIR + K2Cr2O7 incubado 24 h]). El número de células muertas en el 
grupo donde se preincubó con SAC o PIR y luego se incubó con K2Cr2O7 
(grupo: 5 [SAC o PIR preincubado 6 h; K2Cr2O7 incubado 24 h]) es semejante al 
grupo de K2Cr2O7. Esto sucedió con las dos concentraciones de antioxidantes 
Neevia docConverter 5.1
 20 
que fueron evaluadas. En la figura 2 se muestran las fotografías 
representativas de los grupos de PIR 1 mM. 
 
 
 
 
(VER PÁGINA SIGUIENTE) 
Figura 2. Efecto de antioxidantes en la toxicidad por K2Cr2O7 en células LLC-PK1. 
Fotos representativas de las células LLC-PK1 examinadas con un microscópio 
invertido. 400X. Panel superior: Fotos de los grupos control (medio DMEM/SFB 1% por 
24 h), K2Cr2O7 (incubado por 24 h), N-acetil-cisteína (NAC), S-alil-cisteína (SAC) y 
curcumina (CUR) (antioxidante preincubado 6 h; medio DMEM/SFB 1% 24 h). Panel 
inferior: Fotos representativas del efecto del glutatión (GSH), piruvato (PIR) y ácido 
ascórbico (ASC) en la toxicidad por K2Cr2O7. A- Antioxidante preincubado 6 h y medio 
DMEM/SFB 1% 24 h; B- Antioxidante preincubado 6 h y antioxidante incubado 24 h; C- 
Antioxidante preincubado 6 h y K2Cr2O7 incubado 24 h; D- Antioxidante preincubado 6 
h; antioxidante + K2Cr2O7 incubado 24 h; E- Antioxidante + K2Cr2O7 incubado 24 h. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 21 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Control K2Cr2O7 NAC 10 mM SAC 20 mM CUR 10 µM 
A C B D E 
G
S
H
 2
0m
M
 
P
IR
 1
 m
M
 
A
S
C
 2
 m
M
 
E 
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 22 
La cantidad de células pegadas en todos los grupos con CUR o ASC y 
K2Cr2O7 (grupos: 5 [CUR o ASC preincubado 6 h; K2Cr2O7 incubado 24 h], 6 
[CUR o ASC preincubado 6 h; CUR o ASC + K2Cr2O7 incubado 24 h] y 7 [CUR 
o ASC + K2Cr2O7 incubado 24 h]) fue semejante al grupo con K2Cr2O7. En la 
figura 2 se muestran las fotografías representativas de los grupos de ASC 2 
mM. 
 
En todos los ensayos donde se evaluó la viabilidad, las células control 
representan el 100% (grupo: 1 [medio DMEM/SFB 1% por 24 h]). Las células 
tratadas con K2Cr2O7 (grupo: 2 [K2Cr2O7 incubado por 24 h]) presentaron el 
50% de viabilidad respecto al control, en todos los ensayos. Los grupos donde 
se preincubó o no con antioxidante (NAC, GSH, SAC, PIR, CUR o ASC) y 
luego se incubó con antioxidante por 24 h (grupos: 3 [Antioxidante preincubado 
6 h; medio DMEM/SFB 1% 24 h] y 4 [Antioxidante preincubado 6 h; 
antioxidante incubado 24 h]) presentaron una viabilidad igual al control en todos 
los ensayos. 
 
La NAC 1 mM y GSH 2 mM protegieron parcialmente y la NAC 10 mM 
y GSH 20 mM protegieron totalmente a las células LLC-PK1 de la toxicidad 
producida por el K2Cr2O7 cuando se preincubaron o no con el antioxidante y 
luego fueron coincubadas con antioxidante y K2Cr2O7 (grupos: 6 [NAC o GSH 
preincubado 6 h; NAC o GSH + K2Cr2O7 incubado 24 h] y 7 [NAC o GSH + 
K2Cr2O7 incubado 24 h]). La NAC y el GSH no evitaron la toxicidad por el 
K2Cr2O7 cuando se preincubó con el antioxidante y luego se incubó con 
K2Cr2O7 (grupo: 5.- [NAC o GSH preincubado 6 h; K2Cr2O7 incubado 24 h]). 
Esto sucedió con las dos concentraciones de antioxidantes que fueron 
evaluadas (Fig. 3). 
 
