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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA 
DE MEXICO 
FACULTAD DE QUIMICA 
ESTUDIO DE ULTRASONIDO Y METODOS 
CONVENCIONALES SOBRE LA EXTRACClON DE LlMONIN 
A PARTIR DE SEMILLAS DE LlMON MEXICANO 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: 
QUIMICA DE ALIMENTOS 
P R E S E N T A 
SUSANA K A JI 
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C:t:~'~r-
GARCIA 
(.AA~U:NES PROf\ SIONAlES 
MEXICO,D.F. fACULTAD DE QULM&CA 2005 
 
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JURADO ASIGNADO: 
Presidente 
Vocal 
Secretario 
ler. Suplente 
2°. Suplente 
Prof. Ma. De los Ángeles Valdivia López 
Prof. Arturo Navarro Ocaña 
Prof. Juan Diego Ortiz Palma Pérez 
Prof. Julieta Sandoval Guillén 
Prof. Enrique Martínez Manrique 
Sitio en donde se desarrolló el tema: 
Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Química, 
Departamento de Alimentos y Biotecnología, 
Lab322-323. 
) 
ASESOR DEL TEMA: 
M~:\e los Ángeles ValdMa Lópe, 
SUPERVISOR TÉNICO: 
I 
\...-
~ 
Dr. Aruro Navarro Ocaña 
SUSTENTANTE: s!2t.2 
AGRADECIMIENTOS 
A la M. C. Ángeles Valdivia, por darme la oportunidad de formar parte de su 
equipo de trabajo y brindarme su confianza y apoyo. 
Al Dr. Arturo Navarro por todo su apoyo, interés y valiosos consejos durante el 
desarrollo de este proyecto. 
A Q. Georgina Duarte y Margarita Guzmán, por su ayuda en los análisis de 
RMN y EM. 
A la UNAM, por todo lo aprendido dentro y fuera de las aulas. 
DEDICATORIAS 
A mis papás, a los cuales no tengo palabras para agradecerles su apoyo 
incondicional, su confianza, amor y paciencia. No saben cuanto los admiro y 
amo. 
A mis hermanos, por siempre estar ahí. A Maru por ser mi mejor amiga y 
cómplice. A Alex, por ser un gran ejemplo. Los quiero mucho! 
A mis abuelos y tíos, por alentarme a lo largo de mi vida. 
A todos mis primos, por su cariño. Son una gran inspiración. 
A Ana, Juan y Roberto, por su amistad incondicional y porque siempre puedo 
cuentar con uds. 
A Adriana, Laura, Eli y Diana, por todos los buenos momentos. 
A Iara, Adriana, Angel, Toño, Milet, Jorge, Ale, Gisela, Magas, Gaby S., Gaby 
A., Ingrid, Licha, Checo, Carlos, Ernesto S. y Ernesto N., Yasser, Javier, 
Charmina y David, por compartir conmigo una de las etapas más importantes 
de mi vida y hacerla inolvidable. Su amistad significa mucho para mí. 
A Carlos, por ser una gran persona, por apoyarme en todo y por respetar mis 
decisiones: "Gracias por venir". 
A Salomón. Por enseñarme un mundo diferente al que yo conocía. La 
experiencia fue increíble. 
A la Facultad de Química, que me hizo sentir como en casa todos estos años. 
ÍNDICE 
Introducción .......................... ................ .... ....................... ... ............ ...... .......................... . 1 
Objetivos 
Objetivo genera!.. ...................... ... ..................................................................................... 2 
Objetivos particulares ............ .......................................... ... .............................................. 2 
CAPÍTULO l. Antecedentes 
1.1 Historia del limón ............................................................... ................... ..................... 3 
1.2 Descripción del limón ................ .. ... ............ .. .... ....... .......... ................ ..... .... ............... 3 
1.2.1 Morfología ...................... ..... .... .. ... .............. ... ........................................... ... ..... 4 
1.2.2 Composición .................. .... .... ...... .. ............................. ............. .. .... ..... ... .......... 5 
1.3 Producción de limón ............... .. .......... .. ..... .. ... .................................... ........................ 6 
1.3.1 Producción nacional de limón ...................................................... ................ 7 
1.3.2 Exportación de limón ... ........................................... ........ ... ........ .... .... ............ 9 
1.4 Aprovechamiento dellimón ............................. .......................................... ............. . 9 
1.5 Nutracéuticos ................................................................................................ ......... 10 
1.6 Terpenos ............ ......... .................................... .... ................ ......................... ... ... ..... .... 13 
1.7 Limonoides ............................................................................................. ................... . 14 
1. 7.1 Bioquímica de los limonoides en cítricos ............ ...... .......... .. .. ................ 17 
1.7.2 Función de Iimonoides .......................... .................................................... . 19 
a) Actividad anticancerígena .......... .. .................................. .. .. ....... .. ........... 19 
b) Disminución del colesterol. .. .............................. .... ................................ 21 
c) Actividad insecticida ....... .. ....................................... .. ... ........... .. ......... ... ... 21 
1.7.3 Limonín ... ... ........... ... .... ......... ... ... ............ ... .............................................. .... . 22 
1.7.4 Métodos de extracción ...................................... ... ..................................... 23 
i. Maceración ........................................... .. ..... .................................. .. .... ... 23 
ii . Extracción continua .. ............................... ... .................. .. ... ..... .............. 23 
¡ji. Maceración asistida con sonicación .... .................... .. ........ .. ............... 24 
iv. Microburbujas con dióxido de carbono supercrítico ...................... 27 
CAPÍTULO 11. Desarrollo experimental 
Esquema general de trabajo ...... .................. ..... .......... ... .............................. ............... 28 
2.1 Obtención y acondicionamiento de la muestra ........................ ............... ...... ... 29 
2.1 .1 Secado ............................................................ ............. .. ...................... 30 
2.1.2 Molienda ............... ........... .......... ............ ... ........ ... .... ........................... . 30 
2.1.3 Desengrasado ........................ ........................... ...... ................... ........ . 31 
2.2 Extracción sólido- líquido .......... .. ............... .................. ........ .... ..... ...... ................... 31 
2.2.1 Evaluación del solvente en la extracción sólido- líquido ...... ...... 31 
a) Maceración 24h ......... ................... ... ......... .... ........... ..... ... ......... .... ..... ....... 31 
b) Extracción continua 8h ...... ............................................................ ......... 31 
Escalalmiento ......... ............ ............................................................ ...... ... . 31 
c) Maceración asistida con sonicación 30min, 1, 2 Y 3 h ................... 32 
Escalamiento ..... ............ ................ .... .. ...... ... .................. ... .................. ..... 32 
2.3 Extracción líquido- líqUido de limonoides ....... ................ .................................. 32 
2.4 Purificación de limonín ... ... ... ........... .... ...... .. .. .... ...... .... ... ........... ................. .. ......... 33 
2.4.1 Cristalización .. ................................. ...................... .... ..... ... .................. 33 
2.4.2 recristalización ... ..... .... ...... ......... .. ........ ................. ... .......................... .33 
2.5 Análisis por CCF ......... ................................................... ................................. ... ... .... 34 
2.6 Evaluación del rendimiento y grado de pureza ...... ........................................ 34 
2.6.1 Cuantificación de limonín por HPLC ........................ ............ .......... 34 
2.6.2 Espectrometría de masas y RMN .............................. ..................... 35 
2.7 Análisis estadístico .......................................................................................... ....... 35 
CAPÍTULO 111. Resultados y discusión 
3.1 Obtención y acondicionamiento de la muestra .................. .............................. 36 
3.2 Extracción sólido - Ilquido .... .............. .................................................................. 37 
3.2.1 Métodos convencionales y uso de ultrasonido .......................... .37 
3.2.2 Evaluación del solvente en la extracción sólido- Iíquido ...... .. .. 39 
3.3 Purificación de limonín ..... ................................................ ...... ................................ 43 
3.3.1 Cristalización .................................... .. ... ............. ...... .. ...................... .. 43 
3.3.2 Recristalización .................................... .... ............ ...... ... ... ... ..... .. ..... ... 45 
3.4 Escalamiento ............... ...... ... ...... ............................... .. ............. .... .. ..................... .. . 46 
3.5 Evaluación del rendimiento y grado de pureza ...... .................... .. ........ .... ...... ..47 
3.5.1 Cuantificación de limonín por HPLC. .... .. ................................ ...... .47 
3.5.2 Espectrometría de masas ................................... .... .. ..... .. ............. .. S1 
3.5.3 Resonancia magnética nuclear ............ .......................................... 52 
3.6 Presupuesto ............................................................................................................ 53 
CAPÍTULO IV. Conclusiones ................... .. ....................... ....... .. ............... ............ 55 
Bibliografía ...................... .... .... ................................................................................. ... 56 
Apéndice I 
Análisis estadístico ............... .................................... ......... .................. ......................... 60 
Introducción 
Introducción 
México ocupa el primer lugar a nivel mundial en la producción de limón tanto 
mexicano como persa (Elizondo, 2004). Los principales Estados productores son Colima, 
Michoacán y Oaxaca, produciendo un total de 1,824.89 tm en el 2003 (Sagarpa, 2004). 
El 70% cosechado se consume de manera fresca y solo el 30% es utilizado en la 
industria (Ramos, 2004). 
Del 30% aprovechado a nivel industrial, se obtiene principalmente aceite esencial y 
pectina, utilizando únicamente la cáscara de limón y desperdiciando el resto del fruto. En 
otros países como E.U. y Japón se obtiene además pulpa seca, melaza y concentrado de 
limón. 
Es necesario aumentar su explotación, extrayendo compuestos de alto valor 
comercial que beneficien a los productores y campesinos, al otorgarle un valor agregado 
a este fruto (Elizondo, 2004). 
Una buena opción son los limonoides, los cuales son fitoquímicos que se encuentran 
principalmente en la semilla del limón, los cuales protegen el tejido pulmonar del fruto y 
son la principal causa de amargor en los jugos. Se consideran nutracéuticos, ya que 
recientes investigaciones en animales, han encontrado que .reducen riesgos de cánceres 
de la cavidad oral, laringe, esófago, estómago, páncreas, pulmones, colon y recto. 
Además, actúan como repelentes de insectos, interruptores de crecimiento e inhibidores 
de la reproducción en contra de varias especies de insectos. 
Los limonoides más conocidos son ellimonín, nomilín y obacunona. 