 
 
 
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0
50
100
150
NAC 10 mM NAC 1mM
# # # #
# # #
* * *
#,*
#,*
NAC 6h - - + +
NAC 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
V
ia
bi
lid
ad
%
 
0
50
100
150
GSH 6h - - + +
GSH 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
GSH 2 mMGSH 20 mM
*
*
*
#,* #,*
#
#
# # #
# #
V
ia
bi
lid
ad
%
 
Figura 3. Efecto de la N-acetil-cisteína [NAC] (A) y del glutatión [GSH] (B) en la 
toxicidad por K2Cr2O7 en células LLC-PK1. Prom±E.E.M. n=9. ANOVA P<0.001 y post-
análisis de Bonferroni. *P<0.001 vs grupo control, #P<0.001 vs grupo de K2Cr2O7. 
 
 
 
 
A 
B 
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 24 
 
 
 
La SAC y el PIR protegieron parcialmente a las células LLC-PK1 del 
K2Cr2O7 cuando se preincubaron o no con el antioxidante y luego fueron 
coincubadas con antioxidante y K2Cr2O7 (grupos: 6 [SAC o PIR preincubado 6 
h; SAC o PIR + K2Cr2O7 incubado 24 h] y 7 [SAC o PIR + K2Cr2O7 incubado 24 
h]). La SAC y el PIR no evitaron la toxicidad por el K2Cr2O7 (grupo: 5 [SAC o 
PIR preincubado 6 h; K2Cr2O7 incubado 24 h]). Esto sucedió con las dos 
concentraciones de antioxidantes que fueron evaluadas (Fig. 4). 
 
La CUR protegió parcialmente a las células LLC-PK1 del K2Cr2O7 
cuando fueron coincubadas con CUR 10 µM y K2Cr2O7 (grupo: 7 [CUR + 
K2Cr2O7 incubado 24 h]), pero no protegió preincubando con antioxidante y 
luego coincubando con CUR y K2Cr2O7 (grupo: 6 [CUR preincubado 6 h; CUR + 
K2Cr2O7 incubado 24 h]). La CUR no previno la toxicidad por el K2Cr2O7 con 
ninguna de las dos concentraciones evaluadas (grupo: 5 [CUR preincubado 6 
h; K2Cr2O7 incubado 24 h]) (Fig. 5A). 
 
El ASC no evitó ni protegió a las célulasLLC-PK1 de la toxicidad por 
K2Cr2O7 (grupos: 5 [ASC preincubado 6 h; K2Cr2O7 incubado 24 h], 6 [ASC 
preincubado 6 h; ASC + K2Cr2O7 incubado 24 h] y 7 [ASC + K2Cr2O7 incubado 
24 h]) (Fig. 5B). 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 25 
0
50
100
150
SAC 6h - - + +
SAC 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
SAC 20 mM SAC 2 mM
# # # # #
* * *
#,*
#,*
#,*
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
#
V
ia
bi
lid
ad
%
 
 
0
50
100
150
PIR 0,1mMPIR 1mM
* * *
# # # #
#,* #,*
#,* #,*
#
PIR 6h - - + +
PIR 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
V
ia
bi
lid
ad
%
 
Figura 4. Efecto de la S-alil-cisteína [SAC] (A) y del piruvato [PIR] (B) en la toxicidad 
por K2Cr2O7 en células LLC-PK1. Prom±E.E.M. n=9. ANOVA P<0.001 y post-análisis 
de Bonferroni. *P<0.001 vs grupo control, #P<0.001 vs grupo de K2Cr2O7. 
 
 
 
 
A 
B 
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 26 
0
50
100
150
CUR 1 µµµµMCUR 10 µµµµM
#
# #
#
*
*
*
* * *
#,*
#
CUR 6h - - + +
CUR 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
V
ia
bi
lid
ad
%
 
0
50
100
150
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
ASC 0.2 mMASC 2 mM
* * *
#
# # #
#
* * **
ASC 6h - - + +
ASC 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
V
ia
bi
lid
ad
%
 
Figura 5. Efecto de la curcumina [CUR] (A) y del ácido ascórbico [ASC] (B) en la 
toxicidad por K2Cr2O7 en células LLC-PK1. Prom±E.E.M. n=9. ANOVA P<0.001 y post-
análisis de Bonferroni. *P<0.001 vs grupo control, #P<0.001 vs grupo de K2Cr2O7. 
 
 
 
A 
B 
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 27 
 
 
El peroxinitrito se evaluó como un marcador de estrés oxidativo. El 
peroxinitrito presente en el grupo control tuvo una concentración de 1 µM, y 
aumentó al doble en el grupo con K2Cr2O7. Los grupos preincubados o no y 
luego incubados con antioxidante por 24 h (grupos: 3 [Antioxidante preincubado 
6 h; medio DMEM/SFB 1% 24 h] y 4 [Antioxidante preincubado 6 h; 
antioxidante incubado 24 h]) presentaron un ligero aumento del peroxinitrito con 
respecto al grupo control. Esto ocurrió con todos los antioxidantes evaluados 
(NAC, GSH, SAC, PIR, CUR y ASC). 
 