La mayor concentración de limonín se encuentra en la semilla, por lo que resulta 
interesante establecer un esquema de extracción para la obtención de limonín de alto 
rendimiento y grado de pureza, a partir de residuos generados en la industria del limón. 
Los métodos más utilizados para la extracción de limonín son por medio de maceración y 
extracción continua. Recientemente se ha probado la maceración asistida con sonicación 
para la extracción de diversos compuestos origen vegetal, mostrando un alto 
rendimiento para algunas extracciones. 
Objetivos 
Objetivos 
Objetivo general 
.:. Establecer un esquema de extracción para la obtención de limonín presente en la 
semilla de limón con alto rendimiento y grado de pureza. 
Objetivos particulares 
~ Aplicar métodos convencionales y sonicación para evaluar el rendimiento de 
extracción del limonín. 
~ Evaluar el tipo de solvente en cuanto al rendimiento y tiempos de extracción. 
~ Conocer el método adecuado para la purificación dellimonín. 
~ Realizar la extracción de limonín con una mayor cantidad para conocer los 
rendimientos para un posterior escalamiento. 
2 
Antecedentes 
CAPÍTULO l. Antecedentes 
1.1 Historia del limón 
Las frutas cítricas se han cultivado durante más de 4000 años. Se cultivan 
prácticamente en todos los países entre los 40° de latitud norte y sur. Esta diseminación 
está asociada con muchas de las grandes exploraciones y conflictos de la historia, tales 
como las conquistas de Alejandro Magno, la expansión del Islam o las exploraciones de 
Colón, que introdujo los cítricos al continente americano. 
Se cree que el origen de los cítricos es el sureste de Asia, desde Arabia oriental 
hasta Filipinas y desde el Hímalaya hasta Indonesia y Australia. Este movimiento de 
dispersión de los cítricos probablemente ocurrió antes de que existiera algún tipo de 
registro histórico. 
Se piensa que la dispersión de los cítricos de la India hacia Africa ocurrió durante los 
años 700-1400 d.C. Varios cítricos como la lima, el limón y la naranja fueron 
introducidos en América por los colonizadores españoles y portugueses y su dispersión 
fue promovida por la Iglesia católica. 
Los principales tipos de cítricos comprenden el cidro, la naranja agria, naranja 
dulce, lima, limón, toronja, pomelo, mandarina y kumquat. 
El limón Citrus aurantifolia swingle, es originario del archipiélago Indio oriental. Fue 
introducido por el mar de Omán por marineros árabes y transportados posteriormente a 
Egipto y Europa (Davis et al., 1994). 
El procesado de productos cítricos data del año 300 d.C. por los chinos, que 
obtenían aceites esenciales para perfumes de la corteza de los frutos. 
1.2 Descripción 
Los limoneros son árboles sensibles a bajas temperaturas, son vigorosos, de 
crecimiento erecto, tupidos y exuberantes. Miden entre 3 y 6 m de altura y están 
cubiertos de follaje. Suelen ser espinosos, con dos periodos de floración. La flor tiene 
cinco sépalos, cinco pétalos, numerosos estambres y un pistilo. Los pétalos son blancos 
por el haz y rosados por el revés. 
3 
r 
Antecedentes 
Su fruto es el limón, el cual pertenece a la familia Rutaceae, género Citrus y especie 
Citrus limón. Es una baya de color amarilla, de forma esférica, variando la cantidad de 
semilla en cada fruto. Las semillas son pequeñas, con cubiertas lisas y con marcados 
extremos micropilares. 
Se cultiva en regiones tropicales y subtropicales y es un fruto no climatérico. 
(Davis et aL, 1994). 
1.2.1 Morfología 
El limón está compuesto por: 
• Flavedo (exocarpio). Consiste en la porción colorida de la piel, donde las células 
contienen carotenoides y clorofila que le otorgan ese color característico, así como 
glándulas oleosas que producen aceite esencial. 
• Albedo(mesocarpio). Se encuentra debajo del f1avedo. Es una capa gruesa, 
blanca y esponjosa formada por células parenquimatosas rica en sustancias pécticas y 
hemicelulosa. Sirve de protección, ya que envuelve el endocarpio (Bartholomew et aL, 
1999). 
• Cáscara (pericarpio). Está formada por el albedo y f1avedo. Contiene compuestos 
amargos (f1avona, Iimonín) y pectina. 
• Endocarpio. Está compuesto por segmentos donde se localizan las vesículas del 
jugo, las cuales se encuentran en grandes cantidades. Son de forma elíptica y se 
enCuentran de forma ramificada en un tallo no vascular. El citoplasma contiene ·pequeñas 
cantidades de lípidos, leucoplastos y cromoplastos. 
El jugo dentro de las vacuolas, contiene ácidos, aminoácidos, sales como oxalato de 
calcio, hespiridina y limonín (Seymour et aL, 1993). 
• Semillas. Tienen una cubierta dura, Iignocelulósica, generalmente localizadas en 
dos filas en el endocarpio alrededor de la base central. Contiene una gran cantidad de 
aceite y proteína (globulina), la cual se puede encontrar en concentraciones de hasta 
16% en base seca. Las semillas se encuentran en una concentración de 0.2-0.7% en el 
limón (Davis et aL, 1994, Braverman, 1980). 
4 
Antecedentes 
Fig. 1. Partes que conforman el limón 
1.2.2 Composición 
Así como la mayoría de los cítricos, el limón está constituido principalmente por 
agua aunque también contiene cerca de 400 constituyentes, donde se encuentran 
incluidos los carbohidratos, aminoácidos, ácidos orgánicos, ácido ascórbico, minerales, 
lípidos (Tabla 1.). Su contenido de proteínas es bajo (Ting et al., 1986). 
Tabla 1. Composición química de la porción comestible en 100g de sustancia 
comestible de limón, (Sagarpa, 2002). 
ComQonente COlTlQonente 
Agua (g) 90.1 Vitamina C (mg) 45- 75 
Proteínas (g) 1.1 Ácido cítrico (mg) 3840 
Lípidosfgl 0.03 Sodio 1 m-.9} 6 
Carbohidratos (g) 8.2 Potasio Lm-ºl 148 
Calorías (kcal) 27 CalcioLm-ºl 26 
Vitamina A (U.I.) 20 Magnesio (mg) 9 
Vitamina B11n19l 0.04 Manganeso (mg) 0.04 
Vitamina B2 (mg) 0.02 Hierro lm-.9} 0.6 
Vitamina B6 (mg) 0.06 CobreLn19l 0.26 
Ácido nicotínico (mg) 0.1 Fósforo(mg) 16 
Ácido pantoténico (mql 0.2 Azufre (mg) 8 
5 
Antecedentes 
Tabla 2. Composición química de la semilla fresca, (Braverman, 1980). 
Componente Porcentaje (%) 
Aqua 40 
Grasa 25 
Nitróqeno 2 
Proteína cruda 10 
Fibra cruda 6 
Compuestos no 15 
nitrogenados 
Cenizas 2 
La Tabla 2. muestra la composición qUlmlca de la semilla fresca, la cual está 
constituida principalmente por agua. Contiene entre 20 y 25% de grasa, la cual está 
compuesta principalmente por ácido oleico, linoleico (36.6 y 36.5% respectivamente) y 
por ácido palmítico (20.7%). 
1.3 Producción dé limón 
La cosecha del limón se realiza en las zonas subtropicales semiáridas y áridas con 
temperaturas mínimas a -4°C, aunque su temperatura óptima de cosecha es de 18 a 
30°C. 
El fruto se produce a lo largo de todo el año en la mayoría de las regiones de 
cultivo, se recolecta verde, casi a punto de madurar entre 6 y 10 veces al año y se deja 
madurar a temperatura moderadamente cálida. Un árbol rinde entre 1,000 y 2,000 
frutos al año. 
El limón ha registrado un incremento en la producción mundial los últimos años, 
debido a la reciente preferencia retomada por los consumidores. Se ha registrado 
principalmente en países en vías de desarrollo, debido a condiciones climatológicas 
idóneas y un importante mercado en expansión, el cual ha logrado la creación de un 
sector más productivo. Los principales países productores de limón son México, India y 
Argentina con el 14.7, 11 Y 9.6% respectivamente. Le siguen España, Irán, Brasil y 
Estados Unidos con una producción de 8.6, 8.4, 7.6 Y 7.5% logrando el 67.4% de la 
6 
Antecedentes 
producción total mundial (Tabla 3.). Cabe mencionar que México muestra la mayor tasa 
de crecimiento anual a nivel mundial. 
Tabla 3. Producción mundial de limón en toneladas métricas (Fuente: FAO. Periodo 
2000-2003). 
País 2000 2001 2002 2003 % 
Mundo 11,145,492 11,820,365 11,862,044 12,451,680 67.4 
México 1,661,220 1,594,020 1,725,090 1,824,890 14.7 
India 1,400,000 1,320,000 1,370,000 1,370,000 11 
Argentina 1,171,498 1,180,000 1,200,000 1,200,000 9.6 
España 915,049 1,024,105 919,7 1,065,700 8.6 
Irán 1,032,479 1,038,833 1,040,000 1,040,000 8.4 
Brasil 577,582 964,817 984,551 950,000 7.6 
Estados Unidos 762,04 913,53 733,001 939,000 7.5 
1.3.1 Producción nacional de limón 
México es el primer productor a nivel mundial generando empleo directo a tres 
millones de campesinos anualmente y se manifiesta como un cultivo en auge, ya que su 
producción aumenta cada año (Elizondo, 2004). 
En el 2003, la producción ascendió a 1,824.89 tm según registros de la FAO para 
una participación mundial del 14.7% de la producción mundial basándose principalmente 
en dos variedades: Persa o sin semilla (Citrus latifolia) y limón mexicano o con semilla 
(Citrus aurantifolia). 
En el 2002, la superficie sembrada fue de 92,503.08 hectáreas, mientras que la 
cosechada fue de 84403.86 hectáreas. En la tabla 4. se muestra la superficie cosechada 
y sembrada así como la producción anual de los últimos años (Sagarpa, 1999-2002). 
Los principales Estados productores durante los últimos 5 años han sido Colima, 
Michoacán y Oaxaca. En la tabla 5. se muestra la producción de dichos Estados en los 
últimos años. 
El 70% de la producción se consume de manera fresca y se calcula que el consumo 
per capita fue de 9.2 Kg en el 2003. El 30% restante es destinado a la industria para 
7 
r 
Antecedentes 
producir principalmente aceite esencial, produciendo alrededor de 1089.6 L, el cual es 
exportado casi en su totalidad a Estados Unidos (Ramos, 2003). 
Tabla 4. Producción nacional de limón de 1999 a 2004 en México (Fuente: 
SAGARPA. Periodo 1999-2002). 
Superficie 
Superficie Producción Año sembrada 
(HA) cosechada (HA) total (TON) 
1999 98544.21 90196.69 1 367502 
2000 95491 91188.27 1661,220 
2001 93429.89 87056.4 1594020 
2002 92503.08 84403.86 1 725 090 
Tabla 5. Principales Estados productores de limón en México (Fuente: SAGARPA. 
Periodo 1999-2002). 
Producción en Producción en Producción en Producción en 
2002 (TON) 2001 (TON) 2000 (TON) 1999 (TON) 
COLIMA 584,533 493038.22 556177.83 438,086.1 
MICHOACAN 357277.89 304822.06 334238.78 296604.42 
OAXACA 133225 176284 207018 205,002.8 
GUERRERO 58509.4 58592.3 58829.77 69388 
TAMAULIPAS 19993.95 17,170.15 18,252 11 950.2 
A nivel nacional, las empacadoras son las más importantes en la comercialización 
del limón, pues por este medio se envía el producto de manera fresca a diferentes 
estados del país. 
8 
Antecedentes 
1.3.2 Exportación de limón 
La exportación de cítricos es muy baja a nivel mundial, ya que existe un alto 
consumo interno. En la tabla 6. se muestra los principales países exportadores de 
cítricos. 
En México, la mayor parte del limón persa es exportado (18%). Su principal destino 
es Estados Unidos, aunque también abarca a Francia, Japón, Alemania, Inglaterra, 
Canadá, Países Bajos, Bélgica, Suiza, Guatemala y el Salvador ( Elizondo, 2004). 
Actualmente los productores de limón buscan la manera de exportar a China, ya 
que la venta del fruto dentro del país se concentra en mercados para su consumo fresco, 
generado pocas ganancias (Hernández, 2004). 
Tabla 6. Principales países exportadores de limón (Fuente: FAO. Producción 
acumulada para el periodo 2001-2002). 
Volumen (TM) 
2001 2002 
Mundo 1,726,395 1,719,788 
España 498,921 501, 944 
Argentina 244,955 267,714 
México 248,488 263,713 
Turquía 198,665 208,984 
Estados Unidos 121,899 106,455 
Sudáfrica 75,199 75,814 
1.4 Aprovechamiento del limón 
El limón es un producto del cual se puede aprovechar la cáscara, la pulpa, el bagazo 
y la semilla para la obtención de subproductos, sin embargo, muy pocos países lo 
explotan en su totalidad. 
Algunos de los subproductos que se pueden obtenera partir del limón se muestran 
a continuación: 
9 
Antecedentes 
• Pectina. La pectina está integrada por moléculas de ácido galacturónico unidas por 
enlaces glucosídicos o-D-(l,4), en la cual algunos carboxilos pueden estar 
esterificados con metilos o en forma de sal. Existen dos clases principales de 
sustancias pécticas: Los ácidos pectínicos que tienen parte de sus ácidos 
galacturónicos como ésteres metílicos y ácidos pécticos que sólo contienen 
moléculas del ácido sin esterificación. En el área alimenticia se usa por su 
capacidad de gelificar, en la estabilización de bebidas, emulsificación de aceites y 
. en la elaboración de helados y gelatinas (Astisarán et aL, 1999). 
• Vitamina C. El jugo de limón contiene de 45-75mg de ácido ascórbico, el cual se 
usa en el área farmacéutica (Fennema, 1995). 
• Aceite esencial. Se usa como saborizante en bebidas, en el área de perfumería, 
farmacia y panadería. 
• Enzimas. La pectina esterasa se obtiene del albedo y flavedo del limón. Se usa 
para la conversión de pectina a ácido péctico. Junto con una enzima glucósidasa, 
puede usarse como clarificante en jugos. 
• Ácido cítrico. Se utiliza en alimentos para la preparaclon de bebidas, alimentos, 
dulces y en su forma de citrato de sodio como agente emulsificante. También se 
usa en platería, grabado, tintas, e impresión. 
• Concentrado de jugo. Se utiliza para la elaboración de bebidas. 
• Cáscara escarchada. Es un típico dulce mexicano (Astisarán et aL, 1999). 
En México, su explotación a nivel industrial es bajo, ya que se aprovecha 
principalmente para la obtención aceite esencial y pectina. 
1.5 Nutracéuticos 
El ser humano siempre ha buscado una mejor forma de vivir, así como de vivir por 
más tiempo. 
Los alimentos proveen los macro y micronutrientes (carbohidratos, proteínas, 
grasas, fibra, vitaminas y minerales) necesarios para cubrir los requerimientos del 
organismo en cada una de sus funciones. 
10 
Antecedentes 
Además de estos nutrientes, se han encontrado otros compuestos, los cuales tienen 
efectos positivos en la salud de las personas por lo que se conocen como alimentos 
funcionales o nutracéuticos. 
En los años 70' s, el progreso tecnológico aplicado a las ciencias de los alimentos, 
dio a conocer nuevos componentes alimenticios. La comunidad científica japonesa, 
estudió los efectos fisiológicos de dichos componentes en animales. 
Los componentes que probaron ser efectivos sobre enfermedades crónicas como 
osteoporosis, anemia, estreñimiento, disfunciones cardiovasculares e incluso algunas 
probaron reducir el riesgo de desarrollar un cáncer. 
Se considera como alimento funcional, a aquel alimento que se consume como parte 
de una dieta normal y contiene un componente químico, ya sea nutriente o no, que 
ofrece beneficios para la salud aparte de su contenido de nutrientes convencionales. 
Las características de un alimento funcional son las siguientes: 
• Su consumo no posee efectos nocivos. 
• Cuenta con propiedades nutritivas y beneficiosas para el organismo, por lo que su 
presencia en el organismo cebe conducir a la regulación de un proceso biológico: 
Mecanismos de defensa, procesos de envejecimiento, estado físico o mental, etc. 
(Vasconcelos, 1998). 
Un nutracéutico se define como una sustancia, la cual puede ser considerada un 
alimento o parte de éste, que provee beneficios a la salud, el cual incluye tratamiento o 
prevención de la enfermedad. Estas sustancias cumplen funciones fisiológicas 
importantes en el organismo. A continuación se mencionan algunas sustancias 
consideradas nutracéuticas (Andaluer et al. , 2002): 
• Fibra dietética 
• Oligosacáridos 
• Azúcares alcoholes 
• Péptidos y proteínas 
• Glúcidos 
• Alcoholes 
• Isoprenoides y vitaminas 
• Colinas 
• Bacterias acidolácticas 
• Minerales 
• Ácidos grasos polinsaturados 
(PUFAs) 
11 
Antecedentes 
En la siguiente tabla se muestran algunos alimentos funcionales, así como el 
componente por el cual se consideran funcionales y las propiedades benéficas de dicho 
componente sobre el organismo. 
Tabla 7. Alimentos funcionales (Vasconcellos 1998, Andaluer et al. , 2002). 
Alimento 
Compuesto beneficio Estructura 
de origen 
r- CH,OH -
CH,a; ~ 
~ Polisacárido Hongo Antiviral, OH a; a;/ o 
antitu merígena 
OH .p SCH, CH,OH 
H,c CH,a; ~ ~O-
CH,OH ~ ~o O O ~O o, OH 
'OH OH a; OH OH a; 
OH OH OH _n '-- Lentlnana 
O 
-?' 
O 
I I 
Antiosteopótico, ~ -?' 
Isoflavona Soya anticancerígeno O ~ 
I 
O 
Isoflavona 
OH 
Ayuda al Oc°H 
HO~ " '" I OH Catequina Té sistema 
inmunológico I ó __ 
-'OH 
OH 
Epigallocatechin (EGC) 
12 
Antecedentes 
Alimento Estructura 
Compuesto beneficio 
de origen 
Favorecen la 
Bifidobacteria Yoghurt y función 
otros gastrointestinal, 
componen la producción de 
tes lácteos vitamina B12 y 
K 
Licopeno Tomate Anticancerígeno 
::::,... ::::,... ::::,... ::::,... ::::,... ::::,... ~ 
Licopeno 
O 
1 O 
// 
CH 
Frutas 
O 
V~o Limonoide cítricas Anticancerígeno O H 
~~ 
H~3C H 
Limonín 
1.6 Terpenos 
Los terpenos son una clase de lípidos que se obtienen de las plantas. Pueden ser 
hidrocarburos o contener oxígeno y ser alcoholes, cetonas o aldehídos. Los compuestos 
que contienen otros elementos aparte del H y e se conocen como terpenoides 
(Solomons, 1996). 
Los terpenos son estructuras conformadas por dos o más unidades 
pentacarbonadas conocidas como unidades de isopreno (2-metil-1,3-butadieno) (Fig 
2). Se clasifican de acuerdo al número de carbonos que contiene: Monoterpeno si está 
13 
Antecedentes 
compuesto por dos unidades de isopreno, sesquiterpeno por tres, diterpenos por cuatro 
y triterpeno por seis. La cabeza es el extremo más próximo a la ramificación del 
metilo. Sus moléculas pueden ser de cadena abierta, cíclica, dobles enlaces, grupos 
hidróxilo, grupos carbonilos u otros grupos funcionales (Fessenden et al., 1983). 
cola 
cabeza 
Fig. 2. Unidad isopreno 
Los monoterpenos son compuestos volátiles por lo que son componentes olorosos 
de los aceites esenciales. 
Los tetraterpenos funcionan como antioxidantes protegiendo a los lípidos contra el 
ataque de radicales libres, previenen la ocurrencia de cáncer en muchos sitios y son 
agentes antitumoríficos efectivos. 
Los triterpenoides funcionan como anticancerígenos y se encuentran en ciertos 
cítricos. Dentro de este grupo se encuentran los limonoides (McMurry, 1994). 
Los terpenos más estudiados son los carotenoides y los limonoides. 
1.7 Limonoides 
Los limonoides son triterpenoides altamente oxigenados y casi siempre hidroxilados 
en la posición 3, los cuales presentan una unidad estructural estable. Están presentes en 
las familias Rutaceae y Meliaceae. Son fitoquímicos, parte de un grupo de compuestos 
contenidos naturalmente en alimentos de origen vegetal que se encuentran 
principalmente en cítricos y son la principal causa del amargor en jugos. (Teranishi et al., 
1999). 