La SAC (Fig. 7A) y el GSH (Fig. 6B) evitaron (grupo: 5 [SAC o GSH 
preincubado 6 h; K2Cr2O7 incubado 24 h]) y protegieron parcialmente (grupos: 6 
[SAC o GSH preincubado 6 h; SAC o GSH + K2Cr2O7 incubado 24 h] y 7 [SAC 
o GSH + K2Cr2O7 incubado 24 h]) de la formación de peroxinitrito. 
 
La NAC 10 mM (Fig. 6A), la CUR 10 µM (Fig. 8A) y el ASC 2 mM (Fig. 
8B) también previnieron y protegieron parcialmente (grupo: 5 [NAC o CUR o 
ASC preincubado 6 h; K2Cr2O7 incubado 24 h], 6 [NAC o CUR o ASC 
preincubado 6 h; antioxidante + K2Cr2O7 incubado 24 h] y 7 [NAC o CUR o ASC 
+ K2Cr2O7 incubado 24 h]) de la formación de peroxinitrito. 
 
El PIR 1 mM evitó (grupo: 5 [PIR preincubado 6 h; K2Cr2O7 incubado 
24 h]) y protegió parcialmente de la formación de peroxinitrito, pero sólo cuando 
se preincubó con el antioxidante y luego se coincubó con el PIR y el K2Cr2O7 
(grupo: 6 [PIR preincubado 6 h; antioxidante + K2Cr2O7 incubado 24 h]) (Fig. 
7B). 
 
 
 
 
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0
1
2
3
NAC 10 mM NAC 1mM
NAC 6h - - + +
NAC 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
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#
#,*
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#,*
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+ + - + + + + -
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in
it
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µ
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1
2
3
GSH 6h - - + +
GSH 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
GSH 2 mMGSH 20 mM
*
#
#,*
#,*
#,*
#,*
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#,*
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#,*
P
er
ox
in
it
ri
to
µ
M
 
Figura 6. Efecto de la N-acetil-cisteína [NAC] (A) y del glutatión [GSH] (B) en la 
producción de peroxinitrito en la toxicidad por K2Cr2O7 en células LLC-PK1. 
Prom±E.E.M. n=9. ANOVA P<0.001 y post-análisis de Bonferroni. *P<0.01 vs grupo 
control, #P<0.001 vs grupo de K2Cr2O7. 
 
 
 
A 
B 
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0
1
2
3
SAC 6h - - + +
SAC 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
SAC 20 mM SAC 2 mM
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
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µ
M
 
0
1
2
3
PIR 6h - - + +
PIR 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
PIR 0,1mMPIR 1mM
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#,*
#,*#,*
*
*
#,*
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
P
er
ox
in
it
ri
to
µ
M
 
Figura 7. Efecto de la S-alil-cisteína [SAC] (A) y del piruvato [PIR] (B) en la producción 
de peroxinitrito en la toxicidad por K2Cr2O7 en células LLC-PK1. Prom±E.E.M. n=9. 
ANOVA P<0.001 y post-análisis de Bonferroni. *P<0.01 vs grupo control, #P<0.001 vs 
grupo de K2Cr2O7. 
 
 
A 
B 
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 30 
0
1
2
3
CUR 6h - - + +
CUR 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
CUR 1 µµµµMCUR 10 µµµµM
*
#
#,*
*
#
#,*
#,*#,*
#,*
#,*
#,*#,*
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
P
er
o
xi
n
it
ri
to
µ
M
 
0
1
2
3
ASC 6h - - + +
ASC 24 h - - - +
K2Cr2O7 24 h - + - -
+ + - + + + + -
- + + - + - + +
+ + + - - + + +
ASC 0.2 mMASC 2 mM
*
#
#,*
*
#,*
#,*#,*
#,*#,*
#,*
#,*
#,*
P
er
ox
in
it
ri
to
µ
M
 
Figura 8. Efecto de la curcumina [CUR] (A) y del ácido ascórbico [ASC] (B) en la 
producción de peroxinitrito en la toxicidad por K2Cr2O7 en células LLC-PK1. 
Prom±E.E.M. n=9. ANOVA P<0.001 y post-análisis de Bonferroni. *P<0.001 vs grupo 
control, #P<0.001 vs grupo de K2Cr2O7. 
 