14 
Antecedentes 
o 
Fig 3. limonín 
Los limonoides están presentes en los cítricos en tres diferentes formas: 
• Limonoides monolactonas, los cuales tiene el anillo D abierto. Un ejemplo es el 
limonoato anillo A- lactona. 
• Limonoides dilactonas o aglucones, que tienen cerrado el anillo D. Los limonoides 
aglucones se acumulan principalmente en semillas en desarrollo. Se han separado 36 
limonoides aglucones a partir de cítricos de los cuales sólo seis son amargos. Dentro de 
estos limonoides se encuentran el limonín, nomilín, diacetilnomilín, obacunone e 
ichangin. El limonín es el principal limonoide responsable del . amargor en los jugos. 
(Ozaki, 1991). 
• Limonoides glucósidos, los cuales tienen una molécula de glucosa. Se encuentran 
en la semilla en una concentración entre 0.31 y 0.87%. Se acumulan en semillas 
maduras, son solubles en agua, insípidos y abundantes en la naturaleza. Dentro de estos 
limonoides se encuentran el limonín, nomilín, obacunone, diacetilnomilín glucósidos,ácido nomilínico y ácido diacetilnomilínico. 
La Concentración de limonoides varía según el fruto. Los frutos donde se observa 
una mayor cantidad es el limón (6000 a 8950 ppm de limonín y 800 ppm de nomilín), 
las uvas (2400 ppm de limonín) y la naranja (1400 ppm de limonín y 800 ppm de 
nomilín). 
15 
Antecedentes 
Tabla 8. Concentración de Iimonoides aglucones en la semilla de limón (Ozaki, 
1991). 
Limonoide Concentración (ppm) 
Limonín 6000-9,270 
Nomilín 3030 
Obacunona 580 
Ichangin Trazas 
Deacetil-nomilin Trazas 
Total 12560 
La tabla 8. muestra las concentraciones de varios Iimonoides aglicones en el limón. 
El limonoide que se encuentra en mayor proporción es el Iimonín, el cual cubre 
aproximadamente la mitad de la concentración total de Iimonoides. 
La concentración de Iimonoides también varía en los diferentes tejidos de un mismo 
fruto. En la fig. 4. Se observa la concentración de limonín en diferentes partes del limón, 
donde la mayor concentración se encuentra en la semilla, seguido por el endocarpio, 
albedo y flavedo. Las vesículas del jugo presentan la menor concentración (Berhow et 
al., 2000). 
927 2.5 
Fig. 4. Distribución de Iimonín en diferentes tejidos de fruto 
(mg en 100g de tejido), (Berhow et al., 2000). 
16 
Antecedentes 
1.7.1 Bioquímica de los limonoides en cítricos 
El nomilín es el limonoide precursor del resto de los limonoides. Éste es sintetizado 
en el tallo por la vía terpenoide de acetato y mevalonato. Posteriormente, el nomilín se 
desplaza a las hojas, al fruto, a la cáscara y a las semillas, donde se metabolizan el 
resto de los limonoides gracias a la actividad de diferentes enzimas. 
La trans-eliminación del grupo acetil del nomilín, da como resultado obacunona por 
medio de la enzima nomilín trancetileliminasa. La obacunona es convertido a ácido 
obacunoico por medio de la enzima obacunona anillo A-Iactona hidrolasa la cual cata liza 
la lactonización del anillo-D en las semillas. La hidroxilación del metil-19 del ácido 
deacetilnomilínico da ácido 19-hidroxideacetilnomilínico forma el limonoide ichangin al 
cerrarse el anillo. El Limonín se forma por la ciclización del ichangin. 
La enzima UDP-D-glucosa: limonoide glucosiltransferasa cata liza la conversión de 
limonoides aglicones a sus respectivos glucósidos durante la maduración, el cual ocurre 
en el tejido del fruto y en las semillas. La actividad del limonoides glucósido 13-
glucosidasa cataliza la hidrólisis de limonoides glucósidos para liberar glucósidos 
aglucones y glucosa durante la germinación el cual ocurre en las semillas. 
Los limonoides glucosilados son relativamente estables en el fruto, sin embargo, en 
las semillas se hidrolizan rápidamente durante la germinación. La hidrólisis es catolizada 
por la enzima glucósido glucosidasa (Berhow et al., 2000). 
La fig. 5. muestra la biosíntesis de limonín a partir de nomilín. 
17 
Antecedentes 
o 
Nomilín 
¡ 
o 
o 
Obacunone 
~ 
Hooe o 
o 
Ichangin 
! 
o 
Fig. 5. Biosíntesis de limonín (Berhow et al., 2000). 
18 
Antecedentes 
1.7.2 Función de limonoides 
a) Actividad Anticancerígena 
Gran número de estudios epidemiológicos ha demostrado que el consumo de cítricos 
es protector contra un gran número de cánceres en humanos. Los compuestos 
responsables son los limonoides aglucones y glucosilados, los cuales han mostrado 
poseer actividad anticancerígena en animales de laboratorio. 
Los limonoides son triterpenoides altamente oxidados los cuales contienen un anillo 
furano, además de muchas dobles ligaduras. Algunas de estas características se 
consideran las responsables de su actividad antitumoral, como el anillo A y el B de dichas 
estructuras, el grupo furano sustituído en la posición 3 y la doble ligadura del carbono 7. 
El mecanismo de acción relacionado con su actividad quimiopreventiva aún no se 
comprende por completo. Se sabe que al cambiar la doble ligadura del carbono 7 por una 
ligadura sencilla, la configuración espacial del anillo B cambia observándose una pérdida 
de la actividad antitumoral (Berhow et al., 2000). 
o 
Fig. 6. Limonín 
Los furanos monosustituidos están ligados a la inhibición de carcinogénesis. El 
potencial inhibitorio de los furanos se atribuye a su habilidad de inducir a la enzima de 
detoxificación glutation S-transferasa (GST), la cual protege al organismo contra la 
acción de agentes carcinógenos. 
La enzima GST consiste en tres tipos de isoenzimas: n, J.l y 1t. Es la mejor enzima de 
detoxificación que cata liza la conjugación de tripéptidos endógenos, glutatión utilizando 
electrófilos reactivos. Muchos agentes carcinógenos son electrófilos, por lo que la 
19 
Antecedentes 
inducción de GST es muy importante para la detoxificación de agentes carcinógenos 
incrementando la formación de glutatión, el cual será excretada posteriormente ya que 
es menos reactivo y es soluble en agua (Berhow et aL, 2000). 
La inducción de la isoenzima Il de la enzima GST por el limonín, está asociada con la 
inhibición de carcinogénesis. Se ha encontrado reducción en riesgos de cánceres de la 
cavidad oral, laringe, esófago, estómago, páncreas, pulmones colon y recto: 
• La administración de obacunona y limonín inhibe la formación de lesiones 
tumorales en colon, con inducción del hígado GST y quinona reductasa en ratones (QR) 
(Berhow et aL, 2000). 
• Su ingestión en ratones, inhibe la proliferación y metastasis de MDA-MB-435-ER 
(células cancerígenas de pecho de humanos). 
• Inhiben significativamente la proliferación y crecimiento de los receptores 
negativos y positivos de estrógeno en células cancerígenas del pecho en humanos. 
• Limonín es un potente inhibidor de 7,12-dimetilbenz[a]antracen (DMBA), el cual 
induce a agentes carcinógenos en mejillas de ratones. 
• Limonín, deoxilimonín, limonín carboximetoxin, y limonín 17-¡3-D-glucopiranosido 
inhiben el desarrollo de DMBA el cual induce carcinoma oral. Muestra una reducción 
entre el 50-60% (Miller et al., 1994). 
• Nomilín ha mostrado actividad antitumoral en un modelo parabenza[a]pireno para 
inducir tomores en el estómago y en pulmón en ratones ICR/Ha. 
• Su efectividad en la prevención de formación de tumores en pulmón inducido por 
BP (benzopireno) y nitrosamina 4-( metilnitrosamino )-1-(3-pitidil)-1-butanona (NNK, 
agente carcinógeno más potente encontrado en tabaco y humo de tabaco) se ha 
demostrado en ratones . 
• Nomilín es un mejor inhibidor que limonín en la etapa de iniciación de 
carcinogénesis en la piel, mientras que limonín es más efectivo en la etapa de promoción 
(Berhow et al,2000). 
20 
Antecedentes 
b) Disminución de colesterol 
Investigaciones en conejos, han demostrado que el Iimonín disminuye el nivel de 
colesterol en células HepG2, las cuales son células neoplásicas del hígado que secretan y 
catabolizan Iipoproteínas (Berhow et aL,2000). 
e) Actividad insecticida 
la estructura del Iimonín contiene gran número de grupos polares, los cuales son 
sitios potenciales de interacción con receptores. Se ha determinado que el grupo furano 
y el grupo epóxido del anillo e y D, son estructuras primarias responsables de la 
actividad insecticida. 
Tienen varios modos de acción y efectos sobre la población de insectos: Reducen la 
alimentación en larvas, actúan como repelentes y reducen la reproducción en adultos 
(Berhow et aL,2000). 
Actúan como repelentes de insectos, interruptores de crecimiento e inhibidores de la 
reproducción en contra de varias especies por lo que pueden sustituir insecticidas 
sintéticos. 
Se ha demostrado que los sembradíos de papa, pueden ser protegidos del 
escarabajo Leptinotarsa decemlineata, usando limonoides, ya que previenen la 
colonización y reproducción en sembradíos de papa. 
Se ha determinado que el Iimonín, nomilín y obacunona interrumpen el crecimiento 
del gusano de maíz Helicoverpa zea y Spodoptera frugiperda, además de que 
incrementan la mortalidad del mosquitoCulex quinquefasciatus (Berhow,2000). 
Toxicidad 
Además se ha demostrado que no existen efectos negativos por la ingestión de altas 
concentraciones de limonoides (Zhang et aL, 1994), (Teranishi et aL, 2000). 
21 
Antecedentes 
1.7.3 Limonín 
Fue el primer limonoide caracterizado y fue obtenido a partir de jugo de naranja en 
1949. Su estructura se determinó a través de análisis de cristalograña de rayos X en 
1960. Su nombre químico es 8-(3-furil)decahidro-2,2,4a,8a-tetrametil-llH,13H-
oxireno[d]pirano[4',3':3,3a] isobenzofuro[5,4-f][2]benzopiran-4,6,13(2H,5aH)-triona y 
su composición química es C25H300a con un peso molecular de 470gjmol (Fig. 7) (Index 
Merck, 2000). 
Fig. 7. Estructura dellimonín. 
El precursor del limonín es el limonoato anillo-A lactona. Éste se convierte 
gradualmente en limonín bajo condiciones ácidas a un pH por debajo de 6.5 mediante la 
enzima limonoide anillo- O lactona hidrolasa (Fig 8.). 
Limonoato anillo - A laetona 
(No amargo) 
pH ácido .. 
Laetona hidrolasa 
Limonín 
(Amargo) 
Fig. 8. Limonín a partir de limonoato anillo-A lactona 
22 
Antecedentes 
1. 7.4 Métodos de extracción 
La extracción se realiza a partir de semillas debido a que son más ricas en 
limonoides que el resto de lo tejidos del fruto. 
Para la obtención y purificación de limonín, se han llevado a cabo diferentes 
métodos usando diferentes partes del fruto como lo son el jugo, la cáscara y la semilla. 
Para la extracción de limonoides existen varios métodos: 
.:. Macercación 
La muestra se coloca en un contenedor junto con el solvente por un periodo de 
tiempo, hasta que se lleva a cabo la extracción. 
Es un método sencillo y fácil de llevarse a cabo. Sin embargo, el solvente no puede 
ser renovado de manera inmediata durante la operación, es necesario filtrar la muestra 
al terminar la extracción y el tiempo de la extracción es mayor al requerido en cualquier 
otro método. 
Los solventes que se han utilizado para la extracción de limonín son: Acetona, 
metanol, benceno, diclorometano y éter de petróleo, donde se obtuvo un rendimiento 
muy bajo con benceno y un costo muy elevado con éter de petróleo (Pifferi et al., 1993) . 
• :. Extracción continua 
Es un método muy utilizado para la extracción de compuestos orgánicos. El Soxhlet 
es el equipo más común para la extracción continua, donde la muestra se coloca en un 
contenedor el cual se llena gradualmente con solvente condensado. Cuando el solvente 
se excede del nivel del contenedor, un sifón aspira el solvente y lo regresa al contenedor 
de destilación. Esta operación se repite hasta que termina la extracción. 
Con este método, la muestra se encuentra en contacto con solvente fresco 
constantemente, no se requiere una filtrar la muestra el terminar la extracción, ya que el 
solvente se separa durante la operación y es un método simple. Sin embargo requiere de 
un largo tiempo para realizarse la extracción, además de que no se puede agitar la 
muestra, lo cual aceleraría el proceso de extracción (Luque et al., 1998). 
23 
Antecedentes 
Por métodos no convencionales: 
.:. Maceración asistida con sonicación 
La extracción por maceración asistida con sonicación se emplea exitosamente para 
mejorar la extracción de algunos compuestos orgánicos. 
La sonicación se deriva principalmente de la cavitación acústica: La formación, 
crecimiento y colapso por implosión de las burbujas dentro del líquido. La cavitación es 
un medio de concentrar la energía producida por el sonido (Suslick, 1990). 
Las ondas ultrasónicas consisten en ciclos de compresión y expansión. Los ciclos de 
compresión, ejercen una presión positiva en el líquido, juntando las moléculas, mientras 
que los ciclos de expansión, ejercen una presión negativa que separa las moléculas unas 
de otras. 
Durante el ciclo de expansión, la onda de sonido genera cavidades. Las moléculas 
del líquido se encuentran juntas por fuerzas de atracción, las cuales están determinadas 
por la tensión superficial del líquido. Para que la cavidad se forme, se necesita una 
presión negativa asociada con el ciclo de expansión para superar la tensión superficial del 
líquido. 
El ultrasonido de alta intensidad expande la cavidad rápidamente durante el ciclo de 
expansión, que la cavidad nunca tiene oportunidad de encogerse durante el ciclo de 
compresión. Si la intensidad es baja, el tamaño de la cavidad oscila en fase con el ciclo 
de expansión y compresión. El área superficial de la cavidad producida por el ultrasonido 
es ligeramente mayor en los ciclos de expansión que en los ciclos de compresión . Según 
la cantidad de gas que difunde dentro o fuera de la cavidad dependerá el área 
superficial. 
El crecimiento de la cavidad puede alcanzar eventualmente un tamaño crítico, 
donde será más eficiente absorber energía del ultrasonido. Dicho tamaño dependerá de 
la frecuencia de la onda. Una vez que la cavidad ha experimentado un crecimiento rápido 
causado por cada ciclo de ultrasonido no se podrá absorber energía de las ondas de 
sonido, por lo que no podrá retenerse y provocará la implosión de lé A t "" d" t" 
n ece en es 
líquido circundante. 
La implosión de las cavidades establece un ambiente que estimula reacciones 
químicas y por lo tanto, el mecanismo de la extracción. Los gases y vapores dentro de 
las cavidades se comprimen generando calor e incrementando la temperatura del líquido 
24 
r 
Antecedentes 
La implosión de las cavidades establece un ambiente que estimula reacciones 
químicas y por lo tanto, el mecanismo de la extracción. Los gases y vapores dentro de 
las cavidades se comprimen generando calor e incrementando la temperatura del líquido 
inmediato a los alrededores, la cual se disipa rápidamente, debido a que el área es muy 
pequeña (Suslick, 1989). 
El mecanismo de extracción envuelve dos tipos de fenómenos físicos: La difusión del 
solvente a través de las paredes celulares y la extracción del limonín al romperse la 
pared celular. Ambos fenómenos se ven favorecidos durante la sonicación. 
Para realizar la extracción es necesario que la muestra se encuentre en contacto con 
el solvente, por lo que es recomendable moler la muestra. 
Cuando la pared celular es delgada, puede ser destruida fácilmente por la 
sonicación, sin embargo cuando es gruesa, es necesario moler la muestra para reducir el 
tamaño de la partícula y aumentar el número de células expuestas al solvente durante la 
extracción por sonicación. 
La transferencia de masa de los compuestos solubles al solvente a partir de la 
muestra se lleva a cabo por difusión y procesos osmóticos (Vinatoru et al., 2001). 
La sonicación facilita lél hidratación e hinchamiento de la célula, ya que hace más 
grandes los poros de la pared celular por efecto de la cavitación, rompiéndola y forzando 
al solvente a introducirse dentro de la célula, favoreciendo la transferencia de masa 
(Albu et al., 2004). Este método permite que la extracción sea más rápida que con los 
métodos de extracción continua y de maceración, además de que es un método fácil de 
llevarse a cabo y ha demostrado obtener altos rendimientos en extracciones de diversos 
compuestos químicos a partir de tejidos vegetales, como se puede observar en la tabla 
12., donde se observa la obtención de limoneno, ácido carnósico y menta, utilizando 
varios métodos de extracción. 
25 
Antecedentes 
Tabla 12. ppm de limoneno, ácido camósico y menta a diferentes tiempos por 
maceración, extracción continua y maceración asistida con sonicación(Referencia: Albu, 
2004; Vinatoru, 1997; Vinatoru, 2001) 
Método Limoneno Ácido carnósico Menta 
(ppm) , (ppm) (ppm) 
Extracción continua con 
407 soxhlet 
- -
Maceración asistida con 
496 7,800 700 sonicación 30 min 
Maceración asistida con 
512 14,050 2,500 sonicación 60 min 
Maceración (7 días) 250 4,100 10,200 
Tanto el limoneno como al ácido camósico, obtuvieron el menor rendimiento 
macerando la muestra por sietedías. Por medio de la extracción continua, el rendimiento 
aumentó en gran medida y es cercano al obtenido por maceración asistida con 
sonicación, sonicando por 30 min en el caso del limoneno, mientras que al sonicarlo por 
60 min, el rendimiento fue aún mayor. 
Con el método de extracción por maceración asistida con sonicación, la extracción 
se lleva a cabo con mayor rapidez que con los métodos de extracción continua y de 
maceración (Vinatoru et al., 2001; Albu et al., 2004). 
Las desventajas de este método son: Que el solvente no puede ser renovado de 
manera inmediata durante la operación como en el caso de la extracción continua, lo que 
causa que la eficiencia de la extracción este en función de la cantidad de solvente 
utilizado al inicio de la extracción, además se requiere filtrar la muestra al finalizar la 
extracción. (Vinatoru et al., 1997). 
Este método se puede llevar a cabo de manera sencilla a nivel laboratorio utilizando 
un sonicador de tina, el cual se conoce como sonicación indirecta, ya que la muestra y el 
solvente se colocan en un matraz dentro de la tina de sonicación. Con este método solo 
se pueden extraer pequeñas cantidades de muestra. Existen otros equipos que permiten 
26 
Antecedentes 
la extracción de cantidades mayores de muestra como en el caso de la sonicación 
directa. 
Para la extracción a macro-escala es posible utilizar un sonicador industrial, el cual 
es un diseño reciente, que ha demostrado alcanzar altos rendimientos. Cuenta con 
agitación continua y un sistema de enfriamiento que controla el incremento de la 
temperatura provocado por la sonicación y la agitación (Vinatoru, 2001) . 
• :. Microburbujas con dióxido de carbono supercrítico. 
Recientemente se ha probado un nuevo método para remover los limonoides 
aglucones del jugo por medio de microburbujas con dióxido de carbono supercrítico. 
Este método se lleva a cabo de la siguiente manera: 
La muestra se provee de dióxido de carbono supercrítico (SC-C02) a través de un 
flitro con microporos, formando microburbujas, donde componentes responsables del 
olor y limonoides aglucones se solubilizan en el fluído supercrítico. Las microburbujas 
penetran las células de los microorganismos y de las enzimas, inactivándolos. 
La muestra y las microburbujas permanecen en contacto mientras la muestra es 
trasladada del fondo al tope del extractor. El SC-C02 que contiene loe limonoides 
aglucones se sacan por la parte superior del reactor (Berhow et al., 2000). 
Los métodos que se llevaron a cabo para la extraccion de limonín fueron: Extracción 
por maceración durante 24 h, extracción continua por 8h y extracción por maceración 
asistida con sonicación por diferentes tiempos (30min, 1h, 2h, 3h), utilizando como 
solventes acetona y metanol. 