 
V. DISCUSIÓN 
A 
B 
Neevia docConverter 5.1
 31 
 
En este trabajo se utilizaron células LLC-PK1; ésta es una línea celular 
comercial de túbulo proximal renal de cerdo. El túbulo proximal es la estructura 
renal que se ve dañada funcional y/o estructuralmente durante la mayoría de 
los tipos de insuficiencia renal aguda. El daño que se genera en la mayoría de 
las nefropatías es debido a la presencia de estrés oxidativo que las ERO 
producen. Sin embargo no cualquier antioxidante es capaz de evitar o revertir 
el daño observado. Por tal motivo es necesario caracterizar el tipo de radicales 
que se producen y los antioxidantes que podrían ser eficaces en prevenir el 
daño. 
 
Existe una amplia variedad de moléculas que tienen propiedad 
antioxidante. Dicha propiedad es debida a su capacidad de reaccionar con 
especies reactivas o pro-oxidantes, lo cual evita o disminuye el daño que las 
especies reactivas producen. La reacción química que se lleva a cabo entre los 
antioxidantes y los radicales libres forma especies no reactivas. Es decir los 
antioxidantes seden protones a la estructura química del radical evitando que 
este reaccione con biomoléculas. Por ejemplo, el ácido ascórbico reacciona 
con el radical hidroxilo, generando radical ascorbato y agua (ver pagina 2). 
 
En este estudio, se utilizaron antioxidantes ampliamente estudiados y 
otros que recientemente se inicio su caracterización. El glutatión (Na KJ, et al. 
1992), la N-acetil-cisteína (Banner, et al. 1986) y el ácido ascórbico (Appenroth 
D, et al. 1998) son antioxidantes que se han probado en modelos de 
nefrotoxicidad en rata. La S-alil-cisteína (Chung LY. 2006), la curcumina 
(Miquel J, et al. 2002)y el ácido ascórbico son compuestos exógenos que se 
ha demostrado que tienen gran actividad antioxidante. El piruvato (Salahudeen 
AK, et al. 1991), glutatión y N-acetil-cisteína son antioxidantes endógenos, cuya 
presencia es susceptible a ser modificada por factores internos y externos a la 
célula. 
 
Neevia docConverter 5.1
 32 
El modelo de toxicidad con K2Cr2O7 en células se diseñó a partir del 
estudio en ratas, realizado por Barrera y colaboradores (2003a). En dicho 
trabajo, se observó que el máximo daño se presentó a las 24 h después de la 
administración del K2Cr2O7. A este tiempo de estudio el 50% de las células de 
túbulo proximal se encontraban con necrosis. Por tanto el tiempo de exposición 
elegido fue de 24 h. La concentración de K2Cr2O7 seleccionada fue la que 
produjo 50% de muerte celular, por tanto se determinó la CL50 a 24 h de 
exposición. 
 
Se decidió utilizar el método de cristal violeta debido a que presentaba 
menor variabilidad en las lecturas obtenidas. En el método de MTT, éste es 
reducido por los radicales que se forman normalmente durante el transporte de 
electrones en la mitocondria. La variabilidad en los resultados que se presentó 
al utilizar este método, probablemente se deba a que los radicales formados 
por el K2Cr2O7 (Carranza 2007; Xie Y y Zhuang ZX. 2001) reaccionaron con el 
MTT. El método de cristal violeta tiñe inespecíficamente a todas las proteínas 
de la célula. Las células vivas se mantienen pegadas y mediante lavados 
garantizamos que las células muertas no se encuentren cuando se fijen. Por 
tanto este método es más confiable para medir la viabilidad en modelos en los 
que la producción de especies reactivas esta presente, lo cual ocurre en la 
toxicidad por K2Cr2O7. 
 
La condición experimental donde se preincuba con antioxidante y 
posteriormente se exponen las células a K2Cr2O7 fue diseñada para determinar 
si el antioxidante podía evitar el daño. En todos estos casos, se observó que 
ninguno de los antioxidantes probados (solamente preincubando) fueron 
capaces de evitar la toxicidad por el K2Cr2O7. 
 
Los antioxidantes que son capaces de proteger, lo hacen al coincubar 
el antioxidante y el K2Cr2O7 Esta protección es independientemente de la 
preincubación con el antioxidante y posteriormente la coincubación. El intentar 
Neevia docConverter 5.1
 33 
pre-cargar a las células con antioxidante no funciona, lo que correlaciona con la 
falta de prevención cuando solo preincubamos y exponemos las células al 
K2Cr2O7. 
 