27 
------------
Desarrollo experimental 
CAPÍTULO 11. Desarrollo experimental 
Extracción sól- Iiq (m etanol) 
Semilla de limón 
Desengrasado: 
Extracción sólido- líquido con hexano 
Evaluación del 
solvente 
Métodos convencionales v sonicación Métodos convencionales v sonicación 
Maceración 
con 
Sonicación 
30 min 
Ih 
2h 
3h 
Extracción continua: 
Soxhlet 8h 
Maceración 
con 
Sonicación 
(30min, 
Ih, 2h, 3h) 
Extracción 
continua: 
Soxhlet 8h 
I _________ -+~I Monitoreo por TLC 
Cristalización 
diclometano:isopropanol (1: 1) 
I __________ ~~I Monitoreo por TLC 
Recristalización 
diclometano: isopropanol (1: 1) 
---------+_ Monitoreo por TLC 
Evaluación de rendimiento y 
grado de pureza por medio de 
análisis por HPLC, EM y 
RMN 28 
Desarrollo experimental 
MATERIAL Y EQUIPO 
SOLVENTES Y REACTIVOS: 
~ Acetona 
~ Metanol 
~ Diclorometano 
~ Isopropanol 
~ Acetato de etilo 
~ Etanol 
~ Éter de petróleo 
~ Std de limonín Sigma- Aldrich 
aldehído ~ Paradimetilaminobenz 
~ Placas de silica 
EQUIPO: 
~ Estufa, Felisa, Mod 14 2A, 117 volts 
~ 
~ 
~ 
~ 
Molino, Cecoco, grindi ng mili, malla #20 
Equipo soxhlet para 5 O Y 500g de muestra 
Sonicador, Mettler ultr 
HPLC 
Equipo 
Columna 
Fase móvil 
Flujo 
Elución 
Muestra 
asonics cavitator, modelo 4.6, Frecuencia 40 Hz 
Cromatógrafo Beckman 
Gold system 
Waters C-18 
Acetonitrilo:a ua 
1ml/min 
Isocrático 
20 microlitros 
Detección UV 207 nm 
29 
Desarrollo experimental 
~ Resonancia magnética nuclear 
Equipo Varian Unity Inova 
Radiofrecuencia 300Hz 
Referencia interna Trimetilsilano (TMS) 
Disolvente CDCI3 y DMSO 
~ Espectrometro de masas 
Equipo JEOl, SX-102A 
Tipo Doble sector, geometría inversa 
Cámara de ionización 30°C 
Gas Xenón de alta pureza 
Matriz Alcohol 3- Nitrobencencílico (Sigma) 
2.1 Obtención y acondicionamiento de la muestra 
2.1.1 Secado 
Se trabajaron con dos lotes de semilla de limón de la variedad mexicano (cítrus 
aurantífolía swíng/e), proveniente del municipio de Apatzingán Michoacán. El primer lote 
consistía en cáscaras de limón con semillas, por lo que fue necesario someterlo a un 
proceso de secado por 10 h a 70°C y posteriormente separar las semillas. 
2.1.2 Molienda 
Una vez que la semilla estaba seca, se molió para disminuir el tamaño de partícula 
(malla #20) con la finalidad de aumentar la superficie de contacto durante las diversas 
extracciones así como para homogeneizar los lotes (Otha et al., 1985). 
30 
Desarrollo experimental 
2.1.3 Desengrasado 
Posteriormente, se procedió a eliminar el contenido de grasa en la muestra 
utilizando el método Soxhlet. Las condiciones de trabajo fueron las reportadas por NMX-
F-089-S-1978 para determinación de extracto etéreo en alimentos e incluyen hexano 
como solvente, temperatura de 500C y tiempo 12 horas (NMX-F-089-S-1978). 
2.2 Extracción sólido- líquido 
Esta extracción se realizó con la finalidad de obtener tanto los limonoides aglucones 
como los glucosilados. Cada extracción se realizó a partir 50g de semilla de limón seca y 
desengrasada. 
2.2.1 Evaluación del solvente en la extracción sólido- líquido 
Con la finalidad de comparar la eficiencia del solvente durante esta extracción en 
cuanto al rendimiento y tiempo de extracción, estas extracciones se realizaron con dos 
diferentes solventes: Metanol y acetona. 
2.2.2 Métodos convencionales y sonicación 
Esta extracción se llevó a cabo por diferentes métodos: 
a) Maceración: Se adicionó 450 mL de metanol, se dejó reposar 24h y se prosiguió 
a filtrar la muestra. El extracto se concentró en el rotavapor a una temperatura de 30°C. 
La extracción se monitoreó con cromatografía en capa fina (CCF). 
b) Extracción continua: Se realizó con Soxhlet utilizando 300 mL de metanol 
como solvente durante 8h a una temperatura de 50°C. Posteriormente se concentró en 
un rotavapor a 30°C. La extracción se monitoreó con CCF. 
31 
Desarrollo experimental 
Escalamiento 
Se realizó esta extracción, utilizando una mayor cantidad de semilla (450g), ya que 
es uno de los métodos donde se observó un mayor rendimiento. Se realizó con Soxhlet 
utilizando 3000 mL de metanol como solvente durante 8h a una temperatura de 50°C. 
Posteriormente se concentró la acetona en un rotavapor a 30°C. 
e) Maceración asistida con sonicación: La muestra se sonicó a diferentes 
tiempos (30 min, 1h, 2h Y 3h) con 450 mL de metanol, se filtró inmediatamente y se 
concentró a 30°C. La extracción se monitoreó con CCF. 
Escalamiento 
Se realizó la extracción, utilizando una mayor cantidad de semilla (450g) con el 
método de maceración asistida por sonicación por 1h, ya se observó un mayor 
rendimiento: Se realizó una extracción con 2L de metanol, de 450g de semilla seca 
molida y desengrasada. Se filtró inmediatamente después. La extracción se monitoreó 
con CCF. 
2.3 Extracción líquido- líquido de limonoides 
A todas las extracciones anteriores se les sometió a una extracción líquido- líquido 
con diclorometano: agua (2:1), utilizando embudos de separación. Los limonoides 
glucosilados se encuentran en la fracción acuosa mientras que los limonoides aglicones 
se encuentran enla fracción con diclorometano, la cual se concentró en rotavapor a 
30°C. De acuerdo al monitoreo por cromatografía en capa fina (CCF), la extracción se 
repitió 4 veces por muestra, para asegurar la completa extracción de limonín. Los 
extractos obtenidos en esta etapa se les identificó como crudos. 
32 
- ------ - - ---- . 
Desarrollo experimental 
2.4 Purificación de limonín 
La recuperación de limonín se llevó a cabo utilizando el extracto de limonoides 
obtenido a partir de la extracción con 450g de semilla, ya que contiene una mayor 
concentración de limonín. Para su recuperación fue necesario purificar el extracto de 
limonoides por medio de la cristalización y recristalización, donde el sol uta disuelto 
(limonín) se separa de la disolución formando cristales. 
2.4.1 Cristalización 
La cristalización se realizó utilizando diferentes mezclas de disolventes, con el fin de 
obtener un mayor rendimiento así como la mayor pureza posible. El método con el que 
se llevó a cabo fue el mismo en todos los casos. 
La mezcla de disolventes utilizados durante la cristalización fueron: 
a) Metanol: Acetona (2:8) 
b) Diclorometano: Isopropanol (1:1) 
El extracto crudo de limonoides se disolvió en una cantidad mínima del primer 
disolvente a 25°C y se adicionó el segundo en frío gota a gota hasta observar un 
precipitado de color blanco. Se dejó reposar en hielo por 30 min, para aumentar el 
tamaño de los cristales. Los cristales puros de limonín empezaron a formarse lentamente 
y precipitaron. El precipitado se filtró al vacío utilizando un matraz buchner y se secó al 
vacío (Pifferi et al., 1993). 
Las aguas madres se dejaron enfriar en hielo para que precipitara el limonín 
faltante. Éste se filtró nuevamente al vacío. 
Se determinó el punto de fusión de los cristales obtenidos. 
2.4.2 Recristalización 
Con la finalidad de aumentar la pureza del limonín recuperado, éste se recristalizó 
utilizando las siguientes mezclas de disolventes: 
33 
Desarrollo experimental 
a) Benceno: Diclorometano (9: 1) 
b) Acetona: Diclorometano (9: 1) 
La recristalización se llevó a cabo de la misma forma que la cristalización. 
2.5 Análisis por Cromatografía en capa fina (CCF) 
Se realizó cromatografía en capa fina para el monitoreo en las extracciones de 
limonín. Se usó estándar de limonín disuelto en diclorometano como referencia. Éste se 
aplicó sobre las placas de silica, junto los extractos disuletos en diclorometano. Se 
utilizaron placas de silica de 10 cm de longitud y 5 cm de ancho las cuales se eluyeron en 
una solución de ciclohexano:acetato de etilo (2:3) (Hideaki, 1985, Campos, 2004). 
Posteriormente, se rociaron con reactivo de Ehrlich (5% paradimetilaminobenzaldehído 
en etanol) y se dejaron secar. Las placas se revelaron con gases de ácido clorhídrico. 
Esta técnica es específica de los limonoides, ya que estos adquieren un color rojizo. 
2.6 Evaluación del rendimiento y grado de pureza 
2.6.1 Cuantificación de limonín por HPLC 
Tanto el estándar de limonín como las muestras obtenidas a partir de las 
extracciones fueron cuantificadas por HPLC. Todos los extractos se disolvieron en 
acetonitrilo. Éste se filtró en una Sepak C18. 
Para la cuantificación del limonín fue necesario la elaboración de una curva de 
calibración, utilizando un estándar de limonín de Sigma- Aldrich. Ésta se realizó 
utilizando el factor de respuesta del estándar del limonín en 7 concentraciones diferentes 
(de O.OlmgfmL a O.6mgfmL) e inyectando 20).11. Cada muestra fue inyectada por 
triplicado. 
Una vez realizada la curva patrón, se inyectaron todas las muestras obtenidas con 
los diferentes métodos de extracción para evaluar la concentración y el rendimiento. 
34 
r 
Desarrollo experimental 
2.6.2 Espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear 
Los análisis de espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear se 
realizaron para confirmar la obtención de limonín de alta pureza, mediante el análisis de 
su estructura. El Iimonín cristalizado por la mezcla de disolventes diclorometano: 
isopropanol (1:1), fue analizado por resonancia magnética nuclear de protón y carbono y 
por espectrometría de masas por impacto electrónico en la USAI. 
2.7 Análisis estadístico 
Todos los análisis se realizaron por triplicado y se determinó la media y la desviación 
estándar. 
Para comparar la influencia de disolvente sobre el rendimiento obtenido de Iimonín, 
se realizó un análisis de t de student de los resultados. 
Para evaluar la eficiencia de los métodos utilizados, se realizó un análisis de 
varianza de los resultados. Una vez que se determinó que existe diferencia, fue necesario 
evaluar entre cuales métodos existen diferencia. Para comparar las parejas de medias, se 
aplicó la prueba de intervalos múltiples de Duncan. 
Los resultados del análisis estadístico se muestran en el apéndice 1. 
35 
- - --------- -
Resultados y discusión 
CAPÍTULO 111. Resultados y discusión 
3.1 Obtención y acondicionamiento de la muestra 
La extracción de limonín, se lleva a cabo utilizando diferentes partes del limón como 
el jugo, la cáscara y las semillas del fruto. 
Al analizar la concentración de limonín en los diferentes tejidos del fruto, se observó 
que la semilla presenta una mayor concentración (Berhow et al.,2000). Por esta razón, la 
extracción de limonín se realizó a partir de semilla de limón. 
Para facilitar la extracción de los limonoides, es necesario eliminar tanto el 
contenido de agua como grasa de la semilla de limón. La humedad se eliminó por medio 
de secado por 12h a 50°C, mientras que la extracción de grasa se realizó con el método 
de extracción continua, utilizando hexano como solvente. En la tabla 9. se muestran los 
resultados del contenido de humedad y grasa en los dos lotes de semilla utilizados. 
Tabla 9. Contenido de humedad y grasa en la semilla de limón. (El contenido de 
grasa fue calculado en base seca) 
Humedad Grasa 
(%) cv (%) cv 
Lote 1 (Cáscara con 
semillas) 35.73 0.427 32.53 3.536 
Lote 2 (únicamente 
semillas) 2.1 4.761 37.43 3.265 
Cv = coeficiente de variación 
La humedad calculada en el primer lote se encuentra por debajo al reportado (39 y 
44.6%) (Braverman, 1980), ya que las semillas perdieron un poco de humedad durante 
su transporte; en cuanto al segundo lote, la humedad fue muy baja debido a que la 
semilla ya se encontraba seca. 
El contenido de grasa en ambos lotes, es superior al reportado en la literatura 
(19.5-25.5%), aunque se sabe que varía dependiendo de la variedad y ésta puede llegar 
a un 40% en base seca (Braverman, 1980). 
36 
Resultados y discusión 
3.2 Extracción sólido- líquido 
3.2.1 Evaluación del solvente en la extracción sólido- líquido 
Los solventes que se han utilizado para la extracción de limonín son: Acetona, 
metanol, benceno, diclorometano y éter de petróleo, éste último resulta ser muy costoso 
(Pifferi et al. , 1993). 
Con la finalidad de conocer la eficiencia del solvente en la extracción de limonín, se 
comparó el rendimiento obtenido con acetona y metanol, utilizando tres diferentes 
métodos durante la extracción sólido- líquido. Los resultados se muestran en la tabla 11. 
Tabla 11. Evaluación de solventes en cuanto al rendimiento obtenido de limonín 
utilizando varios métodos de extracción en semilla de limón seca 
Acetona 
(ppm) cv 
Metanol 
(ppm) cv 
Maceración 
1931 .026 2.900 1916.614 4.4 24h 
Maceración 
asistida con 3557.031 3.4 3948.17 2.5 sonicación 
1h 
Extracción 
continua 4398.619 1.3 4244.006 2.6 
(8h) 
Cv = coeficiente de variación 
37 
5000 
4500 
4000 
e 3500 e 
~3000 
=; 2500 
'O 
E 2000 
11. 
11.1500 
1000 
500 
0 +--1---
Maceración 24h 
Resultados y discusión 
Maceración asistida Extracción continua 
con sonicación 1 h (8h) 
Método 
Gráfica l. Rendimiento de limonín en función de la naturaleza del solvente 
En la gráfica 1. se puede observar que la eficiencia de los solventes en cada método 
es muysimilar. Al ser el· limonín un compuesto polar, es necesario el uso de disolventes 
polares para su separación; tanto el metanol como la acetona son solventes polares, los 
cuales pueden extraen el contenido de limonín en la semilla. 
Al realizar la extracción por maceración durante 24h, el rendimiento es 
practica mente el mismo con ambos disolventes, mientras que al sonicar la muestra por 
lh, se obtuvo un rendimiento ligeramente mayor con el uso de metanol, mientras que 
con el soxhlet por 8h, fue ligeramente mayor con acetona. Sin embargo, 
estadísticamente no se estableció diferencia significativa entre el uso de metanol y 
acetona a un nivel de significancia de 0.05, con los tres diferentes métodos. 
En la tabla 10, se muestran los rendimientos de limonín reportados por Ozaki y 
Pifferi utilizando diferentes solventes. 
38 
.. 
Resultados y discusión 
Tabla 10. ppm de limonín obtenidas utilizando diferentes solventes(Referencias: 
Pifferi et al., 1993; Ozaki, 1991*) 
Solvente Método ppm de limonín 
Acetona Extracción 7,320 
continua 
Eter de Extracción 6,500 petróleo continua 
Metanol* 
Extracción 8,950 
continua 
Se observa un menor rendimiento con el uso de éter de petróleo, además de que es 
un solvente más costoso y dificil de manejar. Los solventes recomendados para la 
extracción de limonín a partir de semilla de limón son metanol y acetona, ya que han 
demostrado más altos rendimientos. 
En todas las extracciones se obtuvieron rendimientos considerablemente más bajos 
al reportado por Ozaki (8,950 ppm), el cual utilizó la variedad Citrus limon y como ya 
mencionamos, la concentración de limonoides varía de una variedad a otra. Cabe 
agregar que en dicho artículo no se menciona el tratamiento que se le da a la -muestra 
para realizar la extracción (Ozaki, 1991). 
3.2.2 Métodos convencionales y sonicación 
Una vez que se ha elegido el solvente para la extracción de limonín, es necesario 
elegir el método al cual se someterá la semilla. Actualmente existen varios métodos para 
la extracción de limonín, los cuales abarcan maceración, extracción continua y 
maceración asistida con sonicación. 
a) La maceración representa el método más sencillo para la extracción de limonín, 
sin embargo los rendimiento obtenidos son bajos para la extracción de limonín. 
39 
Resultados y discusión 
b) La extracción continua con soxhlet es un método donde la muestra se encuentra 
en contacto con solvente limpio constantemente, no requiere filtrar la muestra el 
terminar la extracción y se han obtenidos altos rendimientos en la extracción de limonín 
(Pifferi et al., 1993; Ozaki, 1991). Sin embargo requiere de un largo tiempo para 
realizarse la extracción. Además, puede causar la descomposición del limonín si la 
extracción se realiza a temperaturas mayores a 50 oc (Luque et al., 1998). 
c) La maceración asistida con sonicación es un método que se emplea exitosamente 
en la extracción de varios compuestos para mejorar la extracción sólido- líquido. La 
sonicación favorece la difusión del solvente a través de las paredes celulares y la 
extracción del limonín al romperse la pared celular, la cual está formada por celulosa, 
polisacáridos, compuestos fenólicos y proteínas, que permiten que se lleve a cabo la 
difusión. 
En este estudio se utilizaron diferentes métodos para la extracción de limonín a 
partir de semilla de limón durante la primera extracción sólido- líquido. Los métodos que 
se utilizaron fueron: Maceración por 24h, extracción cOíltinua por 8h y maceración 
asistida con sonicación a diferentes tiempos (30 min, 1, 2 Y 3h). 
40 
í 
5,000,000 
4,000,000 
.5 
5 ª 3,000,000 
-8 
~ 2,000,000 
1,000,000 
o 
1: 
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Resultados y discusión 
1::2 
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o 
Método 
Gráfica 2. Rendimiento de limonín en función al método de extracción utilizando 
metanol 
La gráfica 2. muestra los rendimientos de extracción obtenidos por diversos 
métodos durante la primera extracción sólido- líquido y se puede observar que existe 
diferencia significativa en los rendimientos obtenidos de limonín entre todos los métodos. 
Tabla 13. Obtención de limonín (ppm) a partir de diferentes métodos de extracción 
con semilla seca de limón. 
Maceración Maceración Maceración Maceración 
Extracción 
Maceración asistida con asistida con asistida con asistida con continua 8h 
24h (ppm) sonicación 30 sonicación 1 h sonicación 2h sonicación (ppm) 
min (ppm) (ppm) (ppm) 3h (ppm) 
Extracción sólido-
1916,615 2841,844 3948,174 4482,885 4340,271 4398,619 líquido con metanol 
Extracción líquido-
líquido 
898,524 925,699 2620,364 2768,825 2872,313 2430,598 diclorometano: 
agua 
41 
Resultados y discusión 
En el proceso de maceración por 24h se obtuvo el menor rendimiento, ya que la 
extracción ocurre únicamente por la acción del solvente. 
Al sonicar la muestra 30 min, se observa un mayor rendimiento al obtenido por 
maceración, ya que la extracción se ve favorecida por las vibraciones creadas por el 
sonicador, las cuales provocan una agitación en las moléculas de la muestra, que 
aceleran el proceso de hidratación en la pared celular, que al transcurrir el tiempo, 
conduce a la desintegración de tejidos vegetales (Toma et al., 2001). 
Por esta razón, el rendimiento aumenta considerablemente al aumentar el tiempo 
de sonicado hasta llegar a 2h, donde se mantiene, incluso al sonicar la muestra durante 
3h. Esto se debe a que a las 2h de sonicado, las paredes celulares de la semilla de 
limón han sido fragmentadas en su gran mayoría, aumentando el área de superficie y 
por lo tanto la transferencia de masa al solvente, favoreciendo de esta forma la 
extracción (Toma et al., 2001). 
La extracción continua con soxhlet por 8h muestra un rendimiento similar al 
obtenido con el método de sonicación por 2h. La extracción por soxhlet se ve favorecida 
por el recambie de solvente limpio, el cual requiere de 8h para llevarse a cabo. El tiempo 
de la extracción con este método fue reportada en investigaciones anteriores en el 
laboratorio, como la mínima para la obtención de un alto rendimiento (Campos, 2004). 