En nuestro laboratorio se demostró que se generan ERO en el medio 
de incubación en presencia de K2Cr2O7, aun en ausencia de las células 
(Carranza, 2007). Probablemente los antioxidantes reaccionan con los 
radicales que se generan en el medio de cultivo y de esta forma impiden que 
lleguen a dañar a las células. Esto explicaría por qué para proteger, los 
antioxidantes necesitan estar presentes cuando el K2Cr2O7 genera el daño. 
 
La N-acetil cisteína, el glutatión, la S-alil cisteína, el piruvato y la 
curcumina fueron capaces de conferir protección dependiente de su 
concentración. 
 
La N-acetil cisteína 10 mM y el glutatión 20 mM evitaron totalmente la 
muerte celular por el K2Cr2O7. Esto sugiere una importante participación de 
H2O2 y OH
• en la toxicidad. Sin embargo la N-acetil cisteína y el glutatión no 
fueron capaces de disminuir totalmente la producción de peroxinitrito. La N-
acetil cisteína es el precursor del glutatión, siendo posible que ésta sea la 
forma en que confiere la protección la N-acetil cisteína. 
 
La S-alil cisteína y el piruvato generaron una protección parcial, al igual 
que la curcumina 10 µM. Estos resultados confirman la participación de H2O2 y 
OH•. Sin embargo, al no producir una protección total como la N-acetil cisteína 
y el glutatión sugiere que estos antioxidantes tienen un mecanismo adicional 
para evitar la muerte celular. Por otro lado podría deberse a que la S-alil 
cisteína y el piruvato no son capaces de reacción con todas las moléculas de 
H2O2 y OH
• formadas. 
 
Neevia docConverter 5.1
 34 
El ácido ascórbico no confirió ningún beneficio en las condiciones de 
nuestro modelo experimental. Está documentado que el ácido ascórbico es 
capaz de formar radicales más reactivos que las ERO (Standeven y 
Wetterhahn, 1989; Sugiyama, 1992). Esto podría explicar que no se presente 
protección a pesar de la disminución de la producción de peroxinitrito. 
 
Todos los antioxidantes utilizados en nuestro modelo de toxicidad por 
K2Cr2O7 son capaces de disminuir la producción de peroxinitrito y por tanto el 
estrés oxidativo presente es menor. Sin embargo, el estrés oxidativo no es el 
único factor que produce la muerte en la toxicidad por K2Cr2O7. 
 
Se ha observado que otros factores que contribuyen a la muerte 
celular son la disfuncionalidad de enzimas, el daño a DNA y la disminución de 
la producción de ATP. Estos factores también son capaces de producir estrés 
oxidativo y el estrés oxidativo es capaz de producir disfuncionalidad celular 
(Brenner BM. 2000). Por tanto se requieren más estudios para determinar los 
factores que contribuyen a la toxicidad por K2Cr2O7 en el túbulo proximal renal. 
 
Neevia docConverter 5.1
 34 
VI. CONCLUSIONES 
 
Los antioxidantes que protegen parcial o totalmente de la toxicidad por 
K2Cr2O7, lo hacen sólo cuando se exponen al mismo tiempo que el 
K2Cr2O7. 
El ácido ascórbico no protege. 
La S-alil cisteína, el piruvato y la curcumina presentan un efecto protector 
parcial. 
La N-acetil cisteína y el glutatión generan un efecto protector total. 
Todos los antioxidantes estudiados son capaces de disminuir parcialmente los 
niveles del peroxinitrito. 
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 35 
INDICE DE ABREVIATURAS 
 
ASC Ácido ascórbico 
ADP Adenosin-di-fosfato 
AMP Adenosin-mono-fosfato 
ATP Adenosin-tri- fosfato 
ANOVA Análisis de Varianza 
MTT Bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tretazolio 
PBS Amortiguador Salino de Fosfatos 
CL50 Concentración letal media 
CUR Curcumina 
EEM Error estándar de la media 
ERO Especies Reactivas de Oxígeno 
GSH Glutatión 
IRA Insuficiencia renal aguda 
LLC-PK1 Línea celular de túbulo proximal de riñón de cerdo (Line 
Cells - Pig Kidney-1) 
DMEM Dubelco’s Medio Eagle Modificado 
NAC N-acetil-cisteína 
NTA Necrosis tubular aguda 
PIR Piruvato 
SAC S-alil-cisteína 
SFB Suero Fetal Bovino 
 
 
 
 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
 36 
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Neevia docConverter 5.1
	Portada
	Índice
	I. Introducción
	II. Antecedentes Experimentales
	III. Materiales y Métodos
	IV. Resultados
	V. Discusión
	VI. Conclusiones
	Índice de Abreviaturas
	VII. Bibliografía