Durante la extracción sólido- líquido se logró la obtención de un extracto rico en 
limonoides glucósidos y aglicones, por lo que fue necesario realizar una extracción más 
selectiva, para lograr la separación de los limonoides glucósidos de los aglicones. 
Para la extracción selectiva de los limonoides aglucones, se realizó una segunda 
extracción con diclorometano, ya que en investigaciones anteriores (OCPI, 1987), 
demostró tener un mayor rendimiento de recuperación. 
En la Tabla 13. se pueden observar los rendimientos de limonín obtenidos durante la 
extracción líquido- líquido con diclorometano para la obtención de un extracto rico en 
limonoides aglucones. 
42 
Resultados y discusión 
3.3 Purificación de limonín 
El extracto de limonoides se purificó por medio de la cristalización y recristalización, 
donde el soluto disuelto (limonín) en el primer solvente se separó de la disolución 
formando cristales al adicionar el segundo solvente. 
3.3.1 Cristalización 
Se ha reportado que la mezcla de disolventes donde se obtiene un mayor 
rendimiento es diclorometano: isopropanol (1:1), obteniendo 732 ppm .de limonín 
cristalizado (Pifferi, 1993). 
Se utilizaron diferentes mezclas de disolventes, con el fin de conocer la mezcla de 
disolventes donde se obtuviera un mayor rendimiento de limonín, así como el mayor 
grado de pureza posible. Las mezclas de disolventes utilizados durante la cristalización 
fueron: 
a) Metanol: Acetona (2:8) 
b) Diclorometano: Isopropanol (1: 1) 
El extracto crudo de limonoides se disolvió en una cantidad mínima del primer 
disolvente a 25°C y se adicionó el segundo en frío gota a gota hasta observar un 
precipitado de color blanco. Se dejó reposar en hielo por 30 min, para aumentar el 
tamaño de los cristales. El precipitado sefiltró al vacío utilizando un matraz buchner y se 
secó al vacío (Pifferi et al., 1993). La Tabla 14. muestra los resultados obtenidos durante 
la cristalización del limonín. 
Tabla 14. Características de la cristalización del limonín. 
Rendimiento* Punto de 
Pureza con 
Disolvente Características respecto al (ppm) fusión (oC) estándar (%) 
Metanol: 
Cristales cafés, 
acetona (2:8) 
opacos, no 860* 260-265 65.4 
homogéneos 
Diclorometano: Cristales de color 
isopropanol blanco, cristalinos y 770* 298-300 92 
(1:1) uniformes 
43 
Resultados y discusión 
Al realizar la cristalización con metanol: acetona (2:8), se obtuvo limonín con una 
pureza del 65% con respecto al estándar, en donde los cristales eran de color café, 
heterogéneos tanto en color y forma. El rendimiento obtenido fue de 0.86%, debido a las 
impurezas que contenían los cristales. 
Al realizar la cristalización con la mezcla diclorometano: isopropanol (1:1), se 
obtuvieron cristales homogéneos, color blanco y cristalinos, alcanzando una pureza del 
92% con respecto al estándar. Esta mezcla de disolventes resultó ser la más adecuada 
ya que se obtuvo limonín de una pureza 20% mayor. A pesar de que el rendimiento fue 
menor al obtenido con acetona: metanol (2:8), éste fue mayor al reportado por Pifferi. 
La cantidad de limonín obtenido se muestra en la siguiente tabla 
Tabla 15. ppm de limonín cristalizado, obtenido a partir de diferentes métodos, 
utilizando diclorometano: isopropanol (1:1) (Referencia: Pifferi et al., 1993*) 
Método ppm de limonín 
Maceración asistida con 
770, 69 sonicación 1h 
Extracción continua con 
867,503 Soxhlet 8h 
Extracción continua con 732 
Soxhlet 8h * 
Fig 9. limonín cristalizado 
44 
Resultados y discusión 
3.3.2 Recristalización 
Para aumentar la pureza del limonín, se recristalizó el limonín. La Tabla 16. muestra 
los resultados obtenidos durante la recristalización del limonín, utilizando las siguientes 
mezclas de disolvente: 
a) Benceno: Diclorometano (9:1) 
b) Acetona: Diclorometano (9:1) 
Tabla 16. Características de la recristalización del limonín 
Rendimiento 
Pureza con 
Disolvente Características Punto de respecto al (ppm) fusión (OC) Standard (Ofo) 
Benceno: Cristales de color 
580* 296-298 96.84 diclorometano blanco, cristalinos 
(9:1) v uniformes 
Acetona: Cristales de color 
diclorometano blanco, cristalinos 390* 292-294 93.3 
(9:1) y uniformes 
Con la mezcla benceno: diclorometano (9: 1), Los cristales no muestran un gran 
cambio ñsico. Dichos cristales son muy similares a los del estándar de limonín obtenido 
por Sigma- Aldrich. 
Se logró aumentar la pureza 4.8% más y el rendimiento se redujo un 33% del 
limonín obtendido durante la cristalización. El aumento de pureza no aumento 
significativamente durante este proceso, aunque su rendimiento si disminuyó de manera 
significativa, por lo que a pesar de que esta mezcla resultó ser la mejor durante la 
recristalización, ésta no se recomienda, a menos que la pureza del limonín sea de gran 
importancia. 
La pureza se determinó por medio del HPLC y el punto de fusión, el cual resultó ser 
igual al reportado en el Index Merck (Index Merck, 2000). 
45 
Resultados y discusión 
3.4 Escalamiento 
Debido a las funciones de los limonoides como anticarcinogénicos e insecticidas, 
resulta importante su extracción a nivel industrial a partir de residuos generados en la 
industria como son la semilla de limón. 
Con la finalidad de un posterior escalamiento a nivel planta piloto, se llevó a cabo la 
extracción de limonín con una mayor cantidad de semilla de limón. En las Tablas 17. Y 
18. se comparan los rendimientos obtenidos con diferentes cantidades de semilla de 
limón utilizando dos métodos diferentes. 
Tabla 17. Obtención de limonín (ppm) aumentando la cantidad de semilla para su 
extracción con el método de sonicación por 1h 
Sonicar 1h en Sonicar 1h en 
509 4509 
(ppm) (ppm) 
Extracción 
3948.174 2422.766 sól- IíQ ' . 
Extracción 
2620.364 1960.418 IíQ- IíQ 
Cristalización * 770.691 
., 
*No se llego la cnstalrzaClon 
Tabla 18. Obtención de limonín (ppm) aumentando la cantidad de semilla para su 
extracción con el método de Soxhlet por 8h 
I 
Soxhlet en 509 I Soxhlet en 450g 
(ppm) (ppm) 
¡ 
Extracción sól-
4398.619 I 3725.924 líq 
Extracción 
2430.598 I 1927.758 líq- liq 
Cristalización * ¡ 867.503 
I 
. , 
*No se llego a la cnstalrzaClon 
46 
------------------ -----_. 
Resultados y discusión 
Al aumentar la cantidad de muestra en la extracción, el rendimiento de limonín 
disminuyó un 39% en el caso de sonicación por 1h y en un 16% en el caso del soxhlet en 
comparación con el rendimiento obtenido utilizando una menor cantidad. Esta 
disminución en el rendimiento se debe a que no se contaba con equipo para extraer 
grandes cantidades, por lo que fue necesario dividir la muestra y realizar varias 
extracciones, las cuales contenían una menor cantidad de disolvente, disminuyendo así, 
el rendimiento obtenido de limonín. 
En el caso de la maceración asistida con sonicación, el rendimiento fue aun menor, 
debido a que al aumentar la cantidad de muestra, resulta más difícil que el ultrasonido 
abarca toda la muestra, tomando en cuenta que la sonicación indirecta es utilizada para 
pequeñas cantidades. Para mayores cantidades se recomienda el uso de sonicación 
directa (Vinatoru, 2001). 
La maceración asistida con sonicación se puede llevar a cabo de manera sencilla a 
nivel laboratorio utilizando un sonicador de tina, extrayendo pequeñas cantidades de 
muestra. 
Para realizar la extracción a nivel industrial se requiere de un sonicador industrial 
pára alcanzar altos rendimientos, ya que cuenta con agitación continua y un sistema de 
enfriamiento para controlar el calentamiento provocado por la sonicación y la agitación 
(Vinatoru, 2001). 
La cristalización de limonín no se puede llevar a cabo, con cantidades de semilla de 
50g, ya que no existe la cantidad suficiente de limonín para cristalizar. 
3.5 Evaluación del rendimiento y grado de pureza 
3.5.1 Cuantificación por HPLC 
Los análisis de HPLC utilizando fase inversa y ultravioleta como sistema de 
detección resultó de gran utilidad para determinar el rendimiento obtenido de limonín así 
como el grado de pureza. 
47 
140 i 120 y= 198.77x-1 .2337 
100 1 R2 = 0.9955 
80 i 
j 60 i 
40 , 
20 J 
Resultados y discusión 
O~=--~-~--r---.---'---'----' 
-20 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 
Concentraci6n (rnghnL) 
Gráfica 3. Curva de calibración de limonín (limonín estándar Sigma-Aldrich) 
~ i 
":-4 
;. I 
~ 
I 
-J ..,. 
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I 
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I 
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-:: ~ j 
A Limonín 
11 tret2.62 
I 
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-=-- _ r-,. ,...-, .... __ w-. ~., ...-.; _ . o 
Cromatograma 1. Cromatograma de std de limonín Sigma- Aldrich 
48 
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¡t;:¡ 
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I! '" ; , 
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Resultados y discusión 
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Cromatograma 2. Cromatograma de limonín obtenido durante la cristalización 
diclorometano: isopropanol (1: 1) 
La tabla 19. Muestra los resultados obtenidos para la elaboración de la curva de 
calibración utilizando 7 concentraciones diferentes del estándar de limonín Sigma-
Aldrich. La curva de calibración se muestra en la gráfica 3. 
El cromatograma 1. Muestra el cromatograma del estándar de limonín Sigma-
Aldrich obtenido por HPLC. Como se puede observar en dicho cromatograma, el 
estándar cuanta con una pureza del 75%. 
El cromatograma 2. Muestra el cromatograma de limonín obtenido por HPLC, 
utilizando limonín cristalizado con diclorometano: isopropanol (1:1), donde la señal 
concuerda con la otorgada por el estándar. 
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Resultados